Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Диссоциация образцов опухолевой ткани человека и мыши для секвенирования РНК одиночных клеток

3.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/66766

⸱

16 августа 2024 г.

 ,  ,  ,  , 
1Krantz Family Center for Cancer Research, Department of Medicine, Massachusetts General Hospital, 2Broad Institute of MIT and Harvard, 3Department of Medicine, Harvard Medical School

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

В этом протоколе описана процедура быстрой диссоциации образцов опухолей человека и мыши для секвенирования РНК одиночных клеток.

Аннотация

Образцы опухолей человека содержат множество информации об их микроокружении и иммунном репертуаре. Эффективная диссоциация образцов тканей человека в жизнеспособные клеточные суспензии является необходимым входом для конвейера секвенирования РНК одиночных клеток (scRNAseq). В отличие от подходов к объемному секвенированию РНК, scRNAseq позволяет нам сделать вывод о транскрипционной гетерогенности в образцах опухолей на уровне отдельных клеток. Внедрение этого подхода в последние годы привело ко многим открытиям, таким как идентификация иммунных и опухолевых клеточных состояний и программ, связанных с клиническими ответами на иммунотерапию и другие виды лечения. Кроме того, одноклеточные технологии, применяемые к диссоциированным тканям, могут быть использованы для идентификации доступных областей хроматина, Т- и В-клеточного рецепторного репертуара, а также экспрессии белков с использованием антител со штрих-кодом ДНК (CITEseq).

Жизнеспособность и качество диссоциированного образца являются критическими переменными при использовании этих технологий, поскольку они могут существенно повлиять на перекрестное загрязнение отдельных клеток окружающей РНК, качество данных и интерпретацию. Более того, длительные протоколы диссоциации могут привести к элиминации чувствительных клеточных популяций и повышению сигнатуры гена реакции на стресс. Чтобы преодолеть эти ограничения, мы разработали протокол быстрой универсальной диссоциации, который был валидирован на нескольких типах опухолей человека и мышей. Процесс начинается с механической и ферментативной диссоциации, за которой следует фильтрация, лизис эритроцитов и обогащение живых мертвецов, пригодных для образцов с низким содержанием клеток (например, биопсия ядра иглой). Этот протокол обеспечивает чистую и жизнеспособную одноклеточную суспензию, имеющую первостепенное значение для успешного создания гелевых эмульсий (GEMs), штрих-кодирования и секвенирования.

Введение

Несмотря на то, что многие достижения в исследованиях рака привели к разработке и одобрению FDA препаратов, нацеленных на ингибиторные рецепторы, экспрессируемые на иммунных и опухолевых клетках, известных как ингибиторы блокады контрольных точек, устойчивость к терапии и выявление механизмов, которые стимулируют реакцию пациента, остаются сложной задачей. Сложная задача характеристики гетерогенности опухоли по ее молекулярному разнообразию и сложному взаимодействию между опухолевыми клетками и иммунным микроокружением требует новых подходов к анализу этой сложной экосистемы с разрешением для одной клетки. Понимание молекулярных сложностей в опухолях и их микроокружении имеет решающее значение для продвижения терапевтических стратегий и расшифровки сложной биологии, лежащей в основе прогрессирования рака2. Секвенирование РНК одиночных клеток (scRNA-seq) становится все более популярным, поскольку оно обеспечивает анализ отдельных клеток с высоким разрешением в сложных образцах опухолей 3,4.

Гетерогенность опухолей, охватывающая генетические, эпигенетические и фенотипические различия, представляет собой проблему для раскрытия тонкостей биологиирака. Традиционные методы массового секвенирования РНК имеют тенденцию скрывать уникальные профили экспрессии и фенотипы гетерогенных клеточных популяций, присутствующих в опухолях, поскольку эти методы усредняютсигналы по целым клеточным популяциям. В отличие от этого, scRNA-seq позволяет препарировать отдельные типы клеток, выявляя различные экспрессии генов, паттерны репрессии и клеточные состояния, которые в противном случае были бы упущены из виду 4,6. Предпосылка scRNA-seq заключается в его способности расшифровывать генетические и молекулярные сигнатуры отдельных клеток, что открывает огромные перспективы в открытии новых методов лечениярака.

