Методическая статья

Анализ in vitro для изучения миграции тромбоцитов с использованием функционализированных РГД авидин-биотиновых тротов

DOI:

10.3791/66757

⸱

8 ноября 2024 г.

 ,  , 
1Department of Medicine I, University Hospital, LMU Munich, 2Institute of Surgical Research at the Walter Brendel Centre of Experimental Medicine, University Hospital, LMU Munich, 3Department of Vascular Surgery, Charité-Universitätsmedizin Berlin, Freie Universität Berlin and Humboldt-Universität zu Berlin, 4Interfaculty Center for Endocrine and Cardiovascular Disease Network Modelling and Clinical Transfer, Ludwig-Maximilians-University Munich, 5DZHK (German Centre for Cardiovascular Research), Partner site Munich Heart Alliance

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Представлен подробный протокол визуализации одиночных мигрирующих тромбоцитов с использованием функционализированных RGD авидин-биотиновых тросов с перестраиваемой плотностью, показывающий, что тромбоциты генерируют достаточную силу для разрыва авидин-биотиновой связи.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Несмотря на то, что тромбоциты являются ануклеированными фрагментами клеток, в настоящее время широко признаны благодаря своим многогранным способностям. Они не только образуют сгустки крови, предотвращая кровотечение после травмы, но и борются с инфекциями и поддерживают целостность сосудов во время воспалительных заболеваний. В то время как гемостатические пробки требуют коллективной активации и агрегации тромбоцитов, их роль в защите воспаленных кровеносных сосудов выполняется на уровне отдельных клеток. В этом контексте последние данные показали, что тромбоциты могут мигрировать автономно, что зависит от механоощущения их адгезивной среды. В данной работе представлен подробный протокол визуализации миграции одиночных тромбоцитов с использованием трехслойной системы покрытия, состоящей из поли-L-лизинового трансплантата поли(этиленгликоль) (PLL-PEG)-биотинового каркаса (1), флуоресцентного авидинового линкера (2) и биотинциклического Arg-Gly-Asp (cRGD) (3) в качестве мотива, связывающего интегрин тромбоцитов. Этот редукционистский подход позволяет точно контролировать адгезионные свойства субстрата и служит простым, стандартизированным анализом in vitro для изучения механизмов, лежащих в основе миграции тромбоцитов. Результаты показывают, что мигрирующие тромбоциты, связывающиеся с cRGD, оказывают силы, способные нарушить связь авидин-биотин. Кроме того, плотность биотина-цРГД существенно влияет как на распространение, так и на миграцию тромбоцитов.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Тромбоциты представляют собой небольшие ануклеированные фрагменты клеток, полученные из мегакариоцитов в костном мозге. Активированные тромбоциты собираются в агрегаты, которые образуют основу тромба для герметизации сосудистых поражений при физиологическом гемостазе или для окклюзии пораженных кровеносных сосудов при патологическом тромбозе1. Однако в последние десятилетия стало ясно, что тромбоциты также играют центральную роль в патофизиологии воспаления, инфекции и злокачественных новообразований, где многогранное взаимодействие с иммунными клетками, раковыми клетками и вторгшимися патогенами имеет решающее значение для формирования иммунногоответа хозяина. Последние данные показали, что тромбоциты обладают способностью мигрировать автономно4. В ответ на системную бактериемию тромбоциты рекрутируются в синусоиды печени, где они прилипают и мигрируют. Миграция позволяет тромбоцитам захватывать и связывать бактерии, что, в свою очередь, способствует активации лейкоцитов. Примечательно, что тромбоциты остаются внутрисосудистыми во время этого процесса и не мигрируют в субэндотелиальную ткань4. Кроме того, тромбоциты являются стражами воспаления сосудов, сканируя воспаленные кровеносные сосуды на предмет микроповреждений, вызванных экстравазирующими иммунными клетками5, и используя миграцию для защиты воспаленных кровеносных сосудов 6,7. Здесь тромбоциты используют свои интегрины для связывания фибриногена, отложенного на воспаленном эндотелии. Затем тромбоциты образуют пластинчато-подиальные выступы, которые позволяют им сканировать адгезивные свойства окружающей среды. Затем тромбоциты поляризуются и мигрируют в сторону более высокой плотности фибриногена, процесс, известный как гаптотаксис. Направленная миграция тромбоцитов в конечном итоге поддерживает позиционирование в эндотелиальных микропоражениях, которые предотвращают кровотечение в воспаленных тканях, включая мышцы и легкие.

