Методическая статья

Использование органоидов кишечника человека для понимания эпителия тонкой кишки на уровне транскрипции отдельных клеток

1.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/66749

⸱

28 июня 2024 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Virology and Microbiology, Baylor College of Medicine, 2Department of Molecular and Cellular Biology, Baylor College of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

Протокол сочетает в себе технологию органоидов кишечника человека с транскриптомным анализом отдельных клеток, чтобы обеспечить значительное понимание ранее неизученной биологии кишечника.

Аннотация

Транскриптомика одиночных клеток произвела революцию в нашем понимании клеточной биологии человеческого организма. Современные культуры органоидов тонкого кишечника человека обеспечивают модельные системы ex vivo , которые устраняют разрыв между животными моделями и клиническими исследованиями. Применение транскриптомики одиночных клеток к моделям кишечных органоидов (ГИО) человека раскрывает ранее непризнанную клеточную биологию, биохимию и физиологию желудочно-кишечного тракта. Передовые платформы транскриптомики одиночных клеток используют микрофлюидное разделение и штрихкодирование для создания библиотек кДНК. Эти кДНК со штрих-кодами могут быть легко секвенированы платформами секвенирования нового поколения и использованы различными инструментами визуализации для создания карт. В данной работе мы описываем методы культивирования и дифференциации ГИО тонкого кишечника человека в различных форматах и процедуры выделения жизнеспособных клеток из этих форматов, которые подходят для использования в платформах профилирования транскрипции одиночных клеток. Эти протоколы и процедуры облегчают использование ГИО тонкого кишечника для получения более глубокого понимания клеточного ответа эпителия кишечника человека на транскрипционном уровне в контексте различных сред.

Введение

Эпителий тонкой кишки имеет две четко выраженные зоны: крипту, в которой находятся кишечные стволовые клетки (ISC), и ворсинки, которые состоят из дифференцированных клеток секреторной и абсорбционной линий. К этой сложности добавляется региональная специфичность эпителия, которая обеспечивает уникальные функциональные свойства между областями тонкой кишки. Новаторская работа позволила создать условия культивирования, в которых как крипта тонкой кишки человека, так и зоны ворсин могут быть созданы ex vivo из хирургических тканей или биопсии тканей1. Эти культуры преодолевают разрыв между исследованиями на животных и клиническими испытаниями и раскрывают ранее непризнанную клеточную биологию, биохимию и физиологию желудочно-кишечного тракта. HIO размножаются в виде 3D-сферических структур с использованием среды с факторами роста, которые способствуют жизнеспособности стволовых клеток и внеклеточным поддерживающим матрицам. Эти условия приводят к криптоподобной модели HIO, которая состоит в основном из предшественников и стволовых клеток. Удаление факторов роста способствует дифференцировке ISC (ворсинчатая модель) и производству зрелых эпителиальных клеток кишечника (бокаловидных, энтероэндокринных, хохолковых, энтероцитарных) в соответствующих соотношениях, а также пролиферации и дифференцировке клеток, поляризации, целостности барьера, региональным особенностям и соответствующим физиологическим реакциям2. Культуры HIO генетически стабильны и могут размножаться бесконечно долго в своем криптообразном состоянии. Легкий доступ к верхушечной поверхности этих культур обеспечивается условиями культивирования, позволяющими выращивание в монослоевом формате3. HIO также позволяют учитывать индивидуальную изменчивость хозяина, такую как генетика, возраст, пол, этническая принадлежность и статус заболевания, которые могут быть включены в биологический анализ. Аналитические и функциональные инструменты оценки идентичны тем, которые используются в подходах, сосредоточенных на трансформированных клеточных линиях, и включают в себя различные молекулярные методы, такие как проточная цитометрия, микроскопия, транскриптомика, протеомика и метаболомика.

Транскриптомика одиночных клеток революционизирует наше понимание биологии и физиологии тонкой кишки, давая представление об индивидуальном вкладе каждого типа клеток в биологический процесс. Новаторская работа с использованием этой технологии позволила получить представление о типах клеток, присутствующих в нативном кишечнике человека 4,5,6. Платформы транскрипционного профилирования отдельных клеток позволяют исследовать транскрипционный ландшафт отдельных клеток, позволяя гетерогенности клеток выйти на передний план научных исследований. В некоторых платформах транскрипционного профилирования отдельных клеток микрофлюидное деление и штрихкодирование используются для создания библиотек кДНК из клеточных полиаденилированных мРНК, полученных из 10 000 клеток на образец. На этой платформе капли, содержащие отдельные клетки, олигонуклеотиды со штрих-кодом, реагенты с обратной транскрипцией и масло, образуют реакционный везикул, в результате чего все кДНК из одной клетки имеют один и тот же штрих-код. Затем кДНК со штрих-кодом могут быть эффективно секвенированы с помощью секвенирования нового поколения. Генерируемые данные могут обрабатываться с помощью программного обеспечения и инструментов визуализации, которые преобразуют штрихкодированные последовательности в карты визуализации и профили транскрипции отдельных клеток. Клеточные популяции могут быть идентифицированы с помощью общедоступных баз данных эпителия тонкой кишки человека 4,5,6. Несмотря на то, что во многих исследованиях эта платформа использовалась для изучения органоидов кишечника мышей на уровне отдельных клеток, анализ транскрипционных реакций HIO на отдельные клетки отстает от 7,8,9,10,11,12.

