В этом протоколе описывается сборка пневматической системы для подачи сжатого воздуха к игле в процессе снятия фаски с иглы. В протоколе также описывается процесс снятия фаски для создания острых игл для микроинъекций и то, как измерить относительный размер отверстия иглы.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Мокрое снятие фаски с игл для микроинъекций с использованием постоянного давления воздуха для обратной связи при открытии иглы
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Иглы для микроинъекций являются важнейшим инструментом для доставки реагентов для модификации генома, компонентов CRISPR (направляющих РНК, белка Cas9 и донорской матрицы) и компонентов системы транспозонов (плазмид и мРНК транспозазы) в развивающиеся эмбрионы насекомых. Острые иглы для микроинъекций особенно важны во время доставки этих модифицирующих агентов, поскольку они помогают свести к минимуму повреждение инъецируемого эмбриона, тем самым увеличивая выживаемость этих эмбрионов по сравнению с инъекциями иглами без скоса. Кроме того, при снятии фаски иглы получаются иглы, которые более однородны от иглы к игле по сравнению с иглами, вскрытыми путем случайного ломания кончика иглы путем прикосновения кончика к объекту (стороне покровного стекла, поверхности эмбриона, который будет введен и т. д.). Процесс влажного снятия фаски с игл для микроинъекций с подачей воздуха к игле под постоянным давлением позволяет человеку, снимающему фаску с иглы, знать, когда игла открыта (наличие пузырьков), а также дает относительное представление о том, насколько большое отверстие иглы было создано. Относительный размер отверстия в игле можно определить, регулируя давление воздуха, подаваемого на иглу, до тех пор, пока не будет достигнуто равновесие и пузырьки не перестанут вытекать из кончика иглы. Чем ниже давление, при котором достигается равновесие, тем больше размер иглы; И наоборот, чем выше давление, тем меньше размер иглы.
Введение
Генетическая модификация насекомых — это процесс, первоначально разработанный у дрозофил Рубином и Спрэдлингом, и с годами этот процесс был модифицирован для создания генетических модификаций удругих видов. Процесс основан на точной доставке компонентов модификации, микроинъецированных в эмбрионы в определенный промежуток времени и в определенном месте внутри развивающегося эмбриона 2,3,4. Острые иглы для микроинъекций являются критически важным инструментом в процессе генетической модификации некоторых насекомых, таких как комары 4,5,6,7,8,9 и песчаные мухи10, в то время как не столь критичны для других насекомых, таких как шелкопряды11. Острые иглы часто являются ключевым фактором между успехом и неудачей при попытке создать генетически модифицированное насекомое 2,4. Как правило, иглы микрокапиллярного стекла вытягиваются путем нагревания стекла до такой степени, что стекло становится эластичным, что позволяет втягивать капилляр в сужающуюся иглу с закрытым концом. Прежде чем иглу можно будет использовать, ее необходимо открыть таким образом, чтобы образовался острый кончик для инъекции. Традиционно иглы вскрывают путем осторожного прикосновения кончика иглы к чему-либо (краю предметного стекла/покровного стекла или зародышу и т.д.), в результате чего небольшое количество стекла откалывается от кончика, случайным образом создавая острый кончик 2,3. Чуть менее случайным процессом является сухая фаска, при которой игла быстро опускается на оптически плоскую, вращающуюся абразивную пластину в течение короткого периода времени, в результате чего небольшое количество стекла стирается от кончика иглы, создавая острый кончик. Сухая фаска немного менее случайна, чем прикосновение кончика иглы к чему-либо. Описанный ниже протокол делает еще один шаг вперед в процессе снятия фаски, подавая сжатый воздух на списку и снимая фаску под слой жидкости таким образом, что пузырьки становятся видимыми, как только игла будет открыта. В этом протоколе подробно описан метод производства надежных острых игл для микроинъекций. Снятие фаски под жидким слоем является улучшением по сравнению со случайным поломкой иглы, как описано выше, и сухим снятием фаски, потому что пользователь получает обратную связь о процессе снятия фаски, позволяя человеку, снимающему фаску, знать, когда игла открыта и относительно большого отверстия иглы. Знание относительного размера отверстия кончика иглы может позволить человеку, снимающему фаску, создавать иглы с различными размерами отверстия. Различные размеры отверстий игл имеют разные преимущества; Например, большие размеры отверстий игл могут вместить инъекционные смеси высокой вязкости, в то время как меньшие размеры открывающихся игл наносят меньший ущерб вводимому эмбриону.