Расшифровывая профили экспрессии генов опухолевых клеток и окружающих стромальных и иммунных клеток, исследователи могут идентифицировать новые терапевтические мишени и разработать стратегии точной генетической медицины, адаптированные к индивидуальнымпациентам. Кроме того, анализ иммунного репертуара в опухолевом микроокружении позволяет получить важнейшее представление о взаимодействии между опухолевыми клетками и иммунными эффекторами, прокладывая путь к иммунотерапевтическимвмешательствам. Несмотря на достижения в использовании scRNAseq на клинических образцах, некоторые проблемы на этапах обработки могут нанести ущерб целостности РНК клетки, жизнеспособности и качеству генерируемых данных. Кроме того, обработка тканей с низкой жизнеспособностью клеток может повышать уровни окружающей РНК в каплях, образующихся при инкапсуляции отдельных клеток, что приводит к перекрестному загрязнению и неправильной аннотации типов клеток, в то время как длительные протоколы диссоциации, выполняемые при 37 °C, могут привести к повышению сигнатуры гена реакции на стресс в нескольких типах клеток 8,9. 10.

Поэтапная процедура (рис. 1A), описанная в данном протоколе, начинается с быстрой механической и ферментативной диссоциации опухолей с последующей фильтрацией и удалением мертвых клеток, в зависимости от жизнеспособности каждого образца опухоли. В настоящее время эта процедура верифицирована на образцах опухолей меланомы11, толстой кишки12, плоскоклеточного рака головы и шеи13, опухолей поджелудочной железы и легких (неопубликованные данные). Эти методы обеспечивают получение высококачественных жизнеспособных клеточных суспензий, имеющих решающее значение для последующих анализов14. В частности, удаление эритроцитов, лишенных синтезированной РНК, становится обязательным условием для очистки образца15. Последующая оценка количества клеток и элиминация мертвых клеток служат предпосылкой для успешного получения 10-кратной гелевой эмульсии (GEM) Genomics Gel, штрих-кодирования и увеличения восстановления транскриптов и секвенированных клеток без риска исключения чувствительных популяций (например, нейтрофилов и эпителиальных клеток)16. Эти шаги имеют основополагающее значение для раскрытия потенциала анализа разрешения одиночных клеток в образцахопухолей 9,10, выявления новых профилей экспрессии генов и иммунных сигнатур, необходимых для проведения инновационных терапевтических вмешательств, а также выявления новых уязвимостей опухолей.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Это исследование соответствовало всем институциональным рекомендациям по забору образцов тканей человека. От пациентов было получено информированное согласие, а идентифицируемые данные образцов были анонимизированы. Образцы собираются в операционной, помещаются в раствор RPMI, физиологического раствора или PBS и подтверждаются на злокачественность в отделении патологии перед использованием в исследованиях. Все шаги, за исключением случаев, когда указано указание, должны выполняться при температуре 4 °C или на льду. Работа внутри биозащитного колпака при обработке тканей человека. Подробную информацию обо всех материалах, реагентах и инструментах, используемых в этом протоколе, см. в Таблице материалов .

1. Получение образца

  1. Возьмите образец твердой опухоли в пробирке со средой и поместите его на лед.
    1. Проинструктируйте персонал операционной о необходимости транспортировать образец в пробирке, содержащей достаточное количество RPMI, физиологического раствора или PBS для полного погружения ткани во избежание обезвоживания образца.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Важно убедиться, что образец не высох, так как это снизит жизнеспособность.
  2. Охладите все центрифуги до 4 °C и доведите термомиксер до 37 °C.
  3. Достаньте подготовленные ферменты диссоциации опухолей человека или мыши (Таблица материалов), разморозьте на термомиксере при температуре 37 °C и после оттаивания переместите на лед.
  4. Извлеките аликвоту RPMI объемом 20 мл.
  5. Записывайте соответствующую информацию об образце (например, идентификатор пациента, деидентификатор, тип образца).
  6. Перенесите образец в чашку для культуры тканей диаметром 60 мм (помещенную на лед), несколько раз перевернув пробирку и вылив содержимое в чашку, чтобы убедиться, что весь материал образца перенесен. Если образец не был доставлен в фильтрующем материале по прибытии, добавьте в блюдо свежий фильтрующий материал RPMI.
    1. Если образец фрагментирован, вращайте пробирку, содержащую образец, при 450 × г 4 °C в течение 5 минут, выбросьте надосадочную жидкость, повторно суспендируйте образец в 420 мкл RPMI и перейдите к разделу 2.

