Методическая статья

Оптимизация метода окклюзии средней мозговой артерии Лонга для полной реперфузии

DOI:

10.3791/66720

⸱

22 ноября 2024 г.

 ,  , 
1Department of Histology and Embryology, University of Zagreb School of Medicine, 2Croatian institute for brain research, University of Zagreb School of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол представляет собой пошаговое руководство для исследователей по выполнению процедуры окклюзии средней мозговой артерии у мышей с использованием модифицированного метода наружной сонной артерии Лонга. Модификации, представленные в данной статье, направлены на повышение точности окклюзии средней мозговой артерии и обеспечение полной реперфузии.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Модель окклюзии средней мозговой артерии служит основной животной моделью для изучения ишемического инсульта. Несмотря на то, что он используется в исследованиях уже более трех десятилетий, его стандартизация остается недостаточной. Процедура, проводимая преимущественно на крысах и мышах, сопряжена с трудностями из-за более мелкого и хрупкого характера мышей. В отличие от метода общей сонной артерии Коидзуми, наружная сонная артерия Лонга является единственной моделью удара внутрипросветной нити, обеспечивающей полную реперфузию после ишемии. Этот аспект имеет решающее значение для исследований, изучающих феномены реперфузии. Представленные в статье хирургические модификации обеспечивают непрерывный кровоток из общей сонной артерии на протяжении всей ишемической фазы и после начала реперфузии. Целью этих модификаций является селективная окклюзия средней мозговой артерии путем поддержания непрерывности перфузии в ветвях, проксимальных к средней мозговой артерии в период ишемии. Кроме того, начало реперфузии является внезапным и может быть точно контролируемо, что позволяет более точно моделировать эндоваскулярную тромбэктомию в медицине человека. Наша цель в представлении этой всеобъемлющей видеостатьи состоит в том, чтобы облегчить обучение новых хирургов и способствовать стандартизации хирургических процедур в научном сообществе.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Инсульт занимает второе место среди основных причин смерти и третье место среди причин смерти и инвалидности вместе взятых1. По своей причине инсульт может быть ишемическим или геморрагическим, при этом ишемический инсульт значительно чаще встречается в клинической практике. Ишемический инсульт возникает из-за закупорки артерии, снабжающей кровью ткани мозга, что приводит к ишемии, гибели клеток и воспалению. С появлением реперфузионных терапий, таких как тромболизис и механическая тромбэктомия, был достигнут большой прогресс в лечении инсульта. Тем не менее, любая реперфузионная терапия сопряжена с риском усугубления состояния пациента, вызывая то, что обычно называют реперфузионным повреждением2. Точный механизм реперфузионного повреждения остается неясным, и выявление потенциальных причин и профилактических мер зависит от доклинических исследований. Для этого решающее значение имеет разработка подходящей животной модели реперфузионного повреждения, которое следует за ишемическим инсультом.

Окклюзия средней мозговой артерии (MCAO) является наиболее часто используемой животной моделью для изучения ишемического инсульта. Он проводится преимущественно на грызунах и имеет множество различных вариантов, описанных в научной литературе на сегодняшний день 3,4. Два основных типа, Коидзуми и Лонга, известные как варианты общей сонной артерии (КЦА) и варианты наружной сонной артерии (ХКА), технически различаются по месту артериотомии для введения нити 5,6. В нашей недавней статье, проведя мониторинг сосудистой перфузии in vivo, мы показали, что только метод Лонга может считаться моделью ишемии/реперфузии мозга7. Процедура включает в себя введение филамента в ECA, его продвижение через ICA, и закрепление его в точке разветвления средней мозговой артерии (MCA), чтобы вызвать ишемию ткани мозга. После заданного периода ишемии удаление нити позволяет провести реперфузию, имитируя транзиторную ишемию головного мозга. После начала инсульта основной переменной исхода, используемой в исследованиях, чаще всего является объем инфарктного поражения, который может быть измерен либо с помощью гистологии ex vivo, либо сканирования мозга in vivo. Проблемы в моделях MCAO связаны с низкой воспроизводимостью, связанной с межвариантными, межоператорными и межсубъектными вариациями, причем последняя представляет собой существенное ограничение в доклинических исследованиях инсульта4.

Более того, инфарктные участки после MCAO у грызунов массивны по сравнению с размером мозга грызуна. Кроме того, задние отделы мозга гиппокампа часто включаются в объем инфаркта, несмотря на то, что эти области в первую очередь зависят от кровотока из задней мозговой артерии (PCA), а не MCA8. Как и в описанных в литературе методах Коидзуми и Лонга, ОСА остается лигированной в течение периода ишемии из-за неполной проходимости Виллисового круга у мышей, что приводит к индукции ишемии в гораздо более широкой области, чем предполагалось 5,6,9. Даже при методах, при которых ОСА вновь открывается или восстанавливается после периода ишемии, обычные 30-60 минут ишемии приводят к необратимому повреждению тканей в областях, не относящихся к МКА10. Кроме того, вопреки ожиданиям, предыдущие исследования показали, что длина силиконового покрытия нити не влияет на размер поражения11. Тем не менее, выбор длины силиконового покрытия нити рассматривался исключительно в моделях с лигированным CCA в период окклюзии.

