Выделение, очистка и идентификация бацитрацин-продуцирующих Bacillus licheniformis из свежих фекалий здоровых свиней

Краткое содержание

Этот протокол содержит полное и всестороннее описание подробного процесса выделения, очистки и идентификации бацитрацин-продуцирующих Bacillus licheniformis из здоровых свиных фекалий.

Аннотация

Bacillus licheniformis и бацитрацин имеют огромный рынок применения и ценность в области медицины, химии, аквакультуры, сельского хозяйства и побочных продуктов. Поэтому отбор B. licheniformis с высокой продукцией бацитрацина имеет большое значение. В этом экспериментальном протоколе Bacillus с высоким выходом бацитрацина был выделен, очищен и идентифицирован из свежих фекалий здоровых свиней. Также было проверено ингибирующее действие вторичного метаболита бацитрацина на Micrococcus luteus . Для качественного и количественного определения бацитрацина использовали тонкослойную хроматографию и высокоэффективную жидкостную хроматографию. Физиологические и биохимические характеристики B. licheniformis определяли по соответствующим наборам. Филогенетические отношения B. licheniformis были определены и построены с помощью детекции последовательности генов. Этот протокол описывает и вводит стандартный процесс выделения, очистки и идентификации B. licheniformis из свежих фекалий животных с различных точек зрения, обеспечивая метод широкомасштабного использования B. licheniformis и бацитрацина на заводах.

Введение

Bacillus licheniformis — вид бацилл из семейства Firmicutes, который широко распространён в различных средах обитания, таких как вода, почва и кишечник животных¹. B. licheniformis имеет короткую и толстую палочковидную структуру и передвигается индивидуально². Колония почти круглая и тусклая, с центральной выпуклостью и аккуратными краями серовато-белого^{цвета 3}. Он обладает сильной способностью к росту и размножению и может поглощать и использовать питательные вещества из различных источников углерода, таких как моносахариды, полисахариды, кетоза и органические кислоты⁴. На более поздней стадии роста и развития B. licheniformis может существовать в виде спящих спор и продуцировать антибактериальные вещества, такие как бацитрацин, лихенизин и сурфактин. Он также может противостоять дефициту питательных веществ и экстремальным внешним условиям⁵. Явного предпочтения кодонов не существует, а эффективная система секреции определяет гетерологичную белковую секрецию B. licheniformis, которая в два раза выше, чем у Bacillus subtilis⁶. Он часто используется для производства ферментных препаратов, таких как протеаза, амилаза и целлюлаза⁷. Из-за отсутствия эндогенных токсинов он сертифицирован как безопасный для пищевых продуктов штамм и внесен в список QPS по EFSA⁸. Таким образом, существует несколько потенциальных применений, включая производство биоактивных соединений, которые имеют широкий спектр применения в аквакультуре, сельском хозяйстве, пищевой промышленности, биомедицине и фармацевтической промышленности. Кроме того, B. licheniformis является важным компонентом кишечной флоры животных, что может способствовать повышению продуктивности животных, улучшению баланса кишечной флоры и профилактике заболеваний. В 2004 г. был проанализирован весь геном B. licheniformis ATCC14580, и постепенно^{была изучена} исходная информация о транскрипционной трансляции, сворачивании белка и механизме секреции9. Эта генетическая информация делает его способствующим генетической модификации на молекулярном уровне, способствуя широкомасштабному производству B. licheniformis.

Бацитрацин является додекациклическим пептидным антибиотиком, продуцируемым нерибосомальной пептидсинтетазой путем вторичного метаболизма у B. subtilis и B. licheniformis. Бацитрацин представляет собой смесь, состоящую из различных компонентов, таких как бацитрацин А, В и С, где одна или две аминокислоты различаются между каждым компонентом; среди них наибольшей биологической активностью обладает бацитрацин А¹⁰. Бацитрацин может ингибировать грамположительные бактерии, такие как стафилококк и Micrococcus luteus, а также некоторые грамотрицательные бактерии, ингибируя образование клеточной стенки и взаимодействуя с мембрансвязывающими белками^. Между тем, бацитрацин безопасен и стабилен, ему нелегко выработать лекарственную устойчивость, и он может быть совместим с другими антибактериальными препаратами. Поэтому бацитрацин используется в медицинской и ветеринарной практике. Кроме того, из-за его быстрой скорости выведения и низкой скорости усвоения, его также можно использовать в качестве добавки к кормам для животных¹³.