2. Механическое и ферментативное пищеварение

  1. Пипетка 420 мкл среды из чашки для образцов диаметром 60 мм в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл. Попытайтесь включить любые фрагменты образцов, взвешенные на носителе.
  2. Перенесите образец ткани из чашки диаметром 60 мм в пробирку объемом 1,5 мл с средой с помощью пинцета. Разрежьте образец чистыми ножницами внутри пробирки так, чтобы кусочки были максимум 2-3 мм в диаметре.
  3. Добавляют ферменты для пищеварения, приготовленные в соответствии со спецификациями производителя (Таблица материалов), в образце в следующих объемах: 42 мкл фермента H (неспецифические протеазы) для образцов человека, фермент D (неспецифические протеазы) для образцов мышей, 21 мкл фермента R (неспецифические протеазы) и 5 мкл фермента A (нуклеазы).
  4. Добавьте еще 420 μL среды из чашки или до отметки 1 мл на пробирке. Не превышайте 420 мкл среды.
  5. Сделайте трубку вихревой в течение 5 с и поместите ее в термомиксер, расположенный вертикально на боку (рис. 1B). Инкубировать при 37 °C, 450 об/мин, в течение 15 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Во время инкубации извлеките все 10x материалы Genomics, необходимые для получения GEM, так как им требуется 30 минут для балансировки до комнатной температуры.

3. Фильтрация образцов

  1. Поместите фильтр ячейки 50 μм поверх новой конической трубки объемом 15 мл и заполните фильтр, пропустив через него 1 мл свежего фильтрующего материала RPMI внутрь трубки.
  2. После разложения переложите образец в пробирку объемом 15 мл с помощью широкого наконечника пипетки объемом 1 000 мкл с низким удержанием. Промойте пробирку объемом 1,5 мл 1 мл свежей среды и переложите среду в фильтр, чтобы убедиться, что весь материал образца прошел через фильтр.
  3. Возьмите пластиковый шприц объемом 1 мл и выньте только поршень (оставшуюся часть шприца выбросьте). С помощью задней части поршня шприца измельчите и надавите на образец на фильтр вращательными движениями.
  4. Промойте фильтр 5 мл фильтра и остатками фильтрующего материала из чашки, в которой находился образец (раздел 1), чтобы собрать все клетки, которые могли отделиться от ткани.
  5. Поместите фильтр ячейки 30 μм поверх новой конической трубки объемом 15 мл, заправьте фильтр 1 мл фильтрующего материала и пропустите содержимое пробирки, содержащей диссоциированный образец, через фильтр.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе удаляются крупные загрязнения, которые могут засориться или привести к сбою смачивания при обработке образца с использованием микрофлюидных чипов 10x Genomics.

4. Лизис эритроцитов

  1. Центрифугируйте образец при 450 × г, 4 °C в течение 5 минут. Отсасывайте среду, стараясь не потревожить гранулы.
  2. Ресуспендируйте в буфере ACK Lysis для удаления эритроцитов (эритроцитов) и записи использованного объема. Объем будет зависеть от размера гранул и количества эритроцитов в гранулах.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ресуспендированный раствор образца ACK должен быть бесцветным, когда добавлено достаточное количество буфера для лизиса ACK, так как это приведет к удалению эритроцитов из образца.
  3. Центрифугируйте пробирку с образцом при 450 × г, 4 °C в течение 5 мин и аспирируйте надосадочную жидкость.
  4. При необходимости повторяйте шаги 4.2-4.3 до тех пор, пока после центрифугирования гранула образца не потеряет видимый красный цвет (рисунок 2). Запишите все дополнительные объемы буфера ACK Lysis, используемого на этом этапе.
  5. Повторно суспендируйте образец гранулы в свежей среде при подготовке к подсчету.