Целью данного метода была модификация метода Longa MCAO у мышей для обеспечения непрерывного кровотока из ОСА в период ишемии, тем самым повышая селективность МКАО, а также обеспечивая полную реперфузию инфарктированной области после процедуры. Эти модификации могли бы значительно улучшить лонгитюдные исследования, изучающие ишемско-реперфузионное повреждение у мышей, за счет снижения уровня смертности и уменьшения межсубъектной вариативности.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все процедуры обращения с животными были одобрены Комитетом по лицензированию этики Медицинского факультета Университета Загреба и Комитетом по этике для защиты животных, используемых в научных целях Министерства сельского хозяйства Республики Хорватия. Экспериментальные процедуры проводились в соответствии с Законом Хорватии о защите животных (NN 102/17, 32/19), Поправками к Закону о защите животных (NN 37/13) и Руководством по защите животных, используемых в научных целях (NN 55/13), которые соответствуют Европейскому руководству по уходу за лабораторными животными и их использованию (Директива 2010/63/EU).

1. Подготовка животного и поле операции

  1. Поместите животное в нокаут-бокс и введите анестезию, используя 5% объема изофлурана в смеси кислорода и азота (соотношение 1:2).
  2. После визуального осмотра состояния сознания животного и частоты дыхания поднесите его к лабораторным весам и взвесьте.
  3. Проверьте рефлекс, защипнув межпальцевую кожу нижней конечности, чтобы обеспечить надлежащую глубину анестезии.
  4. Расположите животное на нагретом операционном столе и поднесите его нос к маске для анестезии. Установите начальную температуру операционного стола на 36 °C и отрегулируйте ее так, чтобы поддерживать температуру тела животного на уровне 37 °C (измеряется с помощью ректального зонда, вводимого на последующих этапах). На всех последующих этапах регулируйте объемную долю изофлурана, чтобы поддерживать частоту дыхания животного на уровне 100 вдохов/мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все поверхности и материалы, находящиеся в непосредственном контакте с животным, должны быть тщательно продезинфицированы перед процедурой.
  5. Нанесите глазную мазь на глаза животного, чтобы защитить их от обезвоживания и газообразного изофлурана.
  6. Переверните животное на спину и вытяните ему шею, подложив под нее небольшую подушку из хирургической ленты.
  7. Закрепите конечности животного на месте с помощью хирургической ленты. Следите за тем, чтобы не разгибать передние конечности слишком сильно, чтобы случайно не вызвать вывих плечевого сустава.
  8. Смажьте ректальный зонд белым вазелином и введите его в прямую кишку для непрерывного измерения температуры тела. Закрепите зонд на месте вместе с хвостом с помощью хирургической ленты.
  9. Применяйте предоперационную инъекцию физиологического раствора и бупренорфина (0,5 мг/кг) внутрибрюшинно, чтобы животное хорошо гидратировалось и находилось под обезболиванием во время процедуры.
  10. Сбрейте шерсть животного в области шеи с помощью аккумуляторной машинки для стрижки животных. Соберите всю выбритую шерсть с помощью кусочков хирургического скотча. Кроме того, побрейте этот участок бритвой, чтобы полностью освободить его от шерсти.
  11. Выбирайте нить MCAO в зависимости от веса и/или возраста измеряемого животного. Достаньте его из контейнера и положите в чашку Петри на видном месте. Нанесите каплю физиологического раствора на силиконовую часть нити, чтобы она оставалась чистой и не содержала пыли.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Толщину силиконового покрытия нити следует выбирать в соответствии с официальными рекомендациями производителя в случае мыши возрастом 12-16 недель. Кроме того, длина силиконового покрытия должна быть тщательно спланирована заранее, в зависимости от размера зоны полива, которая должна быть перекрыта (см. Обсуждение).
  12. Накройте операционный стол чистой хирургической простыней.
  13. Нанесите каплю Бетадина на выбритую кожу животного. С помощью ватного тампона втирайте дезинфицирующее средство в кожу круговым образом изнутри наружу. После этого проделайте то же самое с помощью ватного тампона, смоченного в этаноле. Повторите этот шаг 3 раза со свежей парой стерильных ватных палочек для каждого повторения.
  14. Нанесите каплю лидокаинового геля на продезинфицированный участок будущего места разреза для местного обезболивания раны.