Здесь мы предоставляем пошаговое руководство по выделению жизнеспособных клеток из тонкокишечных ГИО для обработки на платформах профилирования транскрипции одиночных клеток (рис. 1). Мы предоставляем рекомендации по культивированию и дифференцировке, а также компоненты среды, оптимизированные для дифференцировки эпителия. Мы описываем методы восстановления клеток для трех различных форматов культур: трехмерных (3D) и монослойных культур либо на пластике, либо на мембранных вставках для клеточных культур. Мы предоставляем образцы данных кластеризации, полученные с помощью программного обеспечения с открытым исходным кодом, для получения дифференциально экспрессируемых генов в каждом кластере.

Протокол

Используемые здесь линии органоидов были получены из Центра заболеваний пищеварительной системы Техасского медицинского центра GEMS Core. Вкратце, чтобы первоначально установить органоидные линии, образцы донорских тканей промывали и ферментативно переваривали для высвобождения кишечных крипт. Крипты были встроены в базальную мембрану и культивировались в среде. Институциональный наблюдательный совет Медицинского колледжа Бейлора одобрил протокол исследования для получения образцов тканей, из которых были созданы органоидные линии, и было получено информированное согласие от всех доноров на создание органоидных линий из донорской ткани.

1. Прохождение 3D HIO для расширения для дифференциации

  1. Удалите и отбракуйте среду из лунок с органоидами, выращенными в 24-луночных планшетах (вокруг твердой базальной мембраны) с помощью пипетки P1000. Добавьте в лунку 300 мкл 0,05% трипсина-ЭДТА и механически разбейте органоиды путем пипетирования пипеткой P1000 вверх и вниз 5 раз.
  2. Выдерживать в столовой температуре при температуре 37 °C в течение 4 минут. Добавьте в каждую лунку 500 μл полной среды без факторов роста (CMGF-medium) с 10% FBS (табл. 1). Используйте пипетку P1000 и смесь CMGF и HIO 10 раз вперед и назад в лунке. Переложите весь объем в пробирку объемом 15 мл. Объедините проход из нескольких лунок в одну и ту же пробирку объемом 15 мл. Не объединяйте более 10 лунок в одной трубе.
  3. Вращайте ячейки при температуре 4 °C с помощью центрифуги с поворотным ротором при давлении 100 x g в течение 5 минут. Удалите всю среду, сохранив гранулу на дне трубки. Держите трубку на льду.
  4. Рассчитайте необходимое количество базальной мембраны для количества пластин HIO и повторно суспендируйте гранулу HIO в 30 мкл/лунку базальной мембраны с помощью холодных наконечников для пипеток P200. Пипетируйте смесь базальной мембраны HIO в виде капель в центр 24-луночного планшета с помощью холодных наконечников пипетки P200.
  5. Перенесите планшет в инкубатор с температурой 37 °C. Дайте базальной мембране застыть в течение 5-10 минут, затем добавьте 500 μл полной среды комнатной температуры, содержащей WNT, R-спондин, ноггин, EGF и ингибитор ROCK (WRNE+Y; Таблица 1) в каждую лунку и культуру в инкубаторе при температуре 37 °С. Обновляйте культуру с помощью WRNE+Y через день в течение 7 дней.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Здоровый ГИО будет кистозной формы с блестящим почковающимся эпителием (Рисунок 2). Клетки в середине кисты не могут быть визуализированы. Нездоровый ГИО будет выглядеть тусклым и иметь толстый эпителий с твердой серединой. Самая главная характеристика – это блестящий внешний вид.

2. Дифференциация HIO: 3D-формат

  1. Используйте одну лунку 3D HIO для 3 лунок 3D дифференцированных HIO через 1 неделю после культивирования.
  2. Удалите среду из колодцев. Диспергируйте базальную мембрану и HIO с помощью пипетки P1000 и добавьте холодные 500 мкл CMGF- в лунку и пипетируйте вверх и вниз не менее 5 раз. Понизьте температуру HIO при 4 °C с помощью центрифуги с поворотным ротором при 100 x g в течение 5 минут. Удалите всю среду, держа гранулу на дне пробирки.
  3. Добавьте 30 мкл базальной мембраны на каждую лунку с оцинковкой HIO. Пипетируйте каплю базальной мембраны объемом 30 мкл с HIO в лунку 24-луночного планшета. Выдерживать при температуре 37 °C в течение 10 минут. Добавьте 500 мкл фильтрующего материала WRNE+Y/Diff (50/50).
  4. Переключите среду на среду для дифференцировки через 24 часа на 3 дополнительных дня, обновляя среду через день. Подготовьте 3 лунки на пробу для пула, чтобы уменьшить техническую вариативность.

