Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Получение наночастиц оксида цинка и оценка их антибактериального действия

3.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/66725

⸱

27 сентября 2024 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Integrative Engineering, Chung-Ang University, 2Feynman Institute of Technology, Nanomedicine Corporation, 3Department of Chemical Science and Engineering, Tokyo Institute of Technology, 4Department of Chemical Engineering, Kumoh National Institute of Technology

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

В данном исследовании наночастицы оксида цинка были синтезированы методом осаждения. Антибактериальное действие синтезированных частиц было проверено против штаммов бактерий Staphylococcus aureus (MRSA) и Pseudomonas aeruginosa , устойчивых к метициллину.

Аннотация

Внутрибольничные бактериальные инфекции становятся все более сложными из-за присущей им устойчивости к антибиотикам. Появление штаммов бактерий с множественной лекарственной устойчивостью в больницах объясняется широким и разнообразным использованием антибиотиков, что еще больше усугубляет проблему устойчивости к антибиотикам. Наноматериалы металлов широко изучаются в качестве альтернативного решения для уничтожения устойчивых к антибиотикам бактериальных клеток. Металлические наночастицы атакуют бактериальные клетки с помощью различных механизмов, таких как высвобождение антибактериальных ионов, образование активных форм кислорода или физическое нарушение, к которому бактерии не могут развить устойчивость. Среди активно исследуемых антимикробных наночастиц металлов наночастицы оксида цинка, одобренные FDA, известны своей биосовместимостью и антибактериальными свойствами. В этом исследовании мы сосредоточились на успешной разработке метода осаждения для синтеза наночастиц оксида цинка, анализе свойств этих наночастиц и проведении антимикробных испытаний. Наночастицы оксида цинка были охарактеризованы с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ), динамического рассеяния света (DLS), ультрафиолетовой/видимой спектроскопии и рентгеновской дифракции (XRD). Антибактериальные тесты проводились с использованием теста микроразведения бульона с мультирезистентными штаммами метициллин-резистентных Staphylococcus aureus (MRSA) и Pseudomonas aeruginosa. Это исследование продемонстрировало потенциал наночастиц оксида цинка в подавлении пролиферации устойчивых к антибиотикам бактерий.

Введение

Бактериальные инфекции с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ) представляют собой значительную глобальную угрозу для здоровья человека1. Поскольку эти инфекции могут быть смертельными у пациентов с сопутствующими заболеваниями, активные исследования пытаются решитьэту проблему. Бактерии эволюционировали, чтобы уклоняться от действия различных лекарств. Пенициллин, широко известный и спасший миллионы жизней во всем мире, представляет собой β-лактамный антибиотик, который подавляет синтез бактериальной клеточной стенки. Тем не менее, бактерии эволюционировали, чтобы нейтрализовать эффективность лекарств с помощью различных механизмов, таких как насосы оттока, изменения транспептидазы или снижениепроницаемости. Кроме того, бактериальные клетки могут передавать эти гены устойчивости следующему поколению, увеличивая выживаемость следующего поколения и усиливая проблему устойчивыхштаммов.

Увеличение числа устойчивых к антибиотикам бактерий привело к появлению бактерий с множественной лекарственной устойчивостью, которые обычно проявляют устойчивость к нескольким антибиотикам. Штаммы МЛУ чаще всего встречаются в условиях больниц, где различные штаммы бактерий подвергаются воздействию различных антибиотиков и, следовательно, развивают устойчивость к ним6. Staphylococcus aureus, в частности метициллин-резистентный S. aureus (MRSA), является грамположительной комменсальной бактерией, которая образует скопления на коже примерно у 30% людей 7,8. MRSA, который был впервые идентифицирован в 1960-х годах, демонстрирует сниженную чувствительность к β-лактамным антибиотикам, что приводит к резкому увеличению уровня инфицирования с 1990-х годов9. Среди грамотрицательных бактерий Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) является одним из наиболее распространенных штаммов, приобретенных в больницах. Этот вид, факультативная палочковидная бактерия, вызывает условно-патогенные инфекции у человека10. В частности, штаммы МЛУ, которые непосредственно влияют на здоровье человека, являются причиной более 50 % инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи11. В этом исследовании мы использовали наиболее часто встречающиеся в больницах штаммы с множественной лекарственной устойчивостью, MRSA и P. aeruginosa.