B. licheniformis может колонизировать кишечник и улучшать микросреду желудочно-кишечного тракта. Адгезия и репродуктивная способность и связанные с ними физиологические функции Bacillus из разных источников в желудочно-кишечном тракте разных животных различны. Выведенный из свиньи B. licheniformis более благоприятен для колонизации в кишечнике свиней и другого домашнего скота. Существует тесная связь между относительным обилием кишечных пробиотиков и состоянием здоровья хозяина¹⁴. Пищевая добавка с смесью B. licheniformis у поросят-отъемышей улучшает экосистему кишечника за счет изменения состава микробиоты и метаболической активности, а также влияет на слизистую оболочку кишечника¹⁵. Фекалии животных могут отражать тип и количество кишечной флоры животных. В этом протоколе описывается выделение и очистка бацитрацин-продуцирующих Bacillus spp. из здоровых свиных фекалий. Кал получают от свиноматок породы Тайху, которых не кормят комбикормами и которые имеют отличные производственные показатели на свинофермах. Изоляты были идентифицированы как B. licheniformis на основании их морфологических характеристик, физико-химических свойств и биохимической идентификации.

Протокол

Все экспериментальные процедуры были задокументированы и одобрены Этическим комитетом Нанкинского технического университета. Кал был получен от свиноматок тайху в возрасте около 2 лет (см. Таблицу материалов), которые были выращены на профессиональных и стандартных свинофермах.

1. Подготовка носителей

1. Жидкая среда Лурия-Бертани (LB): Добавьте 10 г NaCl, 5 г порошка дрожжевого экстракта и 10 г триптона в коническую бутылку, добавьте дистиллированную воду до 1 л, перемешайте и растворите стеклянным стержнем. Перелейте 100 мл среды в коническую бутылку объемом 500 мл и плотно завяжите ее дышащей герметизирующей пленкой. Стерилизовать при 121 °C в автоклаве в течение 20 мин (см. Таблицу материалов).
2. Твердая среда LB: Добавьте 10 г NaCl, 5 г порошка дрожжевого экстракта, 10 г триптона, 20 г порошка агара в коническую бутылку, добавьте дистиллированную воду до 1 л, растворите стеклянным стержнем и плотно завяжите дышащей герметизирующей пленкой. Стерилизовать при 121 °C в автоклаве в течение 20 минут. Когда среда остынет до 50 °C, налейте 20 мл среды в чашки Петри, дайте им остыть, а затем храните вверх дном.
3. Среда для брожения бацитрацина: Добавьте 8 г соевого жмыха, 4 г растворимого крахмала, 0,1 г (NH₄)₂SO₄, 0,6 г CaCO₃ и 100 мл дистиллированной воды в коническую бутылку объемом 500 мл, перемешайте стеклянным стержнем, чтобы она полностью растворилась, и плотно завяжите дышащей герметизирующей пленкой. Стерилизовать при 121 °C в автоклаве в течение 20 мин (см. Таблицу материалов).
4. Суспензия M. luteus : Выберите кольцо M. luteus и инокулируйте на культуральный планшет LB, приготовленный на шаге 1.2 (см. Таблицу материалов). Выращивание в инкубаторе постоянной температуры при 37 °С в течение 16 ч (см. Таблицу материалов). Добавьте в тарелку 5 мл обычного физиологического раствора и осторожно встряхните, чтобы разбавить колонии. Измерьте OD600 и разведите раствор в пробирке, чтобы получить суспензию с OD600 0,3-0,7. Храните суспензию M. luteus при температуре 4 °C для последующего использования.
5. Среда для анализа антибактериальной активности: Добавьте 1 мл суспензии M. luteus , приготовленной на стадии 1.4, в 100 мл жидкой твердой среды LB, приготовленной на стадии 1.2, и слегка встряхните. Немедленно возьмите 5 мл этого раствора, содержащего M. luteus, и равномерно распределите его по культуральной пластине LB.

2. Выделение и очистка Бациллы из свежих фекалий здоровых свиней

1. Добавьте 9 мл физиологического раствора и 1,0 г свежего свиного кала в колбу Эрленмейера объемом 150 мл. Перемешивайте с помощью магнитной мешалки (см. Таблицу материалов) при комнатной температуре со скоростью 60 об/мин в течение 15 минут.
2. Поместите фекальный экстракт в водяную баню с термостатом при температуре 80 °C (см. Таблицу материалов) на 20 минут, чтобы убить бактерии, не производящие споры.
3. Добавьте суспензию в 100 мл жидкой среды LB в колбу Эрленмейера объемом 250 мл и закваливайте в шейкере (см. Таблицу материалов) со скоростью 180 об/мин при 37 °C в течение 8 ч.
4. Проводят серийное разведение культивируемого бактериального раствора обычным физиологическим раствором от ^10-1 до ^10-8. Нанесите 0,1 мл ^10-6, ^10-7 и ^10-8 бактериального разбавителя на отдельные культуральные планшеты LB и дайте высохнуть. Через 10 минут поместите перевернутые пластины в инкубатор с постоянной температурой при температуре 37 °C на 48 часов.
5. С помощью инокуляционного кольца выберите колонии, которые внешне похожи на B. licheniformis (кремово-белый цвет, мягкая консистенция, слизистый вид, выпуклость, плоский рельеф и неправильная форма)¹⁶, и сделайте для них зигзагообразную полосу на среде для анализа антибактериальной активности, приготовленной на этапе 1.5 (см. рисунок 1).
6. Поместите планшеты в инкубатор при температуре 37 °C на 48 ч и понаблюдайте, есть ли вокруг колонии зона торможения.

