Методическая статья

Диагностика на основе CRISPR в месте оказания медицинской помощи с использованием предварительно смешанных и лиофилизированных реагентов

DOI:

10.3791/66703

⸱

16 августа 2024 г.

 ,  , 
1School of Biomolecular Science and Engineering, Vidyasirimedhi Institute of Science and Technology (VISTEC)

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем пошаговое приготовление предварительно смешанных, лиофилизированных рекомбиназ на основе изотермической амплификации и кластеризованных регулярно чередующихся коротких палиндромных повторов (CRISPR), которые могут быть использованы для обнаружения биомаркеров нуклеиновых кислот возбудителей инфекционных заболеваний или других генетических маркеров, представляющих интерес.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Молекулярная диагностика с помощью кластерного обнаружения с регулярным интервалом коротких палиндромных повторов (CRISPR) обладает высокой диагностической точностью и характеристиками, которые подходят для использования в местах оказания медицинской помощи, такими как быстрое время обработки результатов, удобные простые считывания и отсутствие необходимости в сложных инструментах. Тем не менее, эти реакции могут быть трудоемкими для выполнения в месте оказания медицинской помощи из-за большого количества компонентов и ручных этапов обработки. В этой статье мы предоставляем пошаговый, оптимизированный протокол для надежного обнаружения патогенов заболеваний и генетических маркеров с помощью изотермической амплификации на основе рекомбиназы и реагентов на основе CRISPR, которые предварительно смешиваются, а затем лиофилизируются в легко хранящихся и готовых к использованию форматах. Предварительно смешанные, лиофилизированные реагенты могут быть регидратированы для немедленного использования с сохранением высокой эффективности амплификации и обнаружения. Мы также предоставляем руководство по устранению часто встречающихся проблем при приготовлении и использовании предварительно смешанных, лиофилизированных реагентов для диагностики на основе CRISPR, чтобы сделать платформу обнаружения более доступной для более широкого круга специалистов по диагностике и генетическому тестированию.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Впервые о диагностике на основе CRISPR для обнаружения биомаркеров нуклеиновых кислот сообщалось в 2017 году 1,2,3,4, и с тех пор она была доказана как диагностика нового поколения с помощью тестов, одобренных Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA), в частности, для обнаружения РНК коронавируса тяжелого острого респираторного синдрома 2 (SARS-CoV-2) во многих странах 5,6,7,8. Помимо коронавирусной инфекции 2019 года (COVID-19), технологии продемонстрировали свою эффективность для обнаружения различных вирусов и бактерий 9,10,11,12,13, мутаций и делеций генетических заболеваний, а также могут быть разработаны для обнаружения белковых и низкомолекулярных биомаркеров 2,12. Диагностика на основе CRISPR часто сочетает методы изотермической амплификации, такие как амплификация рекомбиназной полимеразы (RPA) или петлевая изотермическая амплификация (LAMP)14,15, с детектированием на основе CRISPR с использованием CRISPR-управляемых ферментов CRISPR-ассоциированных (Cas) с «коллатеральной» эндонуклеазной активностью после распознавания мишени3. Двойное использование изотермической амплификации и детектирования на основе CRISPR придает технологиям несколько желательных характеристик, в частности, высокую диагностическую точность, приближающуюся к золотому стандарту полимеразной цепной реакции (ПЦР), и способность мультиплексировать и обнаруживать небольшие различия в последовательностях, включая однонуклеотидные полиморфизмы 1,9.

Однако наиболее точные версии диагностики на основе CRISPR содержат несколько компонентов и этапов и могут быть сложными для выполнения с неспециалистами или в месте оказания медицинской помощи (POC). Чтобы решить эту проблему, связанную с расширением использования высокоточной диагностики на основе CRISPR до настроек POC, мы разработали протоколы для приготовления предварительно смешанных, лиофилизированных, рекомбиназных изотермических амплификационных реакций и реакций детектирования на основе CRISPR, которые просты в использованиии хранении. Эти протоколы должны дополнять существующие превосходные протоколы диагностики на основе CRISPR14, которые содержат дополнительную информацию о производстве биохимических компонентов, необходимых для диагностики на основе CRISPR7, рекомендации по проектированию 1 и составы с использованием альтернативных методов изотермической амплификации 2,14,15,16 и ферментов Cas12. В конечном счете, мы надеемся, что диагностика на основе CRISPR может помочь реализовать быстрое, недорогое и чувствительное обнаружение нуклеиновых кислот в условиях, где требуются портативные и неинструментальные анализы 1,9,17.

В основном мы используем комбинацию RPA и детектирования на основе Cas13 в наших протоколах. RPA функционирует при температурах, близких к температуре окружающей среды (37-42 °C), и поэтому имеет низкие требования к энергии и оборудованию. Другие реакции изотермической амплификации требуют более высоких температур (LAMP, 60-65 °C; амплификация смещения цепи (SDA), 60 °C; реакция экспоненциальной амплификации (EXPAR), 55 °C; и геликаз-зависимая амплификация (HDA), 65 °C). Конструкция праймеров RPA также не сложна, в отличие от праймеров LAMP, и может быть расширена до мультиплексного усиления 7,9,14. Несмотря на то, что мультиплексирование более двух целей с помощью RPA на практике затруднено, существуют четкие рекомендации по проектированию мультиплексированных праймеров RPA для минимизации помех18.

В то время как переносимое загрязнение остается большой проблемой в двухступенчатом рабочем процессе, генерируемые ампликоны RPA имеют небольшие размеры и с меньшей вероятностью вызывают переносное загрязнение по сравнению с большими конкатемными ампликонами из LAMP14. Праймеры RPA могут быть спроектированы в соответствии со стандартным руководством14: обычно они имеют длину 25-35 нуклеотидов и температуру плавления от 54 до 67 °C. Размер ампликона должен быть меньше 200 пар оснований. Фермент обратной транскриптазы (ОТ) может быть добавлен к RPA для обеспечения амплификации из РНК, а при обратной транскрипции-RPA (RT-RPA) другой фермент рибонуклеаза H (РНКаза H) обычно добавляется в небольших количествах, чтобы помочь разрешить полученный гибрид РНК: ДНК и стимулировать реакцию амплификации 5,19. Чтобы обеспечить транскрипцию Т7 для детектирования на основе Cas13, промотор РНК-полимеразы Т7 может быть помещен на 5'-конец прямого праймера RPA.

