Методическая статья

Методика выделения и культивирования мезенхимальных стволовых клеток костного мозга челюсти крысы

2.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/66765

⸱

31 мая 2024 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Medical School of Chinese PLA, 2Department of Stomatology, the First Medical Centre, Chinese PLA General Hospital, 3Department of Stomatology, Fujian People's Armed Police Corps Hospital

В этой статье

Краткое содержание

Мезенхимальные стволовые клетки из костного мозга челюсти играют важную роль в разнообразной дифференцировке, самообновлении и иммуномодуляции. Они стали важнейшим резервуаром клеток-предшественников в генной терапии, тканевой инженерии и регенеративной медицине. В этой статье мы представляем уникальный метод выделения мезенхимальных стволовых клеток костного мозга челюсти у крыс.

Аннотация

Мезенхимальные стволовые клетки костного мозга (BMMSC) представляют собой тип стволовых клеток с потенциалом многонаправленной дифференцировки. По сравнению с BMMSC, полученными из аппендикулярных костей, BMMSC, полученные из челюсти, обладают большей пролиферативной и остеогенной дифференцировочной способностью, постепенно становясь важными семенными клетками для восстановления дефектов челюсти. Тем не менее, нижняя челюсть имеет сложную костную структуру и менее губчатое содержимое, чем аппендикулярные кости. С помощью традиционных методов трудно получить большое количество высококачественных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга, полученных из челюстного мозга. В этом исследовании представлен «нишевый подход к стволовости» для выделения и культивирования мезенхимальных стволовых клеток костного мозга (JBMMSC) челюсти крысы. Первичные JBMMSC крыс были выделены и культивированы с использованием метода адгезивного анализа всего костного мозга в сочетании с методом переваривания костного среза. Выделенные клетки были идентифицированы как JBMMSC с помощью наблюдения за морфологией клеток, обнаружения маркеров клеточной поверхности и индукции многонаправленной дифференцировки. Клетки, извлеченные этим методом, демонстрируют «фибробластоподобную» веретенообразную форму. Клетки длинные, веретенообразные и похожие на фибробласты. Анализ проточной цитометрии показывает, что эти клетки положительны на CD29, CD44 и CD90, но отрицательны на CD11b/c, CD34 и CD45, что соответствует характеристикам BMMSC. Клетки проявляют сильную пролиферативную способность и могут подвергаться остеогенной, адипогенной и хондрогенной дифференцировке. Это исследование обеспечивает эффективный и стабильный метод получения достаточного количества высококачественных JBMMSC с сильной дифференцировочной способностью за короткое время, что может способствовать дальнейшим исследованиям изучения биологических функций, регенеративной медицины и связанных с ними клинических приложений.

Введение

Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) были впервые обнаружены в костном мозге, которые показали способность образовывать адгезивные колонии в культуре и сильный остеогенный потенциал1. Питтингер и др.2 также обнаружили их потенциал многонаправленной дифференцировки в сторону костей, жира и хрящей. Несмотря на то, что все мезенхимальные стволовые клетки из разных источников обладают потенциалом для многонаправленной дифференцировки, мезенхимальные стволовые клетки костного мозга обладают самым сильным потенциалом хондрогенной дифференцировки по сравнению с мезенхимальными стволовыми клетками, полученными из других тканей, что делает их лучшими кандидатами для инженерии костной ткани3. Тем не менее, многие исследования доказали, что BMMSC различного происхождения обладают сайт-специфичными характеристиками и свойствами, такими как остеогенная дифференцировочная способность и клеточная пролиферативная активность 4,5. Это может быть связано с различными зародышевыми слоями между челюстью и аппендикулярными костями или гребнем подвздошной кости6.

Мезенхимальные стволовые клетки костного мозга челюсти (JBMMSC) происходят из клеток нервного гребня нейроэктодермы, в то время как BMMSC, полученные из бедренной кости, происходят из мезодермы7. По сравнению с BMMSC, полученными из длинных костей и подвздошного гребня, JBMMSC имеют более высокую скорость пролиферации, активность ЩФ и остеогенный потенциал8. Кроме того, эффект применения BMMSC в тканях и органах может варьироваться в зависимости от различных типов клеток и окружающей среды9. Восстановление дефектов челюсти в основном зависит от набора мезенхимальных стволовых клеток, полученных из челюсти. Таким образом, изучение JBMMSC может обеспечить экспериментальную основу для его клинического применения в инженерии костной ткани челюсти10. Тем не менее, фундаментальные исследования и клиническое применение в основном сосредоточены на BMMSC, полученных из аппендикулярных и аксиальных костей11. Исследования JBMMSC ограничены, и это может быть связано с низким содержанием губчатой кости в нижней челюсти и тем фактом, что челюсти крыс имеют еще меньшее содержание губчатой кости12. Таким образом, трудно отделить мезенхимальные стволовые клетки, полученные из кости челюсти, с помощью обычного метода промывки костного мозга, который обычно используется для выделения BMMSC из аппендикулярных костей или гребня подвздошной кости13. Основываясь на методах Hong et al.14 и Cheng et al.15, мы предположили, что комбинация плотного костного пищеварения и метода промывки костного мозга может эффективно изолировать JBMMSC крыс.