3. Скрининг на ингибирование активности M. luteus

1. Выберите одну колонию, которая генерирует тормозную зону, и добавьте к 100 мл жидкой среды LB, закваливайте в шейкере при 37 °C и 180 об/мин в течение 12 часов.
2. Инокулировать 5 мл питательной среды в среду для ферментации бацитрацина, приготовленную на стадии 1.3, и культивировать при 37 °С в течение 48 ч.
3. Соберите ферментационный бульон в центрифужную пробирку и центрифугируйте при давлении 13 400 x g при 4 °C в течение 15 минут, а затем отфильтруйте с помощью микропористой фильтрующей мембраны размером 0,22 мкм (см. Таблицу материалов).
4. Добавьте чашку Оксфорд в чашку для свежего антибактериального анализа, а затем добавьте 50 мкл фильтрата (надосадочная жидкость для брожения) в чашку Оксфорд (см. Таблицу материалов). Выращивание в инкубаторе при 37 °С в течение 12 ч. После инкубации измерьте диаметр тормозной зоны с помощью штангенциркуля (см. Таблицу материалов).
5. Для последующих экспериментов отбирают штаммы и соответствующий надосадочный агент брожения с диаметром ингибирующей зоны более 15 мм.

4. Идентификация бацитрацина методом тонкослойной хроматографии

1. Добавьте 60 мг стандартного бацитрацина и растворите в 1% ЭДТА-2Na (см. Таблицу материалов) в объемном флаконе объемом 10 мл до получения раствора бацитрацина 6,0 мг/мл.
2. Разведите 1 мл надосадочной жидкости для ферментации до 10 мл с 1% ЭДТА-2Na. Нанесите 5 мкл образца и 5 мкл стандартного раствора бацитрацина на тонкослойную пластину с активированным силикагелем (см. Таблицу материалов).
3. Добавьте 100 мл н-бутанол-уксусной кислоты-воды-пиридин-этанола (60:15:10:6:5) в хроматографическую емкость (см. Таблицу материалов). Поместите тонкую пластину силикагеля в хроматографическую емкость. Накройте крышкой и дайте настояться при комнатной температуре в течение 30 минут.
4. Достаньте пластину с тонким слоем силикагеля, распылите раствор бутанол-пиридина (99:1), содержащий 1% нингидрина (см. Таблицу материалов), и нагревайте при 105 °C в течение 5 минут до появления коричневато-красных пятен. Рассчитайте R_f (значение коэффициента удержания) для стандарта и образца по следующей формуле:
   R_f = Расстояние перемещения пятна/Расстояние перемещения растворителя.

5. Определение бацитрацина методом ВЭЖХ

1. Добавьте 0,3 мл надосадочной жидкости для брожения и 1,2 мл 50% этанола в микроцентрифужную пробирку объемом 2 мл, встряхните вручную в течение 5 минут и дайте постоять при температуре 4 °C в течение 12 часов.
2. Центрифугируйте при давлении 13 400 x g в течение 15 мин и отфильтруйте в бутылку для образцов с маркировкой S1 с микропористой фильтрующей мембраной 0,22 мкм (см. Таблицу материалов).
3. Приготовление маточного раствора бацитрацина: Добавьте 0,4 г стандартного бацитрацина (60 Ед/мг; см. Таблицу материалов), 100 мл 40 г/л ЭДТА-2Na (см. Таблицу материалов) в объемную колбу объемом 100 мл для приготовления 240 Ед/мл маточного раствора бацитрацина.
4. Добавьте 3 мл маточного раствора бацитрацина и 21, 9, 3, 1 и 0 мл сверхчистой воды в пробирки с маркировкой A1, B1, C1, D1 и E1 соответственно. После фильтрации с помощью микропористой фильтрующей мембраны толщиной 0,22 мкм поместите фильтрат в флаконы с образцами с маркировкой A2, B2, C2, D2 и E2.
   Примечание: Концентрации стандартного раствора бацитрацина составляют 30, 60, 120, 180 и 240 Ед/мл.
5. Поместите A2, B2, C2, D2, E2 и S1 в испытательный лоток прибора для ВЭЖХ. Поместите 1000 мл формиата аммония 50 мМ/л и 1000 мл ацетонитрила в лоток для подвижной фазы и установите их как подвижные фазы А и В соответственно.
   ПРИМЕЧАНИЕ: pH формиата аммония должен быть отрегулирован до 4,0 с муравьиной кислотой.
6. Установите колонку C18 (5 мкм, 4,6 мм x 250 мм) в направлении, указанном на колонке (см. Таблицу материалов).
7. Установите параметры подвижной фазы как 0 мин, 77% А и 23% В; 30 мин, 70% А и 30% В; 40 мин, 60% А и 40% В; 50 мин, 60% А и 40% В; 51 мин, 77% А и 23% В; 58 мин, 77% А и 23% В. Установите размер образца 100 мкл; Расход, 1,0 мл/мин; Температура столба, 30 °C.
8. Нажмите кнопку «Выполнить », чтобы запустить программу.