3. Дифференциация HIO: однослойный формат

  1. Покройте мембрану клеточной культуры вставками или лунками 96-луночного планшета 100 μл/лунку человеческого плацентарного коллагена IV (1 мг/мл в 100 мМ уксусной кислоте), разведенным в холодном H2O (1:30). Инкубировать при температуре 37 °C в течение минимум 1,5 ч или максимум в течение ночи. Для вставки мембранной клеточной культуры добавьте стерильный H2O в пространство планшета, чтобы увлажнить планшет; для 96-луночного планшета добавьте стерильный H2O в неиспользованные лунки.
  2. Соберите 3D HIO, культивируемые в WRNE, в течение 7 дней, удалив среду и восстановив базальную мембрану и клетки путем добавления 500 мкл/лунку холодного 0,5 мМ ЭДТА (0,5 М ЭДТА, разведенного 1:1000 в стерильном PBS). С помощью пипетки P1000 пипетируйте органоиды и раствор вверх и вниз 5 раз и переложите в микроцентрифужную пробирку объемом 15 мл. Не собирайте более 10 лунок органоидов в одной трубе. Центрифуга в течение 5 мин при 300 x g в качающемся роторе ковша при 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы подготовить 3 лунки на 96-луночном планшете, используйте 1 лунку 3D HIO. Для приготовления 1 вкладыша для мембранной клеточной культуры используйте 1 лунку 3D HIO (плотность посева одиночных клеток составляет примерно 1-2 x 105 клеток/лунка для 96-луночного планшета, 2,5-3 x 105 клеток/лунка для мембранной клеточной культуры).
  3. Удалите 500 μл среды, оставив гранулу на дне пробирки. Диссоциацию HIO путем добавления 500 мкл 0,05% трипсина/0,5 мМ ЭДТА и инкубации в течение 4-5 мин при 37 °C. Энергично пипетируйте вверх и вниз в ~50 раз с помощью P1000. Избегайте образования пузырьков путем пипетирования к боковой стороне трубки.
  4. Инактивируйте трипсин, добавив 1 мл CMGF-, содержащего 10% FBS. Отфильтруйте большие скопления непереваренных клеток, смочив клеточный фильтр размером 40 мкм 1 мл CMGF-, содержащего 10% FBS, и добавив клетки в верхнюю часть клеточного фильтра. Используйте силу тяжести, чтобы позволить клеткам пройти через сетчатый фильтр, и выбросьте сетчатый фильтр, содержащий клеточные комки.
  5. Соберите ячейки центрифугированием в течение 5 мин при давлении 400 x g в качающемся роторе ведра при комнатной температуре.
  6. Удалите жидкость из мембранной клеточной культуры, покрытой коллагеном, или из 96-луночного планшета. Ресуспендируйте гранулу HIO в 100 мкл/лунку WRNE, содержащей 10 мкМ Y-27632, затем пипетку в верхний отсек мембранной клеточной культуры или в 96-луночный планшет. Для вставки мембранной клеточной культуры добавьте 600 мкл WRNE, содержащего 10 мкМ Y-27632, в нижний отсек лунки.
  7. Через 24 ч удалите среду из верхней и нижней части мембранной клеточной культуры или из 96-луночного планшета и замените средой для дифференцировки на 5 дней. Подготовьте 3 лунки на пробу для пула, чтобы уменьшить техническую вариативность.

4. Получение суспензий одиночных клеток из дифференцированных 3D HIO для транскриптомики одиночных клеток