Воздух подается к игле с помощью регулятора и системы уретановых трубок на основе модифицированной системы впрыска с регулируемым давлением воздуха2. В то время как воздух подается к игле под постоянным давлением, игла скошена под слоем жидкости. Процесс снятия фаски состоит из повторяющегося пятиэтапного процесса: 1) опускание иглы на абразивную поверхность, 2) предоставление игле возможности снятия фаски в течение короткого периода времени, 3) поднятие иглы в сторону от абразивной пластины, удерживая ее под поверхностью жидкого слоя, 4) остановка вращения абразивной пластины для проверки на наличие пузырьков. Если пузырьков нет, то шаги с 1 по 4 повторяются до тех пор, пока не появятся пузыри; 5) Как только появятся пузырьки, давление воздуха можно отрегулировать, чтобы определить относительный размер отверстия иглы. Чем ниже давление, необходимое для остановки образования пузырьков, тем больше отверстие на кончике иглы.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
ПРИМЕЧАНИЕ: В протоколе, описанном ниже, используется микрокапиллярный скошенный Sutter BV-10. Тем не менее, этот протокол может быть модифицирован для использования с любой моделью с микрокапиллярной скошенностью.
1. Сборка регулятора, манометра и трубки подачи воздуха
- Отрезать участок уретановой трубки для подключения от подачи воздуха к основанию регулятора (R; Раздел 1, Рисунок 1). Длина этого участка будет зависеть от расстояния от подачи воздуха до регулятора, который будет расположен рядом со станком для снятия фаски.
- Наденьте хомут для шланга на уретановую трубку, затем вставьте соединитель шланга в конец трубки. Убедитесь, что соединитель шланга полностью вставлен, приложив соединитель шланга к твердой поверхности. Удерживая трубку близко к соединителю шланга, плотно вдавите трубку в шланг до тех пор, пока соединитель шланга не будет полностью вставлен. Вместе хомут для шланга и соединитель шланга образуют соединение HC (Рисунок 1).
- Сдвиньте хомут шланга вверх до конца трубки, в которую вставлен соединитель шланга. Поверните хомут шланга над вставленным концом заусеницы так, чтобы он образовал герметичное соединение.
- Вкрутите соединитель шланга в основание регулятора (R) вручную, затем завершите затяжку соединения небольшим ключом. Убедитесь, что соединение герметично, но не слишком плотно.
- В боковом порту регулятора вручную вкрутите Т-образный разъем (Т), затем с помощью небольшого ключа завершите затяжку.
- Отрежьте небольшой кусочек уретановой трубки (рисунок 1, раздел 2), примерно 3-5 см в длину. Поместите два хомута для шланга на кусок трубки, затем вставьте соединитель шланга в каждый конец трубки и завершите соединения (HC), как описано в шагах 1.2-1.4 для каждого конца трубки.
- Вкрутите один конец короткой трубки в основание манометра, затем завершите затяжку гаечным ключом, как в шаге 1.5.
- Вкрутите другой конец короткой трубки в одно из портов на Т-образном разъеме (Т), подключенном к регулятору на шаге 1.5.
- Отрежьте участок уретановой трубки (рис. 1, раздел 3) для соединения между регулятором и иглодержателем (NH). Размер этого участка будет зависеть от расстояния от фаски до места расположения регулятора.
- Поместите хомут для шланга на секцию трубки, затем вставьте соединитель для шланга, как описано в шагах 1.2-1.4.
- С другой стороны этого участка трубки поместите внутренний люэровский соединитель (LC), который поставляется в комплекте с иглодержателем (NH).
- Снимите стопорный зажим и нейлоновую шайбу (рисунок 2, f) с манипулятора. Стопорный зажим и шайба предназначены для удержания только стеклянного микрокапилляра, они не предназначены для удержания дополнительного веса держателя микрокапилляров, резьбового стержня и трубки подачи воздуха.
- Отрежьте прямоугольный кусок резинового уплотнительного листа 1,5 см х 2 см, чтобы обернуть резьбовой стержень в зажим велосипедного крыла. Это поможет более надежно удерживать резьбовой стержень и иглодержатель в зажиме велосипедного крыла. С помощью двух плоскогубцев с игольчатым концом откройте зажим для велосипедного крыла, сложите прямоугольный кусок резинового уплотнительного листа поверх резьбового стержня на 3,5 см от одного конца стержня так, чтобы он образовал букву U над стержнем. Вставьте покрытый резиновым листом резьбовой стержень в открытый зажим велосипедного крыла и с помощью плоскогубцев закройте зажим вокруг стержня и резинового листа. Установите велосипедный зажим и узел резьбового стержня на болт манипулятора, замените стопорный зажим без нейлоновой шайбы и затяните стопорный зажим до тех пор, пока он надежно удерживает узел резьбового стержня.