После того, как ампликоны генерируются из RPA, они могут быть обнаружены с помощью ферментов Cas, запрограммированных crRNA. Среди различных ферментов Cas, которые могут быть использованы для детекции ампликонов, мы отдаем предпочтение вариантам Cas13, нацеленным на РНК, из-за их высокой активности расщепления1 и хорошо охарактеризованных предпочтений в расщеплении полинуклеотидов 7,9, последний из которых может быть использован для мультиплексного детектирования. Последовательность кРНК для Cas13 спроектирована таким образом, чтобы быть комплементарной (обратной) к целевому участку в продуцируемой РНК с помощью спейсера и последовательностей прямого повтора (DR). Последовательность crРНК и праймеры RPA не должны перекрываться, чтобы избежать нежелательного обнаружения побочных продуктов амплификации на основе Cas, что увеличивает фоновые и ложноположительныерезультаты14.

Детектирование на основе Cas основано на различных модальностях детекции для мониторинга расщепления молекул репортерных нуклеиновых кислот (репортеров РНК для реакций на основе Cas13)1,2,14. Различные методы обнаружения включают колориметрию, электрохимическое считывание, флуоресценцию, считывание секвенирования и полоски бокового потока2. Мы сосредоточимся на считывании флуоресценции с учетом различных флуорофоров и репортеров, таких как цианин 5 (Cy5), родамин X (ROX) и карбоксифлуоресцеин (FAM), которые могут эффективно возбуждаться с помощью одного синего светодиодного источника света, а их флуоресценция анализируется с помощью считывателя микропланшетов или термоамплификатора в реальном времени 7,14. Кроме того, считывание флуоресценции легко настраивается и обеспечивает непрерывный мониторинг, что позволяет проводить количественное анализ в режиме реального времени. Мультиплексное предамплификация RPA и мультиплексированное детектирование на основе Cas13 с использованием ферментов Cas могут быть объединены с многоцветными флуоресцентными показаниями для одновременного обнаружения нескольких генетических мишеней 2,7.

В наших протоколах мы сначала изотермически амплифицируем РНК с помощью ОТ-РПА путем добавления образца РНК в лиофилизированную форму реагента ОТ-РПА (рис. 1). Во время ОТ-РПА промотор Т7 добавляется к сгенерированному двухцепочечному ампликону ДНК. После этого продукты RPA переносят на лиофилизированный детектирование на основе Cas13, которое также содержит Т7-РНК-полимеразу. Эта реакция детектирования превращает ампликоны ДНК в РНК (с помощью РНК-полимеразы Т7), которая может быть легко обнаружена с помощью запрограммированной на основе crРНК Cas13. Активированный мишенью Cas13 расщепляет репортерные молекулы для получения обнаруживаемого флуоресцентного сигнала 2,7,14. В то время как приведенные здесь протоколы относятся к обнаружению Leptotrichia wadei (LwaCas13a), они могут быть расширены до одновременного мультиплексного обнаружения до четырех целей с использованием ортогональных ферментов Cas13 и Cas12 7,9. Реакции детектирования на основе RPA и Cas также могут быть объединены в одну пробирку, хотя и с потерейчувствительности14.

figure-introduction-1
Рисунок 1: Рабочий процесс обнаружения на основе CRISPR. Рабочий процесс иллюстрирует обнаружение двух генов-мишеней. Во-первых, области интереса в ДНК-мишени изотермически амплифицируются с помощью RPA; реакция может быть выполнена с обратной транскрипцией (ОТ-РПА) при обнаружении РНК-мишеней. После этого транскрипция Т7 преобразует ампликоны дцДНК в РНК, которые, в свою очередь, распознаются комплексами Cas13-crРНК, способными вызывать активность коллатеральной РНКазы при связывании с мишенью. Расщепление гасших флуоресцентных репортеров генерирует флуоресцентные сигналы, которые можно контролировать с помощью считывателя микропланшетов, визуализировать с помощью светодиодного трансиллюминатора или использовать с помощью термоциклера в реальном времени. Сокращения: CRISPR = сгруппированные регулярно чередующиеся короткие палиндромные повторы; RT = обратная транскрипция; RPA = амплификация рекомбиназной полимеразы; Cas = CRISPR-ассоциированный белок; LED = светодиод. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Ключевыми особенностями представленных здесь протоколов являются предварительное смешивание рецептур для лиофилизации. Предварительное смешивание упрощает использование реакции и повышает воспроизводимость, но многие компоненты детектирования на основе RPA и Cas, особенно обратная транскрипция, и некоторые лабильные кофакторы, такие как АТФ, нестабильны в растворе. Поэтому мы разрабатываем готовые растворы таким образом, чтобы их можно было лиофилизировать для длительного хранения и удобства транспортировки и развертывания 1,9,20. Предварительно смешанные, лиофилизированные реагенты также помогают повысить чувствительность обнаружения, так как длявосстановления реакции может быть добавлен больший объем образца (и, следовательно, более высокое количество ДНК/РНК). В наших рецептурах мы в основном используем трегалозу21 в качестве криопротектора в лиофилизированных реакциях обнаружения RPA и Cas7. В дополнение к сохранению реагентов, трегалоза также способствует реакциям за счет увеличения стабилизации фермента 16,22,23,24 и снижения температуры плавления дцДНК 23. Исследования других стабилизаторов 5,7,21,25,26 помимо трегалозы могут дать еще более оптимальные составы для различных сценариев использования.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Приготовление лиофилизированных предварительно смешанных реагентов ОТ-РПА