  1. Поместите реагент для ферментативного расщепления клеток при температуре 37 °C в инкубатор с CO2 для размораживания и нагревания за 30 минут до начала 3D разложения HIO. Проверьте HIO с помощью светлопольного микроскопа с 10-кратным увеличением, чтобы убедиться в здоровье клеток.
  2. Удалите фильтрующий материал из лунок и добавьте в лунки 500 мкл раствора для восстановления холодных камер. Проводите пипетку вверх и вниз несколько раз, чтобы освободить клетки от базальной мембраны, с помощью пипетки P1000 и стандартных наконечников для пипетки. Перенесите клеточную суспензию в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Использование реплицирующих лунок обеспечивает достаточное количество клеток и снижает вариацию от скважины к лунке. Не объединяйте лунки до шага 4.7 ниже.
  3. Инкубируйте пробирки клеток на льду в течение 10 минут, пипетируя вверх и вниз каждые 5 минут. Соберите клетки центрифугированием в течение 3 мин при 400 x g при 4 °C.
  4. Удалите жидкость из трубки, стараясь не потревожить клеточную гранулу. Ресуспендируйте клетки в 500 мкл предварительно подогретого ферментативного реагента для расщепления клеток. Проводите пипетку вверх и вниз с помощью P1000 не менее 10 раз.
  5. Инкубируйте HIO в течение 30 минут при 37 °C в инкубаторе сCO2 . Каждые 10 минут пипетируйте весь объем 10 раз с помощью пипетки P1000, чтобы помочь диссоциировать клетки. Избегайте введения пузырьков воздуха в клеточную суспензию.
  6. Гранулируйте ячейки в течение 3 минут при 400 x g при 4 °C. Удалите надосадочную жидкость, ресуспендируйте клетки в 1 мл дифференцировочной среды и храните на льду.
    ПРИМЕЧАНИЕ: С этого момента HIO всегда должны находиться на льду.
  7. Быстро пипетируйте ячейки вверх и вниз 50 раз с помощью P1000, чтобы убедиться, что HIO диссоциированы на отдельные клетки. Следите за тем, чтобы на этом этапе не появились пузырьки воздуха, так как это приведет к потере клеток.
  8. Отфильтруйте весь объем через сетчатый фильтр с наконечником 70 μм с помощью наконечника для дозатора P1000. Используйте микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл для сбора элюата.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Наконечник фильтра не засорится, если время для разложения достаточное. Используйте несколько наконечников фильтра, если фильтр засоряется; Не продавливайте громкость через фильтр с силой.
  9. Повторите шаг 4.8 с фильтром с наконечником 40 мкм. Храните образцы на льду.
  10. Подсчитывайте жизнеспособные одиночные клетки в камере для подсчета клеток с использованием исключения трипанового синего путем добавления 5 мкл 0,4% трипанового синего к 5 мкл клеточной суспензии. Разбавьте образец по мере необходимости до 1000 клеток/мкл. Если плотность клеток составляет менее 1000 клеток/мкл, гранулированные клетки в течение 2 мин при 400 x g при 4 °С, удалить исходную среду и ресуспендировать в средах клеточных культур. Этот протокол обычно дает 5 x 105-1 x 106 ячеек.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовление высококачественной суспензии (90% жизнеспособных и 90% одиночных клеток) имеет важное значение для получения высококачественных данных об одиночных клетках. Тем не менее, опыт показывает, что жизнеспособность может быть достигнута на уровне 75% в тех случаях, когда лечение, такое как инфекция или применение малых молекул, влияет на жизнеспособность.
  11. Подготовка библиотек ДНК для платформ транскрипционного профилирования одиночных клеток в соответствии с протоколами производителя. Обработка данных в соответствии с протоколами передовой практики для анализа данных scRNAseq13,14.

5. Получение суспензий одиночных клеток из HIO, дифференцированных на вставке для мембранных клеточных культур