6. Морфологическая идентификация

1. Разбавляют и покрывают штамм самым высоким титром бацитрацина на планшете для культивирования LB и выращивают в инкубаторе при 37 °C в течение 48 часов. Окрашивайте и наблюдайте за морфологией колонии, как описано ниже.
2. Добавьте на горку каплю стерильной очищенной воды, соберите небольшое количество колоний, и добавьте в водную каплю. Равномерно размажьте, дайте предметному стеклу высохнуть естественным образом, а затем зафиксируйте над огнем.
3. Добавьте кристаллическую фиалку на 1 минуту, чтобы испачкать образец, а затем промойте водой из-под крана. Добавьте йод на 1 минуту, чтобы испачкать образец, а затем промойте дистиллированной водой.
4. Добавьте 95% спирт, встряхните предметное стекло до обесцвечивания в течение 1 минуты, а затем смойте дистиллированной водой.
5. Добавьте шафран на 1 минуту для окрашивания образца, а затем промойте дистиллированной водой. Дайте предметному стеклу высохнуть естественным образом и понаблюдайте за морфологией колонии под микроскопом с масляной иммерсией (см. Таблицу материалов).

7. Физиолого-биохимическая идентификация

1. Добавьте в пробирку 2 мл стерильного физиологического раствора и введите одну колонию из планшета в стерильный физиологический раствор с помощью инокуляционного кольца для получения бактериальной суспензии.
2. Добавьте 100 мкл бактериальной суспензии в каждое отверстие для измерения V-P, цитрата, желатина, 7% хлорида натрия, pH 5,7, восстановления нитратов и гидролиза крахмала на биохимической идентификационной полоске Bacillus (см. Таблицу материалов).
3. Используйте инокуляционное кольцо, чтобы выбрать еще одну отдельную колонию и проложите их зигзагообразным узором на биохимической трубке анаэробного роста биохимической идентификационной полоски Bacillus .
4. Используйте инокуляционное кольцо, чтобы выбрать другие колонии и проколоть их вертикально в поры для идентификации пропионата, D-ксилозы, L-арабинозы и D-маннита на биохимической идентификационной полоске Bacillus .

8. Определение последовательности генов штамма

1. Извлеките ДНК штамма с помощью набора для экстракции ДНК бактерий (см. Таблицу материалов): Добавьте 2 мл жидкости для семян в микроцентрифужную пробирку объемом 5 мл и центрифугируйте при 11 500 x g в течение 1 минуты. Выбросьте надосадочную жидкость и добавьте в гранулу 110 мкл буфера (содержащего 20 мМ Трис, pH8,0; 2 мМ Na_2-ЭДТА и 1,2% Тритона) и 70 мкл 50 мг/мл раствора лизоцима 50 мг/мл и инкубируйте при 37 °C в течение 30 минут.
2. Добавьте 4 мкл 100 мг/мл РНКазы А в течение 15 с и оставьте на 5 минут при комнатной температуре. Добавьте 20 мкл раствора протеиназы К и хорошо перемешайте.
3. Добавьте 220 μL буфера GB, встряхивайте в течение 15 секунд, пока гранула не станет взвешенной, поместите при температуре 70 °C на 10 минут, чтобы раствор стал прозрачным, и выполните короткий отжим, чтобы удалить шарики воды со стенки трубки.
4. Добавьте 220 μл безводного этанола, полностью ударьте в течение 15 с, короткое отделение. Перенесите раствор и осаждение флокуляции в адсорбционную колонну CB3 сборной трубки, центрифугируйте при давлении 13 400 x g в течение 30 с и выбросьте надосадочную жидкость.
5. Добавьте 500 мкл буферного GD в адсорбционную колонку, центрифугируйте в течение 30 с при 13 400 x g и выбросьте надосадочную жидкость. Добавьте в колонку 600 μL PW, центрифугируйте в течение 30 с при 13 400 x g и выбросьте надосадочную жидкость.
6. Поместите адсорбционную колонну обратно в сборную пробирку, центрифугируйте в течение 2 минут при давлении 13 400 x g и выбросьте надосадочную жидкость.
7. Поместите адсорбционную колонну при комнатной температуре на 10 минут для высыхания. Перенесите колонку в центрифужную трубку и добавьте 100 мкл элюирующего буфера TE в середину адсорбционной мембраны.
8. Оставьте при комнатной температуре на 5 минут, чтобы поток набрал поток в центрифужную трубку и центрифугу в течение 2 минут при давлении 13 400 x g.
9. Добавьте 25 мкл 2x мастер-смеси (см. Таблицу материалов), 2,5 мкл образца ДНК, полученного на стадии 8.8, 2 мкл прямого праймера 27F, 2 мкл обратного праймера 1492R и 18,5 мкл дважды дистиллированного H₂O в 0,1 мл ПЦР-пробирки.
   Примечание: Последовательности генов праймеров: 27F: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' и 1492R: 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'.
10. Поместите ПЦР-пробирку в ПЦР-аппарат (см. Таблицу материалов) в следующих условиях: предварительная денатурация при 95 °C в течение 10 минут, денатурация при 95 °C в течение 30 секунд, отжиг при 55 °C в течение 30 секунд, наращивание при 72 °C в течение 90 секунд, наращивание при 72 °C в течение 7 минут. Запустите трехступенчатый цикл денатурации, отжига и удлинения в 32 раза.
11. Возьмите 5 μл продукта и проведите электрофорез с 1% агарозным гелем при 120 В в течение 30 минут.
    1. Растворите 500 мг агарозы в 50 мл 1x TAE буфера. Нагревайте раствор в микроволновке в течение 1-2 минут до полного растворения агарозы. Добавьте 5 μL красителя для окрашивания ДНК, затем налейте в лоток для геля и вставьте диафрагму. Дать постоять при комнатной температуре 30 минут, пока он не застынет; поместите гель в резервуар для электрофореза и добавьте 1x буфер TAE, чтобы погрузить гель. Добавьте 2 мкл 2 kb DNA ladder (10 мг/μл) в первую лунку и 5 μL продукта ПЦР, смешанного с 1 μL загружающего красителя, в оставшиеся лунки в геле.
12. Поместите гель в систему визуализации геля и сделайте снимок. Быстро разрежьте полоски ДНК под воздействием ультрафиолета и взвесьте.
13. Добавьте полоски в микроцентрифужную пробирку и добавьте равный объем раствора ПН. Держите тюбик на водяной бане при температуре 50 °C до полного растворения геля.
14. Добавьте 500 мкл равновесной жидкости BL в адсорбционную колонку CA2, центрифугируйте при 13 400 x g в течение 1 мин и выбросьте надосадочную жидкость.
15. Добавьте растворенный раствор геля в адсорбционную колонну CA2 и поместите ее при комнатной температуре на 2 минуты, центрифугируйте при 13 400 x g в течение 30 секунд и выбросьте надосадочную жидкость.
16. Добавьте 600 мкл PW в адсорбционную колонку CA2, центрифугируйте при 13 400 x g в течение 1 мин, выбросьте надосадочную жидкость и повторите 1 раз.
17. Поместите адсорбционную колонку CA2 в сборную пробирку, центрифугируйте при давлении 13 400 x g в течение 2 минут и выбросьте надосадочную жидкость.
18. Поместите адсорбционную колонну CA2 при комнатной температуре на 10 минут для полного высыхания, а затем поместите ее в чистую центрифужную пробирку.
19. Добавьте 50 мкл элюирующего буфера EB в адсорбционную пленку, подвешенную при комнатной температуре на 2 мин, и соберите раствор ДНК путем центрифугирования при 13 400 х г в течение 2 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вышеупомянутые растворы или реагенты входят в комплект для очистки (см. Таблицу материалов).
    1. Отправьте собранный раствор ДНК в профессиональную компанию по секвенированию (см. Таблицу материалов) для секвенирования. Сравните результаты секвенирования с помощью Blast в базе данных GenBank NCBI. В соответствии с гомологией последовательностей выбрать различные штаммы и построить филогенетические деревья методом максимального правдоподобия в MEGA-X для определения видовых отношений штаммов.

Результаты

В этом эксперименте из свежих фекалий здоровых свиней было выделено 48 штаммов Bacillus , пронумерованных от 1001 до 1048. Среди них 15 штаммов обладали антибактериальной активностью в отношении M. luteus. Из 15 штаммов титры бацитрацина измеряли с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии, как показано в таблице 1. Среди них B. licheniformis No 1026 имел самый высокий титр бацитрацина — 456,35 ± 21,75 Ед/мл, поэтому для последующих экспериментов был выбран No 1026.