5. Подсчет ячеек

  1. Поместите 10 μл трипанового синего в пробирку объемом 1,5 мл. Аккуратно перемешайте диссоциированные клетки, возьмите 10 μл образца и смешайте (1:1) с трипановым синим. Загрузите по 10 мкл с каждой стороны гемоцитометра и подсчитайте клетки.
  2. Регистрируйте концентрацию клеток, общее количество живых клеток, процент жизнеспособности и конечный объем среды после подсчета.
  3. Убедитесь, что количество клеток находится в диапазоне от 700 до 1 200 клеток/л (7 × 10, 5-1,2 × 106/мл) для оптимального 10-кратного запуска геномики.
    1. Если проба слишком концентрированная, разбавьте ее средой и пересчитайте.
    2. Если образец слишком разбавлен, центрифугируйте образец при 450 × г, 4 °C в течение 5 мин и повторно суспендируйте в меньшем объеме среды.
    3. Если жизнеспособность клеток ниже 80%, проведите процедуру удаления мертвых клеток.
    4. Если их меньше одного миллиона клеток, см. раздел 6.
    5. Если количество клеток превышает миллион и жизнеспособность > 10%, см. раздел 6.
    6. Если имеется более миллиона клеток и жизнеспособность < 10%, см. раздел 7.
    7. Если жизнеспособность клеток превышает 80%, держите обработанные клетки на льду и немедленно приступайте к генерации GEM в соответствии с инструкциями производителя.

6. Удаление мертвых клеток - Набор 1

ПРИМЕЧАНИЕ: Работайте внутри колпака биобезопасности при использовании реагентов для удаления мертвых клеток, так как они могут легко загрязниться.

  1. Центрифугируйте образец при 450 × г, 4 °C в течение 5 минут.
  2. В конической пробирке объемом 15 мл приготовьте изоляционную среду и храните ее при комнатной температуре: 9,8 мл PBS, 10 мкл CaCl2 и 200 мкл термоинактивированной FCS (добавленной в биозащитный колпак).
  3. После центрифугирования отсасывайте среду из гранулы и повторно суспендируйте в 1 мл изоляционной среды.
  4. Снова центрифугируйте пробирку при 450 × г, 4 °C в течение 5 минут. Отсадите надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулу в 100 мкл изоляционной среды.
  5. Перелейте 100 мкл образца в изоляционной среде в одну лунку ПЦР-пробирки объемом 0,2 мл.
  6. В биозащитный колпак добавьте 10 мкл коктейля Аннексин V и 10 мкл биотинового коктейля в лунку, содержащую 100 мкл образца в изоляционной среде. Пипеткой перемешайте раствор и дайте ему настояться при комнатной температуре в течение 4 минут.
  7. Через 4 минуты наведите магнитные частицы с покрытием декстрана на 30 с. Добавьте в образец 20 μL гранул и 60 μL изоляционной среды (общий объем 200 μL). Если жизнеспособность ниже 40%, масштабируйте количество шариков до 40 μL при этом регулируйте объем изоляционной среды (до 40 μL), сохраняя общий объем 200 μL. Перемешайте пипетку и дайте раствору настояться при комнатной температуре в течение 3 минут.
  8. Поместите полосковую пробирку на магнитный сепаратор 10x Genomics (на высоких настройках) на 5 минут при комнатной температуре.
  9. Переложите жидкость из полосковой пробирки, не потревожив шарики, в новую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл lo-bind. Не снимайте полоску-трубку с магнита.
  10. Центрифугируйте пробирку объемом 1,5 мл, содержащую образец, при 450 × г, 4 °C в течение 5 минут. Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулу в соответствующем объеме среды RPMI в зависимости от размера и количества клеток гранулы, как описано в разделе 5. Повторите процедуру удаления мертвых клеток, если жизнеспособность остается ниже 80% (Рисунок 3 и Рисунок 4).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не ресуспендируйте клетки в изоляционной среде для последующего получения GEM, так как хлорид кальция будет мешать процессу инкапсуляции и этапу обратной транскрипции (RT).
  11. Держите обработанные клетки на льду, если жизнеспособность клеток превышает 80%, и немедленно приступайте к получению GEM в соответствии с инструкциями производителя.

7. Удаление мертвых клеток - Набор 2

ПРИМЕЧАНИЕ: Работайте внутри биозащитного колпака при использовании реагентов набора.

  1. Поместите микрогранулы и 20-кратный раствор связующего буфера в колпак для биобезопасности.
  2. Суспензию образца центрифугируют при 450 × г, 4 °C в течение 5 мин.
  3. Приготовьте 1x буферный раствор в стерильных условиях, используя 1 мл 20x стокового раствора Binding Buffer, помещенного пипеткой в 19 мл дистиллированной воды, не содержащей ДНКазы и РНКазы.
  4. После завершения центрифугирования аспирируйте надосадочную жидкость, добавьте микрогранулы, аккуратно перемешайте образец и инкубируйте при комнатной температуре в течение 15 минут.
    1. Когда количество клеток составит 10-7 или меньше, добавьте 100 мкл микрогранул.
    2. При количестве более 107 клеток отрегулируйте микрогранулы до конечной концентрации 100 мкл на 107 живых клеток.
  5. Во время инкубации получите одну колонку положительного отбора MACS, мультистенд MACS и соответствующий магнитный сепаратор. Убедитесь, что сепаратор выровнен на многоклеточном стенде и рядом с ним нет других металлических или магнитных предметов, так как магнитная сила очень велика и может повлиять на эффективность удаления мертвых ячеек. Плотно поместите колонну в держатель сепаратора крыльями наружу.
  6. После инкубации образца, если общий объем ресуспендирования составляет менее 500 мкл, добавьте 1x связывающий буфер до тех пор, пока общий объем не составит 500 мкл.
  7. Поместите коническую трубку объемом 15 мл под колонку и загрунтуйте колонку 3 мл 1x связующего буфера.
  8. Замените коническую трубку на новую коническую на 15 мл для сбора образцов клеток и добавьте образец в колонку, чтобы он мог полностью протекать через колонку.
  9. Промойте колонку 4 x 3 мл 1x связующего буфера, добавляя только одну промывку за раз после того, как предыдущая промывка полностью протекла через колонку.
  10. После четвертой промывки коническую пробирку, содержащую выделенные клетки, центрифугируют в течение 5 мин при 450 × г, 4 °С. Отбросьте столбец и оставшийся 1x буфер привязки.
  11. Повторно суспендируйте раствор образца в соответствующем количестве среды RPMI в зависимости от размера гранул и подсчитайте выделенные клетки способом, описанным в разделе 5 (рис. 3 и рис. 5).
    1. Если жизнеспособность остается ниже 80%, а общее количество клеток составляет 106 или меньше, повторите раздел 6.
    2. Если жизнеспособность клеток превышает 80%, держите обработанные клетки на льду и немедленно приступайте к генерации GEM в соответствии с инструкциями производителя.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Была получена биопсия меланомы во взвешенном состоянии в RPMI и немедленно помещена на лед. Образец переносили в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл, содержащую 420 мкл RPMI и ферментов для разложения, измельчали на мелкие кусочки с помощью ножниц и подвергали последующему ферментативному разложению в течение 15 мин в вертикально расположенном термомиксере при температуре 37 °C (рис. 1). После разложения образец фильтровали через стерильный одноразовый фильтр толщиной 50 мкм, а фильтр ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Этот протокол описывает диссоциацию образцов опухолей человека или мыши в одиночную клеточную суспензию для секвенирования скРНК с использованием микрофлюидной системы 10x Genomics. При обработке тканей, которые часто происходят из редких видов рака или являются частью текущих клинических испытаний или длительных экспериментов по мышиным опухолям, образец должен быть оптимально и бережно сохранен между всеми этапами. Все шаги следует проводить быстро на льду или при 4 °C для сохранения профилей нативной клеточной РНК и п...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

М.С-Ф. получал финансирование от Bristol Myers-Squibb, Istari Oncology и был консультантом Galvazine Therapeutics.