Это исследование направлено на создание эффективного метода выделения JBMMSC крыс и обеспечение достаточных источников затравочных клеток для инженерии костной ткани челюсти.

Протокол

Протокол был одобрен Институциональным комитетом по этике животных Главного госпиталя НОАК Китая. Для эксперимента были использованы тринадцатинедельные самцы крыс Вистар. Подробная информация о животных, реагентах и оборудовании приведена в Таблице материалов.

1. Подготовка к эксперименту

  1. Стерилизуйте все хирургические инструменты, включая офтальмологические ножницы, пинцет и костные наконечники, при высокой температуре и давлении.
  2. Подготовьте питательные среды заранее.
    1. Приготовьте полнорационную среду α-MEM, содержащую 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллин-стрептомицина.
    2. Приготовьте 0,1% коллагеназу II типа в фосфатно-солевом буфере (PBS).
    3. Приготовьте 50 мл PBS с 1% пенициллин-стрептомицином в одноразовой стерильной центрифужной пробирке объемом 50 мл.

2. Выделение и выращивание крыс JBMMSC

  1. Изолируйте нижнюю челюсть крысы, выполнив следующие действия:
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для поддержания стерильности образца все металлические хирургические инструменты должны быть продезинфицированы при высокой температуре на пламени спиртовой лампы в течение не менее трех секунд перед использованием.
    1. Обезболить крысу 2% пентобарбиталом натрия (2 мл/кг) путем внутрибрюшинного введения.
    2. Принесите в жертву крысу, находящуюся под наркозом, из-за вывиха шейных позвонков (в соответствии с утвержденными в учреждении протоколами) после того, как частота дыхания уменьшится и мышцы полностью расслабятся.
    3. Погрузите крысу в 75% этанол на 30 минут, чтобы продезинфицировать ее, а затем переложите на ультрачистый стол.
    4. Поместите крысу на одноразовую стерильную салфетку или в стерильный контейнер и держите ее в лежачем положении.
    5. Разрежьте и отделите кожу и мышцу от уголка до сустава вдоль ветви, а затем отделите мыщелок от суставной ямки, разрезав диск височно-нижнечелюстного сустава и двусторонние периферические связки горизонтально офтальмологическими ножницами.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Определите положение височно-нижнечелюстного сустава, двигая нижней челюстью и наблюдая за положением мыщелка снаружи.
    6. Разрежьте и отделите мышцы и соединительные ткани боковой нижней челюсти с помощью ножниц от вестибулярной борозды на щечной стороне нижних резцов с левой и правой стороны.
    7. Разрежьте язычные мышцы нижней челюсти от уздечки языка до задней области нижней челюсти.
    8. Удалите нижнюю челюсть из черепа.
    9. Разделите нижнюю челюсть на половины, разрезав офтальмологическими ножницами симфиз между нижними резцами.
    10. Удалите оставшиеся прикрепленные мышцы, фасцию и другие мягкие ткани на нижней челюсти осторожно с помощью офтальмологических ножниц и щипцов.
  2. Изолируйте JBMMSC.
    1. Поместите клюв ронжера на стыке резцов и мезиальной части первого моляра, обрежьте соединение между нижними резцами и нижней челюстью с ронжером, а нижние резцы извлеките полностью.
    2. Удалите все коренные зубы с помощью костного ронжера.
    3. Удалите ветвь нижней челюсти с помощью костного ронжера и обнажите полость костного мозга, отделив центральную часть нижней челюсти по дистальному краю последнего моляра16.
    4. Отсасывайте α-MEM полную среду одноразовым стерильным шприцем объемом 1 мл. Введите иглу в полость костного мозга и многократно промойте костный мозг в чашку для посева полной средой α-MEM до тех пор, пока кость не станет белой.
    5. Соберите раствор для промывки костного мозга в центрифужную пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте его при давлении 800 x g в течение 3 минут при комнатной температуре.
    6. Выбросьте надосадочную жидкость с помощью пипетки, повторно суспендируйте клетки 10 мл полной среды α-MEM и поместите их в новую чашку для культивирования диаметром 10 см.
    7. Разделите промытую нижнюю челюсть на 1-3 мм³ костных ломтиков с помощью ронжера и переварите их с 3 мл 0,1% коллагеназы II типа в течение 90 минут в шейкере со скоростью 200 об/мин при температуре 37 °C.
    8. Центрифугируйте переваренную нижнюю челюсть при концентрации 800 х г в течение 3 минут при комнатной температуре и выбросьте надосадочную жидкость.
    9. Культивируйте собранные клетки и переваренные срезы костей в полной среде α-MEM при температуре 37 °C в инкубаторе с 5% содержаниемCO2 .
    10. Через 72 ч замените половину питательной среды свежей средой, а затем полностью меняйте ее каждые 2 дня.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не перемещайте чашку для культуры в течение первых трех дней.
    11. Пройдите адгезивные клетки в соотношении 1:2, когда они достигнут 80%-90% конфлюенции. Удаляют срезы костей во время второй субкультуры. Для экспериментов используйте клетки поколений P2 или P3.