Миграция тромбоцитов критически зависит от механических свойств адгезивной подложки 4,8. Задача восприятия и передачи механических свойств окружающей среды в первую очередь опосредована интегриновыми рецепторами, которые представляют собой трансмембранные гетеродимерные белки, состоящие из α- и β-субъединиц с внеклеточным доменом, связывающимся с лигандом на внеклеточном матриксе, и внутриклеточным доменом, связывающимся с актиновым цитоскелетом через адапторные белки 9,10. Наиболее распространенным интегрином тромбоцитов являетсяα IIbβ3, а его основным лигандом является фибрин(оген)11. Взаимодействие интегрин-лиганда запускает сигнальные события, которые завершаются образованием Arp2/3-управляемого ламелиподия, который образует передний край адгезивного тромбоцита7. Адгезивные тромбоциты мгновенно прощупывают механические свойства своей адгезивной среды, натягивая ее4. Когда миозин IIa-зависимые силы вытягивания преодолевают механическую стабильность внеклеточного матрикса (например, фибрина (огена)), тромбоциты механически разрывают ослабленные лиганды и используют их пластинчатые выступы для сканирования микроокружения на предмет адгезивных лигандов, создания новых субстратных связей и миграции из обедненной лигандом среды6. Миграция клеток, вызванная непротеолитическим, механическим истощением лигандов, вероятно, играет роль, выходящую за рамки функции тромбоцитов, поскольку это, по-видимому, общее явление, наблюдаемое в клетках, способных механически ремоделировать свой адгезивный матрикс. Скорость истощения лиганда определяет скорость миграции и зависит как от стабильности лиганда, так и от плотности лиганда субстрата8. Тромбоциты с низкой плотностью лигандов способны механически разрушать сконструированные интегриновые лиганды (циклические Arg-Gly-Asp (cRGD))6,7, связанные со стеклянными покровными стеклами с помощью биотин-авидиновых тротов, имеющих разъедающую силу около 160 пиконьютонов (pN)12,13,14,15.

В данной работе эти наблюдения используются для разработки простого протокола in vitro для создания лиганд-лабильных адгезивных поверхностей, облегчающего изучение механизмов миграции тромбоцитов. Адгезивное покрытие, описанное в этом протоколе, состоит из трех основных элементов: (1) основы PLL-PEG-биотина и (2) линкера нейтравидин-флуоресцеин изотиоцианата (NA-FITC), который способствует связыванию (3) биотин-cRGD (адгезивного лиганда) с основой PLL-PEG-биотина (также см. Рисунок 1B). Стабильность этой конструкции зависит от прочности связи биотин-авидин, которая может разорваться либо на границе (A) PLL-PEG-биотин-NA-FITC, либо на (B) FITC-NA-биотин-cRGD. Кроме того, плотность адгезивных лигандов можно регулировать, адаптируя соотношение PLL-PEG-биотина к PLL-PEG в нижнем слое. Нарушение связи (А) приводит к высвобождению FITC из покрытия, что приводит к снижению сигнала флуоресценции под мигрирующими тромбоцитами. Таким образом, покрытие, описанное в данном протоколе, позволяет точно настраивать механические и адгезивные свойства подложки и обеспечивает легкое считывание миграции тромбоцитов на основе флуоресценции.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эксперименты на животных, проведенные в этом исследовании, проводились в соответствии со всеми соответствующими этическими нормами для исследований на мышах и были одобрены местным законодательством о защите животных (Regierung von Oberbayern, Мюнхен, 190-15, 2015). В данном исследовании использовались самки и самцы мышей C57BL/6 в возрасте 8-10 недель (масса тела 20-25 г). Подробная информация об используемых реагентах и оборудовании приведена в Таблице материалов.

