Печеночный клиренс инсулина имеет решающее значение для регуляции гомеостаза глюкозы. В этой статье описана удобная процедура перфузии печени для непосредственной оценки скорости клиренса печеночного инсулина in situ у мышей.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Оценка клиренса инсулина у мышей с помощью перфузии печени in situ
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Печеночный клиренс инсулина необходим для поддержания гомеостаза глюкозы и тесно связан с метаболическими нарушениями, такими как ожирение, резистентность к инсулину и диабет. Точное измерение клиренса инсулина имеет жизненно важное значение для понимания основных механизмов этих состояний. Этот протокол представляет собой простую и удобную для пользователя процедуру перфузии печени у мышей, специально разработанную для непосредственной оценки скорости клиренса печеночного инсулина. Метод включает в себя точную канюляцию воротной вены и надпеченочной нижней полой вены для создания перфузионной системы in situ , имитирующей физиологические условия. Протокол помогает исследователям пройти через каждый этап процедуры, от хирургической подготовки и настройки системы перфузии до сбора и анализа образцов. Предоставляются подробные инструкции, а также репрезентативные результаты и важные советы по оптимизации процедуры. Видеоурок сопровождает письменный протокол, предлагая визуально подробные инструкции и иллюстрации, что делает его доступным и всеобъемлющим справочником для ученых, изучающих молекулярные механизмы метаболизма и клиренса инсулина в печени.
Введение
Открытие инсулина стало одной из вех прошлого века. Много известно о регуляции синтеза, секреции и физиологических функций инсулина в метаболических тканях. Тем не менее, меньше внимания уделялось деградации инсулина и ее регуляторным механизмам. Метаболизм инсулина можно понимать как взаимодействие между функцией бета-клеток, инсулинорезистентностью (ИК) или чувствительностью и клиренсом инсулина. Наряду с секрецией инсулина, печеночный клиренс инсулина играет решающую роль в поддержании гомеостатического уровня инсулина, необходимого для достижения периферических тканей-мишеней и содействия правильномудействию инсулина. Многочисленные исследования определили нарушение клиренса инсулина как решающий фактор в патогенезе гиперинсулинемии при метаболическом синдроме, а также при других состояниях, таких как сахарный диабет 2 типа 2,3, неалкогольный стеатогепатит4 и синдром поликистозных яичников5. Таким образом, гиперинсулинемия, вторичная по отношению к сниженному клиренсу, может играть роль в патогенезе метаболических заболеваний. Стратегии, которые улучшают клиренс инсулина, могут обратить вспять неблагоприятные последствия гиперинсулинемии у этих людей.
Инсулин имеет уникальную схему распределения. Уровень циркулирующего плазменного инсулина зависит от равновесия между секрецией и выведением инсулина. Поджелудочная железа пульсирующим образом выделяет инсулин в воротную вену, направляя его к гепатоцитам. Будучи первым органом, который сталкивается с секрецией инсулина, печень разрушает большую часть инсулина во время его первого прохождения, составляя 60-70% от общего количестваинсулина6. Оставшийся инсулин выводится из печени через печеночную вену, попадая в системный кровоток, где он частично используется периферическими тканями (в первую очередь мышцами, жировой тканью и почками) перед дальнейшим извлечением печенью во время его второго прохождения через печеночнуюартерию.
Точное измерение клиренса инсулина имеет решающее значение. Прямое измерение клиренса печеночного инсулина в исследованиях на людях является сложной задачей, поскольку получение образцов крови из воротных и печеночных вен затруднено. Для оценки клиренса инсулина у людей и животных моделей используются как прямые, так и косвенные методы. Для косвенного измерения клиренса инсулина используются примерно три стратегии. Наиболее часто используемые в клинической практике оценки включают методы, основанные на молярном соотношении С-пептид/инсулин8. Этот подход основан на эквимолярной секреции обоих пептидов и отсутствии экстракции С-пептидов печенью9. Вторая группа методов основана на математическом анализе кривых распада инсулина в плазме крови после известного и специфического ввода гормона в кровоток 2,10,11. Третий метод основан на том, что вливание инсулина с постоянной скоростью приводит к стабильному уровню гормона в крови, где скорость выведения соответствует скорости введения12. Эти косвенные методы в первую очередь отражают общий клиренс инсулина в организме. Учитывая, что печень является основным местом клиренса инсулина и играет решающую роль в этом процессе, важно непосредственно оценить печеночный клиренс инсулина.