  1. Поместите реагент для ферментативного расщепления клеток при температуре 37 °C в инкубатор сCO2 для размораживания и нагревания за 30 минут до начала расщепления мембранной клеточной культуры HIO. Разделите предварительно подогретый реагент для ферментативного расщепления клеток на 200 мкл аликвот в микроцентрифужных пробирках объемом 1,5 мл, по 1 пробирке на каждую мембранную вставку для клеточной культуры. Храните пробирки в инкубаторе при температуре 37 °C до тех пор, пока они не будут готовы к использованию.
  2. Приготовьте PBS-EDTA, добавив 5 мкл 0,5 М ЭДТА к 5 мл PBS. Аликвота 500 мкл PBS-EDTA в 24-луночный планшет, по 1 лунке на мембранную вставку для клеточной культуры.
  3. Промойте клетки PBS-EDTA: перенесите вставки для мембранных клеточных культур из лунок, содержащих питательные среды, в лунки, содержащие PBS-EDTA. Удалите среду для культивирования клеток с апикальной стороны и замените ее 100 мкл PBS-EDTA. Следите за тем, чтобы не потревожить клеточный слой.
  4. Немедленно выбросьте PBS-EDTA, добавленный на апикальную сторону мембраны клеточной культуры. Извлеките мембранную вставку для клеточной культуры из лунки, промокните ее, аккуратно коснувшись края бумажным полотенцем, а затем переверните на столешнице. С помощью острого лезвия скальпеля удалите мембрану из вставки, разрезав ее по внутренней окружности. Работайте быстро, чтобы предотвратить высыхание.
  5. С помощью щипцов перенесите мембрану в предварительно нагретую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл, заполненную ферментативным реагентом для расщепления клеток, и убедитесь, что мембрана полностью погружена в воду. Повторите эти действия для всех дополнительных вставок для мембранных клеточных культур.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Увеличение объема реагента для ферментативного расщепления клеток до 500 мкл может помочь в диссоциации плотных монослоев.
  6. Диссоциируйте клетки путем инкубации трубок с мембранами при температуре 37 °C в инкубаторе сCO2 . Перемешивайте, аккуратно дозируя весь объем 5 раз с помощью пипетки объемом 200 мкл каждые 10 минут в общей сложности 30 минут. Избегайте образования пузырей и всасывания мембраны для сохранения жизнеспособности.
  7. Переносите небольшую аликвоту клеток (1-2 мкл) на предметное стекло каждые 10 мин для оценки диссоциации путем качественной оценки процента одиночных клеток. При дополнительном пипетировании может потребоваться до 50 минут для достижения 80%-90% одиночных клеток, в зависимости от типа HIO. Осторожно соскабливайте мембрану наконечником пипетки во время смешивания, чтобы стимулировать диссоциацию, особенно для трудно диссоциируемых клеток, однако соскоб может повлиять на жизнеспособность.
  8. Объедините 3 повторяющиеся лунки в одном микроцентрифужном пробирке объемом 1,5 мл (всего 600 мкл). Добавьте 400 μL среды для клеточных культур (diff) + 10 μM ROCKi (1 мл общего объема). Аккуратно перемешайте с помощью пипетки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Использование реплицирующих лунок обеспечивает достаточное количество клеток и снижает вариацию от скважины к лунке. На этом этапе скважины должны быть объединены.
  9. Отфильтруйте весь объем через ситечко с наконечником 70 μм с помощью наконечника для дозатора объемом 1 мл. Соберите поток в свежую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Наконечник фильтра не засорится, если время для разложения достаточное. Используйте несколько наконечников фильтра, если фильтр засоряется; Не продавливайте громкость с силой.
  10. Повторите шаг 5.9 с помощью ситечка с наконечником 40 мкм. Храните образцы на льду.
  11. Подсчитывайте жизнеспособные одиночные клетки в камере для подсчета клеток с использованием исключения трипанового синего путем добавления 5 мкл 0,4% трипанового синего к 5 мкл клеточной суспензии. Разбавьте образец по мере необходимости до 1000 клеток/мкл. Если плотность клеток меньше 1000 клеток/мкл, вращайте 2 мин при 400 x g при 4 °C, чтобы гранулировать клетки, удалить исходную среду и ресуспендировать в WRNE+Y при желаемой плотности клеток. Этот протокол обычно дает 4 x 105 - 6 x 105 ячеек.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовление высококачественной суспензии (90% жизнеспособных и 90% одиночных клеток) имеет важное значение для получения высококачественных данных об одиночных клетках. Тем не менее, опыт показывает, что жизнеспособность может быть достигнута на уровне 75% в тех случаях, когда лечение, такое как инфекция или применение малых молекул, влияет на жизнеспособность.
  12. Подготовка библиотек ДНК для платформ профилирования транскрипции одиночных клеток в соответствии с протоколами производителя. Обработка данных в соответствии с протоколами передовой практики для анализа данных scRNAseq13,14.

6. Получение суспензий одиночных клеток из ГИО, дифференцированных в виде 96-луночных монослоев

  1. Поместите реагент для ферментативного расщепления клеток при температуре 37 °C в инкубатор сCO2 для размораживания и нагрева за 30 минут до начала однослойного разложения HIO.
  2. Приготовьте PBS-EDTA, добавив 5 мкл 0,5 М ЭДТА к 5 мл PBS. Выбросьте среду для культивирования клеток из 96-луночного планшета и замените ее 100 мкл PBS-EDTA. Следите за тем, чтобы не потревожить клеточный слой.
  3. Диссоциируйте клетки: выбросьте PBS-EDTA и добавьте 100 μL теплого ферментативного реагента для расщепления клеток в каждую лунку. Поместите планшет в температуру 37 °C в инкубатор с 5%CO2 и перемешивайте, аккуратно пипетируя весь объем 5 раз наконечником для дозатора объемом 200 мкл каждые 10 минут в течение 20-30 минут. Избегайте образования пузырьков, чтобы сохранить жизнеспособность.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Увеличение объема реагента для ферментативного расщепления клеток до 500 мкл может помочь в диссоциации плотных монослоев.
  4. Переносите небольшую аликвоту клеток (1-2 мкл) на предметное стекло каждые 10 минут для оценки диссоциации. Для достижения 80%-90% одиночных клеток может потребоваться до 50 минут, в зависимости от типа HIO. Осторожно соскребите пластину наконечником пипетки во время смешивания, чтобы стимулировать диссоциацию, особенно для трудно диссоциируемых клеток; Тем не менее, скребок может повлиять на жизнеспособность.
  5. Объедините 3 повторяющиеся лунки в одном микроцентрифужном пробирке объемом 1,5 мл (всего 300 мкл). Добавьте 700 мкл среды для культивирования клеток (diff) + 10 мкМ ROCKi (общий объем 1 мл). Аккуратно перемешайте с помощью пипетки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Использование реплицированных лунок, выращенных в лунках, обеспечивает достаточное количество клеток и снижает вариацию от скважины к лунке.
  6. Отфильтруйте весь объем через ситечко с наконечником 70 μм с помощью наконечника для дозатора объемом 1 мл. Соберите поток в свежую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Наконечник фильтра не засорится, если время расщепления реагента ферментативного расщепления клеток достаточно. Используйте несколько наконечников фильтра, если фильтр засоряется; Не продавливайте громкость с силой.
  7. Повторите шаг 6.6 с помощью ситечка с наконечником 40 мкм. Храните образцы на льду.
  8. Подсчитывайте жизнеспособные одиночные клетки в камере для подсчета клеток с использованием исключения трипанового синего путем добавления 5 мкл 0,4% трипанового синего к 5 мкл клеточной суспензии. Разбавьте по мере необходимости до 1000 клеток/мкл. Если плотность клеток составляет менее 1000 клеток/мкл, вращайте 2 мин при 400 x g 4 °C, чтобы гранулировать клетки, удалить исходную среду и ресуспендировать в среде клеточных культур + ROCKi при желаемой плотности клеток. Этот протокол обычно дает 2 x 105 - 6 x 105 ячеек.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовление высококачественной суспензии (90% жизнеспособных и 90% одиночных клеток) имеет важное значение для получения высококачественных данных об одиночных клетках. Тем не менее, опыт показывает, что жизнеспособность может быть достигнута на уровне 75% в тех случаях, когда лечение, такое как инфекция или применение малых молекул, влияет на жизнеспособность.
  9. Подготовка библиотек ДНК в соответствии с протоколами производителя платформы транскрипционного профилирования одиночных клеток. Обработка данных в соответствии с протоколами передовой практики для анализа данных scRNAseq13,14.

