В настоящем протоколе описана методология трансфекции трофозоитов Naegleria gruberi с помощью конструкции, которая поддерживается на протяжении всего пассирования трофозоитов in vitro, а также посредством энцистирования и эксцистации.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Трансфекция молекулярного клона рДНК Naegleria gruberi в трофозоиты N. gruberi
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Все рибосомные гены трофозоитов Naegleria поддерживаются в замкнутой кольцевой внехромосомной рибосомной ДНК (рДНК), содержащей элемент (CERE). Несмотря на то, что о CERE известно немного, полный анализ последовательности генома трех видов Naegleria ясно показывает, что в ядерном геноме отсутствуют цистроны рДНК. Кроме того, у N. gruberi CERE было картировано единственное начало репликации ДНК, что подтверждает гипотезу о том, что CERE реплицируется независимо от ядерного генома. Эта характеристика CERE позволяет предположить, что можно использовать сконструированный CERE для введения чужеродных белков в трофозоиты Naegleria . В качестве первого шага в изучении использования CERE в качестве вектора у Naegleria мы разработали протокол для трансфекции N. gruberi молекулярным клоном N. gruberi CERE, клонированным в pGEM7zf+ (pGRUB). После трансфекции pGRUB был легко обнаружен у трофозоитов N. gruberi в течение, по крайней мере, семи пассажей, а также через энцистацию и эксцистацию. В качестве контроля трофозоиты трансфицировали с помощью основного вектора, pGEM7zf+, без последовательностей N. gruberi (pGEM). pGEM не был обнаружен после первого пассажа после трансфекции в N. gruberi, что указывает на его неспособность к репликации в эукариотическом организме. В этих исследованиях описан протокол трансфекции трофозоитов Naegleria и показано, что последовательность бактериальной плазмиды в pGRUB не ингибирует успешную трансфекцию и репликацию трансфицированного клона CERE. Кроме того, этот протокол трансфекции будет иметь решающее значение для понимания минимальной последовательности CERE, которая управляет его репликацией у трофозоитов, а также для идентификации регуляторных областей в нерибосомной последовательности (NRS).
Введение
Род Naegleria насчитывает более 45 видов, хотя маловероятно, что все представители вида были идентифицированы1. Naegleria могут существовать в разных формах: в виде трофозоитов (амеб), в виде жгутиков или, когда ресурсы сильно ограничены, в виде цист 1,2,3,4. Род Naegleria известен своим единственным особенно опасным видом, Naegleria fowleri, известным как «амеба, поедающая мозг» (рассмотрено в 1,2,3,4,5,6,7<....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Подробная информация о видах, реагентах и оборудовании, использованных в этом исследовании, приведена в Таблице материалов. Последовательность конструкции pGRUB из 17 004 пар оснований представлена в дополнительном файле 1.
1. Культивирование трофозоитов
- Замороженные трофозоиты N. gruberi разморозить при 37 °C в течение 3 мин.
- Инокулируйте трофозоиты в колбы T25 в модифицированный пептон/дрожжевой экстракт/нуклеиновую кислоту/фолиевую кислоту/гемин с 10% эмбриональной телячьей сывороткой (PYNFH) плюс 2% буфером (динатрийфосфат, дигидрофосфат калия).
- Ку....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
ПЦР трофозоитов, которые были трансфицированы pGRUB, показывает, что трансфицированный CERE обнаруживается по меньшей мере через семь пассажей трофозоитов, а также через энцистирование и эксистмент (рис. 4). Праймеры, используемые в ПЦР, отжигают как вектор pGEM, так и последовательность CERE, тем самым гарантируя, что ПЦР не обнаружит нативный CERE. ПЦР после трансфекции pGEM в трофозоиты показала, что pGEM был отрицательным (рис. 4), что указывает на то, что п.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Протокол, описанный в настоящем документе, очень прост, хотя каждая конструкция, вероятно, потребует некоторой степени оптимизации, в частности, соотношения ДНК-трансфекционного реагента, в зависимости от природы конструкции и используемого вида Naegleria . Мы протестировали только один коммерчески доступный реагент для трансфекции с использованием этого протокола, но вполне вероятно, что несколько других могут быть эффективными. Учитывая, что используется полноразмерный клон CERE, содержащий функциональное нача.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Никаких финансовых конфликтов интересов заявлено не было.
Благодарности
Эти исследования были частично профинансированы за счет гранта Фонда Джорджа Ф. Хэддикса Крейтонского университета (KMD). Рисунок 1 сгенерирован в biorender.com, а рисунок 3 — в benchling.com.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Agarose | Bio Rad | 161-3102 | |
| Ацетат аммония | Sigma Aldrich | A-7330 | |
| Хлорид кальция | Sigma Aldrich | C-4901 | |
| Колбы для культуры дробленого льда | |||
| , T-75 | Thermo Scientific | 130190 | |
| Планшет для культивирования, 6-луночный | Corning | 3506 | |
| ДНКаза | Sigma Aldrich | D-4527 | |
| ЭДТА, 0,5 м | Affymetrix | 15694 | |
| Электрофереза Гелевый аппарат | Amersham Biosciences | 80-6052-45 | |
| Пробирки Эппендорфа, 1,5 мл | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Пробирки Эппендорфа, 2 мл | Fisher Scientific | 05-408-138 | |
| Этанол, 100% | Decon Laboratories | 2716 | |
| Бромид этидия | Sigma Aldrich | E-8751 | |
| Фетальная сыворотка крупного рогатого скота | Gibco | 26140 | |
| Фолиевая кислота | Sigma Aldrich | F7876-25G | |
| GeneRuler 1 kb Plus Ladder | Thermo Scientific | SM1331 | |
| Ледяная уксусная кислота | Fisher Scientific | UN2789 | |
| GoTaq Green PCR Master Mix | Promega | M7122 | |
| Нагревательный блок | Thermo Scientific | 88871001 | |
| Гемацитометр | Hausser Scientific | 1483 | |
| Hemin | Sigma Aldrich | 51280 | |
| Хлорид железа | Sigma Aldrich | 372870-256 | |
| Лигаза | NEB | M2200S | |
| Магнейсум хлорид | Fisher Scientific | M33-500 | |
| Microfuge | Thermo | Scientific MySpin 12 | |
| Микроскоп | Nikon | TMS | |
| N. gruberi | ATCC | 30224 | |
| Нуклеиновая кислота | Chem Impex Int' l | #01625 | |
| Пептон | Gibco | 211677 | |
| pGEM | Promega | P2251 | |
| Фосфат калия | Sigma Aldrich | P0662-500G | |
| PowerPac HC Электрофарез Блок питания | Bio Rad | 1645052 | |
| хлорид натрия | Реагенты | MCB SX0420 | |
| Фосфат натрия, двухосновной | Sigma Aldrich | S2554 | |
| Настольная центрифуга | eppendorf | 5415R | |
| Tris, основание | Sigma Aldrich | T1503-1KG | |
| Трипан синий, 0,4% | Gibco | 15250-061 | |
| ViaFect Реагент | Promega | E4981 | |
| Весы | Denver Instruments | APX-60 | |
| Экстракт дрожжей | Гибко | 212750 |
Ссылки
- De Jonckheere, J. F. What do we know by now about the genus Naegleria. Exp Parasitol. 145, Suppl S2-S9 (2014).
- De Jonckheere, J. F. A century of research on the Amoeboflagellate genus Naegleria. Acta Protozool. 41, 309-342 (2002).
- Fulton, C.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