В предыдущих исследованиях непосредственно измеряли экстракцию инсулина в печени у здоровых собак13,14. В исследованиях также использовалась изолированная перфузированная модель печени крысы для оценки экстракции инсулина из печени15,16. Благодаря высокой доступности генетически модифицированных штаммов, мыши служат ценными моделями для исследования молекулярных путей. В нескольких исследованиях17 перфузия печени использовалась для непосредственной оценки печеночного клиренса инсулина на мышиной модели. В этих исследованиях перфузат, содержащий человеческий инсулин, вводится в воротную вену и собирается из нижней полой вены. Доля инсулина, поглощаемого печенью, указывает на его клиренс. Метод перфузии печени поддерживает печень в условиях, близких к физиологическим, путем циркуляции теплого, насыщенного кислородом и обогащенного питательными веществами перфузата через сосудистую сеть печени. Тем не менее, нет достаточных практических указаний и важных советов по продвижению и распространению этой техники.
Таким образом, в то время как печеночный клиренс инсулина привлекает все больше внимания, его роль в расстройствах, а также его молекулярные механизмыостаются неясными. Поэтому в области научных исследований очень нужны передовые методики. Этот протокол устанавливает детальную процедуру модифицированной перфузии печени у мышей для оценки клиренса печеночного инсулина. Кроме того, этот метод также может быть использован для изучения влияния лекарств на печень, включая эффект первого прохождения, процессы транспортировки лекарств и различные другие аспекты.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Этот протокол был одобрен Комитетом по уходу за животными и их использованию Нанкинским медицинским университетом (IACUC-2105018) и соответствует рекомендациям Комитета по институциональному уходу за животными и их использованию. Все мыши C57BL/6N содержались в 12-часовом цикле свет/темнота со свободным доступом к пище и воде. Шестинедельные мыши были случайным образом разделены на группу диеты Чау (CD) и группу диеты с высоким содержанием жиров (HFD). Группа HFD получала пищу с 60% высоким содержанием жиров и продолжала придерживаться этой диеты до 10-недельного возраста. Средняя масса тела составила 28,55 г ± 1,2 г в группе HFD и 24,3 г ± 0,48 г в контрольной группе. Подробная информация о реагентах и оборудовании, использованных в этом исследовании, приведена в Таблице материалов.
1. Подготовка
- Выполняйте необходимую стерилизацию хирургических инструментов и расходных материалов с помощью автоклавирования.
- Положите на операционный стол хирургические инструменты, шелковый шовный материал 6-0, стерильный маленький ватный аппликатор, инъекцию хлорида натрия (500 мл), ватные палочки и губки.
- Приготовьте 30 мл гепаринизированного физиологического раствора с конечной концентрацией 200 МЕ/мл.
- Подготовьте две силиконовые трубки с внутренним диаметром 0,31 мм и внешним диаметром 0,64 мм; Один длиной 4 см для использования в качестве катетера воротной вены, а другой 10 см в длину для использования в качестве катетера нижней полой вены.
- Приготовьте перфузионный буфер Krebs-Henseleit (KRBH), содержащий 5,0 ммоль/л глюкозы и 0,25% BSA.
- Приготовьте перфузионный буфер Krebs-Henseleit (KRBH), содержащий 5,0 ммоль/л глюкозы, 0,25% BSA и 4,0 нг/мл человеческого инсулина.
- Настройте систему перфузии печени. На рисунке 1 представлены основные компоненты системы перфузии печени.
2. Хирургическая катетеризация
- Приготовьте обезболивающую смесь, выполнив следующие действия:
- Развести Золетил 50 (250 мг/5 мл) в 10 раз с 0,9% раствором натрия хлорида.
- Ксилазина гидрохлорид (200 мг/2 мл) развести в 10 раз с 0,9% раствором натрия хлорида.
- Смешайте 0,5% раствор Zoletil 50 с 1% раствором гидрохлорида ксилазина в соотношении 1:1.
- Обезболите мышей.
- Проверьте и запишите вес тела мыши. Вводят смесь анестетиков путем внутрибрюшинного введения в дозе 5 мл/кг массы тела (2,5 мг/мл Золетил 50; 5 мг/мл ксилазина гидрохлорида). Начало анестезии обычно происходит в течение 5-10 минут после инъекции, о чем свидетельствует потеря выпрямляющего рефлекса и снижение реакции на внешние раздражители.
- Перенесите мышь на операционный стол. Закрепите конечности с помощью скотча. Вводите 2,5 ЕД/г гепарина внутрибрюшинно для достижения гепаринизации.
- С помощью электробритвы подстригите шерсть на коже живота и продезинфицируйте участок раствором повидон-йода.
- Провести катетеризацию воротной вены.