  1. Подготовка оборудования
    1. Подготовьте дьюар с жидким азотом или лоток для мгновенной заморозки реакций. Заполните дьюар или лоток жидким азотом.
    2. Сублимационная сушилка
      1. Проверьте наличие конденсата в дренажных трубках и внутри камеры; При необходимости удалите воду.
      2. Очистите внутреннюю часть камеры и металлический штатив микроцентрифужной пробирки объемом 1,5 мл раствором для обеззараживания РНКазы, а затем 70% этанолом.
      3. Закройте дверцу камеры и клапан сброса вакуума.
      4. Включите сублимационную сушилку.
      5. Вручную установите температуру полки на -30 °C.
    3. Оборудование для молекулярной биологии
      1. С помощью раствора для обеззараживания РНКазы очистите: пипетки, штативы для наконечников для пипеток, вихревой смеситель, миницентрифугу с понижающим вращением и перманентный маркер.
      2. Очистите водой из-под крана, затем протрите чистящей бумагой: пластиковые штативы для микроцентрифужных пробирок и поролоновую коробку для льда.
      3. Подготовьте нагревательный блок (используемый для растворения/ресолюбилизации раствора триглицина), очистив его раствором для обеззараживания РНКазы и 70% этанолом. Затем включите его и установите температуру на 60 °C.
  2. Приготовление предварительно смешанных реакций RPA
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот состав рассчитан на 10 реакций (с использованием трех гранул RPA).
    1. Перед применением проверьте, нет ли в растворе триглицина осадка. Если есть осадок, растворите его путем инкубации при 60 °C и тщательного перемешивания перед использованием. Охладите раствор триглицина перед добавлением других термочувствительных реагентов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Осадки могут легко образоваться, если оставить трубку при комнатной температуре в течение длительного времени.
    2. Извлеките из морозильной камеры три трубки с пеллетами RPA; Постучайте по полосковым трубкам, осторожно постучав ими по лабораторному столу, чтобы выбить белые гранулы.
    3. Переложите все три гранулы в микроцентрифужную пробирку А объемом 1,5 мл.
    4. Пипеткой с помощью пипетки в 25 мкл воды, не содержащей нуклеаз, смыть оставшийся порошок RPA в полосковых пробирках и перенести раствор для полоскания в новую микроцентрифужную пробирку B объемом 1,5 мл.
    5. Добавьте 10 мкл 0,57 М раствора триглицина и 10 мкл праймерной смеси (по 10 мкМ каждая) в пробирку мастермикса B.
    6. Вихревая микс-трубка В; Затем открутите вниз и поставьте трубку на лед.
    7. Добавьте 28,4 мкл 5x RPA буфера (полученного из 500 мкл 50% (w/v) PEG20000, 250 мкл 1 М Tris pH 7,4 и 100 мкл 100 мл 100 мМ дитиотреитола (DTT)) в пробирку master mix B и тщательно перемешайте путем сильного постукивания или многократного встряхивания.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мы готовим раствор таким образом, чтобы помочь разбавить/уменьшить вязкость PEG в пробирке mastermix, прежде чем добавлять все для растворения гранул RPA.
    8. Перенесите гранулы, собранные в пробирке А, с шага 1.2.3 в пробирку мастермикс В, а затем несколько раз переверните пробирку мастермикса для смешивания. Посмотрите, выглядит ли раствор однородным и однофазным (он также будет выглядеть слегка непрозрачным), а затем поместите пробирку на лед.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если перемешивание не является тщательным, ПЭГ может привести к разделению раствора/суспензии на фазы.
    9. Добавьте 0,71 μL 200 Unit/μL RT и 2,84 μL 5 Unit/μL RNase H в пробирку мастермикса. Осторожно постукивайте или переворачивайте трубку mastermix вверх и вниз много раз. Открутите вниз и поставьте трубку на лед.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мы добавляем эти ферменты после интенсивного смешивания на более ранних стадиях, поскольку RT и РНКаза H чувствительны к сдвигу из-за смешивания; После добавления РТ/РНКазы H больше нет вортекса.
    10. Разогнать 8,4 мкл раствора мастермикса на 10 предварительно охлажденных 1,5 мл пробирок и поместить пробирки на лед. Для этого погрузите наконечник пипетки в раствор mastermix и медленно и медленно втягивайте раствор mastermix в наконечник, чтобы предотвратить образование пузырьков воздуха и обеспечить точное измерение объема. Раздайте раствор mastermix в предварительно охлажденную пробирку объемом 1,5 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: По нашему опыту, при использовании аликвотирования 8,4 мкл в пробирке мастермикса останется ~1-2 мкл суспензии. Экспериментатор может немного уменьшить объем аликвотирования, чтобы обеспечить достаточное количество реагентов для всех 10 реакций. Используйте правильные методы пипетирования при работе с вязкими растворами.
    11. После завершения аликвотирования поместите пробирки в металлическую решетку, погруженную в жидкий азот, чтобы подготовить их к лиофилизации. Дайте трубкам погрузиться в жидкий азот на 5 минут.
      Примечание: Поскольку лиофилизация удаляет избыток раствора, она позволяет нам добавить больше ДНК/РНК, что помогает повысить чувствительность. Лиофилизированные предварительно смешанные реакции RPA могут храниться при температуре -20 °C в течение 8 месяцев. Лиофилизация помогает добиться воспроизводимости, если данный эксперимент выполняется с использованием мастермиксов RPA, приготовленных в одной партии, поэтому создание большей партии также помогает.
  3. Лиофилизация
    1. В сублимационной сушилке проверьте температуру коллектора и полки. При необходимости дождитесь, когда температура коллектора достигнет -75 ± 5 °C, а температура полки достигнет -30 ± 1 °C.
    2. Накройте открытые пробирки в металлической решетке листом чистящей бумаги, поместите металлическую решетку вместе с открытыми пробирками на полку сублимационной сушилки и закройте дверцу полки.
    3. Выберите программу, показанную в таблице 1 , и нажмите кнопку «Пуск». После 30 минут вторичной стадии сушки (20 °C, <0,1 мбар; температура поддерживается бесконечно, устанавливая время шага в положение «бесконечно»), нажмите кнопку «стоп » программы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мы даем трубкам прогреться в сублимационной сушилке, чтобы предотвратить конденсацию воды.
    4. Сбросьте давление, открыв клапан вакуумного выпуска, затем снимите решетку с полки. Немедленно закройте пробирки крышкой и храните лиофилизированные реакции при температуре -20 °C.
      Лиофилизированные реакции RPA и CRISPR-Cas13a могут храниться при температуре -20 °C в течение 8 месяцев.