2. Хирургия индукции ишемии

  1. Сделайте первоначальный надрез на продезинфицированной коже с помощью скальпеля. Сведите к минимуму количество разрезов кожи, чтобы ускорить заживление хирургической раны.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все инструменты должны быть предварительно стерилизованы. Читатель должен обратиться к своим институциональным рекомендациям по использованию стерильных или хирургических перчаток.
  2. С помощью щипцов 7 и 5 типа оторвите поверхностную фасцию и отделите слюнные железы от подлежащих тканей.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда продвигайтесь вперед с закрытыми щипцами и вытягивайте их, отодвинув их в сторону, чтобы отодвинуть ткань. Таким образом, анатомические пространства могут быть пройдены с минимальной травматизацией тканей.
  3. Поместите втягивающее устройство для проволоки в исходное положение, следя за тем, чтобы слюнные железы не мешали последующим шагам.
  4. Удалите глубокую фасцию шеи с помощью щипцов типа 7 и отсоедините грудино-ключично-сосцевидные мышцы от сонной артерии, чтобы переместить ретрактор.
  5. Переместите ретрактор так, чтобы он достигал грудино-ключично-сосцевидных мышц, чтобы обеспечить доступ к сонной артерии.
  6. Резецируйте подъязычную мышцу, чтобы обеспечить четкий визуальный и более легкий доступ к сонной артерии.
  7. Освободите сонную артерию и ее ветви от сонной вены и блуждающего нерва, которые удерживаются вместе в сонной фасции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эту фасцию необходимо удалять осторожно, чтобы не повредить блуждающий нерв и не вызвать значительного кровотечения.
    1. Зажмите сонную фасцию на латеральной стороне триады сонной артерии и осторожно потяните ее в сторону, чтобы визуально идентифицировать артерию, нерв, вену и все окружающие ветви кровеносных сосудов.
    2. Оттягивая фасцию латерально, с помощью щипцов 5-го типа, отделите ОСА от соседнего нерва и вены до точки ветвления и верхней щитовидной вены, которая пересекает ОСА.
    3. Полностью отделите нижнюю часть CCA от подлежащих тканей и фасции с помощью изогнутых щипцов типа 7, убедившись, что она готова к зажиму на последующих этапах.
    4. Действуя краниально в области над точкой ветвления ОСА, разорвите сонную фасцию с помощью двух щипцов.
    5. Аналогичным образом потяните свободный конец сонной фасции медиально и латерально, чтобы точно отделить ЭХА и внутреннюю сонную артерию (ВСА) от фасции и окружающих тканей соответственно.
    6. Освободите ECA и ICA от подлежащих тканей с помощью изогнутых щипцов 7-го типа.
  8. С помощью тщательно подготовленного CCA с двумя соответствующими ветвями поднимите ECA с помощью изогнутых щипцов типа 7 и зажмите его самозакрывающимися щипцами типа N0.
  9. Осторожно опустите самозакрывающиеся щипцы типа N0 на операционный стол.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы изменить положение точки зажима ECA, иногда необходимо слегка ослабить хват и надавить на точку разветвления ECA каудально. На этом этапе важно убедиться, что между зажимом ECA и точкой разветвления остается более 1 мм ECA.
  10. Зажав ECA и надежно удерживая его с помощью пинцета типа N0, введите две плетеные шелковые нити за ECA.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Краниальная нить образует лигационный узел и должна быть размещена краниально от места зажима.
  11. Полностью завяжите черепную нить, так как она постоянна, и отрежьте лишнюю нить ножницами.
  12. Завяжите каудальную нить в свободный фиксирующий узел.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Он должен быть расположен близко к точке разветвления ECA и оставаться свободным, чтобы нить MCAO могла пройти.
  13. С помощью сосудистых микрозажимов зажмите CCA и ICA, чтобы предотвратить кровотечение после артериотомии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Крайне важно убедиться, что микрозажим, нанесенный на ОСА, имеет достаточно прочный захват, поскольку ОСА является пульсирующей артерией с высокой пропускной способностью, и невыполнение этого требования может привести к обильному кровотечению и смерти животного на более поздних стадиях.
  14. С помощью ножниц с микропружинами сделайте небольшую артериотомию прямо под местом зажима ECA.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Артериотомия должна быть достаточно большой, чтобы силиконовая часть нити могла войти внутрь, но не более половины окружности ECA, чтобы не нарушить натяжение, сохраняемое щипцами типа N0.
  15. С углом, совпадающим с углом ЭХА, введите филамент в место артериотомии в проксимальном направлении к ОСА, проходя через свободный фиксирующий узел в месте разветвления ЭХА и вклеиваясь в просвет ОСА вместе с нитью.
  16. Затяните фиксирующий узел вокруг силиконовой части нити накала.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе требуется большая осторожность, так как нить имеет тенденцию выскальзывать из ECA на полпути к последнему маневру, и вставить ее обратно в эту точку очень сложно.
  17. Осторожно откройте микрозажим ICA и извлеките его.
  18. Когда филамент частично вставлен в ECA и закреплен внизу, сделайте полную артериотомию, тем самым освободив культю ECA вместе с филаментом MCAO внутри. На этом этапе отпустите самозакрывающиеся щипцы типа N0 и снимите их.
  19. Одним набором пинцетов типа 5 сильно зажмите культю ЭХА и слегка приподнимите ее. Держась за частично вставленную нить другим щипцом, опустите и осторожно потяните культю ECA, чтобы ориентировать внутренний конец нити в сторону ICA. Ни в коем случае не зажимайте силиконовую часть нити.
  20. С помощью щипцов, удерживающихся за нить, медленно продвигайте нить через ICA к кругу Воли.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Первая точка ветвления ICA также является единственной, где оператор может пропустить нужную точку ветвления MCA. Таким образом, небольшой боковой угол продвижения необходим для направления нити накала к точке разветвления MCA. При небольшом боковом угле продвижения нить изгибается в сторону от крыло-нёбной артерии (ППА) и делает продвигающийся конец более вероятным для входа в виллидисовский круг (рис. 1).