Использование наночастиц (НЧ) в противомикробных целях было широко исследовано для решения проблемы устойчивости к антибиотикам. Металлические НЧ, в частности, вызывают гибель бактериальных клеток с помощью различных механизмов, предлагая потенциальное решение проблемы лекарственной устойчивости. Металлические НЧ проявляют антимикробную активность благодаря нескольким механизмам, включая, среди прочего, высвобождение антимикробных ионов, образование активных форм кислорода (АФК) и физическое разрушение клеток. НЧ, состоящие из серебра, меди, оксида цинка (ZnO) и оксида титана, обладают высокой антимикробной эффективностью и поэтому активно исследуются13.

НЧ ZnO были одобрены Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) для использования у людей. И наоборот, несмотря на их высокую антимикробную эффективность, использование НЧ серебра и меди у человека ограничено их высокой цитотоксичностью. Тем не менее, ZnO NP обычно встречаются в повседневной жизни и даже присутствуют в широко используемых солнцезащитных кремах14. Следует отметить, что ионы Zn2+ , высвобождаемые из НЧ ZnO, очень эффективны в бактериальной обработке, вызывая гибель бактериальных клеток за счет образования АФК и других механизмов физического повреждения15.

В данном исследовании изложен протокол синтеза наночастиц ZnO (НЧ) методом осаждения и представлен подход к антимикробному тестированию с использованием метода разведения микробульона с клиническими образцами MRSA и P. aeruginosa. Метод осаждения ZnO NP включает синтез нерастворимых твердых ZnO NP путем регулировки pH и температуры с использованием растворимых предшественников, таких как ацетат цинка или нитрат цинка16. Наряду с относительно простым и быстрым получением, этот метод обеспечивает повторяемость в синтезе и облегчает контроль над размером и морфологиейчастиц17. В этом протоколе синтеза гидроксид натрия (NaOH), один из наиболее часто используемых агентов осаждения, был использован для осаждения ацетата цинка, а небольшое количество гексадецилтриметиламмония бромида (CTAB) было использовано для ингибирования неконтролируемого синтеза наночастиц18. Среди различных антимикробных тестов антибактериальная активность наночастиц ZnO оценивалась с помощью метода разведения микробульона, который позволяет избежать оптической интерференции от наночастиц оксида металла и позволяет напрямую измерять колонию для определения MIC19.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Реагенты и оборудование, использованные в данном исследовании, перечислены в Таблице материалов.

1. Получение наночастиц оксида цинка

  1. Отмерьте 200 мл абсолютного этилового спирта и перелейте его в стеклянную колбу с круглым дном.
  2. Поместите колбу с круглым дном на нагревательную мантию и поддерживайте помешивание при температуре 25-40 °C.
  3. Отмерьте 500 мг CTAB во флаконе объемом 50 мл и добавьте его к этиловому спирту в колбе. Перемешивайте до полного растворения CTAB.
  4. Добавьте в раствор 1,4 г ацетата цинка и размешайте до полного его растворения.
  5. Повысьте температуру раствора, установив температуру нагревательной мантии на 70 °C.
  6. Добавьте в смесь 25 мл 0,5 М раствора NaOH и дайте ему вступить в реакцию в течение 1 ч, пока прозрачный раствор не приобретет белый цвет.
  7. Разогрейте раствор до 50 мл конических пробирок, центрифугируйте при 15000 × г в течение 15 мин при комнатной температуре, а затем выбросьте надосадочную жидкость.
  8. Добавьте 10 мл дистиллированной воды в одну из конических пробирок и повторно суспендируйте наночастицы путем ультразвука в растворе. Переложите взвешенный раствор в другую коническую пробирку, содержащую гранулу ZnO, и повторяйте до тех пор, пока все растворы ZnO не соберутся в одной конической пробирке.
  9. Промойте наночастицы через центрифугирование при 15000 × г в течение 15 мин (комнатная температура), удалите надосадочную жидкость и снова суспендируйте в дистиллированной воде. Проверьте pH раствора надосадочной жидкости с помощью бумаги для проверки pH и повторяйте до тех пор, пока pH раствора не станет нейтральным.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Когда pH раствора надосадочной жидкости станет нейтральным (pH = 7), выбросьте раствор надосадочной жидкости и не суспендируйте ее дистиллированной водой.
  10. Вакуумную сушку поддона с образцами при температуре 60 °C в течение 24 часов и получение порошка ZnO NP.

2. Антибактериальные тесты с использованием MRSA и P. aeruginosa

  1. Бактериальный посев
    ПРИМЕЧАНИЕ: Клинические штаммы бактерий МЛУ были получены из университетской больницы Чунг-Анг, Сеул, Южная Корея.
    1. Достаньте из морозильной камеры штаммы бактерий MRSA и P. aeruginosa, хранящиеся в триптическом соевом бульоне (TSB).
    2. После размораживания бактериальных растворов нанесите раствор на пластину триптического соевого агара (TSA) с помощью одноразовой петли для посева. Поместите прорезанные агаровые пластины в инкубатор и инкубируйте в течение 24 ч.
      Примечание: Одну колонию, отобранную из планшета TSA, добавляли к 10 мл среды TSB в конической пробирке объемом 50 мл с использованием петли бактериального посева. Бактерии культивировали в течение 24 ч. Бактерии культивировали в условиях аэробного культивирования при температуре 37 °С.
    3. Для измерения концентрации раствора бактерий разбавляют культивируемый раствор с помощью 10-кратного серийного разбавления до 10-6 с помощью дистиллированной воды. После этого нанесите 50 μL разбавленного раствора на планшеты TSA и распределите раствор с помощью L-образного разбрасывателя.
    4. Инкубируйте планшеты в инкубаторе в течение 24 ч.
      Примечание: Колонии подсчитывали оптически, а концентрацию культивируемого раствора рассчитывали путем умножения коэффициентов разведения на количество подсчитанных колоний.
  2. Отбор проб бактерий
    1. Чтобы проверить широкий диапазон концентраций ZnO, приготовьте раствор ZnO NPs в дозе 2 мг/мл с использованием фосфатно-солевого буфера (DPBS) Дульбекко и выполните 2-кратное серийное разведение для получения различных концентраций.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Были протестированы 1000 г/мл, 500 г/мл, 250 г/мл, 125 г/мл и 62,5 г/мл.
    2. Добавьте по 100 мкл для каждой из испытуемых концентраций ZnO NP в 96-луночный планшет.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте удвоенную (2x) конечную желаемую концентрацию ZnO NPs, так как каждый образец в лунке будет разбавлен добавлением 100 μL бактериальной культуры. Используйте 2% раствор антибиотика-антимикотика (А/А) в качестве положительного контроля и DPBS в качестве отрицательного контроля. А/А представляет собой комплекс антибиотиков пенициллина и стрептомицина, который эффективен в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий соответственно.
    3. Разбавьте бактериальную культуру до 1 ×10 6 КОЕ/мл с использованием среды TSB и добавьте по 100 мкл в каждую лунку, содержащую различные концентрации ZnO NP.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Первоначальные концентрации растворов культур MRSA и P. aeruginosa составляли 3 x 109 КОЕ/мл. Концентрацию культуры бактерий 1 х 106 КОЕ/мл получали путем разведения культурального раствора на 1/20 и 1/150. После смешивания со 100 мкл ZnO NP конечная концентрация бактерий составит 5 × 105 КОЕ/мл.
    4. Поместите планшет на 96 лунок в инкубатор при температуре 37 °C и инкубируйте в течение 24 часов.
  3. Распространение бактерий
    1. Пипетку по 100 мкл из каждой лунки и готовьте различные 10-кратные серийные разведения до 10-6.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Добавьте 100 μL ZnO NPs, содержащих бактериальный раствор, в 900 μL стерилизованной дистиллированной воды и повторите 6 раз.
    2. Пипетку 50 мкл из четырех разбавленных растворов и добавить в медиа пластины TSA. Используйте L-образный разбрасыватель клеток, чтобы распределить бактериальную суспензию на агаровой пластине.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте разведения 100, 10-2, 10-4 и 10-6 . Проводите все эксперименты в трех экземплярах. Распределяйте до тех пор, пока весь бактериальный раствор не впитается на агаровую пластину.
    3. Поместите агаровые пластины в инкубатор при температуре 37 °C и инкубируйте в течение 24 часов.
  4. Подсчет бактериальных КОЕ
    1. Выберите коэффициент разрежения, который можно подсчитать для каждой группы. Отметьте все колонии в счетной таблице для разведения и пересчитайте так, чтобы концентрация стала # КОЕ/мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Счетный коэффициент разбавления указывает на пластины, которые имеют 20-100 КОЕ на отдельной пластине. Первоначально подсчитанные результаты концентрации # КОЕ/50 μл. Используя разбрасываемую пластину с неразбавленным бактериальным раствором, определите потенциальную минимальную бактерицидную концентрацию.
    2. Используйте полученные данные, чтобы представить процентное соотношение живых бактерий по отношению к таковым в отрицательном контроле.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Процентное содержание живых бактерий (%) =figure-protocol-1