1. Покрытие cRGD биотин-нейтравидин-биотин

  1. Ультразвуковые стеклянные покровные стекла (24 мм x 24 мм; # 1,5) в пределах 20% HNO3 в течение 1 минуты, с последующим ультразвуковым обработкой в пределах изопропанола, этанола и H2O в течение 1 минуты. После каждой обработки ультразвуком тщательно промойте покровные стекла в дистиллированной воде (ddH2O) и, наконец, высушите их в инкубаторе.
  2. Предварительно очищенные покровные стекла обработать плазмой Ø2 в плазменном очистителе в течение 2 мин, а затем собрать с помощью липких стекол, как описано ранее16. Липкие предметные стекла и стеклянные покровные стекла образуют канал между ними (как показано на рисунке 1A).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Важна эффективная плазменная терапия. Используйте O2 в качестве источника плазмы.
  3. Заполните канал 2,5 μЛ PLL-PEG-биотина (1 мг/мл), разведенного в 97,5 μL PLL-PEG (1 мг/мл) и инкубируйте в течение 30 минут при комнатной температуре (RT), затем трижды промойте PBS. PLL-PEG-биотин связывается с нейтравидином на следующем этапе, в то время как остов PLL-PEG образует инертный субстрат, предотвращающий неспецифическое связывание белков и тромбоцитов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация PLL-PEG-биотина в растворах покрытий определяет конечную плотность лигандов cRGD.
  4. Добавьте 100 μL Neutravidin-FITC (25 μг/мл) и инкубируйте в течение 30 минут в темноте при RT, затем трижды промойте PBS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Отрегулируйте концентрацию нейтравидина-FITC до концентрации PLL-PEG-биотина. Увеличьте концентрацию нейтравидина-FITC, если покрыты покрытия с более высокой плотностью PLL-PEG-биотин.
  5. Добавьте 100 μL цикло [Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys (Biotin-PEG-PEG)] (cRGD-biotin) (0,1-1 μM), инкубируйте в течение 30 минут при RT и трижды промойте PBS. Покровные стекла готовы к использованию. Схема покрытия изображена на рисунке 1В.

2. Выделение тромбоцитов мыши из крови

  1. Приготовьте модифицированный буфер Тирода, который содержит 136,9 мМ NaCl, 12,1 мМ NaHCO3, 2,6 мМ KCl, 5,5 мМ глюкозы, 10 мМ HEPES, и отрегулируйте рН до 7,4 и 6,5.
  2. Обезболивайте мышей (в соответствии с утвержденными в учреждении протоколами) путем внутрибрюшинной инъекции 0,5 мг/кг фентанила, 5 мг/кг мидазолама и 0,05 мг/кг медетомидина. После подтверждения глубины анестезии путем защипывания пальцев ног удалите кожу грудной клетки ножницами.
  3. Приготовьте шприц объемом 2 мл (игла 26 г) со 150 мкл кислоты-цитрата-декстрозы (ACD) в качестве антикоагулянта. Введите иглу между вторым и третьим ребрами с левой стороны грудины, чтобы взять кровь из сердца. После этого усыпите мышь при вывихе шейки матки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: (1) Буферный состав ACD: 85 мМ трехосновного дегидрата цитрата натрия и 65 мМ моногидрата лимонной кислоты в 111 мМ глюкозы. (2) Забор крови должен быть плавным, чтобы избежать образования тромбов. Около 1 мл крови можно получить от 8-10-недельных мышей.
  4. Смешайте кровь с 1 мл буфера Tyrode's (pH 6,5) в пробирке FACS (полистирол с круглым дном) объемом 5 мл и центрифугируйте при 70 x g в течение 20 минут при RT с выключенным тормозом.
  5. После центрифугирования возьмите верхнюю часть (около 1 мл), содержащую обогащенную тромбоцитами плазму (PRP). Смешайте с 3 мл буфера Tyrode's (pH 6,5) и добавьте 100 нг/мл простациклина (PGI2) для предотвращения активации тромбоцитов.
  6. Центрифугируйте при 1200 x g в течение 5 минут при RT, выбросьте надосадочную жидкость, повторно суспендируйте гранулу в 500 μл буфера Tyrode (pH 6,5) и измерьте количество тромбоцитов с помощью гемоцитометра.