- Наденьте иглодержатель на стержень с резьбой. Убедитесь, что люэровский соединитель заканчивается в положении, которое не будет связывать уретановую трубку при его подключении (рисунок 2, g).
- Подсоедините гнездовой соединитель Люэра к наружному соединителю Люэра (Рисунок 2, ж) иглодержателя (Рисунок 2, г).
- Подсоедините свободный конец трубки на рисунке 1, раздел 1 к источнику воздуха (это соединение будет варьироваться в зависимости от используемого источника воздуха). Подача воздуха должна быть чистой, сухой и не содержать остатков масла. Подача воздуха может осуществляться от источника воздуха в доме или газового баллона, сжатого воздуха или азота.
2. Снятие фаски с боросиликатной иглой
- Вытягивайте иглы для микроинъекций с помощью микрокапилляров из боросиликатного стекла со следующими настройками на инструменте: Heat: 305, Fil: 4, Vel: 70, Del: 235, Pul: 160, с временем петли 12.24.
- Соберите шлифовальный узел в соответствии с инструкциями производителя, состоящий из абразивной пластины и стопорного кольца с магнитами12.
ПРИМЕЧАНИЕ: Абразивную пластину может потребоваться обернуть тонкой полоской прозрачной пленки, чтобы предотвратить преждевременную утечку Photo-Flo (смачивающего агента) с абразивной пластины. Это необходимо только в том случае, если раствор смачивающего агента преждевременно просачивается в масло на пьедестале, в результате чего шлифовальная пластина перестает вращаться. Смачивающий агент снижает риск появления следов высыхания на иглах стекла после снятия фаски. Использование смачивающего агента не является критическим для процесса снятия фаски, и его можно заменить водой. - Нанесите 10 капель масла на пьедестал на оптически плоскую поверхность пьедестала и поместите сверху шлифовальный узел. Начните шлифовальную сборку.
- Включите источник света, чтобы осветить поверхность. Убедитесь, что источник света расположен за скошенным станком и светит под углом 45° к абразивной пластине и игле. Угол освещения необходим для того, чтобы тень от иглы была легко видна. При 90-кратном увеличении поверните головку микроскопа на место. Кратковременно остановите вращение абразивной пластины и сфокусируйте микроскоп на поверхности абразивной пластины.
- Добавьте в фитиль 1% смачивающего агента, пока фитиль полностью не намокнет. Добавьте 1% смачивающий агент на поверхность абразивной пластины. Убедитесь, что смачивающий агент покрывает абразивную поверхность, но не просачивается на черное стопорное кольцо.
- Поместите предварительно увлажненный фитиль на поверхность абразивной пластины во время ее вращения. Убедитесь, что фитиль находится с левой стороны абразивной пластины (когда вы смотрите вниз сверху) и тянется от 11 до 6 часов (с пластиной в качестве циферблата). Убедитесь, что фитиль не заезжает на черную часть стопорного кольца.
- Вставьте иглу в иглодержатель (рисунок 2, г) и затяните стопорное кольцо, чтобы удержать иглу на месте. Откройте регулятор (Рисунок 1, R) и увеличьте давление до 24 фунтов на квадратный дюйм.
- Поднимите иглодержатель, вращая ручку регулировки курса (Рисунок 2, a) Убедитесь, что игла поднята достаточно высоко, чтобы она была выше поверхности вращающейся абразивной пластины, затем поверните весь манипулятор так, чтобы игла качнулась на месте над вращающейся абразивной пластиной. Игла, которую необходимо скосить, должна быть размещена на вращающейся абразивной пластине, ориентированной таким образом, чтобы вращение пластины отталкивалось от кончика иглы (Рисунок 3A)
- Наблюдая сбоку, с помощью ручки грубой регулировки (рис. 2, а) опустите иглу к поверхности абразивной пластины. Остановитесь, когда игла почти коснется поверхности жидкости.
- Используйте зум, чтобы уменьшить увеличение микроскопа, затем переместите микроскоп так, чтобы игла оказалась в центре поля зрения. Оказавшись в центре обзора, увеличивайте увеличение, регулируя положение манипулятора так, чтобы кончик иглы оставался в центре обзора. Достигнув максимального увеличения, остановите шлифовальную пластину и сфокусируйте микроскоп на поверхности абразивной пластины, затем немедленно возобновите вращение пластины, как только поверхность окажется в фокусе. В этот момент игла может отсутствовать.