Результаты идентификации с помощью ТСХ показаны на рисунке 2А. Положение основных пятен в бродильном бульоне штамма No 1026 и стандартном растворе бацитрацина было одинаковым, а значение R_f составило 0,61. Для анализа ВЭЖХ стандартное уравнение кривой бацитрацина составляет y = 50,287x - 250,55, а коэффициент корреляции R² = 0,9968 (рисунок 2B). Пиковое время ферментации надосадочной жидкости соответствовало стандарту бацитрацина (рис. 2В), поэтому бактериостатическое вещество было идентифицировано как бацитрацин, а титр бацитрацина составил 456,35 ± 21,75 Ед/мл.

Колонию штамма No 1026 культивировали на среде LB в течение 12 ч, как показано на рисунке 3А. Колония была круглой и прозрачной в форме капель воды, с полными выступами и аккуратными краями. С 12 ч до 24 ч бактерии вступили в более поздние стадии роста. Как показано на рисунке 3В, колонии раскинулись вокруг в форме сливы, центр образовался складчатым, а цвет постепенно углублялся до молочно-белого. Это согласуется с описанием морфологии колонии B. licheniformis¹⁶. По краю была прозрачная слизь. После окрашивания по Граму штамм No 1026 наблюдали под микроскопом, как показано на рисунке 3С. Клетки представляли собой фиолетовые палочки, указывающие на грамположительные бактерии.

Как показано в таблице 2, штамм No 1026 мог расти в анаэробной среде. Штамм дал положительный результат на тест V-P, утилизацию цитратов, восстановление нитратов и гидролиз крахмала. Штамм был способен разлагать и утилизировать большую часть источников углерода. Он имел те же физиолого-биохимические характеристики, что и B. licheniformis.

Размер фрагмента 16S рДНК штамма No 1026 составлял около 1400.о. (рис. 4А). Результаты секвенирования штамма No 1026 показали сходство на 99,58% с таковой B. licheniformis DSM 13 в GenBank. Затем было построено филогенетическое дерево, как показано на рисунке 4B. Длина эволюционной ветви B. licheniformis DSM 13 составляет 0,000, что указывает на то, что это B. licheniformis.

На основании морфологических, физиологических и биохимических характеристик штамма No 1026 и анализа гомологии последовательности гена 16S рДНК штамм No 1026 был идентифицирован как B. licheniformis.

Рисунок 1: Принципиальная схема посева штамма. С помощью инокуляционного кольца колонии отбирали колонии и маркировали их зигзагообразным узором на среде для анализа антибактериальной активности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Идентификация бактериостатических веществ. (А) Тонкослойная хроматография. (B) Стандартная кривая ВЭЖХ бацитрацина. (В) Хроматограмма ВЭЖХ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3: Морфологические характеристики и окрашивание по Граму штамма No 1026. Морфология колонии при (А) 12 ч и (В) 24 ч. (С) Окрашивание по Граму. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 4: Молекулярно-биологическая идентификация штамма No 1026. (A) Амплификация гена штамма No 1026 16S рДНК. (Б) Филогенетическое дерево штамма No 1026. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

НЕТ.	Титр бацитрацина (ЕД/мл)	НЕТ.	Титр бацитрацина (ЕД/мл)
1003	423.57±18.62	1021	317.46±13.46
1004	No 325.82±13.23	1026	456.35±21.75
1009	No 326.26±14.52	1027	435.57±19.18
1011	No 376.65±16.11	1030	382.48±17.64
1015	325.27±12.37	1031	215.37±11.73
1016	256.56±15.37 Стандарты	1039	353.67±16.16
1017	No 352.47±16.47	1041	342.36±14.36
1018	No 328.73±16.12

Таблица 1: Титр бацитрацина антибактериальной активности штаммов.

Элементы	Результаты	Элементы	Результаты
Анаэробный тест роста	+	Тест на D-маннит	+
V.P анализ	+	Желатиновый тест	+
Тест на использование цитрата	+	Тест на 7%NaCl	+
Испытание пропионатом	+	Тест на pH5.7	+
Тест на D-ксилозу	+	Тест на снижение содержания нитратов	+
L-арабиноза	+	Испытание на гидролиз крахмала	+

Таблица 2: Физиологическая и биохимическая идентификация штамма No 1026.

Обсуждение

B. licheniformis быстро растет при простых условиях культивирования и быстром потреблении сахара, а зрелая технология ферментации способствует экономии затрат на промышленное производство¹³. Широкое применение B. licheniformis и его секретов, бацитрацина, определило его перспективную рыночную стоимость. В сельском хозяйстве B. licheniformis используется в качестве биоудобрения для улучшения роста растений и усвоения питательных веществ за счет повышения плодородия почвы, содействия развитию корней и содействия разложению органического вещества¹⁵. Для промышленного производства ферментов B. licheniformis продуцирует ряд ферментов, таких как протеазы, амилазы, целлюлазы и липазы, что определяет его незаменимую рыночную стоимость в пищевой промышленности, производстве моющих средств, кожевенной и^{текстильной промышленности}. Ввиду превосходной антибактериальной фармакологической активности B. licheniformis и бацитрацина, он используется в медицине для лечения различных инфекционных заболеваний, вызванных бактериями и грибами^. Между тем, учитывая рост травянистых растений, а также накопление фармакологически активных ингредиентов в растениях, B. licheniformis является потенциальным усилителем роста растений, а также полезен для производства таких соединений, как салидрозид^17,18, полученный из родиолы. Вышеперечисленные достоинства B. licheniformis и бацитрацина делают их широко применимыми в промышленности, сельском хозяйстве, аквакультуре, биотехнологии и медицинской промышленности. Поэтому выделение и очистка B. licheniformis с высоким выходом бацитрацина является решающим фактором в обеспечении последующего крупномасштабного производства и применения.

Хотя бацитрацин можно получить путем химического синтеза, этапы громоздкие, и в нем много побочных продуктов. В промышленности бацитрацин в основном производится в результате вторичного метаболического процесса кукурузной муки и соевого жмыха, ферментированных B. licheniformis. В современном промышленном производстве бацитрацина высокая стоимость и низкий выход препятствуют его дальнейшему применению¹⁰. Таким образом, скрининг высокопродуктивных штаммов бацитрацина и повышение коэффициента использования сырья являются ключом к улучшению производства бацитрацина.

В настоящее время селекция высокопродуктивных штаммов бацитрацина осуществляется в основном путем естественного скрещивания из почвы и других сред, мутационной селекции с использованием существующих штаммов, продуцирующих бацитрацин, или селекции, основанной на генной инженерии. Операция естественного разведения проста, и отобранные штаммы имеют стабильную производственную мощность, но процесс занимает много времени, а рабочая нагрузка велика. Мутационное скрещивание имеет высокую частоту мутаций и сокращает время размножения, но мутация может не быть стабильно унаследована в последующих^{поколениях.} Селекция, основанная на генной инженерии, в большей степени нацелена на получение высокопродуктивных штаммов10, но существуют опасения по поводу безопасности, вызванные внедрением экзогенных генов. Здоровые фекалии взрослых животных содержат обильные пробиотические ресурсы, которые могут поддерживать баланс флоры.

В данной работе, основываясь на характеристиках B. licheniformis для производства спящих спор в экстремальных условиях¹⁹, разведение здоровых свиных фекалий помещали в высокотемпературную среду для уничтожения термостойких бактерий и грибов, не производящих споры. Поскольку M. luteus чувствителен к продукции бактериостатических пептидов B. licheniformis на поздней стадии роста и продуцирует желтый пигмент для удобства наблюдения, его используют для скрининга антибактериальной активности на основе оценки зоны ингибирования. Согласно морфологии колонии, сходной с морфологией B. licheniformis, морфология клетки короткая палочковидная, грамположительная, физиологические и биохимические характеристики B. licheniformis, 16 s РНК тесно связана с B. licheniformis, что позволяет определить, что штамм No 1026 является B. licheniformis. Бактериостатическое вещество было идентифицировано с помощью ТСХ и ВЭЖХ как бацитрацин. Таким образом, был получен бацитрацин-продуцирующий B. licheniformis . У этого метода есть и недостатки, такие как процесс скрининга, занимающий много времени, и эксплуатация, требующая определенного опыта.

Таким образом, этот экспериментальный протокол всесторонне и подробно представил процесс получения и рутинной лабораторной идентификации B. licheniformis, продуцирующего бацитрацин, который имеет широкие перспективы применения и неоценимую рыночную стоимость^. Эти методы просты, осуществимы и легки в реализации, и, несомненно, станут эффективным эталоном для крупномасштабного производства B. licheniformis. В этой статье также представлена идея скрининга для производства штаммов других антимикробных пептидов.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
2 & раз; Phanta Flash Master Mix	Nanjing Vazyme Biotechnology Co., Ltd., Нанкин, Китай	P252-01
2kb ДНК-маркер	Beijing Trans Biotechnology Co., Ltd., Пекин, Китай	BM121-01
Ацетонитрил	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Шанхай, Китай	A104443
порошок агара	Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd., Шанхай, Китай	A800730
Agarose	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co.,Ltd., Шанхай, Китай	A104062
сульфат аммония ((NH4)2SO4)	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd., Шанхай, Китай	10002917
Автоклавный стерилизатор	Zealway Instrument Inc., Сямынь, Китай	GI36DWS
Биохимическая идентификационная полоска Bacillus	Qingdao Haibo Biotechnology Co., Ltd., Циндао, Китай	HBIG14
Bacitracin	Shanghai Yuanye Bio-Technology Co., Ltd., Шанхай, Китай	B65740
Набор для экстракции ДНК бактерий	Tiangen Biochemical Technology Co., Ltd., Пекин, Китай	DP209
Дышащая герметизирующая пленка	Beijing Leiborun Biotechnology Co., Ltd.	BS-QM-01A
Бутанол	Шанхай Аладдин Биохимическая Технология Ко., Лтд., Шанхай, Китай	B433378
C18 (5 μ м, 4,6 и раз; 250 мм) Колонна ВЭЖХ	Rizhao Kepuno New Material Co., Ltd., Жичжао, Китай	C1805-462510
Карбонат кальция (CaCO3)	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd., Шанхай, Китай	10005717
Центрифуга	New Brunswick Scientific Co., Inc., Великобритания	5452
Хроматографическая емкость	Нанкин Tenghui Experimental Technology Co., Ltd., Нанкин, Китай	P-1
Коническая бутылка	Sichuan Shubo  Co., Ltd., Чэнду, Китай	18012
Инкубатор с постоянной температурой	Taist Instrument Co., Ltd., Тяньцзинь, Китай	GH4500
Дикалийфосфат (K2HPO4)	Xilong Chemical Co., Ltd., Гуандун, Китай	XL0015
EDTA-2Na	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Шанхай, Китай	E397526
Электронные весы	Mettler Toledo International Co., Ltd.	FA2104
Этиловый спирт	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Шанхай, Китай	E130059
Набор для очистки геля Midi	Tiangen Biochemical Technology Co., Ltd., Пекин, Китай	DP302
Стеклянный стержень	Chengdu Yibang Kexi Instrument Co., Ltd.	1294
Глюкоза	Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd., Шанхай, Китай	D823520
Набор для окрашивания Gram's	Qingdao Haibo Biotechnology Co., Ltd., Циндао,	Китай HB8278
Высокопроизводительный жидкостный хроматограф	Agilent Technologies, Inc., Калифорния, Америка	1260
Аппарат	для горизонтального электрофорезаПекин Liuyi Biotechnology Co., Ltd., Пекин, Китай	DYCP-31DN BIOMATE
Кольцо для инокуляции	Shanghai Muchen Biotechnology Co., Ltd., Шанхай, Китай	3171026
Магнитная мешалка	Wiggens GmbH Co., Ltd., Германия	WH220 PLUS
Метиловый спирт	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Шанхай, Китай	M116115
Микроцентрифужная трубка	Shanghai Muchen Biotechnology Co., Ltd., Шанхай, Китай	1351171
Micrococcus luteus	Bena Culture Collection, Сучжоу, Китай	BNCC102589
Микропористая фильтровальная мембрана	Nantong Suri Experimental Equipment Co., Ltd.	PES0.22
Нингидрин	Шанхай Аладдин Биохимическая технология Ко., Лтд., Шанхай, Китай	N105629
Завод оптических микроскопов	Завод оптических приборов, Шанхай, Китай	DYS-108
Свиные фекалии	Нанкинская свиноферма Цюаньфу, Нанкин, Китай
полимеразной цепной реакции (ПЦР)	Сучжоу Дуншэн Xingye Scientific Instrument Co., Ltd., Сучжоу, Китай	ETC811
Профессиональная компания по секвенированию	General Biology (Anhui) Co., Ltd., Аньхой, Китай
Pyridine	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Шанхай, Китай	P111516
Shaker	Taicang Qiangle Experimental Equipment Co., Ltd., Тайцан, Китай	HYL-C
Silicagel GF254 тонкослойная пластина	Yantai Huayang New Material Co., Ltd., Яньтай, Китай	HPT-HSGF5025023
хлорид натрия (NaCl)	Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd., Шанхай, Китай	S805275
цитрат натрия	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd., Шанхай, Китай	C39197100001
растворимый крахмал	Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd., Шанхай, Китай	S817547
Термостат водяная баня	Shanghai Heheng Instrument Equipment Co., Ltd., Шанхай, Китай	DK-8D
Tryptone	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Шанхай, Китай	T139519
Ultra GelRed	Nanjing Vazyme Biotechnology Co., Ltd., Нанкин, Китай	GR501-01
Инструмент для ультрачистой воды	Merck KGaA Co., Ltd., Германия	Milli Ультразвуковой очиститель Direct-Q8
	Jiangsu Huaguan Electric Appliance Group Co., Ltd., Цзянсу, Китай	SB-100DT
Штангенциркуль	Sanfeng Company, Япония	N20P
Порошок дрожжевого экстракта	Vicbio Biotechnology Co., Ltd., Пекин, Китай	LP0021