2. Приготовление лиофилизированных реагентов для детектирования CRISPR-Cas13a

ПРИМЕЧАНИЕ: Следуйте шагу 1.1 для подготовки оборудования.

  1. Премиксованное реакционное приготовление CRISPR-Cas13a (10 реакций)
    1. Извлеките из хранилища следующие элементы и положите их на лед: 10 мкл LwaCas13a (собственного производства 7,8,14) (2 мг/мл), буфер для хранения Cas, 10 нг/мкл (225 нМ) кРНК, 25 мМ рNTP, 50 ед/мкл РНК-полимеразы T7, 2 мкМ флуоресцентного репортера FAT.
    2. Готовьте рабочий раствор LwaCas13a в концентрации 126 мкг/мл (900 нМ) путем добавления 148,8 мкл буфера для хранения Cas (50 мМ Tris-HCl pH 7,4, 0,6 М NaCl, 5% глицерина, 2 мМ DTT) в 10 мкл 2 мг/мл LwaCas13a.
    3. Приготовьте реакцию мастермикса CRISPR-Cas13a следующим образом: 71 мкл воды, не содержащей РНКазы, 20 мкл 400 мМ Tris pH 7,4, 20 мкл 60% (w/v) трегалозы, 10 мкл 10 нг/л (225 нМ) crRNA (в данном случае нацелены на s и n гены SARS-CoV-2), 8 мкл 100 мМ смеси rNTP (по 25 мМ каждая), 6 мкл 50 ЕД/мкл РНК-полимеразы T7 РНК, 25 мкл флуоресцентного репортера FAM 2 мкМ и 10 мкл 126 мкг/мл (900 нМ) LwaCas13a. Хорошо перемешайте, перевернув трубку mastermix; Затем поверните вниз.
    4. Аликвотировать 17 мкл мастермикса в 10 пробирок по 1,5 мл поместить на лед. Поместите пробирки в решетку, погруженную в жидкий азот, и дайте пробиркам погрузиться в жидкий азот на 5 минут.
  2. Лиофилизация
    1. В сублимационной сушилке проверьте температуру коллектора и полки и дождитесь, пока температура коллектора достигнет -75 ± 5 °C, а температура полки достигнет -30 ± 1 °C.
    2. Поместите пробирки в сублимационную сушилку. Выберите программу, показанную в таблице 1 , и нажмите кнопку «Пуск». Через 30 минут после вторичной стадии сушки (25 °C, <0,1 мбар; температура поддерживается бесконечно, устанавливая время шага в положение «бесконечно»), остановите программу.
    3. Сбросьте давление, открыв клапан вакуумного выпуска, и снимите решетку с полки. Немедленно закройте пробирки крышкой и храните лиофилизированные реакции при температуре -20 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Лиофилизированные реагенты RPA и CRISPR-Cas13a можно хранить при температуре -20 °C в течение 8 месяцев.

3. Амплификация нуклеиновых кислот ОТ-РПА

ПРИМЕЧАНИЕ: Для предотвращения перекрестного загрязнения рабочие места и пипетки должны быть разделены для предварительной амплификации, добавления проб и последующей амплификации. Мы рекомендуем использовать отфильтрованные наконечники для пипетки.

  1. Разогрейте термовстряхивающий инкубатор до 42 °C.
  2. Добавьте 1 мкл раствора ацетата магния (Mg(OAc)2) и ацетата калия (KOAc) (состоящего из 196 мМ Mg(OAc)2 и 1,5 М KOAc) на боковую сторону пробирки, содержащей лиофилизированную, предварительно смешанную гранулу RT-RPA (из раздела 1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Хитрость при добавлении смеси Mg(OAc)2 и KOAc: капля должна быть помещена примерно на отметку объема 1 мл пробирки. В этом случае капля будет хорошо видна и вряд ли будет потеряна из-за закрытия трубки или других действий. Усиление начнется после вращения вниз, чтобы собрать каплю на дне трубки. При одновременной обработке более одной реакции амплификация может быть инициирована одновременно.
  3. Ресуспендирование гранулы ОТ-РПА путем добавления 12,4 мкл образца РНК (или контрольных образцов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Последовательность добавления: отрицательный образец/отрицательный контроль, тестируемая РНК/ДНК, положительный образец/положительный контроль.
  4. Чтобы инициировать реакцию ОТ-РПА, кратковременно уменьшите добавленный раствор из этапов 3.2 и 3.3 с помощью миницентрифуги при комнатной температуре в течение 3 с.
  5. Перемешайте, осторожно постукивая по трубке, а затем сделайте еще одно короткое вращение в течение 3 секунд.
  6. Инкубируйте реакцию при 42 °C в течение 60 минут, поместив ее в предварительно нагретый нагревательный блок или термовстряхивающий инкубатор.
  7. После окончания реакции извлеките реакционные пробирки и положите их на лед, прежде чем перейти к этапу детектирования CRISPR-Cas (раздел 4).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Продукт, усиленный RPA, может быть использован в реакции детектирования немедленно или может храниться при температуре 4 °C в течение нескольких дней или при -20 °C в течение нескольких месяцев.