- С помощью ручки грубой регулировки манипулятора опустите иглу в сторону абразивной пластины. В поле зрения будет видно изображение иглы и тень (тени) иглы. Когда игла и тень (тени) иглы будут близки друг к другу, переключитесь на ручку точной регулировки манипулятора и продолжайте опускать иглу до тех пор, пока игла и ее тень (тени) не начнут соприкасаться. На этом этапе прочитайте показания штангенциркуля (Рисунок 2, в) и обратите внимание на показания. Поверхность абразивной пластины находится на уровне или ниже этого показания штангенциркуля.
ПРИМЕЧАНИЕ: Трудно увидеть, когда игла касается поверхности вращающейся абразивной пластины, поэтому игла может фактически не касаться абразивной пластины в этот момент. - Оставьте иглу на этом уровне показаний штангенциркуля в течение 5-10 с.
- С помощью ручки точной регулировки манипулятора поднимите иглу, следя за тем, чтобы она оставалась под поверхностью смачивающего средства. Остановите вращение абразивной пластины на несколько секунд и понаблюдайте, не выйдут ли пузыри из кончика иглы. Если пузырьки присутствуют, переходим к шагу 2.15. Если пузырьков нет, перейдите к шагу 2.14.
- Переместите иглу обратно к показаниям штангенциркуля с помощью ручки точной регулировки манипулятора, затем переместите ее немного ниже и снимите новые показания штангенциркуля, после чего повторите шаги 2.12-2.13.
- Запустите абразивную пластину снова, чтобы увидеть, наблюдается ли образование пузырьков во время вращения пластины. Если во время вращения пластины видны признаки образования пузырьков, отверстие кончика иглы, вероятно, слишком велико для чувствительных микроинъекций эмбрионов, таких как инъекции эмбрионов комаров. Если при вращении абразивной пластины не видно образования пузырьков, то отверстие иглы идеально подходит для использования в процедурах, требующих острого и маленького открывания иглы.
- С помощью ручки регулировки курса манипулятора поднимите иглу над абразивной пластиной в положение, достаточно высоко над пластиной, чтобы игла ни о что не ударилась, так как весь манипулятор вращается, чтобы отодвинуть иглу от абразивной пластины и микроскопа.
- Как только игла окажется в положении, в котором ее можно снять, ни о что не задев, уменьшите давление воздуха до нуля, извлеките иглу и поместите ее в коробку для хранения игл (чашку Петри с двойной клейкой лентой или пластилином для удержания скошенных игл) до использования.
3. Определение относительного размера отверстия скошенной иглы
ПРИМЕЧАНИЕ: Определение относительных размеров отверстия скошенной иглы выполняется на шаге 2.13. Следующие шаги описывают этот процесс подробнее.
- После того, как на шаге 2.13 будут обнаружены пузырьки, когда абразивная пластина не вращается, медленно уменьшите давление воздуха, вращая ручку регулировки регулятора (рис. 1, R) до тех пор, пока пузырьки не перестанут вытекать из кончика иглы. Обратите внимание на давление, при котором пузырьки перестают вытекать из кончика.
- Увеличивайте давление воздуха до тех пор, пока из кончика иглы снова не начнут вытекать пузырьки. Чем выше давление, тем меньше отверстие иглы.
- Приступайте к перемещению иглы в положение, в котором ее можно безопасно извлечь, шаги 2.16-2.17.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Описанная выше процедура позволяет получать стабильно острые иглы для микроинъекций. Острые иглы характеризуются способностью вставлять в мягкие эмбрионы насекомых хориона, таких как эмбрионы комаров, практически без сопротивления со стороны оболочки эмбриона. Когда эмбрионы комаров микроинъекции для генетической модификации, мембрана эмбриона относительно эластична. Если прижать тупую иглу к оболочке эмбриона, она будет углубляться (рисунок 4B). Когда игла оттягивается назад, мембрана восст...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Генетическая модификация комаров основана на точном микроинъекционном вводе модифицирующих материалов (плазмид, направляющих РНК или белков) в эмбрионы, предшествующие бластодерме 3,4,5,6,7,8. Решающее значение в этом процессе имеют острые иглы, которые легко прокалывают эмбрион во время инъе...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Автору нечего раскрывать.