3. Миграция тромбоцитов мышей на покрытии cRGD биотин-нейтравидин-биотин

  1. Дополните модифицированный буфер Тироде (pH 7,4) 10 x 103/мкл мышиных тромбоцитов, 1 мМ CaCl2, 2 мкМ U46619 и 4 мкМ аденозин-5'-дифосфатной натриевой соли (АДФ) и пипетка общим объемом 240 мкл в каналы, подготовленные на стадии 1.
  2. Записывайте миграцию тромбоцитов в реальном времени с помощью инвертированного микроскопа, оснащенного сценическим инкубатором. В качестве альтернативы можно инкубировать канал в течение 1 ч при температуре 37 °C в инкубаторе.
  3. Зафиксируйте образец с 4% параформальдегидом на 10 минут при RT и промойте пять раз PBS.
  4. Пермеабилизируйте тромбоциты с помощью Triton-X (0,2% в PBS) в течение 5 минут и промойте их пять раз PBS.
  5. Разведите 2,5 мкл фаллоидина Alexa Fluor 594 (40-кратный запас метанола) в 100 мкл PBS. Инкубировать с тромбоцитами в течение 30 минут при наступлении темноты, затем пять раз промыть PBS.
  6. Визуализируйте предметные стекла под флуоресцентным микроскопом.

4. Количественная оценка

ПРИМЕЧАНИЕ: Тромбоциты, образующие филоподии (пальцевидные выступы) или ламеллиподии (листовидные выступы), считались адгезивными тромбоцитами4. Тромбоциты, расстояние миграции которых превышает один из его диаметров, были определены как мигрирующие тромбоциты.

  1. Доля мигрирующих тромбоцитов: подсчитайте адгезию тромбоцитов или количество миграции с помощью инструмента Multi Point на Фиджи. Щелкните правой кнопкой мыши по выпадающему меню инструмента «Точка» на панели инструментов, чтобы выбрать инструмент « Многоточечный ». Рассчитайте долю мигрирующих тромбоцитов, разделив количество мигрирующих тромбоцитов на количество адгезивных тромбоцитов.
  2. Среднее расстояние миграции: Извлеките расстояние миграции из фиксированных образцов, измерив длину пути миграции, «отпечатанного» в нейтравидин-FITC-покрытии, с помощью инструмента Free Hand Line Tool . Щелкните правой кнопкой мыши по выпадающему меню «Прямая линия » на панели инструментов, чтобы выбрать инструмент « Свободная линия руки ».
  3. Дескрипторы формы тромбоцитов: Создавайте бинарные маски путем сегментации флуоресцентных тромбоцитов (Alexa594-Phalloidin) с помощью функции Threshold . Выберите «Изображение» > «Настроить порог> на панели инструментов.
  4. При анализе частиц можно получить такие дескрипторы формы, как площадь, периметр, круглость и соотношение сторон. Выберите дескрипторы формы в меню «Анализ» > «Задать измерения», затем выберите «Отобразить результаты » в разделе «Анализ» > «Анализ частиц».