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Успешный синтез ZnO NPs был подтвержден с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ), как показано на рисунке 1A. Было отмечено, что полученные ZnO НЧ имеют круглую форму, со средним размером частиц 35,35 нм и стандартным отклонением 6,81 нм. Осаждение этих наночастиц наблюдалось в результате реакции двойного вытеснения путем добавления раствора NaOH в ацетат цинка, где ионы Zn2+ подвергались гидролизу.

С помощью динамического рассеяния света ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Синтез ZnO NPs с помощью осаждения относительно прост и понятен. Для успешного синтеза ZnO NP с использованием этого метода перемешивание имеет решающее значение для обеспечения полного растворения предшественника (ацетата цинка) в растворителе. Кроме того, повышение температуры помогает вызвать успешную реакцию двойного смещения. При синтезе ZnO NP существует множество факторов, определяющих размер и форму, включая осадитель, концентрацию осадителя и поверхностно-активное вещес...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Д-р Чонхун Чой является генеральным директором/основателем, а д-р Йонгхён Чой является техническим директором Технологического института Фейнмана в Корпорации наномедицины.

Благодарности

Это исследование было поддержано стипендией Университета Чунг-Анг для аспирантов в 2022 году (г-жа Гахюн Ли). Эта работа также была поддержана грантом Национального исследовательского фонда Кореи (NRF), финансируемым правительством Кореи (MSIT) (No 2020R1A5A1018052) и Программой развития технологий (RS202300261938), финансируемой Министерством малого и среднего бизнеса и стартапов (MSS, Корея).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
DLSZetasizer Pro
Этиловый спирт, абсолютныйDAEJUNG4023-2304
Считыватель микропланшетов BioTeck
Гидроксид натрияSigma-Aldrich221465
TEMJEOL JEM-F200
TSADB difco236950
TSBDB difco211825
XRDNEW D8-Advance
Ацетат цинкаSigma-Aldrich383317