Благодарности
Автор выражает признательность следующим людям. Сотрудники Центра трансформации насекомых Университета Мэриленда: Чанна Алувихаре, Роберт Алфорд и Дэниел Гей. Без их самоотверженной работы Центр трансформации насекомых не существовал бы. Ванессе Мелденер-Харрелл за корректуру этой рукописи.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 1,0 мм Наружный диаметр микрокапилляров | World Precision Instruments | ||
| Скос Пьедестал Масло | Sutter Instruments | 008 | |
| Зажим для велосипедного крыла | VeloOrange | R-clip 4-pack | https://velo-orange.com/products/vo-r-clip-4-pack |
| Подставка для стрелы | Микроскоп AmScope | AMScope 3.5X-90X Тринокулярная светодиодная подставка для стрелы Стереомикроскоп или эквивалент | |
| BV-10 Beveler | Sutter Instruments | BV-10 | |
| Алмазная абразивная пластина | Sutter Instruments | 104F | - сверхтонкая (от 0,2 до 1,0 до микроразмеров) |
| Прокладка, Buna-N | Clippard Instrument Laboratory, Inc. | 11761-2-pkg | Используется для герметизации соединения на разъемах T или L, если они еще не включены в эти детали |
| Хомут для шланга | Clippard Instrument Laboratory, Inc. | 5000-2 шт | |
| Соединитель шланга | Clippard Instrument Laboratory, Inc. | CT4-pkg | Требуется 5 коннекторов для шлангов |
| Иглодержатель для микроинъекций | World Precision Instruments | MPH3-10 | Иглодержатель для микрокапилляров наружного диаметра 1 мм |
| P-2000 | Sutter Instruments | Любой съемник игл | |
| Photo-Flo 200 Solution | B& H Фото, видео и аудио | BH #KOPF200P MFR #1464510 | смачивающий агент |
| Манометр | Clippard Instrument Laboratory, Inc. | Манометр PG-100 | 0-100 фунтов на квадратный дюйм |
| Эталонный фитиль | Sutter Instruments | X050300 | |
| Держатель референсного фитиля | Sutter Instruments | M100019 | |
| Регулятор | Clippard Instrument Laboratory, Inc. | 01-мар | Требуется #10-32 порты для соединений |
| Резиновый упаковочный лист 6 дюймов 6 в | Danco | Модель # 59849 | |
| T фитинг | Clippard Instrument Laboratory, Inc. | 15002-2-pkg | |
| Резьбовой стержень | Либо резьбовой стержень, либо стержень с резьбовым концом. Ниток должно быть 10-32. | ||
| Уретановая трубка | Clippard Instrument Laboratory, Inc. | УРХ1-0804-БЛТ-050 |
Ссылки
- Rubin, G. M., Spradling, A. C. Genetic transformation of Drosophila with transposable Element Vectors. Science. 218 (4570), 348-353 (1982).
- O'Brochta, D. A., Atkinson, P. W. Transformation systems in insects. Methods Mol Biol. 260, 227-254 (2004).
- Handler, A. M., James, A. A. Insect Transgenesis: Methods and Applications. , CRC Press. Boca Rato. (2000).
- Harrell, R. A. Mosquito embryo microinjection. Cold Spring Harbor Protocols. , 10.1101/pdb.prot107686 (2023).
- Allen, M. L., O'Brochta, D. A., Atkinson, P. W., Levesque, C. S. Stable, germ-line transformation of Culex Quinquefasciatus (Diptera: Culicidae). J Med Entomol. 38 (5), 701-710 (2001).
- Grossman, G. L., et al. Germline transformation of the malaria vector, Anopheles gambiae, with the piggyBac transposable element. Insect Mol Biol. 10 (6), 597-604 (2001).
- Adelman, Z. N., Jasinskiene, N., James, A. A. Development and applications of transgenesis in the yellow fever mosquito, Aedes aegypti. Mol Biochem Parasitol. 121 (1), 1-10 (2002).
- Perera, O. P., Harrell, R. A., Handler, A. M. Germ-line transformation of the South American malaria vector, Anopheles albimanus, with a piggyBac/EGFP transposon vector is routine and highly efficient. Insect Mol Biol. 11 (4), 291-297 (2002).
- Harrell, R. A. Mosquito embryo microinjection under halocarbon oil or in aqueous solution. Cold Spring Harb Protoc. , 10.1101/pdb.prot108203 (2023).
- Louradour, I., Ghosh, K., Inbar, E., Sacks, D. L. CRISPR/Cas9 mutagenesis in Phlebotomus papatasi: The immune deficiency pathway impacts vector competence for Leishmania major. mBio. 10 (4), e01941(2019).
- Tamura, T., et al. Germline transformation of the silkworm Bombyx mori L. using a piggyBac transposon-derived vector. Nat Biotechnol. 18 (1), 81-84 (2000).
- BV-10 Micropipette Beveler Operation Manual Rev. 3.00. , Available from: https://www.manualslib.com/manual/2073788/Sutter-Instrument-Bv-10.html (2018).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