- Сделайте продольный разрез на 4 см от нижней части живота в сторону мечевидного отростка по средней линии живота. Аккуратно разрежьте брюшину ножницами, чтобы не повредить висцеральные органы. Вставьте брюшной ретрактор мыши, чтобы обнажить операционное поле.
- Сдвиньте кишечник вправо, чтобы открыть воротную вену, правую почку и нижнюю полую вену (рисунок 2A). С помощью артериальных щипцов зажмите полую вену у верхнего края почки.
- Изолируйте воротную вену (рис. 2A) и перевяжите дистальный конец шелковым швом 6-0. Неплотно завяжите еще один шов на проксимальном конце оголенного сосуда.
- Сделайте надрез возле перевязанного конца пружинными ножницами и вставьте катетер. Продвигайте катетер через разрез до уровня бифуркации портала.
- Закрепите обе лигатуры вокруг катетера и подтвердите правильность забора проб, подключив свободный конец катетера к шприцу для забора проб. Промойте гепаринизированным физиологическим раствором и зажмите катетер (рисунок 2C).
- Снимите тракционное устройство и внушите кишечник. Накройте операционную область стерильной марлей, пропитанной солевым раствором, или ватой.
- Провести катетеризацию надпеченочной нижней полой вены.
- Сделайте разрез вдоль грудины из мечевидного отростка, обнажая грудину.
- Вертикально разрежьте грудину и прорежьте диафрагму по краю ребра, чтобы обнажить грудную полость.
- Обнажите и изолируйте надпеченочную нижнюю полую вену (рис. 2B). Аккуратно перевязайте дистальный конец шелковым швом 6-0. Неплотно завяжите еще один шов на проксимальном конце сосуда.
- Сделайте разрез чуть ниже перевязанного конца пружинными ножницами и вставьте катетер длиной 10 см. Продвигайте катетер до тех пор, пока кончик катетера не приблизится к печени, и надежно завяжите обе лигатуры. Подтвердите правильность отбора проб и зажмите свободный конец катетера (рисунок 2D).
- Промойте операционную область солевым раствором. Накройте поверхность стерильной марлей, пропитанной солевым раствором.
3. Перфузия печени
- Усыпьте мышь с помощью передозировки анестетика и торакотомии в соответствии с институциональными рекомендациями по уходу за животными и их использованию, гарантируя, что все процедуры выполняются таким образом, чтобы свести к минимуму страдания.
- Настройте систему перфузии печени, которая включает в себя оксигенатор, устройство модуляции температуры, инфузионный насос и инфузионные трубки, как показано на рисунке 1.
- Обеспечивают непрерывный поток газа 95% кислорода и 5% углекислого газа в оксигенатор.
- Включите водяную баню и прогрейте комнату органа до 37 °C.
- Приготовьте перфузионный буфер KRBH с инсулином и без него. Загрунтуйте систему трубок с перфузионным буфером, инкубированным в водяной бане при температуре 37 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: KRBH не содержит BSA и глюкозы. Перфузионный буфер KRBH без человеческого инсулина содержит 5,0 ммоль/л глюкозы и 0,25% BSA, в то время как перфузионный буфер KRBH с человеческим инсулином содержит 5,0 ммоль/л глюкозы, 0,25% BSA и 4,0 нг/мл человеческого инсулина. - Поместите мышь в контейнер с температурой окружающей среды, поддерживаемой на уровне около 37 °C. Используйте греющую подушечку, чтобы поддерживать температуру тела на уровне 37 °C.
- Введите буфер KRBH через катетер воротной вены. Установите скорость инфузии на уровне 0,2 мл/мин с помощью мини-помпы.
- Обратите внимание, что печень бледнеет в течение нескольких секунд, что указывает на то, что перфузионный буфер протекает через печень. Чтобы вымыть больше оставшихся клеток крови в печени, приостановите инфузию на 1 минуту через 4 и 8 минут, начав время с начала перфузии.
- Перфузируйте печень буфером KRBH в течение 10 минут (без учета двух пауз по 1 минуте), что соответствует периоду равновесия. Соберите базальный образец из катетера нижней полой вены.
- Перфузируйте печень тем же раствором, обогащенным инсулином (4,0 нг/мл человеческого инсулина) еще на 30 мин.
- Отбирайте все образцы из нижней полой вены каждые 2 минуты.
- Запишите вес печени после перфузии. Соберите образцы печени из разных долей, сразу заморозьте их в жидком азоте, а затем перенесите на хранение при температуре -80 °C.