Ссылки

  1. Catalano, A., et al. Multidrug resistance (MDR): A widespread phenomenon in pharmacological therapies. Molecules. 27 (3), 616(2022).
  2. Bazaid, A. S., et al. Bacterial infections among patients with chronic diseases at a tertiary care hospital in Saudi Arabia. Microorganisms. 10 (10), 1907(2022).
  3. Miller, E. L. The penicillins: A review and update. J Midwifery Women's Health. 47 (6), 426-434 (2002).
  4. Martínez-Trejo, A., et al. Evasion of antimicrobial activity in acinetobacter baumannii by target site modifications: An effective resistance mechanism. Int J Mol Sci. 23 (12), 6582(2022).
  5. Jiang, J. -H., et al. Antibiotic resistance and host immune evasion in staphylococcus aureus mediated by a metabolic adaptation. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (9), 3722-3727 (2019).
  6. Lee, H. N., et al. A lateral flow assay for nucleic acid detection based on rolling circle amplification using capture ligand-modified oligonucleotides. BioChip J. 16 (4), 441-450 (2022).
  7. Craft, K. M., Nguyen, J. M., Berg, L. J., Townsend, S. D. Methicillin-resistant staphylococcus aureus (MRSA): Antibiotic-resistance and the biofilm phenotype. Med Chem Comm. 10 (8), 1231-1241 (2019).
  8. Tieu, M. -V., Pham, D. T., Le, H. T. N., Hoang, T. X., Cho, S. Rapid and ultrasensitive detection of Staphylococcus aureus using a gold-interdigitated single-wave-shaped electrode (AU-ISWE) electrochemical biosensor. BioChip J. 17, 1-10 (2023).
  9. Turner, N. A., et al. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus: An overview of basic and clinical research. Nat Rev Microbiol. 17 (4), 203-218 (2019).
  10. Tuon, F. F., Dantas, L. R., Suss, P. H., Tasca Ribeiro, V. S. Pathogenesis of the Pseudomonas aeruginosa biofilm: A review. Pathogens. 11 (3), 300(2022).
  11. Sarabhai, S., Sharma, P., Capalash, N. Ellagic acid derivatives from terminalia chebula retz. Downregulate the expression of quorum sensing genes to attenuate pseudomonas aeruginosa pao1 virulence. PLoS One. 8 (1), e53441(2013).
  12. Dizaj, S. M., Lotfipour, F., Barzegar-Jalali, M., Zarrintan, M. H., Adibkia, K. Antimicrobial activity of the metals and metal oxide nanoparticles. Mat Sci Eng: C. 44, 278-284 (2014).
  13. Ribeiro, A. I., Dias, A. M., Zille, A. Synergistic effects between metal nanoparticles and commercial antimicrobial agents: A review. ACS App Nano Mater. 5 (3), 3030-3064 (2022).
  14. Newman, M. D., Stotland, M., Ellis, J. I. The safety of nanosized particles in titanium dioxide-and zinc oxide-based sunscreens. J Am Acad Dermatol. 61 (4), 685-692 (2009).
  15. Sivakumar, P., Lee, M., Kim, Y. -S., Shim, M. S. Photo-triggered antibacterial and anticancer activities of zinc oxide nanoparticles. J Mater Chem B. 6 (30), 4852-4871 (2018).
  16. Kołodziejczak-Radzimska, A., Jesionowski, T. Zinc oxide-from synthesis to application: A review. Materials. 7 (4), 2833-2881 (2014).
  17. Raoufi, D. Synthesis and microstructural properties of ZnO nanoparticles prepared by precipitation method. Renew Energy. 50, 932-937 (2013).
  18. Wang, Y. -X., Sun, J., Fan, X., Yu, X. A CTAB-assisted hydrothermal and solvothermal synthesis of ZnO nanopowders. Ceram Int. 37 (8), 3431-3436 (2011).
  19. Balouiri, M., Sadiki, M., Ibnsouda, S. K. Methods for in vitro evaluating antimicrobial activity: A review. J Pharm Anal. 6 (2), 71-79 (2016).