Благодарности

Это исследование было поддержано Фондом медицинских исследований Адельсона (AMRF), Альянсом по исследованию меланомы (MRA) и U54CA224068. Рисунки 1, 4 и 5 были созданы с помощью BioRender.com.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1x PBSCorning21-040-CV
10 мл серологическая пипеткаCorning357551
1000 μ L наконечники для пипеток с низким удержаниемRainin30389213
1000 μ L широкие наконечники для пипеток с низким удержаниемRainin30389218
1000 μ L наконечники для пипетокRainin30389212
10x Магнитный сепаратор10x Genomics120250
15 мл конические трубкиCorning430052
2 мл аспирационный пипеткаCorning357558
20 μ L наконечники для пипеток с низким удержаниемRainin30389226
20 μ L наконечники для пипетокRainin30389225
200 μ L наконечники для пипеток низкого удержанияRainin30389240
200 μ L наконечники для пипетокRainin30389239
50 мл Полипропиленовая коническая трубкаFalcon352098
60 x 15 мм Чашка для культуры тканейFalcon353004
ACK Лизирующий буферGibcoA10492-1
BD 1 мл шприцBecton, Dickinson and Company3090659
Bright-Line ГемоцитометрHausser Scientific551660
Раствор хлорида кальцияSigma Aldrich2115-100ML
Cell Ranger 10x GenomicsN/Ahttps://www.10xgenomics.com/support/software/cell-ranger/latest
Слайды для подсчета клеток для счетчика клеток TC20Bio-Rad1450015
CellTrics 30μ m стерильные одноразовые фильтрыSysmex04-004-2326
CellTrics 50μ m стерильные одноразовые фильтрыSysmex04-004-2327
Набор для удаления мертвых клеток Miltenyi Biotec130-090-101Магазин при -20 ° C; набор 2
Щипцы для препарирования, Fine TipVWR82027-386
DNA LoBind Микроцентрифужные пробирки, 1,5 млEppendorf22431021
EasySepTM Dead Cell Removal
(Annexin V) Kit		STEMCELL Technologies17899Хранить при 4 ° C; Комплект 1
Центрифуга Eppendorf 5425REppendorf5406000640
Центрифуга Eppendorf 5910REppendorf2231000657
Eppendorf Easypet 3 Электронный контроллер пипетокEppendorfEP4430000018
Термомиксер Eppendorf F1.5 Модель 5384EppendorfEP5384000012
FBSGibco26140-079Хранить при 4 °deg; C, использование в биологической вытяжке
Немецкие нержавеющие ножницыFine Science Tools14568-12
Leica Dmi1 МикроскопLeica Microsystems454793
Колонна LSMiltenyi Biotec130-042-401
MACS МультистендMiltenyi Biotec130-042-303
Pipet-Lite LTS Пипетка L-1000XLS+Rainin17014382
Пипетка Pipet-Lite LTS L-200XLS+Rainin17014391
Пипетка Pipet-Lite LTS L-20XLS+Магнит Rainin17014392
Quadro MACSMiltenyi Biotec130-091-051
RPMI Medium 1640 (1x)Gibco21870-076Хранить при 4 ° C
TempAssure 0,2 мл ПЦР 8-пробирочные полоскиСША Scientific1402-4700
Трипановый синий краситель 0,4%Thermo Fisher ScientificT10282
Набор для диссоциации опухолей, HumanMiltenyi Biotec130-095-929Хранить при -20 ° C, приготовьте ферменты в соответствии с инструкциями к набору:
Восстановите лиофилизированный фермент H во флаконе объемом 3 мл RPMI 1640
Восстановите лиофилизированный фермент R во 2,7 мл RPMI 1640
Восстановите лиофилизированный фермент A во флаконе с 1 мл буфера A, входящего в комплект.
Набор для диссоциации опухолей, мышьMiltenyi Biotec130-096-730Магазин в -20 градусов; C, приготовьте ферменты в соответствии с инструкциями к набору:
Восстановите лиофилизированный флакон фермента D в 3 мл RPMI 1640
Восстановите лиофилизированный флакон фермента R в 2,7 мл RPMI 1640
Восстановите лиофилизированный флакон фермента А в 1 мл буфера A, входящего в комплект.
Ультрачистая дистиллированная водаInvitrogen10977-015хранить при 4 °deg; С