4. Обнаружение нуклеиновых кислот CRISPR-Cas13

  1. Включите флуоресцентный считыватель микропланшетов, установите и нагрейте температуру нагрева до 37 °C и выберите программу, указанную в таблице 2.
  2. Положите на лед планшет на 384 лунки.
  3. Ресуспендированную реакцию детектирования лиофилизированного CRISPR-Cas (из раздела 2) путем добавления 17 мкл 8 мМ раствора хлорида магния. Перемешайте, осторожно постукивая по трубке; Затем кратковременно поверните вниз в течение 3 с и поместите трубку на лед.
  4. Перенесите 18 μL реактивной суспензионной смеси в каждую лунку предварительно охлажденного 384-луночного планшета на льду.
  5. Добавьте 2 мкл продукта RPA, приготовленного в разделе 3, в каждую реакционную лунку.
  6. Снимите пластину со льда, быстро поместите ее в предварительно нагретый флуоресцентный считыватель микропланшетов и нажмите «Пуск».
    Примечание: 384-луночный планшет был помещен на лед для обеспечения синхронизации инициации реакции, когда 384-луночный планшет переносится в предварительно нагретый флуоресцентный микропланшетный считыватель.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы освещаем кинетику генерации флуоресцентного сигнала FAM при совместном обнаружении s и n генов SARS-CoV-2, а также то, как эта информация была использована для определения оптимальных условий для лиофилизированных, предварительно смешанных реакционных составов. Во всех случаях мы включили образцы со значениями Ct в пределах определенного предела обнаружения (LoD) (Ct ~31-33), а также образцы с Ct в LoD (Ct ~35-37)7, чтобы обеспечить дифференциацию протоколов с лучшей чувствительностью.

Для лиофилизированных, предварительно смешанных ОТ-РПА мы обнаружили, что включение КОАк в предварительно смешанную реакцию отрицательно влияет на чувствительность реакции (рис. 2А). Поэтому мы исключили KOAc из предварительно смешанной реакции и добавили его с инициатором реакции, Mg(OAc)2, после добавления образца РНК. Мы также использовали аналогичные анализы для определения оптимальной концентрации криопротектора трегалозы (рис. 2B) и эффектов триглицина7 в лиофилизированной реакции RT-RPA (рис. 2C). Таким образом, оптимальные лиофилизированные, предварительно смешанные реакции ОТ-РПА получали с 6% трегалозой, без КОАк (но он был добавлен позже после образца РНК), и добавляли триглицин, как описано в разделе 1 протокола.

figure-results-1
Рисунок 2: Оптимизация лиофилизированных, предварительно смешанных реакций ОТ-РПА. Реакцию ОТ-РПА готовили с использованием праймеров, нацеленных на ген n SAR-CoV-2. Mg(OAc)2 был исключен из всех предварительно смешанных реакций. Оценивали эффекты (А) КОАс, (В) трегалозы и (С) триглицина, добавленных в предварительно смешанные реакции. Мониторинг реакции с помощью сгенерированной флуоресценции FAM проводили с помощью термоамплификатора в реальном времени или считывателя флуоресцентных микропланшетов. Приведены отдельные данные, полученные в результате трехкратных измерений. Сокращения: RT = обратная транскрипция; RPA = амплификация рекомбиназной полимеразы; CRISPR = сгруппированные регулярно чередующиеся короткие палиндромные повторы; Cas = CRISPR-ассоциированный белок; SAR-CoV-2 = коронавирус тяжелого острого респираторного синдрома 2; Ct = порог цикла; FAM = карбоксифлуоресцеин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Для лиофилизированных, предварительно смешанных реакций на основе Cas13a мы проверили важность наличия правильного криопротектора: либо 6% трегалозы, либо 2% сахарозы19 работали хорошо, в то время как более низкое содержание сахарозы на уровне 1% или 5% по массе PEG20000 не сохраняло эффективность реакции после лиофилизации (рис. 3). MgCl2 отсутствовал во всех реакциях и добавлялся на стадии регидратации. Оптимальную реакцию детектирования на основе лиофилизированного Cas13 готовили с 6% трегалозой, как показано в разделе 2 протокола.

figure-results-2
Рисунок 3: Оптимизация лиофилизированных, предварительно смешанных реакций детектирования на основе Cas13. Реакцию детектирования проводили при 37 °C с использованием продукта RPA из гена SARS-CoV-2 n. Тесты проводились до и после лиофилизации. MgCl2 был исключен из всех предварительно смешанных реакций. Оценивались способности (А) трегалозы, (В) PEG20000 и (С) сахарозы в сохранении эффективности реакции после лиофилизации. Мониторинг реакции с помощью сгенерированной флуоресценции FAM осуществлялся с помощью термоамплификатора в реальном времени. Приведены индивидуальные данные из тройных измерений для условий «после лиофилизации» и одна репликация из условий «до лиофилизации». Рисунок 3A,B взят из Patchsung et al.7. Сокращения: RPA = амплификация рекомбиназной полимеразы; SAR-CoV-2 = коронавирус тяжелого острого респираторного синдрома 2; FAM = карбоксифлуоресцеин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Лиофилизированные, предварительно смешанные реагенты для реакций на основе ОТ-RPA и Cas13 стабильны при -20 °C в течение не менее 8 месяцев [Рисунок 4].

figure-results-3
Рисунок 4: Испытания на стабильность лиофилизированных, предварительно смешанных реагентов RPA и CRISPR-Cas13a при -20 °C. Испытание на стабильность в (А) 30 дней, (В) 45 дней, (В) 3 месяца, (D) 5 месяцев, (Е) 8 месяцев. Приведены отдельные данные, полученные в результате трехкратных измерений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

LoD лиофилизированных реакций на основе RT-RPA и Cas13 для обнаружения генов s и n SARS-CoV-2 представлен на рисунке 5. Кинетика генерации сигналов может быть улучшена при обнаружении двух генов по сравнению с обнаружением только одного гена.