  20. Clogston, J. D., Patri, A. K. Zeta potential measurement. Characterization of nanoparticles intended for drug delivery. Methods Mol Biol. McNeil, S. , 63-70 (2011).
  21. Abdelbaky, A. S., Mohamed, A. M., Sharaky, M., Mohamed, N. A., Diab, Y. M. Green approach for the synthesis of ZnO nanoparticles using Cymbopogon citratus aqueous leaf extract: Characterization and evaluation of their biological activities. Chem Biol Technol Agric. 10 (1), 63(2023).
  22. Ankamwar, B. G., Kamble, V. B., Annsi, J. I., Sarma, L. S., Mahajan, C. M. Solar photocatalytic degradation of methylene blue by ZnO nanoparticles. J Nanosci Nanotechnol. 17 (2), 1185-1192 (2017).
  23. Babayevska, N., et al. Zno size and shape effect on antibacterial activity and cytotoxicity profile. Scientific Rep. 12 (1), 8148(2022).
  24. Hamidian, K., Sarani, M., Behjati, S., Mahjoub, M., Zafarnia, N. Cytotoxic performance of synthesized mn-doped ZnO nanorods in mcf-7 cells. ChemistrySelect. 8 (19), e202300292(2023).
  25. Gharpure, S., et al. Non-antibacterial and antibacterial ZnO nanoparticles composed of different surfactants. J Nanosci Nanotechnol. 21 (12), 5945-5959 (2021).
  26. Dhoke, S. K. Synthesis of nano-ZnO by chemical method and its characterization. Results Chem. 5, 100771(2023).
  27. Choi, K. -C., et al. Modifying hydrogen bonding interaction in solvent and dispersion of ZnO nanoparticles: Impact on the photovoltaic performance of inverted organic solar cells. RSC Adv. 4 (14), 7160-7166 (2014).
  28. Lee, W., et al. High colloidal stability ZnO nanoparticles independent on solvent polarity and their application in polymer solar cells. Scientific Rep. 10 (1), 18055(2020).
  29. Cozzoli, P. D., Kornowski, A., Weller, H. Colloidal synthesis of organic-capped ZnO nanocrystals via a sequential reduction-oxidation reaction. J Phy Chem B. 109 (7), 2638-2644 (2005).
  30. Roh, S., Jang, Y., Yoo, J., Seong, H. Surface modification strategies for biomedical applications: Enhancing cell-biomaterial interfaces and biochip performances. BioChip J. 17, 1-18 (2023).
  31. Chen, D., Jiao, X., Cheng, G. Hydrothermal synthesis of zinc oxide powders with different morphologies. Solid State Commun. 113 (6), 363-366 (1999).
  32. Hu, X. -L., Zhu, Y. -J., Wang, S. -W. Sonochemical and microwave-assisted synthesis of linked single-crystalline ZnO rods. Mater Chem Phys. 88 (2-3), 421-426 (2004).
  33. Ahamad Khan, M., et al. Phytogenically synthesized zinc oxide nanoparticles (ZnO-NPs) potentially inhibit the bacterial pathogens: In vitro studies. Toxics. 11 (5), 452(2023).
  34. Xie, J., et al. Recent advances in ZnO nanomaterial-mediated biological applications and action mechanisms. Nanomaterials. 13 (9), 1500(2023).
  35. Chawla, U., et al. A review on ZnO-based targeted drug delivery system. Lett Drug Des Discov. 21 (3), 397-420 (2024).
  36. Alavi, M., Nokhodchi, A. An overview on antimicrobial and wound healing properties of ZnO nanobiofilms, hydrogels, and bionanocomposites based on cellulose, chitosan, and alginate polymers. Carbohydr Polym. 227, 115349(2020).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Синтез наночастицметод осажденияпросвечивающая электронная микроскопиядинамическое рассеяние светарентгеновская дифракцияметод микроразведений в бульонеполирезистентные бактерииколониеобразующие единицы
Получение наночастиц оксида цинка и оценка их антибактериального действия
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.