figure-protocol-1
Рисунок 1: Иллюстрация продвижения нити окклюзии средней мозговой артерии за точку ветвления крыловидной артерии. Правильное продвижение нити накала (слева) достигается за счет ориентации нити MCAO таким образом, что она упирается в боковую стенку ICA и изгибается в сторону от точки ветвления PPA. Невыполнение этого требования (справа) может привести к попаданию нити накала внутрь PPA и не вызвать инсульт. В последнем случае нить не сможет продвинуться так далеко, как должна, и хирург должен извлекать нить до тех пор, пока ее конец не станет виден в точке разветвления ICA и не начнет продвигаться снова по нити. Артерии зеленого цвета представляют задние коммуникативные артерии (PcomA), в основном непатентованные у мышей. Создано с помощью BioRender.com. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

  1. Медленно продвигайте нить MCAO по кругу Виллиса до тех пор, пока не почувствуете резкое увеличение сопротивления.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе важно наблюдать за оставшейся длиной нити накала. Нить накала должна без усилий продвигаться на расстоянии не менее 7 мм от точки разветвления ICA у взрослой мыши.
  2. Затяните фиксирующий узел, чтобы нить не сместилась во время ишемии.
  3. Снимите зажим CCA и запишите время.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это знаменует собой начало ишемии.
  4. Упаковать свободный конец нити MCAO в канавку между каротидным треугольником и ипсилатеральной грудино-ключично-сосцевидной мышцей, чтобы она не выступала из операционной раны.
  5. Снимите втягиватель проволоки и приблизьте края операционной раны друг к другу. Дайте месту операции успокоиться на несколько секунд, чтобы ткань вернулась в свое анатомическое положение.
  6. Закройте операционную рану с помощью ленточных застежек, чтобы способствовать более быстрому повторному открытию раны после периода ишемии.
    Примечание: Если исследователь желает дать животному проснуться в период ишемии, рекомендуется наложить швы на рану, чтобы предотвратить преждевременное открытие раны.

3. Период ишемии

  1. Подтвердите успешность операции с помощью МРТ или другого количественного метода измерения перфузии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В случае проведения МРТ перфузионно-взвешенная визуализация (PWI) должна показать критическую ишемию в широкой области MCA, а диффузионно-взвешенная визуализация (DWI) должна очертить участок пониженного кажущегося коэффициента диффузии (ADC) из-за отека клеток.
  2. Поместите животное в чистую клетку до тех пор, пока не закончится период ишемии.

4. Операция по удалению нитей

  1. Примерно за 5 минут до окончания отведенного времени ишемии расположите животное и снова закрепите его на операционном столе.
  2. Снимите затворы с ленты и снова откройте операционную рану с помощью проволочного втягивающего устройства.
  3. Освободите свободный конец нити MCAO от окружающих тканей и концы фиксирующей нити узла.
  4. С помощью щипцов типа N0 сожмите и потяните край культи ECA вентрально, чтобы натянуть ее. Осторожно опустите щипцы вниз, аналогично первой хирургической процедуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Оператор должен избегать защемления фиксирующего узла, так как это сделает так, что узел не сможет развязаться.
  5. Снова зажмите CCA микрососудистым зажимом.
  6. С помощью щипцов типа 5 ослабьте фиксирующий узел, чтобы обеспечить возможность извлечения нити.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Лучший способ начать ослаблять узел - это продолжать сжимать его, пока он не разделится на отдельные части, а затем протолкнуть концы нити к узлу.
  7. Медленно извлекайте нить MCAO до тех пор, пока кремниевая часть не начнет торчать из культи ECA. Слегка затяните фиксирующий узел, чтобы подготовиться к полному извлечению нити.
  8. Находясь близко к силиконовому концу нити, затяните фиксирующий узел так, чтобы он выталкивал нить MCAO и закрывал культю ECA одним маневром. Затяните узел полностью после того, как нить выскользнет наружу.
  9. Откройте и снимите щипцы вместе с зажимом CCA.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это знаменует собой окончание периода ишемии и начало процесса реперфузии.
  10. Снимите втягиватель провода и снова сведите края операционной раны вместе.
  11. Наложите шов на операционную рану, начиная с периферии, полностью закрывая рану без видимых подлежащих тканей.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Количество необходимых швов зависит от размера операционной раны.
  12. Очистите и продезинфицируйте место операции с помощью спиртовых салфеток.

5. Послеоперационный уход

  1. Поместите животное в чистую клетку и дайте ему самопроизвольно проснуться от анестезии.
  2. Поместите гранулированный корм на дно клетки для облегчения доступа. Размягчите пищевые гранулы с помощью питьевой воды. Наполните маленькую чашку Петри питьевой водой и также поставьте ее на пол клетки.
  3. В течение следующих 48 ч вводите 0,25 мл физиологического раствора с бупренорфином (0,5 мг/кг) каждые 24 ч внутрибрюшинно.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Интраоперационная или послеоперационная МРТ, в частности перфузионно-взвешенная визуализация (PWI) и/или диффузионно-взвешенная визуализация (DWI) (Рисунок 2), могут стать окончательным доказательством успешной процедуры. Интраоперационная ПВИ показывает критическую ишемию в ипсилатеральной области МКА, что подтверждает, что установка филамента привела к полной окклюзии. При послеоперационной ПВИ успешной процедуры наблюдается гиперперфузия в центре поражения, а также некоторая степень реперфузии на границах области МКА. Интраоперационные поражения DWI соответствуют наблюдаемым ишемическим областям на интраоперационной PWI. Послеоперационные поражения DWI демонстрируют уменьшение по направлению к ядру ишемического поражения, сопровождающееся значительным снижением видимого коэффициента диффузии поражения, что делает его темнее, чем интраоперационные поражения DWI и окружающая реперфузная ткань мозга. Стандартные анатомические сканирования Т2, как интраоперационные, так и послеоперационные, обычно не показывают ничего примечательного, если только не происходит кровоизлияния, вызванного нитями

(Рисунок 3). В таких случаях сканирование PWI и DWI выявляет неполную ишемию или ее отсутствие.

Процесс реперфузии следует в течение следующих 48 часов, и это подтверждается на МРТ-сканировании, сделанном на второй день после процедуры (Рисунок 2, КБФ на 2-й день). Сканирование PWI показывает полную реперфузию в месте поражения с небольшой гиперперфузией в центре поражения. Сканирование DWI показывает множественные области со сниженными кажущимися коэффициентами диффузии из-за образования отека мозга. Анатомическое сканирование Т2 указывает на гиперинтенсивные области отека, охватывающие области МКА, без участия областей, не относящихся к МСА, таких как гиппокамп.

Проснувшись, у животного проявляются явные признаки острого инсульта. Общие поведенческие симптомы включают повышенный мышечный тонус на стороне поражения, что заставляет животное сгибать свое туловище в этом направлении. Кружение и вращение в ипсилатеральном направлении также являются явными признаками острого инсульта. Атаксия походки часто предполагает вовлечение гиппокампа в объем ишемического поражения. Однако этот симптом может быть недостаточно специфичным в сверхострой фазе из-за побочных эффектов изофлурановой анестезии. В последующие дни у животного должно развиться ипсилатеральное сгибание передней конечности и ухудшение его постурального статуса, сопровождающееся отсутствием рефлекса усов. Смертность достигает пика примерно через 3 дня после процедуры из-за отека мозга. Хроническая фаза начинается после того, как отек мозга начинает рассасываться. В течение этого времени у животного может наблюдаться задержка мочи. По этой причине важно осмотреть животное на предмет жесткости мочевого пузыря, а также плотного колпачка на выходе из уретры. В большинстве случаев этот вопрос можно решить, мягко массируя мочевой пузырь для облегчения мочеиспускания. Признаки восстановления веса обычно появляются в течение первых 7 дней после начала инсульта.

figure-results-1
Рисунок 2: Репрезентативный пример успешной MCAO с полной реперфузией, подтвержденной с помощью МРТ. CBF, ADC и T2w представляют собой карты мозгового кровотока, карты коэффициента видимой диффузии и Т2-взвешенное анатомическое сканирование соответственно. IntraOP, postop и D02 обозначают 3 различные временные точки визуализации после начала ишемии, после начала реперфузии и на второй день после MCAO, соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 3: Репрезентативные МРТ-сканирования кровоизлияния, вызванного нитью, во время процедуры MCAO. CBF, ADC и T2w обозначают карты мозгового кровотока, карты коэффициента видимой диффузии и Т2-взвешенное анатомическое сканирование соответственно. IntraOP, postOP и D02 обозначают 3 различные временные точки визуализации: после начала ишемии, после начала реперфузии и на второй день после MCAO, соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-3
Рисунок 4: Иллюстрация правильного расположения нити в средней ветви мозговой артерии. В большинстве случаев силиконовая часть нити (окрашенная в белый цвет) застревает в проксимальном отделе передней мозговой артерии (ДХА) примерно на 2 мм дальше, чем точка ветвления МКА. Обычно область мозга ACA у мышей не поражается, так как ACA соединяется с контралатеральной в единую азиготную ACA. Пораженные артерии показаны серым цветом. Слева ОСА остается открытой в период ишемии, таким образом, поставляя кровь ко всем ветвям ВСА вплоть до МКА, которая окклюзирована кремниевой частью нити. Справа филамент расположен идентично, за исключением того, что лигирование CCA сохраняется в течение периода ишемии. Из-за того, что PcomA (окрашенный в зеленый цвет) в большинстве случаев не является очевидным, при сохранении лигирования CCA инсульт неизбирательно охватывает большую часть ипсилатерального полушария через MCA, AchA, VTA, HTA и PCA. В этих случаях также могут наблюдаться признаки острого инфаркта глаза (лейкокория и анизокория) из-за заблокированного ППА. Создано с помощью BioRender.com. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MCAO является очень требовательной процедурой для оператора и изнурительной для животного. По этой причине для исследователей крайне важно иметь стандартную операционную процедуру, которая сводит к минимуму тяжесть инсульта, снижает количество неудач в процедуре и улучшает самочувствие животного после процедуры. В данном протоколе MCAO освещаются некоторые ключевые аспекты, которые следует учитывать при проведении данной процедуры на мыши.

Выбор филамента MCAO влияет на размер и расположение индуцированного инсультного поражения и, следовательно, является критическим этапом в этой процедуре11. Нити с силиконовым покрытием, такие как те, которые были впервые разработаны компанией Doccol, сделали большой скачок в снижении частоты кровоизлияний, вызванных нитями. Тем не менее, нити с силиконовым покрытием бывают самых разных размеров и длины, что ставит перед новыми исследователями задачу выбора подходящих нитей для MCAO на экспериментальных животных. В то время как производители нитей обычно предоставляют рекомендации по выбору правильного диаметра нити для данного веса животного, длина силиконового покрытия считается личным предпочтением оператора и должна быть выбрана только на основе навыков оператора. В этой работе мы выступаем за минимизацию длины кремния, чтобы гарантировать, что индуцированное инсультное поражение охватывает только площадь орошения MCA, тем самым улучшая воспроизводимость. На рисунке 4 показано, что задняя мозговая артерия (ПЦА), первая внутричерепная ветвь ВСА, снабжает задние области мозга, включая части гиппокампа. Недавние исследования микрокомпьютерной томографии на мышах выявили еще три меньшие ветви, выходящие из ВСА до точки ветвления МСА13. Нежная и вариабельная гипоталамическая артерия (ГТА), вентральная тегментальная артерия (ВТА) и передняя сосудистая артерия (АХА) в порядке их ветвления вносят значительный вклад в внутривариантную и внутрисубъектную вариабельность8. Более того, исследования с помощью микрокомпьютерной томографии показали, что у мышей среднее расстояние от точек разветвления MCA и PCA составляет около 1,7 мм, что значительно меньше, чем длина силиконового покрытия большинстваизготовленных нитей. Поскольку единственной обратной связью, которую оператор получает при продвижении нити, является внезапное увеличение сопротивления, когда нить достигает точки разветвления MCA, длина замыкания кремниевого покрытия нити является тем, что вызывает ишемию к MCA и, в зависимости от длины кремниевого покрытия, к AChA, VTA, HTA и даже PCA. введение вариативности, противоречащей предполагаемой модели MCAO. Таким образом, для поддержания воспроизводимости и послеоперационного благополучия животных целью должна быть исключительно окклюзия MCA. Компания Doccol предлагает нити MCAO с силиконовым покрытием толщиной от 1 до 2 мм, но наш опыт показывает, что использование покрытий толщиной 1-2 мм часто приводит к фиктивной операции, не вызывая инсульта. Интраоперационная МРТ показала, что нить продвигается на 2 мм за пределы точки ветвления MCA в переднюю мозговую артерию (ДХА), прежде чем обеспечить оператору критическую резистивную обратную связь. По этой причине мы настоятельно рекомендуем использовать силиконовые покрытия длиной от 2 до 3 мм, которые уменьшают участие гиппокампа в поражениях при инсульте по сравнению с более длинными силиконовыми покрытиями на нитях MCAO.

Вторым важным этапом в этой процедуре является правильное размещение нити MCAO с целью достижения полной окклюзии MCA. Ошибочное попадание в первую ветвь ВСА, крыло-нёбную артерию (ППА), является распространенной проблемой для оператора, поскольку вряд ли есть какие-либо отзывы о том, что филамент MCAO сделал неправильный поворот во время своего продвижения. По этой причине мы рекомендуем небольшой боковой угол продвижения, чтобы покрытый силиконом кончик филамента изгибался в сторону от точки разветвления PPA, что повышает вероятность его проникновения во внутричерепную часть ICA. (Рисунок 1) Как указано в разделе протокола, важно следить за длиной замыкающей нити, чтобы сделать вывод о том, является ли ее размещение адекватным. В случае, когда нить не может быть вставлена на расстоянии не менее 7 мм от точки разветвления ICA, оператор должен втянуть нить и повторить процедуру. Любое ненужное усилие, приложенное во время введения нити, может привести к кровотечению и неудачной процедуре. Для этого можно использовать непрерывное лазерно-доплеровское измерение перфузии для подтверждения правильности размещения нити.

Обеспечение беспрепятственного кровотока из ОСА в течение ишемического периода является еще одним важным шагом в этом протоколе. В отличие от большинства иллюстраций, изображающих полный круг Виллиса у мыши, исследования показали, что задняя сообщающаяся артерия (PcomA) чаще всего не является двусторонне открытой у мышей и не может надежно снабжать ипсилатеральную сторону круга Виллиса, если CCA остается закрытой в течение периода ишемии15,16. В этих случаях, даже если исследователь тщательно подберет правильную длину силиконового покрытия нити, удар будет охватывать все полушарие или только область MCA, в зависимости от проходимости PcomA, что приведет к неучтенной вариативности размеров штрихов. По этой причине мы изменили процедуру, включив в нее этап инструкции, при котором оператор извлекает зажим CCA сразу после установки окклюзионного волокна MCAO. Эти модификации могут повысить точность и воспроизводимость операции и в то же время уменьшить гетерогенность результатов. Стандартизация методов еще больше повысит показатель успешности и сопоставимости, а также повысит трансляционный потенциал результатов17.

Самым большим ограничением предлагаемой методики является тот факт, что ЭХА остается перевязанной после процедуры, что потенциально может ухудшить состояние животного вовремя восстановления. До сих пор мы безуспешно пытались восстановить ECA, сохраняя при этом вероятность успеха процедуры достаточно высокой. Это остается потенциальной точкой для будущих усовершенствований метода. Кроме того, свести к минимуму время, в течение которого ОСА остается зажатым, является проблемой, но важно предотвратить вовлечение областей, не относящихся к МСА, при инсульте. Поскольку это может служить источником меж- и внутриоператорской дисперсии, рекомендуется измерять продолжительность зажима CCA, что потенциально позволяет исследователям статистически учесть, по крайней мере, часть наблюдаемой общей дисперсии в размерах ударов. С другой стороны, навыки и опыт оператора играют решающую роль в сокращении времени лигатуры CCA и общей продолжительности процедуры11.

Представленный метод имеет важное значение, поскольку он позволяет исследователям избирательно окклюзировать MCA, тем самым делая начало реперфузии внезапным и хорошо контролируемым. Метод имитирует эндоваскулярную тромбэктомию и ее последующее реперфузионное повреждение более точно, чем доступные в настоящее время методы, обеспечивая детализацию воспроизводимой и клинически значимой модели ишемии/реперфузионного повреждения животных.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не могут раскрывать конфликты интересов. Авторы не имеют никакого отношения к коммерческим наименованиям и товарным знакам, упомянутым в данной работе.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа финансировалась проектом Хорватского научного фонда BRADISCHEMIA (UIP-2017-05-8082); GA KK01.1.1.01.0007 финансируется Европейским союзом через Европейский фонд регионального развития и Европейским союзом через Европейский фонд регионального развития в соответствии с Соглашением о гранте No. КК.01.1.1.07.0071, проект «СинеМозак. Работа докторантов Рок Истер и Марты Понграч была полностью поддержана проектом «Развитие карьеры молодых исследователей - обучение докторантов» Хорватского научного фонда, финансируемым Европейским Союзом из Европейского социального фонда. Процедура была снята с помощью смартфона Android, установленного на хирургическом микроскопе с помощью стандартного крепления для камеры. Видеоматериалы были смонтированы, а озвучка записана с помощью видеоредактора Wondershare Filmora.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Бетадин кожный раствор 10г/100млАлкалоид СкопьеN/A
Плетеный шелковый шовный материалFine Science Tools18020-60
Дафилон шовный материал 5/0 DS16B. BraunC0936154
Dolokain 20 мг/г гельJadran-Galenski LaboratorijN/A Dumont
#5 щипцыFine Science Tools11251-202 шт
Щипцы Dumont #7Инструменты Fine Science Tools11271-30
Самозакрывающиеся щипцы Dumont N0Инструменты Fine Science Tools11480-11
Хирургическая лента Durapore 1,25см x 9,1м3М7100057169
Хирургическая лента Durapore 2,5см x 9,1м3М7100057168
Внешний термостатPetnap1012536
Иглодержатели HalseyFine Science Tools12500-12
Стерилизатор горячих шариковFine Science Tools18000-50
Ножницы для ирисовFine Science Tools14060-10
Isoflurane USPPiramal для интенсивной терапииN/A
Лазерный доплеровский мониторMoor MOORVMS-LDF2
Металлическая грелка для домашних животныхPetnap
Пружинные ножницы Micro VannasFine Science Tools15000-00
Ретрактор Mini-colibriFine Science Tools17000-01
Глазная мазь RecugelBausch& LombN/A
S& T B-1 сосуд микрозажим Инструменты для изобразительной науки00396-012 шт.
S& T микрозажим для наложения щипцовFine Science Tools00071-14
Schwartz micro serrefinesFine Science Tools18052-01
Stemi DV4 Spot стереомикроскопZeiss000000-1018-453
Steri-Strip Усиленный клей для кожи Застежки 3 мм x 75 мм3M7100236545
Прямые тканевые щипцыFine Science Tools11023-10
SZX Stand ArmOlympusSZ2-STS
Tec III 300 серия калиброванный испарительVaporizer Sales and Service inc.Н/Д
Универсальная стойка Тип 2OlympusSZ2-STU2
VetFlo Шестиканальная стойка для анестезииKent ScientificVetFlo-1225Модифицирована для смешивания O2/N2
1012525