3. Проточная цитометрия для идентификации маркеров клеточной поверхности

  1. Ресуспендируйте JBMMSC поколения P2 в буфере проточной цитометрии. Подсчитайте клетки с помощью автоматического счетчика клеток и отрегулируйте концентрацию до 3 × 106 клеток/мл.
  2. Добавьте 100 мкл клеточной суспензии и 2 мкл моноклональных антител (CD11b/c, CD29, CD34, CD44, CD45 и CD90) в каждую микроцентрифужную пробирку. Выдерживать 30 мин при 4 °C17,18.
  3. Дважды промойте образец 200 μл буфера для проточной цитометрии и центрифугируйте его в течение 5 минут при 250 x g при комнатной температуре. Удалите надосадочную жидкость.
  4. Добавьте в каждую пробирку 100 мкл буфера для проточной цитометрии и 2 мкл флуоресцентного вторичного антитела, меченного ПЭ. Выдерживать при температуре 4 °C в течение 30 минут.
  5. Повторите шаг 3.3.
  6. Ресуспендируйте JBMMSC в 300-500 мкл буфера для проточной цитометрии на пробирку.
  7. Проведите проточный цитометрический анализ с помощью проточного цитометра.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте гомологичные антитела в качестве отрицательного контроля для устранения фонового окрашивания, вызванного неспецифической комбинацией антител.

4. Определение пролиферации клеток

  1. Засейте JBMMSC поколения Р3 в 96-луночный планшет с плотностью 5 × 10 по3 ячейки в лунку.
  2. Добавьте по 10 мкл раствора CCK-8 в каждую лунку.
  3. Поместите 96-луночный планшет в инкубатор на 2 ч и измерьте абсорбцию (значение OD при 450 нм) с помощью считывателя микропланшетов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте тест в одно и то же время каждый день в течение семи дней подряд.

5. Способность к образованию колоний

  1. Высейте 1000 JBMMSC из прохода 3 в 10 см посуду для культивирования и культивирования при 37 °C с 5%CO2.
  2. Меняйте питательную среду каждые 3 дня.
  3. Проводите окрашивание кристаллической фиалкой после непрерывного выращивания в течение 15 дней.
  4. Далее зафиксируйте ячейки метанолом на 5 минут и окрашивайте 2% кристаллическим фиолетовым в течение 5 минут.

6. Многолинейная дифференциация JBMMSC

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте JBMMSC поколения P3 для многолинейной дифференциации. Контрольную группу культивировали в полной среде α-MEM.

  1. Проводят остеогенную дифференцировку.
    1. Инокулируйте 1 × 105 JBMMSC в лунку в шестилуночный планшет.
    2. Когда слияние клеток достигнет 70%, смените среду на остеогенную индукционную среду.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Меняйте остеогенную индукционную среду каждые 3 дня.
    3. Проводите окрашивание щелочной фосфатазой (ЩФ) через 7 дней после остеогенной индукции.
    4. Снимите среду с шестилуночного планшета, зафиксируйте клетки 4% параформальдегидом при комнатной температуре на 30 минут, а затем трижды промойте их PBS.
    5. Окрашивайте клетки раствором окрашивания ALP при комнатной температуре в течение 30 минут и защищайте их от света.
    6. Промойте клетки до тех пор, пока не останется раствор для окрашивания, и рассмотрите образцы под микроскопом.
    7. Проводите окрашивание Ализарином в красный цвет через 21 день после остеогенной индукции.
    8. Окрашивайте клетки раствором красного окрашивания Ализарин в течение 5 мин после фиксации клеток 4% параформальдегидом в течение 30 мин.
    9. Промойте клетки PBS до тех пор, пока не останется раствор для окрашивания Ализарина красного.
    10. Понаблюдайте за количеством кальциевых узелков под микроскопом.
  2. Проводят адипогенную дифференцировку.
    1. Инокулируйте 1 × 105 JBMMSC в лунку в шестилуночный планшет.
    2. Когда слияние клеток достигнет 70%, смените среду на среду для адипогенной индукции.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Меняйте адипогенную индукционную среду каждые три дня.
    3. Проводите окрашивание маслом красного О через 14 дней после адипогенной индукции.
    4. Снимите среду с шестилуночного планшета, зафиксируйте ячейки фиксирующим раствором Oil red O на 20-30 минут, а затем трижды промойте их PBS.
    5. Удалите фиксирующий раствор и дважды промойте клетки дистиллированной водой.
    6. Погрузите клетки в 60% изопропанол на 20-30 с.
    7. Удалите 60% изопропанола и окрашивайте клетки окрашиванием Oil red O в течение 20-30 минут.
    8. Удалите раствор для окрашивания, промойте клетки 60% изопропанолом в течение 20-30 с, а затем промойте их дистиллированной водой.
    9. Окрашивайте ядро раствором гематоксилина в течение 1-2 мин.
    10. Удалите раствор гематоксилина и промойте клетки 2-3 раза дистиллированной водой. Добавьте масляное масло красного O в буфер на 1 минуту и удалите его.
    11. Понаблюдайте за количеством липидных капель под микроскопом.
  3. Проводят хондрогенную дифференцировку.
    1. Инокулируйте 1 × 105 JBMMSC в лунку в шестилуночный планшет.
    2. Когда слияние клеток достигнет 70%, смените среду на среду для хондрогенной индукции.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Меняйте хондрогенную индукционную среду каждые 3 дня.
    3. Проводите окрашивание альцианским синим после 21 дня хондрогенной индукции.
    4. Снимите среду с шестилуночного планшета, зафиксируйте клетки 4% параформальдегидом при комнатной температуре на 30 минут, а затем трижды промойте их PBS.
    5. Окрашивайте клетки окрашиванием алкийского синего при температуре 37 °C в течение 1 часа.
    6. Промойте клетки до тех пор, пока не останется красящего раствора, и рассмотрите их под микроскопом.