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Активированные тромбоциты легко адгезируются и распространяются на предметных стеклах, покрытых ФАПЧ-биотин-нейтравидин-FITC-биотин-цРГД (рис. 1С и рис. 2А; 0 мин и 5 мин), а затем поляризуются, образуя пластинчатый подиум на переднем крае (рис. 2А; 10 мин). Во время этого процесса псевдоядро (темная область в центре тромбоцитов) переместилось из центра в заднюю часть тромбоцита (рисунок 2А). Затем поляризованные тромбоциты начинают мигрировать без очевидной направленности (рисунок 2A; 15 мин и 20 мин и рисунок 2B). Мы наблюдали, что тромбоциты, мигрирующие на покрытиях PLL-PEG-биотин-нейтравидин-FITC-биотин-cRGD, могут разрывать связь нейтравидин-FITC-биотин-PLL-PEG, о чем свидетельствует снижение интенсивности флуоресценции по пути миграции (рис. 1C и рис. 2A, B). Кроме того, разрушенный комплекс нейтравидин-ФИТК-биотин-цРГД накапливается на поверхности тромбоцитов (рис. 2А, В). Это явление похоже на предыдущие результаты, когда мигрирующие тромбоциты удаляли фибриноген из субстрата и накапливали его в своей открытой каналикулярной системе (ОКС)4.

Чтобы изучить, как плотность лиганда влияет на миграцию тромбоцитов, плотность cRGD корректировалась путем варьирования соотношения PLL-PEG-биотина к PLL-PEG в первом слое покрытия. Эти данные показывают, что тромбоциты мышей достигают оптимальной миграции при концентрации PLL-PEG-биотина 2,5%. Миграция снижается как при более низких (1%), так и при более высоких (10%) концентрациях PLL-PEG-биотина (рис. 3A, B). Эти зависящие от субстрата изменения миграционного поведения сопровождаются изменениями морфологии тромбоцитов (рис. 3C). При низкой плотности лигандов (1%) тромбоциты распространяются недостаточно широко, о чем свидетельствует низкая площадь и периметр проекции тромбоцитов (рисунок 3C). Это свидетельствует о недостаточной активации интегринов и передаче сигналов «вовне-внутрь»7. Следовательно, тромбоциты не могут оказывать воздействие на лиганды cRGD, не могут ремоделировать субстрат и не мигрируют (рис. 3A, B).

При промежуточной плотности лиганда (2,5%) наблюдается значительное увеличение площади и периметра тромбоцитов (рис. 3В). Тромбоциты эффективно распространяются, механически разрушая лабильные лиганды cRGD, и мигрируют (рис. 3A, B). Однако при высокой плотности лигандов (10%), несмотря на увеличение распространения, тромбоциты не поляризуются, на что указывает уменьшенное отношение сторон (рис. 3C). В этих условиях тромбоциты остаются прикрепленными к липкому субстрату и не мигрируют, поскольку они не могут разорвать лабильные лиганды cRGD (рис. 3A, B).

Эти результаты показывают, что миграция тромбоцитов критически зависит от адгезивных свойств субстрата. Тромбоциты могут мигрировать только в том случае, если они в достаточной степени взаимодействуют с адгезивными лигандами и одновременно создают тяговые силы, достаточно сильные, чтобы преодолеть допуск на растяжение адгезивной подложки 4,6,7,8.