Результаты

Суспензии одиночных клеток объединяли из 2-3 лунок мембранных клеточных культур, монослоя и 3D HIO для обеспечения достаточного выхода клеток и снижения вариаций от скважины к лунке. Библиотеки одиночных клеток были подготовлены с использованием реагентов, специфичных для платформы профилирования транскрипции одиночных клеток. и секвенирован с парными концевыми чтениями на платформе секвенирования нового поколения, 30 000 прочтений на ячейку. Прочтения были картированы, подсчитаны и проанализированы с использованием аналитических инструментов для геномики отдельных клеток. Клетки низкого качества с более чем 20% митохондриального чтения или менее 200 подсчитанных генов были исключены из анализа. Чтобы оценить качество клеток, мы построили график количества генов, UMI и процента митохондриальных прочтений на клетку (рис. 3); высококачественные клетки содержат около 3500 генов, 15 000 UMI и 10% митохондриальных прочтений. После фильтрации мы получили от 4000 до 9500 одиночных клеток в зависимости от формата роста HIO. Неконтролируемая кластеризация и уменьшение размерности UMAP выявили отдельные кластеры, представляющие ожидаемые типы клеток, включая абсорбционные энтероциты и секреторные клетки (рис. 4).

figure-results-1
Рисунок 1: Схема этапов протокола. Схемы, описывающие основные этапы нанесения покрытий HIO в различных форматах на рабочий процесс обработки данных одной ячейки. Это изображение было создано с помощью Biorender. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2: Изображения в светлом поле. Готовые к обработке ГИО были визуализированы с помощью светлопольного микроскопа с 5-кратным увеличением. Слева, 3D органоиды; средняя, 96-луночная пластина; Правильно, Трансвелл. Масштабные линейки = 200 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-3
Рисунок 3: Контроль качества данных. Примеры метрик проанализированных одиночных клеток, выделенных из тощей кишки, выращенных в виде монослоев на 96-луночных планшетах. Графики Скрипки показывают количество генов (nFeature_RNA), UMI (nCount_RNA) и процент митохондриальных прочтений (percent.mt) в клетке. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-4
Рисунок 4: UMAP проанализированных одиночных клеток. (A) В общей сложности 9952 одиночные клетки были выделены из дифференцированных HIO тощей кишки, выращенных в 96-луночных планшетах. (B) В общей сложности 5623 одиночные клетки были выделены из дифференцированных HIO тощей кишки, выращенных на имплантатах мембранных клеточных культур. (C) В общей сложности 4402 одиночные клетки были выделены из дифференцированных подвздошных 3D HIO. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Питательная среда WRNEДифференцирующая среда
КомпонентТомОкончательная концентрацияСреда WRNE без кондиционированной среды L-WRN, никотинамида и SB202190
*Y-27632 (5 mM) опционально200 μл10 μМ
А 83-01 (500 мкМ)100 мкл500 нм
Усовершенствованный DMEM/F1245 мл
В272 мл
ЭФР (50 мкг/мл)100 мкл50 нг/мл
Гастрин (10 μМ)100 мкл10 нМ
ГлутаМакс (100Х)1 мл
ГЕПЕС 1 М1 мл
L-WRN Кон- Медиа50 мл~50%
N21 мл
N-ацетилцистеин (500 мМ)100 мкл500 мкМ
Никотинамид 1 М1 мл10 мМ
SB202190 (10 мМ)100 мкл10 μМ
Общий объем100 мл
CMGF- Средний
Усовершенствованный DMEM/F12500 мл
Глутамакс5 млВ 100 раз
1 м хепес5 мл

Таблица 1: Состав различных используемых сред.