7. ПЦР в реальном времени

  1. Извлеките общую РНК с помощью набора для экстракции РНК и измерьте концентрацию РНК с помощью ферментного маркера (следуя инструкциям производителя).
  2. Синтезируйте кДНК с использованием 500 нг РНК19.
  3. Проведите qRT-PCR на системе в режиме реального времени с 10 μL смеси qRT-PCR, содержащей 1 μL кДНК, 3,5 μL двойной дистиллированной воды, 5 μL SYBR и 0,5 μL смеси праймеров (0,1 μM).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Последовательности праймеров перечислены в таблице 1. Условия термоциклирования следующие: 50 °C в течение 2 мин, 95 °C в течение 2 мин, затем 40 циклов при 95 °C в течение 15 с, 60 °C в течение 2 мин, а затем с шагом 0,5 °C в течение 5 с от 60 °C до 95 °C для кривой плавления.
  4. Использование GAPDH в качестве системы внутреннего контроля16.

Результаты

Через 72 ч после инокуляции клеток большинство клеток были подвешены и круглой формы, и очень немногие из них прилипли к стенке (рис. 1B). К пятому дню появились колонии адгезивных клеток, демонстрирующие веретенообразные или фибробластоподобные формы (рисунок 1C). К седьмому дню адгезивные клетки достигли 90% конфлюенции, образуя форму «рыбьей косяка» с небольшим количеством прерывистых взвешенных клеток (рис. 1D). Пассажные клетки быстро росли и проходили каждые 3 дня. Морфология клеток была относительно однородной, преимущественно веретенообразной и располагалась в виде вихря после слияния (рисунок 1E-G).

Анализ проточной цитометрии выявил высокие уровни экспрессии маркеров поверхности мезенхимальных стволовых клеток CD90, CD29 и CD44 с положительными показателями 97,2%, 97,7% и 95,7% соответственно. И наоборот, маркеры поверхности гемопоэтических стволовых клеток CD45, CD34 и CD11b/c показали низкую экспрессию, с положительными показателями 1,37%, 0,66% и 1,49% соответственно (рисунок 2A). После 2 недель культивирования JBMMSC продемонстрировали колонизацию, о чем свидетельствует окрашивание кристаллическим фиолетовым цветом (рис. 2B). Они продемонстрировали стабильную способность к экспансии in vitro, при этом кривая роста клеток следовала типичной «S-подобной» схеме (рис. 2C). Процесс пролиферации клеток включал латентный период, логарифмическую фазу роста и фазу плато. Быстрый рост начался через два дня, за которым последовало замедление через шесть дней. Отдельные клетки проявляли характеристики саморепликации и пролиферации.

На7-е сутки в клетках наблюдались сине-фиолетовые частицы, окрашивающие ЩФ, а на 21-е сутки – красные минерализованные конкреции. Кроме того, после 14 дней адипогенной индукции в клетках появились красные липидные капли, в то время как хондрогенная индукция дифференцировки привела к образованию синей хрящевой ткани (рис. 3A). Кроме того, после 7 дней остеогенной индукции уровни экспрессии мРНК ALP, OCN и Runx2 в JBMMSC были повышены на15 (рис. 3B).

figure-results-1
Рисунок 1: Изоляция и культура JBMMSCs. (A) Обзор протокола. (Б-Г) Изображения клеток, культивируемых в течение 3 дней, 5 дней и 7 дней в первичной культуре соответственно. (Э-Г) Изображения клеток P1, P2 и P3 соответственно. Масштабные линейки: 100 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-2
Рисунок 2: Идентификация JBMMSC. (A) Результаты анализа проточной цитометрии JBMMSC крыс. Анализ проточной цитометрии показал, что эти клетки были положительными на CD29, CD44 и CD90, что согласуется с характеристиками BMMSC. И наоборот, они были отрицательными для CD11b/c, CD34 и CD45. (B) Репрезентативные изображения колоний JBMMSC, окрашенных кристаллическим фиолетовым цветом (масштабные линейки: 100 мкм). (В) Кривая роста клеток показывает скорость пролиферации клеток. Данные и полосы погрешностей обозначают среднее значение ± стандартного отклонения, n = 3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-3
Рисунок 3: Мультилинейная (остеогенная, адипогенная и хондрогенная) дифференцировка JBMMSCs. (A) После 7 дней остеогенной индукции наблюдалась повышенная активность ЩФ. Через 21 день после остеогенной индукции многочисленные минерализованные конкреции окрашивались в красный цвет с окрашиванием Ализарином в красный цвет. При окрашивании масляным красным О было выявлено значительное количество липидных капель. Окрашивание альцианским синим выделяло клетки, индуцированные в хондроциты после хондрогенной индукции. (B) экспрессия мРНК остеогенного родственного гена ALP, OCN и Runx2 JBMMSCs после остеогенной индукции в течение 7 дней. (P < 0,001, по сравнению с контрольной группой). Данные и полосы погрешностей обозначают среднее значение ± стандартного отклонения, n = 3. Масштабные линейки: 100 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

ГенПоследовательности праймеров (5'-3')
ГАДФНF: ACCCAGAAGACTGTGGATGG
R: CACATTGGGGGTAGGAACACAC
Горная вершинаF: CACGTTGACTGTGGTTACTGCTGA
R: CCTTGTAACCAGGCCCGTTG
OCNF: GGTGGTGAATAGACTCCGGC
R: GCAACACATGCCCTAAACGG
Рунх2F: GCACCCAGCCCATAATAGA
R: TTGGAGCAAGGAGAACCC

Таблица 1: Праймеры, используемые в ПЦР в реальном времени.

Обсуждение

Мезенхимальные стволовые клетки костного мозга (BMMSC) представляют собой подмножество негемопоэтических стволовых клеток, обитающих в костном мозге, характеризующихся способностью к самообновлению, потенциалом многонаправленной дифференцировки и поддерживающими функциями для кроветворения. Эти клетки играют ключевую роль в различных физиологических процессах, таких как регенерация тканей, ангиогенез и регуляция клеточнойактивности. Следовательно, BMMSC часто используются в восстановлении тканей и регенеративной инженерии в качестве оптимального источника затравочных клеток21.

Мезенхимальные стволовые клетки костного мозга челюсти (JBMMSC), первоначально выделенные из костного мозга челюсти человека в 2005 году Matsubara et al.22, демонстрируют отличительные характеристики дифференцировки, связанные с уникальным происхождением и путями развития челюсти по сравнению с другими участками скелета 4,23. Учитывая различные механизмы развития и патологии, управляющие черепно-лицевой костью, приоритет JBMMSC при восстановлении дефектов черепно-лицевой кости представляется необходимым из-за их гомологичных особенностей развития23. Кроме того, JBMMSC демонстрируют повышенную гистосовместимость с микроокружением полости рта благодаря их общему происхождению эмбриональной ткани24,25. Несмотря на эти преимущества, стандартизированный и безопасный протокол изоляции для JBMMSC остается труднодостижимым, а исследования JBMMSC остаются относительно ограниченными.

Выделение и культивирование BMMSC в настоящее время не стандартизированы, при этом обычно используются такие методы, как иммуномагнитная сортировка гранул, сортировка проточной цитометрией, центрифугирование с градиентом плотности и культура адгезивного анализа всего костного мозга26. Среди них метод иммуномагнитных шариков и метод сортировки проточной цитометрией изолируют клетки, узнавая специфические антигены на поверхности клетки. Однако эти методы включают в себя громоздкие операции, требуют специализированных инструментов и могут влиять на активность клеток, несмотря на получение клеток высокой чистоты27. Метод центрифугирования с градиентом плотности разделяет клетки с помощью центрифугирования и стратификации, что может изменить микроокружение клетки, что приводит к замедлению роста клеток и увеличению клеточного старения. И наоборот, метод адгезивного культивирования всего костного мозга отделяет и очищает BMMSC путем периодической замены среды и пропускания на основе различных адгезивных способностей среди различных типов клеток в костном мозге. Этот метод наносит минимальный ущерб клеткам и проств выполнении 16.

По сравнению с бедренной костью, челюсть меньше по размеру и имеет более узкую полость костного мозга, с вмешательством клеток в зуб или периодонтальную связку. Метод промывания костного мозга и адгезии требует относительно большего количества костного мозга и подходит для крупных животных и человека29. JBMMSC у крыс, экстрагированных с применением традиционного метода промывки костного мозга, редки по количеству, медленно размножаются и имеют низкое качество30,31. Содержание JBMMSC в костном мозге очень низкое, и они в основном обнаруживаются в компактной кости и эндокостнице. Bu-Kyu Lee et al.32 использовали аспираты нижней челюсти для выделения JBMMSCs, в то время как общее время аспирации 10 мл костного мозга для нижней челюсти было в пять раз больше, чем для подвздошного гребня, а исходный выход MSCs из нижней челюсти был в три раза ниже, чем из подвздошного гребня. Промывание костного мозга само по себе не может эффективно изолировать клетки в компактной кости и эндокостнице.

В последние годы исследования показали, что компактная кость является новым и надежным источником BMMSC, и был выведен относительно простой метод выделения BMMSC – метод культуры для расщепления костных срезов33. BMMSC, выделенные этим методом, имеют высокую чистоту34. Guo et al.35успешно выделили костные мезенхимальные стволовые клетки из бедренных костей мышей с использованием метода культурального расщепления костных срезов. Yamazaet al.12 и Cheng et al.15 применили метод культуры расщепления костного среза для выделения мезенхимальных стволовых клеток костного мозга нижней челюсти мыши и проверили свойства МСК по пролиферации клеток, иммунофенотипу и мультилинейной дифференцировке. В этом эксперименте использовалась комбинация адгезии промытого целого костного мозга и переваривания костного среза для выделения и культивирования первичных JBMMSC крыс. Костный мозг тщательно вымывали из полости без фильтрации для поддержания исходного клеточного состава и факторов роста в костном мозге. Затем срезы кости были разрезаны на небольшие кусочки и расщеплены с использованием коллагеназы II типа, чтобы облегчить клеткам возможность выбраться из костных фрагментов. Наконец, срезы костей инокулировали на чашку для культивирования и культивировали, чтобы позволить клеткам выползти из срезов костей. Комбинированный метод позволяет сделать так, чтобы система культивирования первичной клетки одновременно содержала компоненты гемопоэтических стволовых клеток, губчатой кости и кортикальной кости, что позволяет лучше моделировать микроокружение мезенхимальных стволовых клеток костного мозга в организме и в большей степени способствует сохранению исходных биологических характеристик клеток. Поэтому этот метод называется «нишевым подходом к основе»36. Luet al.37 также подчеркнул важность ниш стволовых клеток в выделении BMMSC, но они задействовали только микроокружение в костном мозге без корковой кости. Этот метод был успешно применен при выделении мезенхимальных стволовых клеток костного мозга от мышей челюстью38.

Мы также успешно изолировали и культивировали JBMMSC крыс с помощью этого нишевого подхода. Во-первых, изолированные клетки демонстрировали фибробластоподобную форму и прилипали к пластиковым культуральным планшетам in vitro. Во-вторых, клетки положительно экспрессировали поверхностные маркеры CD90, CD29 и CD44 и отрицательно экспрессировали CD45, CD34 и CD11b/c. В-третьих, клетки могут дифференцироваться в остеоциты, адипоциты и хондроциты. Полученные клетки обладали хорошей морфологией, быстрой скоростью пролиферации и способностью к дифференцировке, что соответствовало минимальным критериям идентификации мезенхимальных стволовых клеток человеческого происхождения, предложенным Международным обществом клеточнойтерапии.

Выделение JBMMSC было разработано и использовано для выделения клеток у человека. Matsubara et al.22 были первыми, кто выделил JBMMSC из образцов альвеолярного костного мозга человека во время челюстно-лицевой хирургии. В процессе аспирации нижней челюсти могут возникнуть возможные осложнения, в том числе повреждение прилегающих тканей, инфицирование из-за бактериального загрязнения полости рта и т.д. Zong et al.39 промывали полость костного мозга губчатых образцов кости для получения человеческих JBMMSC. Park et al.40 выделяли человеческие JBMMSC из альвеолярных костных чипов, полученных во время сверления имплантатов с использованием метода последовательного сбраживания. Mason et al.41 непосредственно выделили человеческие JBMMSC из ядер костного мозга челюсти и аспирата пациентов, перенесших рутинную установку дентальных имплантатов. Был отмечен высокий процент успеха выделения клеток либо из аспиратов, либо из ядра, а также более высокий процент успеха комбинации. Однако, несмотря на то, что вышеупомянутые методы успешно изолировали JBMMSC от человека, различия в эффективности между методами необходимо сравнивать. В настоящее время представленный метод используется только на мышах и крысах, и нет исследований по применению этого метода для выделения человеческих JBMMSC. У этого метода есть ограничения, особенно когда он применяется к людям. Во-первых, этот метод совмещения промывки костного мозга и переваривания костного среза относительно сложен и требует большего количества этапов. Во-вторых, сложные процессы предъявляют более высокие требования к стерильности операций, что имеет решающее значение для протокола. В-третьих, невозможно промыть всю полость костного мозга челюстной кости человека, поэтому необходимо изучить некоторые эквивалентные методы, такие как промывание губчатых костных фрагментов.

Таким образом, в этом исследовании были успешно выделены и культивированы JBMMSC крыс с использованием комбинации промывки костного мозга и переваривания костных срезов на основе принципа «ниши стволовых клеток». Результаты идентификации клеток подтвердили, что этот метод может выделять достаточное количество JBMMSC высокой чистоты, обеспечивая достаточные источники клеток для инженерии ткани челюстной кости, особенно при восстановлении костных дефектов, что имеет большое значение.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Это исследование было поддержано проектами в области здравоохранения Департамента материально-технического обеспечения Военной комиссии (19BJZ22), Пекинским фондом естественных наук (7232154) и Четвертым клиническим исследовательским проектом Военного университета Военного университета (2021XB025).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Ализарин красный S раствор 0,2%SolarbioG1450
BCIP/NBT Набор для разработки красителя щелочной фосфатазыBeyotimeC3206
Bio-RAD CFX96 Система реального времениBio-RAD
CCK8 НаборDujindoCK04
Чашка для клеточных культур 10 смCorning353003
центрифугаЦентрифужная пробирка Eppendorf5810R
15 мл Центрифуга Corning430790
Трубка 50 мл Инкубатор Corning430828
CO2Thermo Fisher3111
Генератор постоянной температурыShanghai Zhicheng Analysis Instrument Manufacturing Co., Ltd.ZWY-100H
Фетальная бычья сывороткаBI04-001-1ACS
Проточный цитометрBDFACS C6 
Инвертированный фазово-контрастный микроскопOlympusCKX41 
Набор для обнаружения маркеров поверхности мезенхимальных стволовых клеток (крыс) OricellRAXMX-09011
Многофункциональный считыватель микропланшетов BioTekSynergy LX Многомодовое
масло красное пятноНабор SolarbioG1262
Параформальдегид 4%SolarbioP1110
PBSMACGENECC008
пенициллин-стрептомицин 0,25%MACGENECC004
PowerUp SYBR Green Master MixThermo Fisher A25742
Мастер-микс PrimeScript RT TakaraRR036A
Костный мозг крысы Мезенхимальные стволовые клетки Набор для адиогенной дифференцировкиOricellRAXMX-90031
Костный мозг крысы Мезенхимальные стволовые клетки Набор для хондрогенной дифференцировкиOricellRAXMX-90041
Костный мозг крысы Мезенхимальные стволовые клетки Набор для остеогенной дифференцировкиOricellRAXMD-90021
Набор для экстракции РНКTIANGENDP419
Супер-чистый стендBeijing Yataikelong Instrument Technology Co. Ltd.KLCZ-1220A
Трипсин-ЭДТА  0,25%MACGENECC012
Тип II коллагеназаSolarbioC8150
Wistar крысаBeijing Yataikelong Instrument Technology Co. Ltd.
α-MEM питательная среда GibcoC12571500BT