Ссылки

  1. Liu, C., Yang, M., Zhang, D., Chen, M., Zhu, D. Clinical cancer immunotherapy: Current progress and prospects. Front Immunol. 13, 961805(2022).
  2. Baghban, R., et al. Tumor microenvironment complexity and therapeutic implications at a glance. Cell Commun Signal. 18 (1), 59(2020).
  3. Sun, G., et al. Single-cell RNA sequencing in cancer: Applications, advances, and emerging challenges. Mol Ther Oncolytics. 21, 183-206 (2021).
  4. Huang, D., et al. Advances in single-cell RNA sequencing and its applications in cancer research. J Hematol Oncol. 16 (1), 98(2023).
  5. Ottaiano, A., et al. From chaos to opportunity: decoding cancer heterogeneity for enhanced treatment strategies. Biology. 12 (9), 1183(2023).
  6. Hwang, B., Lee, J. H., Bang, D. Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines. Exp Mol Med. 50 (8), 1-14 (2018).
  7. Erfanian, N., et al. Deep learning applications in single-cell genomics and transcriptomics data analysis. Biomed Pharmacother. 165, 115077(2023).
  8. Jovic, D., et al. Single-cell RNA sequencing technologies and applications: A brief overview. Clin Transl Med. 12 (3), e694(2022).
  9. Burja, B., et al. An optimized tissue dissociation protocol for single-cell RNA sequencing analysis of fresh and cultured human skin biopsies. Front Cell Dev Biol. 10, 872688(2022).
  10. Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows. Genome Biol. 21 (1), 130(2020).
  11. Sade-Feldman, M., et al. Defining T cell states associated with response to checkpoint immunotherapy in melanoma. Cell. 176 (1-2), 404(2019).
  12. Pelka, K., et al. Spatially organized multicellular immune hubs in human colorectal cancer. Cell. 184 (18), 4734-4752 (2021).
  13. Bill, R., et al. CXCL9:SPP1 macrophage polarity identifies a network of cellular programs that control human cancers. Science. 381 (6657), 515-524 (2023).
  14. Al'Khafaji, A. M., et al. High-throughput RNA isoform sequencing using programmed cDNA concatenation. Nat Biotechnol. 42 (4), 582-586 (2024).
  15. Xing, Y., et al. The effect of cell isolation methods on the human transcriptome profiling and microbial transcripts of peripheral blood. Mol Biol Rep. 48 (4), 3059-3068 (2021).
  16. Ma, F., Hernandez, G. E., Romay, M., Iruela-Arispe, M. L. Single-cell RNA sequencing to study vascular diversity and function. Curr Opin Hematol. 28 (3), 221-229 (2021).
  17. Fan, X. -J., et al. Impact of cold ischemic time and freeze-thaw cycles on RNA, DNA and protein quality in colorectal cancer tissues biobanking. J Cancer. 10 (20), 4978-4988 (2019).
  18. LoCoco, P. M., et al. Reliable approaches to extract high-integrity RNA from skin and other pertinent tissues used in pain research. Pain Rep. 5 (2), e818(2020).
  19. Montanari, M., et al. Automated-mechanical procedure compared to gentle enzymatic tissue dissociation in cell function studies. Biomolecules. 12 (5), 701(2022).
  20. Yosefov-Levi, O., Tornovsky, S., Parnas, O. Pancreatic tissue dissection to isolate viable single cells. J Vis Exp. (195), (2023).
  21. Janssen, P., et al. The effect of background noise and its removal on the analysis of single-cell expression data. Genome Biol. 24 (1), 140(2023).
  22. Adam, M., Potter, A. S., Potter, S. S. Psychrophilic proteases dramatically reduce single cell RNA-seq artifacts: A molecular atlas of kidney development. Development. 144 (19), 3625-3632 (2017).
  23. Sutermaster, B. A., Darling, E. M. Considerations for high-yield, high-throughput cell enrichment: fluorescence versus magnetic sorting. Sci Rep. 9 (1), 227(2019).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Диссоциация опухолевой тканиприготовление клеточной суспензииобразцы опухолей человекаобразцы опухолей мышимеханическая диссоциацияферментативная диссоциациялизис эритроцитовобогащение живыми клеткамиподсчет клеток с помощью гемоцитометра
Диссоциация образцов опухолевой ткани человека и мыши для секвенирования РНК одиночных клеток
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.