figure-results-4
Рисунок 5: Аналитическая чувствительность детектирования одного гена и детектирования двух генов. (A) LoD лиофилизированного синглплексного RT-RPA и детектирования на основе Cas, нацеленного на s-ген SAR-CoV-2. (B) LoD лиофилизированной одиночной детекции RT-RPA и Cas-based detection, нацеленной на n ген SAR-CoV-2. (C) LoD лиофилизированной мультиплексной RT-RPA и двойной детекции на основе Cas, нацеленной на гены s и n . LoD определяли с помощью серийно разбавленных РНК SARS-CoV-2, значенияCt которых определяли с помощью анализа RT-qPCR, нацеленного на ген n . Приведены отдельные данные 3-6 повторных измерений. Сокращения: LoD = предел обнаружения; RT = обратная транскрипция; RPA = амплификация рекомбиназной полимеразы; CRISPR = сгруппированные регулярно чередующиеся короткие палиндромные повторы; Cas = CRISPR-ассоциированный белок; SAR-CoV-2 = коронавирус тяжелого острого респираторного синдрома 2; Ct = порог цикла; кПЦР = количественная полимеразная цепная реакция. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Помимо обнаружения вирусов, мы демонстрируем прототип инструмента генотипирования POC на основе диагностики CRISPR, который помогает идентифицировать ядовитые виды змей, эндемичные для Таиланда (рис. 6). Более быстрая и точная идентификация видов змей с помощью образцов ДНК, собранных из ран от укусов, может помочь в быстром введении противоядий, повышая шансы пациента на выживание. Мы нацелились на участки в гене митохондриального цитохрома b (cytb) восьми видов змей, включая Ophiophagus hannah (королевская кобра) (рисунок 6A), и показали, что обнаружение синтетических суррогатов ДНК гена cytb O. hannah может достигать аттомолярного уровня чувствительности (рисунок 6B, C).

figure-results-5
Рисунок 6: Прототип обнаружения на основе CRISPR для идентификации видов змей по отравлению змеиными укусами. (A) Праймеры RPA и дизайн crRNA LwaCas13a для обнаружения гена cytb Ophiophagus hannah. Промотор Т7 (свес Т7) был размещен на 5' конце переднего капсюля РПА. (B) Кинетика генерации сигнала FAM в течение 60 мин и (C) флуоресценция FAM в конечной точке от LwaCas13a-опосредованного обнаружения синтетических входов дцДНК, соответствующих сегментам гена cytb у O. hannah. Использовались различные входные концентрации (0, 10-9, 10-12, 10-15 и 10-18 М). Данные представляют собой среднее значение ± с.д. от трех измерений. Сокращения: RPA = амплификация рекомбиназной полимеразы; CRISPR = сгруппированные регулярно чередующиеся короткие палиндромные повторы; Cas = CRISPR-ассоциированный белок; FAM = карбоксифлуоресцеин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Лиофилизация предварительно смешанных реагентов для детектирования CRISPR-Cas13a
ШагСкорость нарастанияТемпература на шельфеВремя (чч:мм)Пылесос
(°C/мин)(°C)(мбар)
Заморозка 13-30от-
Сухой 13-30от0
Сухой 23401:000
Сухой 3320∞0

Таблица 1: Настройки лиофилизатора предварительно смешанных реагентов для детектирования RT-RPA и CRISPR-Cas13a. Сокращения: RT = обратная транскрипция; RPA = амплификация рекомбиназной полимеразы; CRISPR = сгруппированные регулярно чередующиеся короткие палиндромные повторы; Cas = CRISPR-ассоциированный белок.

ПараметрОправа
Температура37 °C
Кинетический циклПродолжительность02:00 (мм:сс)
Интервальное время02:30 (мм:сс)
ТряскаПродолжительность1 сек
РежимЛинейный
Амплитуда1 мм
Интенсивность флуоресценцииДлина волны возбуждения488 нм
Длина волны излучения520 нм
РежимВверх
Z-позиция24470
Прибыль71
Время интеграции20 мкс
Количество вспышек25

Таблица 2: Программа чтения флуоресцентных микропланшетов для обнаружения нуклеиновых кислот.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом протоколе есть критически важные шаги. Для сегрегации областей рекомендуется использовать отдельные пространства для экстракции нуклеиновых кислот, приготовления мастермикса (зона предварительной амплификации), добавления образца и детекции ампликонов (зона после амплификации). Каждый участок должен быть настроен с помощью отдельного набора инструментов и оборудования. Не переносите инструменты из одной области в другую, особенно из зоны после усиления в зону предварительного усиления. Необходимо провести очистку рабочих зон: очистить рабочие зоны, пипетки, вихревые аппараты и перманентные маркеры раствором для обеззараживания РНКазы/ДНКазы/3% Clorox с последующим добавлением 70% этанола или автоклавной деионизированной воды. Требуется мытье базовой лабораторной посуды и съемных частей инструментов, таких как пластиковые штативы для пробирок объемом 1,5 мл и адаптер ротора миницентрифуги. Вода, не содержащая нуклеазы, используется в качестве отрицательного контроля и компонента реакции, и, таким образом, является чувствительным реагентом, который может быть загрязнен при неосторожном обращении. Поэтому мы рекомендуем делать небольшие аликвоты воды, которые можно использовать только один раз.

Всегда проводите отрицательную контрольную реакцию с использованием праймеров для анализа на загрязнение. Кроме того, чтобы избежать проблем с загрязнением, мы рекомендуем готовить реакцию отрицательного контроля, добавляя воду без нуклеазы в зону предварительной амплификации, а не в комнату добавления пробы. Смесь ацетата магния и ацетата калия следует аликвотировать в небольших объемах (~20 мкл/пробирка), которые используются только один раз, чтобы избежать загрязнения реагента уносящими ампликонами. При добавлении смеси ацетата магния и калия в лиофилизированные реакции премикса RPA мы рекомендуем каждый раз менять наконечник пипетки. Для рабочего процесса экспериментов он должен быть однонаправленным, от экспериментов до экспериментов после усиления. Переходите от «более чистых» (до усиления) рабочих мест к «более грязным» (после усиления).

Для модификации и устранения неполадок в методе, чтобы избежать переноса загрязнения ампликонов, мы рекомендуем пространственно разделить три основных этапа эксперимента: подготовка реакции RPA; добавление проб; а также этапы усиления и обнаружения. Мастермикс должен быть приготовлен в свободной от шаблонов зоне лаборатории. При переодевании также меняйте перчатки и халаты. Работайте в одном направлении от предварительного до последующего усиления. Избегайте использования одной и той же пипетки для разных этапов. Лучше всего, если для этих этапов будут располагаться разные наборы пипеток: приготовление мастермиксов; добавление матричной ДНК/РНК; и передача усиленного продукта. Используйте отфильтрованные наконечники, старайтесь максимально предотвратить образование аэрозоля и избегайте прикосновения к внутренней части трубки при ее открытии. Если эксперименты по амплификации показывают загрязнение, все реактивы следует заменить. Если возможно, обратитесь в другую лабораторию со свежими реагентами и проверьте, сохраняется ли загрязнение. Кроме реагентов, не берите с собой ничего другого, включая пипетки. Попробуйте автоклавировать пипетки, если они автоклавируемы.

Чтобы улучшить скорость амплификации (оптимизация анализа), сначала обратитесь к инструкциям производителя, таким как руководство RPA от TwistDx, чтобы убедиться в оптимальных конструкциях. Затем попробуйте провести эмпирическую оптимизацию реакций, например, добавить реакционные добавки, которые, как известно, усиливают реакции RPA и CRISPR7; увеличение времени реакции (например, время реакции RPA до 60 мин); или различные последовательности праймеров и концентрации. Мы также рекомендуем добавить как можно больший объем выборки; Использование лиофилизированных реагентов позволяет увеличить объем образца. Чтобы уменьшить фоновую флуоресценцию, можно выполнить этап инактивации тепла (75 °C в течение 5 минут) после окончания RPA, прежде чем переходить к обнаружению, или оптимизировать концентрацию репортера. Слишком много репортеров даст более высокий бэкграунд. Кроме того, добавление ингибиторов РНКазы помогает предотвратить Cas-независимую деградацию репортера.

Помимо оптимизации условий реакций на основе (RT)-RPA и CRISPR и процедур их обработки, необходимо убедиться в том, что используемые реагенты имеют хорошее качество, а этап экстракции нуклеиновых кислот, предшествующий всем реакциям, является успешным. Лиофилизированные реагенты обеспечивают высокую чувствительность обнаружения, портативны, позволяют проводить POC-тестирование и могут применяться к различным клиническим образцам. Кроме того, лиофилизированный (RT)-RPA может быть мгновенно регидратирован путем добавления экстракта нуклеиновой кислоты из клинических образцов. Предыдущее исследование показало более высокую чувствительность при введении большего объема нуклеиновой кислоты без ограничения объема, что эффективно увеличивает общее количество целевой нуклеиновой кислоты.

Диагностика на основе CRISPR была адаптирована для обнаружения патогенов путем сбора клинических образцов, таких как мазки из носоглотки и горла, моча и сыворотка 7,8,11. Он также применяется для различения однонуклеотидных вариантов, идентификации генов устойчивости к антибиотикам у устойчивых к противомикробным препаратам организмов и обнаружения мутаций, связанных с раком. Полезность этой технологии может быть наибольшей в полевых приложениях, где инженерные биохимические реакции для изотермической амплификации и детектирования на основе CRISPR могут сочетаться с готовыми к использованию устройствами и считываниями, такими как портативный флуориметр или полоски бокового потока.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

M.P. и C.U. подали заявку на патент в Таиланде на препараты для мультиплексного детектирования РНК SARS-CoV-2. Р.К. не заявляет о каких-либо конкурирующих интересах.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C.U. выражает признательность за финансирование от Сиамского коммерческого банка в рамках Центра пограничных исследований VISTEC-Siriraj и от Таиландского научного исследования и инноваций (TSRI), фундаментальный фонд, 2024 финансовый год, номер гранта FRB670026/0457. Р.К. и М.. получают стипендию и стипендию от VISTEC соответственно.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
<сильно>Материал
Раствор бетаинаSigma-AldrichB0300-1VL
DEPC-Обработанная водаInvitrogenAM9915G
дитиотреитолом (DTT)Merck3870-25GM
EpiScript обратная транскриптазаLucigenERT12925K
Gly-Gly-Gly& НБСП;Sigma-AldrichSIA-50239-1G
LwaCas13aСобственное производствоНазвание штамма: Leptotrichia wadei, Сокращение: Lwa, Название белка: LwaCas13a
Раствор хлорида магния, 1MSigma-AldrichM1028-10X1ML
NxGenT7 РНК-полимеразаLucigen30223-2
Поли(этиленгликоль)Sigma-Aldrich81300-1KG
Раствор ацетата калия, 5МSigma-Aldrich95843-100ML-F
Смесь растворов риобнуклеотидов NEBN0466L
РНКаза HNEBM0297L
СахарозаTCI TCI-S0111-500G
Дигидрат трегалозыSigma-AldrichSIA-90210-50G
раствор тризмы гидрохлорида, 1М, pH 7.4Sigma-AldrichT2194-100ML
TwistAmp Базовый комплект TwistDxTABAS03KIT
Equipment
BluPAD Dual LED Трансиллюминатор Синий/Белый светBio-HelixBP001CU
Сухая ванна Dual BlockELITE4-2-EL-02-220Модель: EL-02
Флуоресцентная микропластина СчитывательTecan30050303Модель:
Сублимационная сушилкаLABCONCO794001030FreeZone Triad Настольная сублимационная сушилка
Микропластина 384-луночныйGreinerGDE0784076F-Bottom, малый объем, Hibase, Med. Binding, черный
Термоамплификатор в реальном времени (система CFX Connect Real-Time PCR)Bio-Rad185-5201Модель: модуль оптики
CFX ConnectOligonucleotide
s-gene forward RPA primerIDTGAAATTAATACGACTCAC
TATAGGGAGGTTTCAAAC
TTTACTTGCTTTACATAGA
s-gene reverse RPA primerIDTTCCTAGGTTGAAGA
TAACCCACATAATAAG
n-gene forward RPA primerIDTGAAATTAATACGACTC
ACTATAGGAACTTCTC
CTGCTAGAATGGCTG
n-ген обратный RPA праймерIDTCAGACATTTTGCTC
AAGCTGGTTCAATC
LwaCas13a-crRNA для s генаSynthegoGAUUUAGACUACCCCAAAAAAC
GAAGGGGACUAAAAACGCA
CCAGCUGUCCAACCUGAAGAAG
LwaCas13a-crRNA для n генаSynthegoGAUUUAGACUACCCCAAAAAACG
AAGGGGACUAAAAAAAGCA
AGCAGCAUCACCGCCAUUGC
FAM-polyU-IABkFQ reporterIDT56-FAM/rUrUrUrU/3IABkFQ
O-hannah_cytb_F RPA PRIMERIDTGAAATTAATACGACTA
TAGGGTACGGATGAACCATA
CAAAACCTTCACGCAATCG
O-hannah_cytb_R RPA праймерIDTAAGATCCATAGTAGATTC
CTCGTGCGATGTGGATA
synT7crRNA13a_ O_hannah IDTGCGCATCCATATTCTTCAT
CTGCATTTAGTTTTAGTCC
CCTTCGTTTGGGGTA
GTCTAAATCCCCTATAGT
GAGTCGTATTAATTTC
Infinite 200 Pro