Ссылки

  1. Friedenstein, A. J., Petrakova, K. V., Kurolesova, A. I., Frolova, G. P. Heterotopic of bone marrow. Analysis of precursor cells for osteogenic and hematopoietic tissues. Transplantation. 6 (2), 230-247 (1968).
  2. Pittenger, M. F., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284 (5411), 143-147 (1999).
  3. Shao, J., Zhang, W., Yang, T. Using mesenchymal stem cells as a therapy for bone regeneration and repairing. Biol Res. 48, 62(2015).
  4. Aghaloo, T. L., et al. Osteogenic potential of mandibular vs. Long-bone marrow stromal cells. J Dent Res. 89 (11), 1293-1298 (2010).
  5. Mendi, A., Ulutürk, H., Ataç, M. S., Yılmaz, D. Stem cells for the oromaxillofacial area: Could they be a promising source for regeneration in dentistry. Adv Exp Med Biol. 1144, 101-121 (2019).
  6. Couly, G. F., Coltey, P. M., Le Douarin, N. M. The triple origin of skull in higher vertebrates: A study in quail-chick chimeras. Development. 117 (2), 409-429 (1993).
  7. Leucht, P., et al. Embryonic origin and hox status determine progenitor cell fate during adult bone regeneration. Development. 135 (17), 2845-2854 (2008).
  8. Jeyaraman, M., et al. Is mandible derived mesenchymal stromal cells superior in proliferation and regeneration to long bone-derived mesenchymal stromal cells. World J Methodol. 13 (2), 10-17 (2023).
  9. Mouraret, S., et al. The potential for vertical bone regeneration via maxillary periosteal elevation. J Clin Peri.odontol. 41 (12), 1170-1177 (2014).
  10. Li, T. Q., Meng, X. B., Shi, Q., Zhang, T. Research progress in biological characteristics and influencing factors of jaw bone marrow mesenchymal stem cell. Zhonghua Kou Qiang Yi Xue Za Zhi. 57 (1), 107-112 (2022).
  11. Arthur, A., Gronthos, S. Clinical application of bone marrow mesenchymal stem/stromal cells to repair skeletal tissue. Int J Mol Sci. 21 (24), 9759(2020).
  12. Yamaza, T., et al. Mouse mandible contains distinctive mesenchymal stem cells. J Dent Res. 90 (3), 317-324 (2011).
  13. Chen, L., et al. Directional homing of glycosylation-modified bone marrow mesenchymal stem cells for bone defect repair. J Nanobiotechnology. 19 (1), 228(2021).
  14. Hong, Y., et al. Isolation and cultivation of mandibular bone marrow mesenchymal stem cells in rats. J Vis Exp. (162), e61532(2020).
  15. Cheng, B., et al. Isolation, culture and biological characteristics of high-purity orofacial-bone-derived mesenchymal stem cells of the rats. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 25 (1), 67-72 (2021).
  16. Lee, D. J., et al. Osteogenic potential of mesenchymal stem cells from rat mandible to regenerate critical sized calvarial defect. J Tissue Eng. 10, 2041731419830427(2019).
  17. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The international society for cellular therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  18. Fathi, E., Mesbah-Namin, S. A., Vietor, I., Farahzadi, R. Mesenchymal stem cells cause induction of granulocyte differentiation of rat bone marrow c-kit(+) hematopoietic stem cells through jak3/stat3, erk, and pi3k signaling pathways. Iran J Basic Med Sci. 25 (10), 1222-1227 (2022).
  19. Xu, W., et al. Exosomes from microglia attenuate photoreceptor injury and neovascularization in an animal model of retinopathy of prematurity. Mol Ther Nucleic Acids. 16, 778-790 (2019).
  20. Chu, D. T., et al. An update on the progress of isolation, culture, storage, and clinical application of human bone marrow mesenchymal stem/stromal cells. Int J Mol Sci. 21 (3), 708(2020).
  21. Liu, Y., et al. Systemic infusion of mesenchymal stem cells improves cell-based bone regeneration via upregulation of regulatory T cells. Tissue Eng Part A. 21 (3-4), 498-509 (2015).
  22. Matsubara, T., et al. Alveolar bone marrow as a cell source for regenerative medicine: Differences between alveolar and iliac bone marrow stromal cells. J Bone Miner Res. 20 (3), 399-409 (2005).
  23. Zhang, G., Li, Q., Yuan, Q., Zhang, S. Spatial distributions, characteristics, and applications of craniofacial stem cells. Stem Cells Int. 2020, 8868593(2020).
  24. Akintoye, S. O. The distinctive jaw and alveolar bone regeneration. Oral Dis. 24 (1-2), 49-51 (2018).
  25. Park, J. B., Kim, I., Lee, W., Kim, H. Evaluation of the regenerative capacity of stem cells combined with bone graft material and collagen matrix using a rabbit calvarial defect model. J Periodontal Implant Sci. 53 (6), 467-477 (2023).
  26. Ni, X., et al. Isolation, culture and identification of SD rat bone marrow mesenchymal stem cells in tissue engineering. Materials Exp. 12, 817-822 (2022).
  27. Abdallah, B. M., Khattab, H. M. Recent approaches to isolating and culturing mouse bone marrowderived mesenchymal stromal stem cells. Curr Stem Cell Res Ther. 16 (5), 599-607 (2021).
  28. Tan, S. L., Ahmad, T. S., Selvaratnam, L., Kamarul, T. Isolation, characterization and the multilineage differentiation potential of rabbit bone marrow-derived mesenchymal stem cells. J Anat. 222 (4), 437-450 (2013).
  29. Mason, S., Tarle, S. A., Osibin, W., Kinfu, Y., Kaigler, D. Standardization and safety of alveolar bone-derived stem cell isolation. J Dent Res. 93 (1), 55-61 (2014).
  30. Kagami, H., Agata, H., Tojo, A. Bone marrow stromal cells (bone marrow-derived multipotent mesenchymal stromal cells) for bone tissue engineering: Basic science to clinical translation. Int J Biochem Cell Biol. 43 (3), 286-289 (2011).
  31. Liu, J., Watanabe, K., Dabdoub, S. M., Lee, B. S., Kim, D. G. Site-specific characteristics of bone and progenitor cells in control and ovariectomized rats. Bone. 163, 116501(2022).
  32. Lee, B. K., Choi, S. J., Mack, D., Oh, S. H. Isolation of mesenchymal stem cells from the mandibular marrow aspirates. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod. 112 (6), e86-e93 (2011).
  33. Zhu, H., et al. A protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse compact bone. Nat Protoc. 5 (3), 550-560 (2010).
  34. Short, B. J., Brouard, N., Simmons, P. J. Prospective isolation of mesenchymal stem cells from mouse compact bone. Methods Mol Biol. 482, 259-268 (2009).
  35. Guo, Z., et al. In vitro characteristics and in vivo immunosuppressive activity of compact bone-derived murine mesenchymal progenitor cells. Stem Cells. 24 (4), 992-1000 (2006).
  36. Pal, B., Das, B. In vitro culture of naïve human bone marrow mesenchymal stem cells: A stemness based approach. Front Cell Dev Biol. 5, 69(2017).
  37. Lu, L. L., et al. Isolation and characterization of human umbilical cord mesenchymal stem cells with hematopoiesis-supportive function and other potentials. Haematologica. 91 (8), 1017-1026 (2006).
  38. Cao, W., et al. Mir-344d-3p regulates osteogenic and adipogenic differentiation of mouse mandibular bone marrow mesenchymal stem cells. PeerJ. 11, e14838(2023).
  39. Zong, C., Zhao, L., Huang, C., Chen, Y., Tian, L. Isolation and culture of bone marrow mesenchymal stem cells from the human mandible. J Vis Exp. (182), e63811(2022).
  40. Park, J. C., et al. Acquisition of human alveolar bone-derived stromal cells using minimally irrigated implant osteotomy: In vitro and in vivo evaluations. J Clin Periodontol. 39 (5), 495-505 (2012).
  41. Mason, S., Tarle, S. A., Osibin, W., Kinfu, Y., Kaigler, D. Standardization and safety of alveolar bone-derived stem cell isolation. J Dent Res. 93 (1), 55-61 (2014).

Перепечатки и разрешения

Теги

Методика выделения и культивирования мезенхимальных стволовых клеток костного мозга челюсти крысы
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.