- Центрифугируйте все собранные образцы перфузии при температуре ~1 000 x g в течение 10 минут при 4 °C. Соберите надосадочную жидкость и перенесите их на хранение при температуре -80 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация инсулина в образцах перфузии измеряется с помощью наборов иммуноферментного анализа человека (ИФА). - После процедуры убедитесь, что все биологические отходы утилизированы в соответствии с правилами безопасности.
4. Анализ данных
- Представьте данные в виде графиков XY, показывающих выход концентрации инсулина с течением времени.
- Рассчитайте среднюю скорость клиренса печеночного инсулина (HICRAVE) по следующей формуле:
HICRAVE = (1−Cf/Ci) × 100%
где Ci = начальная концентрация инсулина в инфузионном буфере, Cf = конечная средняя концентрация инсулина за последние 10 мин из надпеченочной нижней полой вены.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
В этом протоколе описана процедура инфузии печени для непосредственного расчета клиренса печеночного инсулина. Эта модель надежна и воспроизводима. Пример результатов, полученных в результате эксперимента, показан на рисунке 3. После 10-минутного периода равновесия буфер KRBH с добавлением 4,0 нг/мл человеческого инсулина перфузировали через воротную вену в течение 30 минут. Перфузионную жидкость собирали из катетера в надпеченочную нижнюю полую вену с интервалом в 2 минуты, и измеряли конце...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Критические шаги в протоколе
Описанные выше хирургические процедуры должны выполняться с бережной осторожностью, чтобы избежать образования каких-либо повреждений в печени. Кроме того, хрупкая структура стенки сосуда вены печени делает его уязвимым для прокола и последующего кровотечения, если с ним не обращаться осторожно во время канюляции. В этом протоколе используются более мягкие силиконовые трубки, чтобы свести к минимуму повреждение кровеносных сосудов. Рекомен...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
О конфликте интересов заявлено не было.
Благодарности
Работа выполнена при поддержке Национального фонда естественных наук Китая (82200948, 82270921, 82170882).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 60% диета с высоким содержанием жиров | Исследовательские диеты, США | D12492 | |
| Набор для анализа аланинаминотрансферазы | Нанкинский институт биоинженерии | C009-2-1 | |
| Безводная глюкоза | Sangon Biotech | 50-99-7 | 500 г |
| Аспартатаминотрансфераза Набор для анализа | Нанкинский институт биоинженерии | C010-2-1 | |
| Сыворотка крупного рогатого скота Альбумин | GeminiBio | 700-107P | |
| Контурный глюкометр TS | Bayer | PH220800019 | |
| тест-полоски для определения уровня глюкозы в крови | Contour TS Bayer | DP38M3F05A | |
| гепарин натрия | Changzhou Qian hong Bio-pharma | H32022088 | 12500 ЕД/2 мл |
| Человеческий инсулин | Novo Nordisk | S20191007 | 300 ЕД/3 мл |
| Набор для иммуноферментного анализа человеческого | инсулина Ezassay Biotechnology | HM200 | |
| KRBH buffer (сахар, без BSA) | охлаждающий | SL65501 | 500 мл |
| Мембранный оксигенатор | Xi'an Xijing Medical Appliance | 5 | |
| Микроскопические ножницы | Shanghai Jinzhong | YBC020 | |
| Micro-serrefine clamp | Ningbo Medical Needle | 180709 | |
| Микрохирургические щипцы | Shanghai Jinzhong | WA3010, WA3020 | |
| Игольчатый фильтр | N-buliv | LG05-133-2 | |
| Раствор повидон-йода | Shanghai likang Дезинфицирующее средство Hi-Tech | 20231016J | |
| насос 11 Elite | Harvard Apparatus | PC5 70-4500 | |
| Втягивающее | Globalebio (Пекин) Технология | GEKK-10 мм | 10 мм |
| Силиконовая трубка | научные товары | #BB518-12 | 0,31 мм × 0,64 мм |
| Силиконовая трубка | Fisher Scientific | #11-189-15A | ID 0,5 мм |
| Хлорид натрия для инъекций | Baxter | S2402023 | 4,5 г/500 мл |
| Хирургический шелковый шов | Yangzhou Huanyu Medical Equipment | 6-0 | |
| Модуляция температуры | Xi'an Xijing Medical Appliance | 6 | |
| Термостатическая водяная баня | Jiaxing Junsi Electronics | HIH-1 | 220 В 50 Гц |
| Трехсторонний шарнир | YISAI | AQTCY1.6 | ID 0.4 мм |
| Ксилазина гидрохлорид для инъекций | ShengXin | 20240106 | 200 мг/2мл |
| Zoletil 50 | Virbac | WK001 | 250 мг/5мл |
Ссылки
- Najjar, S. M., Perdomo, G. Hepatic insulin clearance: Mechanism and physiology. Physiology (Bethesda). 34 (3), 198-215 (2019).
- Fu, Z., et al. Impaired insulin clearance as the initial regulator of obesity-associated hyperinsulinemia: Novel insight into the underlying mechanism based on serum bile acid profiles. Diabetes Care. 45 (2), 425-435 (2022).
- Koh, H. E., Cao, C., Mittendorfer, B. Insulin clearance in obesity and type 2 diabetes. Int J Mol Sci. 23 (2), 596(2022).
- Bril, F., et al. Relationship between disease severity, hyperinsulinemia, and impaired insulin clearance in patients with nonalcoholic steatohepatitis. Hepatology. 59 (6), 2178-2187 (2014).
- Herman, R., Sikonja, J., Jensterle, M., Janez, A., Dolzan, V. Insulin metabolism in polycystic ovary syndrome: Secretion, signaling, and clearance. Int J Mol Sci. 24 (4), 3140(2023).
- Najjar, S. M., Caprio, S., Gastaldelli, A. Insulin clearance in health and disease. Annu Rev Physiol. 85, 363-381 (2023).
- Polidori, D. C., Bergman, R. N., Chung, S. T., Sumner, A. E. Hepatic and extrahepatic insulin clearance are differentially regulated: Results from a novel model-based analysis of intravenous glucose tolerance data. Diabetes. 65 (6), 1556-1564 (2016).
- Castillo, M. J., Scheen, A. J., Letiexhe, M. R., Lefebvre, P. J. How to measure insulin clearance. Diabetes Metab Rev. 10 (2), 119-150 (1994).
- Rubenstein, A. H., Pottenger, L. A., Mako, M., Getz, G. S., Steiner, D. F. The metabolism of proinsulin and insulin by the liver. J Clin Invest. 51 (4), 912-921 (1972).
- Terris, S., Steiner, D. F. Binding and degradation of 125i-insulin by rat hepatocytes. J Biol Chem. 250 (21), 8389-8398 (1975).
- Ooms, H. A., Arnould, Y., Rosa, U., Pennisi, G. F., Franckson, J. R. Total metabolic clearance of crystalline insulin and radio-iodide substitued insulin. Pathol Biol. 16 (5), 241-245 (1968).
- Defronzo, R. A., Tobin, J. D., Andres, R. Glucose clamp technique: A method for quantifying insulin secretion and resistance. Am J Physiol. 237 (3), E214-E223 (1979).
- Asare-Bediako, I., et al. Assessment of hepatic insulin extraction from in vivo surrogate methods of insulin clearance measurement. Am J Physiol Endocrinol Metab. 315 (4), E605-E612 (2018).
- Kim, S. P., Ellmerer, M., Kirkman, E. L., Bergman, R. N. Beta-cell "rest" accompanies reduced first-pass hepatic insulin extraction in the insulin-resistant, fat-fed canine model. Am J Physiol Endocrinol Metab. 292 (6), E1581-E1589 (2007).
- Kotsis, T., et al. Insulin metabolism and assessment of hepatic insulin extraction during liver regeneration. A study in a rat model. J Invest Surg. 33 (1), 69-76 (2020).
- Mondon, C. E., Olefsky, J. M., Dolkas, C. B., Reaven, G. M. Removal of insulin by perfused rat liver: Effect of concentration. Metabolism. 24 (2), 153-160 (1975).
- Tamaki, M., et al. The diabetes-susceptible gene SLC30A8/ZnT8 regulates hepatic insulin clearance. J Clin Invest. 123 (10), 4513-4524 (2013).
- Ghadieh, H. E., Gastaldelli, A., Najjar, S. M. Role of insulin clearance in insulin action and metabolic diseases. Int J Mol Sci. 24 (8), 7156(2023).
- Winther-Sorensen, M., Kemp, I. M., Bisgaard, H. C., Holst, J. J., Wewer Albrechtsen, N. J. Hepatic glucose production, ureagenesis, and lipolysis quantified using the perfused mouse liver model. J Vis Exp. 200, e65596(2023).
- Rydell-Tormanen, K., Johnson, J. R. The applicability of mouse models to the study of human disease. Methods Mol Biol. 1940, 3-22 (2019).
- Zaidi, S., et al. Loss of ceacam1 in hepatocytes causes hepatic fibrosis. Eur J Clin Invest. 54 (7), e14177(2024).
- Piccinini, F., Bergman, R. N. The measurement of insulin clearance. Diabetes Care. 43 (9), 2296-2302 (2020).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