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gootenberg, J. S., et al. Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science. 356 (6336), 438-442 (2017).
  2. Kaminski, M. M., Abudayyeh, O. O., Gootenberg, J. S., Zhang, F., Collins, J. J. CRISPR-based diagnostics. Nat Biomed Eng. 5 (7), 643-656 (2021).
  3. Makarova, K. S., Koonin, E. V. Annotation and classification of CRISPR-Cas systems. Methods Mol Biol. (1311), 47-75 (2015).
  4. Chen, J. S., et al. CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity. Science. 360 (6387), 436-439 (2018).
  5. Arizti-Sanz, J., et al. Simplified Cas13-based assays for the fast identification of SARS-CoV-2 and its variants. Nat Biomed Eng. 6 (8), 932-943 (2022).
  6. Broughton, J. P., et al. CRISPR-Cas12-based detection of SARS-CoV-2. Nat Biotechnol. 38 (7), 870-874 (2020).
  7. Patchsung, M., et al. A multiplexed Cas13-based assay with point-of-care attributes for simultaneous COVID-19 diagnosis and variant surveillance. CRISPR J. 6 (2), 99-115 (2023).
  8. Patchsung, M., et al. Clinical validation of a Cas13-based assay for the detection of SARS-CoV-2 RNA. Nat Biomed Eng. 4 (12), 1140-1149 (2020).
  9. Gootenberg, J. S., et al. Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6. Science. 360 (6387), 439-444 (2018).
  10. Lee, R. A., et al. Ultrasensitive CRISPR-based diagnostic for field-applicable detection of Plasmodium species in symptomatic and asymptomatic malaria. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (41), 25722-25731 (2020).
  11. Myhrvold, C., et al. Field-deployable viral diagnostics using CRISPR-Cas13. Science. 360 (6387), 444-448 (2018).
  12. Wu, H., et al. Versatile detection with CRISPR/Cas system from applications to challenges. Trends Analyt Chem. 135, 116150(2021).
  13. Yao, R., et al. CRISPR-Cas13a-based detection for bovine viral diarrhea virus. Front Vet Sci. 8, 603919(2021).
  14. Kellner, M. J., Koob, J. G., Gootenberg, J. S., Abudayyeh, O. O., Zhang, F. SHERLOCK: nucleic acid detection with CRISPR nucleases. Nat Protoc. 14 (10), 2986-3012 (2019).
  15. Selvam, K., et al. RT-LAMP CRISPR-Cas12/13-based SARS-CoV-2 detection methods. Diagnostics (Basel). 11 (9), 1646(2021).
  16. Carter, C., Akrami, K., Hall, D., Smith, D., Aronoff-Spencer, E. Lyophilized visually readable loop-mediated isothermal reverse transcriptase nucleic acid amplification test for detection Ebola Zaire RNA. J Virol Methods. 244, 32-38 (2017).
  17. Bhardwaj, P., Kant, R., Behera, S. P., Dwivedi, G. R., Singh, R. Next-generation diagnostic with CRISPR/Cas: Beyond nucleic acid detection. Int J Mol Sci. 23 (11), 6052(2022).
  18. Twistamp. Twistamp® assay design manual. , (2023).
  19. Qian, J., et al. An enhanced isothermal amplification assay for viral detection. Nat Commun. 11 (1), 5920(2020).
  20. Ghouneimy, A., Mahas, A., Marsic, T., Aman, R., Mahfouz, M. CRISPR-based diagnostics: Challenges and toward point-of-care applications. ACSSynth Biol. 12 (1), 1-16 (2023).
  21. Jones, K. L., Drane, D., Gowans, E. J. Long-term storage of DNA-free RNA for use in vaccine studies. Biotechniques. 43 (5), 675-681 (2007).
  22. Fang, X., et al. Real-time monitoring of strand-displacement DNA amplification by a contactless electrochemical microsystem using interdigitated electrodes. Lab Chip. 12 (17), 3190-3196 (2012).
  23. Mok, E., Wee, E., Wang, Y., Trau, M. Comprehensive evaluation of molecular enhancers of the isothermal exponential amplification reaction. Sci Rep. 6 (1), 37837(2016).
  24. Wan, J., et al. Development of a test kit for visual loop-mediated isothermal amplification of Salmonella in spiked ready-to-eat fruits and vegetables. J Microbiol Methods. 169, 105830(2020).
  25. Curti, L. A., et al. Evaluation of a lyophilized CRISPR-Cas12 assay for a ensitive, specific, and rapid detection of SARS-CoV-2. Viruses. 13 (3), 420(2021).
  26. Joung, J., et al. Detection of SARS-CoV-2 with SHERLOCK one-pot testing. N Engl J Med. 383 (15), 1492-1494 (2020).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

CRISPRCas13a

Похожие статьи