Обсуждение

Используя платформы геномики отдельных клеток, сложные биологические системы, такие как тканевые культуры HIO, моделирующие кишечный эпителий, могут быть расщеплены для получения индивидуального клеточного вклада в общий биологический ответ 4,5,6. Клеточная гетерогенность и редкие клеточные популяции также могут быть идентифицированы и исследованы. Клеточный вход должен быть оптимизирован для максимизации выходного сигнала с использованием платформ на основе одноклеточной транскриптомики. Здесь мы описываем протоколы, которые позволят получить высокожизнеспособные и качественные суспензии одиночных клеток, что повысит вероятность получения высококачественных транскриптомных данных в дальнейшем. Знакомство с протоколом имеет первостепенное значение, и рекомендуется выполнить несколько пробных прогонов, прежде чем приступать к подготовке библиотеки. Предполагается воспроизводимое получение жизнеспособных суспензий одиночных клеток до использования клеток для подготовки библиотеки. Быстрота реализации протокола имеет первостепенное значение, поскольку скорость прямо пропорциональна результатам жизнеспособности. Исходя из этого, рекомендуется ограничить количество образцов, обрабатываемых за один раз. Рекомендуется взаимодействовать с организацией, которая будет подготавливать библиотеки до запуска этих протоколов, для получения помощи в устранении неполадок.

Жизнеспособность HIO напрямую влияет на библиотеку ДНК, отправляемую на секвенирование. Жизнеспособность клеток HIO зависит от нескольких этапов приготовления суспензии одиночных клеток, включая диссоциацию, центрифугирование, буферы, пипетирование и точность подсчета. Цель подготовки HIO к работе на платформе состоит в том, чтобы сбалансировать поддержание жизнеспособности клеток с качеством образца. Решающее значение для получения высококачественных данных имеет минимизация клеточных агрегатов, мертвых клеток, неклеточных нуклеиновых кислот и биохимических ингибиторов обратной транскрипции. Умирающие клетки увеличивают шум нуклеиновых кислот и способствуют слипанию клеток, что приводит к сбоям данных и платформ 7,8,9,10,11,12. Фильтрация с соответствующим размером фильтра может помочь удалить большие агрегаты и повысить качество данных.

Необходимо учитывать несколько факторов, чтобы свести к минимуму гибель клеток HIO при приготовлении суспензий одиночных клеток. Необходимо получить не менее 80% жизнеспособных клеток, а >90% жизнеспособности еще более желательно. Образцы с большим количеством нежизнеспособных клеток могут быть улучшены с помощью стратегий удаления мертвых клеток, таких как микрогранулы на основе колонок, хотя для них требуется больше исходных клеток и большие объемы образцов из-за потерь во время обработки. ГИО особенно чувствительны к буферам и подвергаются клеточной гибели, если их слишком долго оставлять в ЛТ в определенных буферах. Органоидные среды приводят к наименьшей потере клеток и образованию агрегатов. Пипетирование также может повлиять на жизнеспособность HIO во время диссоциации. Обычные наконечники отверстий могут срезать органоиды, способствуя диссоциации на одноклеточные суспензии; однако слишком быстрое пипетирование с обычным наконечником отверстия может привести к повреждению клеток HIO под действием сил сдвига. Медленное пипетирование с широкими наконечниками позволяет свести к минимуму нагрузку на клетки HIO и значительно увеличить количество жизнеспособных клеток на последующих этапах. Центрифугирование, промывка и ресуспендирование являются другими факторами, которые могут влиять на качество суспензий одиночных клеток HIO. Центрифугирование с качающимся ковшом приводит к более щадящему гранулированию клеток HIO, что приводит к меньшему количеству мертвых клеток при минимизации потерь клеток. Наконец, точность подсчета для определения концентрации имеет важное значение для обеспечения того, чтобы максимальное количество клеток достигло платформы для синтеза библиотеки. Внимание к этим деталям приведет к минимизации нагрузки на клетки HIO в процессе изоляции и обеспечит наивысшую вероятность возврата данных после обработки.

Несмотря на то, что транскриптомика одиночных клеток является мощным инструментом для анализа биологических профилей и реакций на уровне отдельных клеток 4,5,6, существует ряд ограничений, которые необходимо учитывать при применении технологии для анализа культур органоидов кишечника человека. Во-первых, может наблюдаться значительная вариация транскрипции из-за технической вариативности, вносимой во время подготовки библиотеки и секвенирования, или из-за пакетных эффектов, возникающих в результате подготовки образца. Кроме того, секвенирование может привести к систематической ошибке покрытия, когда глубина секвенирования между генами или клетками неравномерна. Это создает проблемы при обнаружении низко экспрессированных генов или идентификации редких клеточных популяций. Во-вторых, идентификация типов клеток может быть затруднена из-за клеточной и транскрипционной гетерогенности органоидных культур и менее дифференцированного клеточного профиля по сравнению с нативным эпителием кишечника. Сопряжение транскрипционных реакций с функциональными фенотипами также является проблемой и требует дополнительной валидации с использованием других подходов или анализов. В-третьих, этот подход не включает в себя рассмотрение пространственного контекста или временной динамики клеток. Процедура диссоциации устраняет возможность делать выводы о межклеточных взаимодействиях на основе транскрипционных данных. Он дает только один снимок состояния клетки во времени, а не биологический континуум. Наконец, подходы к транскрипции одиночных клеток могут быть дорогостоящими и требовать специализированных вычислительных инструментов и опыта в области биоинформатики. Тем не менее, этот подход по-прежнему остается доминирующим современным инструментом для понимания клеточной гетерогенности и идентификации новых типов клеток.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов.