figure-results-1
Рисунок 1: Процедура нанесения покрытия и визуализация взаимодействия тромбоцитов с подложкой в реальном времени. (A) Фотография собранной камеры. (B) Принцип протокола. Слева: Схема покрытия. Стеклозащитные стеклопакеты с плазменной обработкой были покрыты тремя слоями. Первый слой представляет собой смесь PLL-PEG и PLL-PEG-биотина (остов PLL-PEG инертен к клеткам и предотвращает неспецифическое связывание). Второй слой – нейтравидин-ФИТК, а третий слой – биотин-цРГД. Нейтравидин-FITC связывает PLL-PEG-биотин и биотин-cRGD. Тромбоциты связываются с биотин-цРГД через интегрины в плазматической мембране. Справа: Иллюстрация связывания биотин-авидина интегринами тромбоцитов. Тромбоциты оказывают воздействие на субстрат посредством взаимодействия интегрин-цРГД и разрывают либо верхнюю связь cRGD-биотин - нейтравидин-FITC, либо нижнюю связь нейтравидин-FITC - PLL-ПЭГ-биотин. Разрыв нижней связи между нейтравидином-FITC и биотин-PLL-PEG приводит к снижению флуоресцентного сигнала, в то время как разрыв верхней связи между биотин-cRGD и нейтравидином-FITC не приводит. (C) Временные ряды, показывающие миграцию тромбоцитов и истощение лабильных cRGD-лигандов. Области пониженной флуоресценции указывают на пути миграции тромбоцитов (см. также рисунок 2A), а области повышенной флуоресценции указывают на накопление FTIC-нейтравидина-биотин-cRGD на мигрирующих тромбоцитах. Масштабная линейка: 5 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-2
Рисунок 2: Иммунофлуоресцентная визуализация миграции тромбоцитов, кодируемой ресмоделированным субстратом. (A) Репрезентативная последовательность фильмов об одиночной миграции тромбоцитов. Слева: фазово-контрастные изображения мигрирующих тромбоцитов. Тромбоциты поляризуются, образуя пластинчатый подиум на переднем крае и впоследствии мигрируют. Справа: Нейтравидин-ФИТК был удален из субстрата, оставив «след» миграции тромбоцитов. Разорванный цРГД-биотин-нейтравидин-FITC накапливается в центре мигрирующих тромбоцитов. (B) Репрезентативные изображения миграции тромбоцитов на лигандных лабилевых покрытиях cRGD-биотин-авидин. Верхний: Тромбоциты, окрашенные фаллоидином (Alexa FluorTM 594), показали крупное образование пластинчатого подиума и поляризованную форму, напоминающую мигрирующие тромбоциты. Мигрирующие тромбоциты разрывают связь cRGD-биотин-нейтравидин-FITC, создавая пути миграции на субстрате, о чем свидетельствует сниженный сигнал FITC. Ниже: обрезанное изображение с большим увеличением. (C) Траектории миграции на Фиджи были вручную нарисованы желтыми линиями. Масштабные линейки: 5 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-3
Рисунок 3: Соотношение PLL-PEG-биотина к PLL-PEG определяет миграцию и форму тромбоцитов. (A) Репрезентативные изображения тромбоцитов на покрытиях PLL-PEG-биотина 1%, 2,5% и 10%, масштабная линейка: 5 мкм. (B) Количественная оценка адгезии тромбоцитов, эффективности миграции и расстояния миграции, n = 4 независимых эксперимента; Среднее/SD; Односторонняя ANOVA/Tukey; **p < 0,01; р < 0,001; p < 0,0001, нс: не значимо (C) Количественная оценка дескрипторов формы тромбоцитов (площадь, периметр, круговость и соотношение сторон), n = 4 независимых эксперимента; среднее/мин-макс; Односторонняя ANOVA/Tukey; **p < 0,01; р < 0,001; p < 0,0001, нс: не существенно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В данном протоколе представлена процедура нанесения трехслойного покрытия, состоящая из (1) основы ФАПЧ-ПЭГ-биотина и (2) линкера нейтравидина-FITC, которая способствует связыванию (3) биотин-цРГД (адгезивного лиганда) с основой ФАПЧ-ПЭГ-биотина (см. также рис. 1B), что позволяет точно настраивать механические и адгезивные свойства субстрата путем изменения отношения ФАПЧ-ПЭГ-биотина к ФАПЧ-ПЭГ и обеспечивает легкое флуоресцентное считывание миграции тромбоцитов. В то время как в этом протоколе используются FITC-конъюгированный нейтравидин и Alexa Fluor 594-конъюгированный фаллоидин для отслеживания миграции и формы тромбоцитов, можно использовать другие флуорофор-конъюгированные авидин и фаллоидин. Поскольку все реагенты покрытия, включая PLL-PEG, PLL-PEG-биотин, нейтравидин-ФИТК и cRGD-биотин, а также активаторы тромбоцитов коммерчески доступны, этот эксперимент может быть проведен без особых дополнительных усилий. Критическим этапом является плазменная обработка, поскольку неэффективная плазменная обработка приводит к недостаточному связыванию PLL-PEG/PLL-PEG-биотина с субстратом, что приводит к нарушению адгезии и миграции тромбоцитов. Производительность плазменного очистителя имеет важное значение. В целом, плазменные очистители с генераторами 13,6 МГц работают лучше, чем с генераторами 40 кГц или 100 кГц. Кроме того, источник кислородной плазмы более подходит, чем окружающий воздух. После успешной плазменной обработки этапы нанесения покрытия практически не подвержены ошибкам.

Ранее было показано, что тромбоциты используют мезенхимальный способ миграции, который сильно зависит от адгезии субстрата 4,17. Аналогично фибробластам, низкая плотность лигандов препятствует миграции, поскольку тромбоциты с трудом прилипают к субстрату, в то время как высокая плотность лигандов препятствует миграции, предотвращая разъединение твердых спаек18 (Рисунок 3). При промежуточных плотностях тромбоциты прилипают, в то время как миозин-зависимые силы вытягивания на интегриновую связь все еще достаточны для разрыва спаек. Следует отметить, что высокое сродство между интегрином αIIbβ3 и его лигандом фибрином (огеном) приводит к разрушению спаек не за счет высвобождения адгезивного лиганда, а за счет его разрыва или отрыва от нижележащего субстрата, таких как эндотелиальные клетки in vivo или покровные стекла in vitro 4,6. Сила связывания, необходимая для отделения фибриногена от основного субстрата, в значительной степени зависит от физических и (био-) химических свойств, которые часто трудно контролировать, что может привести к значительной изменчивости эффективности миграции. Представленный здесь анализ предлагает редукционистский подход к решению этой проблемы. Тем не менее, разрывная сила связи авидин-биотин зафиксирована на уровне около 160 пН, поэтому для изучения адгезии тромбоцитов при более низкихрежимах силы необходимо использовать более сложные датчики натяжения, такие как те, которые основаны на двухцепочечном тросе.

Предыдущие исследования показали, что миграция тромбоцитов участвует в бактериальной инфекции и воспалении сосудов in vivo. Следовательно, тромбоциты с миграционными дефектами, такими как нарушение сократительной способности миозина, полимеризация актина или передача сигналов интегрина наружу, демонстрируют нарушение клиренса бактерий и целостности сосудов 4,6,7. Представленный здесь анализ прост, стабилен и, следовательно, подходит для скрининга низкомолекулярных ингибиторов и их влияния на миграцию тромбоцитов. Он представляет собой новый инструмент in vitro для исследования терапевтических мишеней при воспалении или тромбозе.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG; German Research Foundation) номера проектов 514478744 и 514477451 F.G. Проект финансируется Европейским Союзом (ERC, MEKanics, 101078110). Выраженные взгляды и мнения принадлежат только автору (авторам) и не обязательно отражают точку зрения Европейского Союза или Исполнительного агентства Европейского исследовательского совета. Ни Европейский Союз, ни орган, предоставляющий грант, не могут нести за них ответственность.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Аденозин 5′-дифосфатная натриевая соль (АДФ)Sigma-AldrichA2754
Alexa Fluor 594 фаллоидин ThermofisherA12381
Счетчик кровиSysmexXN-1000
Бездонный 6-канальный липкий слайдIBIDI, липкие слайды VI0.480608
ЦентрифугаEppendorf 5804
Конфокальный микроскопZeissLSM880
cyclo [Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys(Biotin-PEG-PEG)]Пептидные международныеPCI-3697-PI
FACSCorning Brand 
FITC конъюгат нейтравидинаThermofisherA2662
Формальдегид Thermofisher28908
HEPES растворSigma-AldrichH0887
Фазовый контраст и эпифлуоресцентный микроскопOlympusIX83
Очиститель плазмыDiener116531
PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)/PEG(3.4)-биотин(50%)SusosPLL(20)-g[3.5]-PEG(2)/PEG(3.4)-биотин (50%)Poly
(L-лизин)- привитый поли(этиленгликоль) сополимерSusosPLL(20)-g[3.5]-PEG(2)
Простагландин I2 натриевая соль (PGI2)Abcamab120912
СоникBANDELINSONNOREX RK514M
Ttriton X-100 20% v/vCayman Chemical 
U46619Энцо Медико-Биологические НаукиBML-PG023-0001)
трубки 352052600217

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jackson, S. P. Arterial thrombosis--insidious, unpredictable and deadly. Nat Med. 17, 1423-1436 (2011).
  2. Kaiser, R., Escaig, R., Nicolai, L. Hemostasis without clot formation: how platelets guard the vasculature in inflammation, infection, and malignancy. Blood. 142 (17), 1413-1425 (2023).
  3. Gaertner, F., Massberg, S. Patrolling the vascular borders: Platelets in immunity to infection and cancer. Nat Rev Immunol. 19 (12), 747-760 (2019).
  4. Gaertner, F., et al. Migrating platelets are mechano-scavengers that collect and bundle bacteria. Cell. 171 (6), 1368-1382.e23 (2017).
  5. Gros, A., et al. Single platelets seal neutrophil-induced vascular breaches via GPVI during immune-complex-mediated inflammation in mice. Blood. 126 (8), 1017-1026 (2015).
  6. Nicolai, L., et al. Vascular surveillance by haptotactic blood platelets in inflammation and infection. Nature Comm. 11, 5778(2020).
  7. Kaiser, R., et al. Mechanosensing via a GpIIb/Src/14-3-3zeta axis critically regulates platelet migration in vascular inflammation. Blood. 141 (24), 2973-2992 (2023).
  8. Sarkar, A., LeVine, D. N., Kuzmina, N., Zhao, Y., Wang, X. Cell migration driven by self-generated integrin ligand gradient on ligand-labile surfaces. Curr Biol. 30 (20), 4022-4032 (2020).
  9. Hynes, R. O. Integrins: Bidirectional, allosteric signaling machines. Cell. 110 (6), 673-687 (2002).
  10. Kechagia, J. Z., Ivaska, J., Roca-Cusachs, P. Integrins as biomechanical sensors of the microenvironment. Nat Rev Mol Cell Biol. 20, 457-473 (2019).
  11. Shattil, S. J., Newman, P. J. Integrins: Dynamic scaffolds for adhesion and signaling in platelets. Blood. 104 (6), 1606-1615 (2004).
  12. Yuan, C., Chen, A., Kolb, P., Moy, V. T. Energy landscape of streptavidin-biotin complexes measured by atomic force microscopy. Biochemistry. 39 (33), 10219-10223 (2000).
  13. Florin, E. L., Moy, V. T., Gaub, H. E. Adhesion forces between individual ligand-receptor pairs. Science. 264 (5157), 415-417 (1994).
  14. Merkel, R., Nassoy, P., Leung, A., Ritchie, K., Evans, E. Energy landscapes of receptor-ligand bonds explored with dynamic force spectroscopy. Nature. 397, 50-53 (1999).
  15. Jurchenko, C., Chang, Y., Narui, Y., Zhang, Y., Salaita, K. S. Integrin-generated forces lead to streptavidin-biotin unbinding in cellular adhesions. Biophys J. 106 (7), 1436-1446 (2014).
  16. Fan, S., Lorenz, M., Massberg, S., Gaertner, F. Platelet migration and bacterial trapping assay underflow. Bio-Protocol. 8 (18), e3018(2018).
  17. Lauffenburger, D. A., Horwitz, A. F. Cell migration: A physically integrated molecular process. Cell. 84 (3), 359-369 (1996).
  18. Palecek, S. P., Loftus, J. C., Ginsberg, M. H., Lauffenburger, D. A., Horwitz, A. F. Integrin-ligand binding properties govern cell migration speed through cell-substratum adhesiveness. Nature. 385, 537(1997).
  19. Zhao, Y., Wetter, N. M., Wang, X. Imaging integrin tension and cellular force at submicron resolution with an integrative tension sensor. J Vis Exp. (146), e59476(2019).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

RGD

Похожие статьи