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Feigin, V. L., et al. regional, and national burden of stroke and its risk factors, 1990-2019: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2019. The Lancet. Neurology. 20 (10), 1-26 (2021).
  2. Bai, J., Lyden, P. D. Revisiting cerebral postischemic reperfusion injury: New insights in understanding reperfusion failure, hemorrhage, and edema. Int J Stroke. 10 (2), 143-152 (2015).
  3. Sommer, C. J. Ischemic stroke: experimental models and reality. Acta Neuropathol. 133 (2), 245-261 (2017).
  4. Hill, J. W., Nemoto, E. M. Transient middle cerebral artery occlusion with complete reperfusion in spontaneously hypertensive rats. MethodsX. 1, 283-291 (2014).
  5. Koizumi, J., Yoshida, Y., Nakazawa, T., Ooneda, G. Experimental studies of ischemic brain edema. Nosotchu. 8 (1), 1-8 (1986).
  6. Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
  7. Justić, H., et al. Redefining the Koizumi model of mouse cerebral ischemia: A comparative longitudinal study of cerebral and retinal ischemia in the Koizumi and Longa middle cerebral artery occlusion models. J Cereb Blood Flow and Metab. 42 (11), 2080-2094 (2022).
  8. El Amki, M., et al. Hypothalamic, thalamic and hippocampal lesions in the mouse MCAO model: Potential involvement of deep cerebral arteries. J of Neurosci Methods. 254, 80-85 (2015).
  9. Engel, O., Kolodziej, S., Dirnagl, U., Prinz, V. Modeling Stroke in Mice - Middle Cerebral Artery Occlusion with the Filament Model. J Vis Exp. (47), e2423(2011).
  10. Trotman-Lucas, M., Kelly, M. E., Janus, J., Gibson, C. L. Middle cerebral artery occlusion allowing reperfusion via common carotid artery repair in mice. J Vis Exp. (143), e58191(2019).
  11. Morris, G. P., et al. A comparative study of variables influencing ischemic injury in the longa and koizumi methods of intraluminal filament middle cerebral artery occlusion in mice. PLoS One. 11 (2), e0148503(2016).
  12. Shimamura, N., Matchett, G., Tsubokawa, T., Ohkuma, H., Zhang, J. Comparison of silicon-coated nylon suture to plain nylon suture in the rat middle cerebral artery occlusion model. J Neurosci Methods. 156 (1-2), 161-165 (2006).
  13. Guan, Y., et al. Effect of suture properties on stability of middle cerebral artery occlusion evaluated by synchrotron radiation angiography. Stroke. 43 (3), 888-891 (2012).
  14. Yuan, F., et al. Optimizing suture middle cerebral artery occlusion model in C57BL/6 mice circumvents posterior communicating artery dysplasia. J Neurotrauma. 29 (7), 1499-1505 (2012).
  15. Kitagawa, K., et al. Cerebral ischemia after bilateral carotid artery occlusion and intraluminal suture occlusion in mice: Evaluation of the patency of the posterior communicating artery. J Cereb Blood Flow and Metab. 18 (5), 570-579 (1998).
  16. McColl, B. W., Carswell, H. V., McCulloch, J., Horsburgh, K. Extension of cerebral hypoperfusion and ischaemic pathology beyond MCA territory after intraluminal filament occlusion in C57Bl/6J mice. Brain Res. 997 (1), 15-23 (2004).
  17. Li, Y., et al. Distinctions between the Koizumi and Zea Longa methods for middle cerebral artery occlusion (MCAO) model: a systematic review and meta-analysis of rodent data. Sci Rep. 13 (1), 10247(2023).
  18. Trueman, R. C., et al. A critical re-examination of the intraluminal filament mcao model: impact of external carotid artery transection. Transl Stroke Res. 2 (4), 651-661 (2011).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Ischemic Stroke ModelExternal Carotid ArteryIntraluminal Filament ModelRodent Stroke ModelSurgical StandardizationPerfusion Weighted ImagingApparent Diffusion Coefficient

Похожие статьи