Благодарности

Авторы выражают признательность за гранты U19 AI157984, U01 DK103168, U19 AI144297, P30 DK56338, P01 AI057788, U19 AI116497 и уведомление о соглашении о сотрудничестве NASA/TRISH NNX16AO69A.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
[Leu15]-Gastrin ISigma-AldrichG914510 нМ
0,05% Трипсин-ЭДТАИнвитроген25300054
0,4% Трипановый синийMillipore-SigmaT8154
0,5 М ЭДТАCorning46-034-CI
1x PBS Ca- Mg-Corning21-040-CM
24 мм TranswellCostar3412
24 скважины Nunclon delta surface tissue culture чашкаThermo Scientific142475
40 & микро; m клеточный фильтрFalcon352340
40 & микро; m Ситечко с наконечником FlowmiSP Bel-Art LabwareH13680-0040
70 & микро; m Фильтр для наконечника FlowmiSP Bel-Art LabwareH13680-0070
96 луночная пластинаCorning3595
A-83-01Tocris2939500 нМ
AccutaseStemCell Technologies7920
Advanced DMEM/F12Invitrogen12634-028
B27 добавкаInvitrogen17504-0441X
Chromium Next GEM Single Cell 3' GEM, библиотека и Набор гелевых бусин v3.110x GenomicsPN-1000128
Коллаген IVSigma-AldrichC5533-5MG33 &микро; г/мл
Решение для восстановления клеток Corning VWR354253
DPBS (Mg2-, Ca2-)Invitrogen14190-1361X
GlutaMAX-IInvitrogen35050-0612 мМ
HEPES 1MInvitrogen15630-08010 mM
L-WRN кондиционированная средаATCCCRL-3276
Matrigel, GFR, без фенолаCorning356231
мыши рекомбинантный EGFInvitrogenPMG804350 нг/мл
N2 добавкаInvitrogen17502-0481X
N-ацетилцистеинSigma-AldrichA9165-5G500 &микро; M
никотинамидSigma-AldrichN063610 мМ
SB202190Sigma-AldrichS706710 &микро; M
TranswellCorning3413
Y27632Технологии стволовых клеток7230810 &микро; М

Ссылки

  1. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  2. Blutt, S. E., et al. Gastrointestinal microphysiological systems. Exp Biol Med. 242 (16), 1633-1642 (2017).
  3. VanDussen, K. L., et al. Development of an enhanced human gastrointestinal epithelial culture system to facilitate patient-based assays. Gut. 64 (6), 911-920 (2015).
  4. Elmentaite, R., et al. Cells of the human intestinal tract mapped across space and time. Nature. 597 (7875), 250-255 (2021).
  5. Hickey, J. W., et al. Organization of the human intestine at single-cell resolution. Nature. 619 (7970), 572-584 (2023).
  6. Burclaff, J., et al. A proximal-to-distal survey of healthy adult human small intestine and colon epithelium by single-cell transcriptomics. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 13 (5), 1554-1589 (2022).
  7. Triana, S., et al. Single-cell transcriptomics reveals immune response of intestinal cell types to viral infection. Mol Syst Biol. 17 (7), e9833(2021).
  8. Triana, S., et al. Single-cell analyses reveal SARS-CoV-2 interference with intrinsic immune response in the human gut. Mol Syst Biol. 17 (4), e10232(2021).
  9. Fujii, M., et al. Human intestinal organoids maintain self-renewal capacity and cellular diversity in niche-inspired culture condition. Cell Stem Cell. 23 (6), 787-793 (2021).
  10. Beumer, J., et al. BMP gradient along the intestinal villus axis controls zonated enterocyte and goblet cell states. Cell Rep. 38 (9), 110438(2022).
  11. Beumer, J., et al. High-resolution mRNA and secretome atlas of human enteroendocrine cells. Cell. 182 (4), 1062-1064 (2020).
  12. Busslinger, G. A., et al. Human gastrointestinal epithelia of the esophagus, stomach, and duodenum resolved at single-cell resolution. Cell Rep. 34 (10), 108819(2021).
  13. Luecken, M. D., Theis, F. J. Current best practices in single-cell RNA-seq analysis: a tutorial. Mol Syst Biol. 15 (6), e8746(2019).
  14. Heumos, L., et al. Best practices for single-cell analysis across modalities. Nat Rev Genet. 24 (8), 550-572 (2023).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи