Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Выделение, очистка и идентификация бацитрацин-продуцирующих Bacillus licheniformis из свежих фекалий здоровых свиней

1.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/66777

⸱

31 мая 2024 г.

 , 
1College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering, Nanjing Tech University

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол содержит полное и всестороннее описание подробного процесса выделения, очистки и идентификации бацитрацин-продуцирующих Bacillus licheniformis из здоровых свиных фекалий.

Аннотация

Bacillus licheniformis и бацитрацин имеют огромный рынок применения и ценность в области медицины, химии, аквакультуры, сельского хозяйства и побочных продуктов. Поэтому отбор B. licheniformis с высокой продукцией бацитрацина имеет большое значение. В этом экспериментальном протоколе Bacillus с высоким выходом бацитрацина был выделен, очищен и идентифицирован из свежих фекалий здоровых свиней. Также было проверено ингибирующее действие вторичного метаболита бацитрацина на Micrococcus luteus . Для качественного и количественного определения бацитрацина использовали тонкослойную хроматографию и высокоэффективную жидкостную хроматографию. Физиологические и биохимические характеристики B. licheniformis определяли по соответствующим наборам. Филогенетические отношения B. licheniformis были определены и построены с помощью детекции последовательности генов. Этот протокол описывает и вводит стандартный процесс выделения, очистки и идентификации B. licheniformis из свежих фекалий животных с различных точек зрения, обеспечивая метод широкомасштабного использования B. licheniformis и бацитрацина на заводах.

Введение

Bacillus licheniformis — вид бацилл из семейства Firmicutes, который широко распространён в различных средах обитания, таких как вода, почва и кишечник животных1. B. licheniformis имеет короткую и толстую палочковидную структуру и передвигается индивидуально2. Колония почти круглая и тусклая, с центральной выпуклостью и аккуратными краями серовато-белогоцвета 3. Он обладает сильной способностью к росту и размножению и может поглощать и использовать питательные вещества из различных источников углерода, таких как моносахариды, полисахариды, кетоза и органические кислоты4. На более поздней стадии роста и развития B. licheniformis может существовать в виде спящих спор и продуцировать антибактериальные вещества, такие как бацитрацин, лихенизин и сурфактин. Он также может противостоять дефициту питательных веществ и экстремальным внешним условиям5. Явного предпочтения кодонов не существует, а эффективная система секреции определяет гетерологичную белковую секрецию B. licheniformis, которая в два раза выше, чем у Bacillus subtilis6. Он часто используется для производства ферментных препаратов, таких как протеаза, амилаза и целлюлаза7. Из-за отсутствия эндогенных токсинов он сертифицирован как безопасный для пищевых продуктов штамм и внесен в список QPS по EFSA8. Таким образом, существует несколько потенциальных применений, включая производство биоактивных соединений, которые имеют широкий спектр применения в аквакультуре, сельском хозяйстве, пищевой промышленности, биомедицине и фармацевтической промышленности. Кроме того, B. licheniformis является важным компонентом кишечной флоры животных, что может способствовать повышению продуктивности животных, улучшению баланса кишечной флоры и профилактике заболеваний. В 2004 г. был проанализирован весь геном B. licheniformis ATCC14580, и постепеннобыла изучена исходная информация о транскрипционной трансляции, сворачивании белка и механизме секреции9. Эта генетическая информация делает его способствующим генетической модификации на молекулярном уровне, способствуя широкомасштабному производству B. licheniformis.

Бацитрацин является додекациклическим пептидным антибиотиком, продуцируемым нерибосомальной пептидсинтетазой путем вторичного метаболизма у B. subtilis и B. licheniformis. Бацитрацин представляет собой смесь, состоящую из различных компонентов, таких как бацитрацин А, В и С, где одна или две аминокислоты различаются между каждым компонентом; среди них наибольшей биологической активностью обладает бацитрацин А10. Бацитрацин может ингибировать грамположительные бактерии, такие как стафилококк и Micrococcus luteus, а также некоторые грамотрицательные бактерии, ингибируя образование клеточной стенки и взаимодействуя с мембрансвязывающими белками. Между тем, бацитрацин безопасен и стабилен, ему нелегко выработать лекарственную устойчивость, и он может быть совместим с другими антибактериальными препаратами. Поэтому бацитрацин используется в медицинской и ветеринарной практике. Кроме того, из-за его быстрой скорости выведения и низкой скорости усвоения, его также можно использовать в качестве добавки к кормам для животных13.

B. licheniformis может колонизировать кишечник и улучшать микросреду желудочно-кишечного тракта. Адгезия и репродуктивная способность и связанные с ними физиологические функции Bacillus из разных источников в желудочно-кишечном тракте разных животных различны. Выведенный из свиньи B. licheniformis более благоприятен для колонизации в кишечнике свиней и другого домашнего скота. Существует тесная связь между относительным обилием кишечных пробиотиков и состоянием здоровья хозяина14. Пищевая добавка с смесью B. licheniformis у поросят-отъемышей улучшает экосистему кишечника за счет изменения состава микробиоты и метаболической активности, а также влияет на слизистую оболочку кишечника15. Фекалии животных могут отражать тип и количество кишечной флоры животных. В этом протоколе описывается выделение и очистка бацитрацин-продуцирующих Bacillus spp. из здоровых свиных фекалий. Кал получают от свиноматок породы Тайху, которых не кормят комбикормами и которые имеют отличные производственные показатели на свинофермах. Изоляты были идентифицированы как B. licheniformis на основании их морфологических характеристик, физико-химических свойств и биохимической идентификации.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все экспериментальные процедуры были задокументированы и одобрены Этическим комитетом Нанкинского технического университета. Кал был получен от свиноматок тайху в возрасте около 2 лет (см. Таблицу материалов), которые были выращены на профессиональных и стандартных свинофермах.

1. Подготовка носителей

  1. Жидкая среда Лурия-Бертани (LB): Добавьте 10 г NaCl, 5 г порошка дрожжевого экстракта и 10 г триптона в коническую бутылку, добавьте дистиллированную воду до 1 л, перемешайте и растворите стеклянным стержнем. Перелейте 100 мл среды в коническую бутылку объемом 500 мл и плотно завяжите ее дышащей герметизирующей пленкой. Стерилизовать при 121 °C в автоклаве в течение 20 мин (см. Таблицу материалов).
  2. Твердая среда LB: Добавьте 10 г NaCl, 5 г порошка дрожжевого экстракта, 10 г триптона, 20 г порошка агара в коническую бутылку, добавьте дистиллированную воду до 1 л, растворите стеклянным стержнем и плотно завяжите дышащей герметизирующей пленкой. Стерилизовать при 121 °C в автоклаве в течение 20 минут. Когда среда остынет до 50 °C, налейте 20 мл среды в чашки Петри, дайте им остыть, а затем храните вверх дном.
  3. Среда для брожения бацитрацина: Добавьте 8 г соевого жмыха, 4 г растворимого крахмала, 0,1 г (NH4)2SO4, 0,6 г CaCO3 и 100 мл дистиллированной воды в коническую бутылку объемом 500 мл, перемешайте стеклянным стержнем, чтобы она полностью растворилась, и плотно завяжите дышащей герметизирующей пленкой. Стерилизовать при 121 °C в автоклаве в течение 20 мин (см. Таблицу материалов).
  4. Суспензия M. luteus : Выберите кольцо M. luteus и инокулируйте на культуральный планшет LB, приготовленный на шаге 1.2 (см. Таблицу материалов). Выращивание в инкубаторе постоянной температуры при 37 °С в течение 16 ч (см. Таблицу материалов). Добавьте в тарелку 5 мл обычного физиологического раствора и осторожно встряхните, чтобы разбавить колонии. Измерьте OD600 и разведите раствор в пробирке, чтобы получить суспензию с OD600 0,3-0,7. Храните суспензию M. luteus при температуре 4 °C для последующего использования.
  5. Среда для анализа антибактериальной активности: Добавьте 1 мл суспензии M. luteus , приготовленной на стадии 1.4, в 100 мл жидкой твердой среды LB, приготовленной на стадии 1.2, и слегка встряхните. Немедленно возьмите 5 мл этого раствора, содержащего M. luteus, и равномерно распределите его по культуральной пластине LB.

2. Выделение и очистка Бациллы из свежих фекалий здоровых свиней

  1. Добавьте 9 мл физиологического раствора и 1,0 г свежего свиного кала в колбу Эрленмейера объемом 150 мл. Перемешивайте с помощью магнитной мешалки (см. Таблицу материалов) при комнатной температуре со скоростью 60 об/мин в течение 15 минут.
  2. Поместите фекальный экстракт в водяную баню с термостатом при температуре 80 °C (см. Таблицу материалов) на 20 минут, чтобы убить бактерии, не производящие споры.
  3. Добавьте суспензию в 100 мл жидкой среды LB в колбу Эрленмейера объемом 250 мл и закваливайте в шейкере (см. Таблицу материалов) со скоростью 180 об/мин при 37 °C в течение 8 ч.
  4. Проводят серийное разведение культивируемого бактериального раствора обычным физиологическим раствором от 10-1 до 10-8. Нанесите 0,1 мл 10-6, 10-7 и 10-8 бактериального разбавителя на отдельные культуральные планшеты LB и дайте высохнуть. Через 10 минут поместите перевернутые пластины в инкубатор с постоянной температурой при температуре 37 °C на 48 часов.
  5. С помощью инокуляционного кольца выберите колонии, которые внешне похожи на B. licheniformis (кремово-белый цвет, мягкая консистенция, слизистый вид, выпуклость, плоский рельеф и неправильная форма)16, и сделайте для них зигзагообразную полосу на среде для анализа антибактериальной активности, приготовленной на этапе 1.5 (см. рисунок 1).
  6. Поместите планшеты в инкубатор при температуре 37 °C на 48 ч и понаблюдайте, есть ли вокруг колонии зона торможения.

3. Скрининг на ингибирование активности M. luteus

  1. Выберите одну колонию, которая генерирует тормозную зону, и добавьте к 100 мл жидкой среды LB, закваливайте в шейкере при 37 °C и 180 об/мин в течение 12 часов.
  2. Инокулировать 5 мл питательной среды в среду для ферментации бацитрацина, приготовленную на стадии 1.3, и культивировать при 37 °С в течение 48 ч.
  3. Соберите ферментационный бульон в центрифужную пробирку и центрифугируйте при давлении 13 400 x g при 4 °C в течение 15 минут, а затем отфильтруйте с помощью микропористой фильтрующей мембраны размером 0,22 мкм (см. Таблицу материалов).
  4. Добавьте чашку Оксфорд в чашку для свежего антибактериального анализа, а затем добавьте 50 мкл фильтрата (надосадочная жидкость для брожения) в чашку Оксфорд (см. Таблицу материалов). Выращивание в инкубаторе при 37 °С в течение 12 ч. После инкубации измерьте диаметр тормозной зоны с помощью штангенциркуля (см. Таблицу материалов).
  5. Для последующих экспериментов отбирают штаммы и соответствующий надосадочный агент брожения с диаметром ингибирующей зоны более 15 мм.

4. Идентификация бацитрацина методом тонкослойной хроматографии

  1. Добавьте 60 мг стандартного бацитрацина и растворите в 1% ЭДТА-2Na (см. Таблицу материалов) в объемном флаконе объемом 10 мл до получения раствора бацитрацина 6,0 мг/мл.
  2. Разведите 1 мл надосадочной жидкости для ферментации до 10 мл с 1% ЭДТА-2Na. Нанесите 5 мкл образца и 5 мкл стандартного раствора бацитрацина на тонкослойную пластину с активированным силикагелем (см. Таблицу материалов).
  3. Добавьте 100 мл н-бутанол-уксусной кислоты-воды-пиридин-этанола (60:15:10:6:5) в хроматографическую емкость (см. Таблицу материалов). Поместите тонкую пластину силикагеля в хроматографическую емкость. Накройте крышкой и дайте настояться при комнатной температуре в течение 30 минут.
  4. Достаньте пластину с тонким слоем силикагеля, распылите раствор бутанол-пиридина (99:1), содержащий 1% нингидрина (см. Таблицу материалов), и нагревайте при 105 °C в течение 5 минут до появления коричневато-красных пятен. Рассчитайте Rf (значение коэффициента удержания) для стандарта и образца по следующей формуле:
    Rf = Расстояние перемещения пятна/Расстояние перемещения растворителя.

5. Определение бацитрацина методом ВЭЖХ

  1. Добавьте 0,3 мл надосадочной жидкости для брожения и 1,2 мл 50% этанола в микроцентрифужную пробирку объемом 2 мл, встряхните вручную в течение 5 минут и дайте постоять при температуре 4 °C в течение 12 часов.
  2. Центрифугируйте при давлении 13 400 x g в течение 15 мин и отфильтруйте в бутылку для образцов с маркировкой S1 с микропористой фильтрующей мембраной 0,22 мкм (см. Таблицу материалов).
  3. Приготовление маточного раствора бацитрацина: Добавьте 0,4 г стандартного бацитрацина (60 Ед/мг; см. Таблицу материалов), 100 мл 40 г/л ЭДТА-2Na (см. Таблицу материалов) в объемную колбу объемом 100 мл для приготовления 240 Ед/мл маточного раствора бацитрацина.
  4. Добавьте 3 мл маточного раствора бацитрацина и 21, 9, 3, 1 и 0 мл сверхчистой воды в пробирки с маркировкой A1, B1, C1, D1 и E1 соответственно. После фильтрации с помощью микропористой фильтрующей мембраны толщиной 0,22 мкм поместите фильтрат в флаконы с образцами с маркировкой A2, B2, C2, D2 и E2.
    Примечание: Концентрации стандартного раствора бацитрацина составляют 30, 60, 120, 180 и 240 Ед/мл.
  5. Поместите A2, B2, C2, D2, E2 и S1 в испытательный лоток прибора для ВЭЖХ. Поместите 1000 мл формиата аммония 50 мМ/л и 1000 мл ацетонитрила в лоток для подвижной фазы и установите их как подвижные фазы А и В соответственно.
    ПРИМЕЧАНИЕ: pH формиата аммония должен быть отрегулирован до 4,0 с муравьиной кислотой.
  6. Установите колонку C18 (5 мкм, 4,6 мм x 250 мм) в направлении, указанном на колонке (см. Таблицу материалов).
  7. Установите параметры подвижной фазы как 0 мин, 77% А и 23% В; 30 мин, 70% А и 30% В; 40 мин, 60% А и 40% В; 50 мин, 60% А и 40% В; 51 мин, 77% А и 23% В; 58 мин, 77% А и 23% В. Установите размер образца 100 мкл; Расход, 1,0 мл/мин; Температура столба, 30 °C.
  8. Нажмите кнопку «Выполнить », чтобы запустить программу.

6. Морфологическая идентификация

  1. Разбавляют и покрывают штамм самым высоким титром бацитрацина на планшете для культивирования LB и выращивают в инкубаторе при 37 °C в течение 48 часов. Окрашивайте и наблюдайте за морфологией колонии, как описано ниже.
  2. Добавьте на горку каплю стерильной очищенной воды, соберите небольшое количество колоний, и добавьте в водную каплю. Равномерно размажьте, дайте предметному стеклу высохнуть естественным образом, а затем зафиксируйте над огнем.
  3. Добавьте кристаллическую фиалку на 1 минуту, чтобы испачкать образец, а затем промойте водой из-под крана. Добавьте йод на 1 минуту, чтобы испачкать образец, а затем промойте дистиллированной водой.
  4. Добавьте 95% спирт, встряхните предметное стекло до обесцвечивания в течение 1 минуты, а затем смойте дистиллированной водой.
  5. Добавьте шафран на 1 минуту для окрашивания образца, а затем промойте дистиллированной водой. Дайте предметному стеклу высохнуть естественным образом и понаблюдайте за морфологией колонии под микроскопом с масляной иммерсией (см. Таблицу материалов).

7. Физиолого-биохимическая идентификация

  1. Добавьте в пробирку 2 мл стерильного физиологического раствора и введите одну колонию из планшета в стерильный физиологический раствор с помощью инокуляционного кольца для получения бактериальной суспензии.
  2. Добавьте 100 мкл бактериальной суспензии в каждое отверстие для измерения V-P, цитрата, желатина, 7% хлорида натрия, pH 5,7, восстановления нитратов и гидролиза крахмала на биохимической идентификационной полоске Bacillus (см. Таблицу материалов).
  3. Используйте инокуляционное кольцо, чтобы выбрать еще одну отдельную колонию и проложите их зигзагообразным узором на биохимической трубке анаэробного роста биохимической идентификационной полоски Bacillus .
  4. Используйте инокуляционное кольцо, чтобы выбрать другие колонии и проколоть их вертикально в поры для идентификации пропионата, D-ксилозы, L-арабинозы и D-маннита на биохимической идентификационной полоске Bacillus .

8. Определение последовательности генов штамма

  1. Извлеките ДНК штамма с помощью набора для экстракции ДНК бактерий (см. Таблицу материалов): Добавьте 2 мл жидкости для семян в микроцентрифужную пробирку объемом 5 мл и центрифугируйте при 11 500 x g в течение 1 минуты. Выбросьте надосадочную жидкость и добавьте в гранулу 110 мкл буфера (содержащего 20 мМ Трис, pH8,0; 2 мМ Na2-ЭДТА и 1,2% Тритона) и 70 мкл 50 мг/мл раствора лизоцима 50 мг/мл и инкубируйте при 37 °C в течение 30 минут.
  2. Добавьте 4 мкл 100 мг/мл РНКазы А в течение 15 с и оставьте на 5 минут при комнатной температуре. Добавьте 20 мкл раствора протеиназы К и хорошо перемешайте.
  3. Добавьте 220 μL буфера GB, встряхивайте в течение 15 секунд, пока гранула не станет взвешенной, поместите при температуре 70 °C на 10 минут, чтобы раствор стал прозрачным, и выполните короткий отжим, чтобы удалить шарики воды со стенки трубки.
  4. Добавьте 220 μл безводного этанола, полностью ударьте в течение 15 с, короткое отделение. Перенесите раствор и осаждение флокуляции в адсорбционную колонну CB3 сборной трубки, центрифугируйте при давлении 13 400 x g в течение 30 с и выбросьте надосадочную жидкость.
  5. Добавьте 500 мкл буферного GD в адсорбционную колонку, центрифугируйте в течение 30 с при 13 400 x g и выбросьте надосадочную жидкость. Добавьте в колонку 600 μL PW, центрифугируйте в течение 30 с при 13 400 x g и выбросьте надосадочную жидкость.
  6. Поместите адсорбционную колонну обратно в сборную пробирку, центрифугируйте в течение 2 минут при давлении 13 400 x g и выбросьте надосадочную жидкость.
  7. Поместите адсорбционную колонну при комнатной температуре на 10 минут для высыхания. Перенесите колонку в центрифужную трубку и добавьте 100 мкл элюирующего буфера TE в середину адсорбционной мембраны.
  8. Оставьте при комнатной температуре на 5 минут, чтобы поток набрал поток в центрифужную трубку и центрифугу в течение 2 минут при давлении 13 400 x g.
  9. Добавьте 25 мкл 2x мастер-смеси (см. Таблицу материалов), 2,5 мкл образца ДНК, полученного на стадии 8.8, 2 мкл прямого праймера 27F, 2 мкл обратного праймера 1492R и 18,5 мкл дважды дистиллированного H2O в 0,1 мл ПЦР-пробирки.
    Примечание: Последовательности генов праймеров: 27F: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' и 1492R: 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'.
  10. Поместите ПЦР-пробирку в ПЦР-аппарат (см. Таблицу материалов) в следующих условиях: предварительная денатурация при 95 °C в течение 10 минут, денатурация при 95 °C в течение 30 секунд, отжиг при 55 °C в течение 30 секунд, наращивание при 72 °C в течение 90 секунд, наращивание при 72 °C в течение 7 минут. Запустите трехступенчатый цикл денатурации, отжига и удлинения в 32 раза.
  11. Возьмите 5 μл продукта и проведите электрофорез с 1% агарозным гелем при 120 В в течение 30 минут.
    1. Растворите 500 мг агарозы в 50 мл 1x TAE буфера. Нагревайте раствор в микроволновке в течение 1-2 минут до полного растворения агарозы. Добавьте 5 μL красителя для окрашивания ДНК, затем налейте в лоток для геля и вставьте диафрагму. Дать постоять при комнатной температуре 30 минут, пока он не застынет; поместите гель в резервуар для электрофореза и добавьте 1x буфер TAE, чтобы погрузить гель. Добавьте 2 мкл 2 kb DNA ladder (10 мг/μл) в первую лунку и 5 μL продукта ПЦР, смешанного с 1 μL загружающего красителя, в оставшиеся лунки в геле.
  12. Поместите гель в систему визуализации геля и сделайте снимок. Быстро разрежьте полоски ДНК под воздействием ультрафиолета и взвесьте.
  13. Добавьте полоски в микроцентрифужную пробирку и добавьте равный объем раствора ПН. Держите тюбик на водяной бане при температуре 50 °C до полного растворения геля.
  14. Добавьте 500 мкл равновесной жидкости BL в адсорбционную колонку CA2, центрифугируйте при 13 400 x g в течение 1 мин и выбросьте надосадочную жидкость.
  15. Добавьте растворенный раствор геля в адсорбционную колонну CA2 и поместите ее при комнатной температуре на 2 минуты, центрифугируйте при 13 400 x g в течение 30 секунд и выбросьте надосадочную жидкость.
  16. Добавьте 600 мкл PW в адсорбционную колонку CA2, центрифугируйте при 13 400 x g в течение 1 мин, выбросьте надосадочную жидкость и повторите 1 раз.
  17. Поместите адсорбционную колонку CA2 в сборную пробирку, центрифугируйте при давлении 13 400 x g в течение 2 минут и выбросьте надосадочную жидкость.
  18. Поместите адсорбционную колонну CA2 при комнатной температуре на 10 минут для полного высыхания, а затем поместите ее в чистую центрифужную пробирку.
  19. Добавьте 50 мкл элюирующего буфера EB в адсорбционную пленку, подвешенную при комнатной температуре на 2 мин, и соберите раствор ДНК путем центрифугирования при 13 400 х г в течение 2 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вышеупомянутые растворы или реагенты входят в комплект для очистки (см. Таблицу материалов).
    1. Отправьте собранный раствор ДНК в профессиональную компанию по секвенированию (см. Таблицу материалов) для секвенирования. Сравните результаты секвенирования с помощью Blast в базе данных GenBank NCBI. В соответствии с гомологией последовательностей выбрать различные штаммы и построить филогенетические деревья методом максимального правдоподобия в MEGA-X для определения видовых отношений штаммов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

В этом эксперименте из свежих фекалий здоровых свиней было выделено 48 штаммов Bacillus , пронумерованных от 1001 до 1048. Среди них 15 штаммов обладали антибактериальной активностью в отношении M. luteus. Из 15 штаммов титры бацитрацина измеряли с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии, как показано в таблице 1. Среди них B. licheniformis No 1026 имел самый высокий титр бацитрацина — 456,35 ± 21,75 Ед/мл, поэтому для последующих экспериментов был выбран No 1026.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

B. licheniformis быстро растет при простых условиях культивирования и быстром потреблении сахара, а зрелая технология ферментации способствует экономии затрат на промышленное производство13. Широкое применение B. licheniformis и его секретов, бацитрацина, определило его перспективную рыночную стоимость. В сельском хозяйстве B. licheniformis используется в качестве биоудобрения для улучшения роста растений и усвоения питательных веществ з...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Это исследование было поддержано Национальной программой ключевых исследований и разработок Китая (No 2022YFC2104800) и проектом «Шесть вершин талантов» в провинции Цзянсу (No 2019-NY-058).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
2 & раз; Phanta Flash Master MixNanjing Vazyme Biotechnology Co., Ltd., Нанкин, КитайP252-01
2kb ДНК-маркерBeijing Trans Biotechnology Co., Ltd., Пекин, КитайBM121-01
АцетонитрилShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Шанхай, КитайA104443
порошок агараShanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd., Шанхай, КитайA800730
AgaroseShanghai Aladdin Biochemical Technology Co.,Ltd., Шанхай, КитайA104062
сульфат аммония ((NH4)2SO4)Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd., Шанхай, Китай10002917
Автоклавный стерилизаторZealway Instrument Inc., Сямынь, КитайGI36DWS
Биохимическая идентификационная полоска BacillusQingdao Haibo Biotechnology Co., Ltd., Циндао, КитайHBIG14
BacitracinShanghai Yuanye Bio-Technology Co., Ltd., Шанхай, КитайB65740
Набор для экстракции ДНК бактерийTiangen Biochemical Technology Co., Ltd., Пекин, КитайDP209
Дышащая герметизирующая пленкаBeijing Leiborun Biotechnology Co., Ltd.BS-QM-01A
БутанолШанхай Аладдин Биохимическая Технология Ко., Лтд., Шанхай, КитайB433378
C18 (5 μ м, 4,6 и раз; 250 мм) Колонна ВЭЖХRizhao Kepuno New Material Co., Ltd., Жичжао, КитайC1805-462510
Карбонат кальция (CaCO3)Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd., Шанхай, Китай10005717
ЦентрифугаNew Brunswick Scientific Co., Inc., Великобритания5452
Хроматографическая емкость Нанкин Tenghui Experimental Technology Co., Ltd., Нанкин, КитайP-1
Коническая бутылкаSichuan Shubo  Co., Ltd., Чэнду, Китай18012
Инкубатор с постоянной температуройTaist Instrument Co., Ltd., Тяньцзинь, КитайGH4500
Дикалийфосфат (K2HPO4)Xilong Chemical Co., Ltd., Гуандун, КитайXL0015
EDTA-2NaShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Шанхай, КитайE397526
Электронные весыMettler Toledo International Co., Ltd.FA2104
Этиловый спиртShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Шанхай, КитайE130059
Набор для очистки геля MidiTiangen Biochemical Technology Co., Ltd., Пекин, КитайDP302
Стеклянный стерженьChengdu Yibang Kexi Instrument Co., Ltd.1294
ГлюкозаShanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd., Шанхай, КитайD823520
Набор для окрашивания Gram'sQingdao Haibo Biotechnology Co., Ltd., Циндао,Китай HB8278
Высокопроизводительный жидкостный хроматографAgilent Technologies, Inc., Калифорния, Америка1260
Аппаратдля горизонтального электрофорезаПекин Liuyi Biotechnology Co., Ltd., Пекин, КитайDYCP-31DN BIOMATE
Кольцо для инокуляцииShanghai Muchen Biotechnology Co., Ltd., Шанхай, Китай3171026
Магнитная мешалкаWiggens GmbH Co., Ltd., ГерманияWH220 PLUS
Метиловый спиртShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Шанхай, КитайM116115
Микроцентрифужная трубкаShanghai Muchen Biotechnology Co., Ltd., Шанхай, Китай1351171
Micrococcus luteusBena Culture Collection, Сучжоу, КитайBNCC102589
Микропористая фильтровальная мембранаNantong Suri Experimental Equipment Co., Ltd.PES0.22
НингидринШанхай Аладдин Биохимическая технология Ко., Лтд., Шанхай, КитайN105629
Завод оптических микроскоповЗавод оптических приборов, Шанхай, КитайDYS-108
Свиные фекалииНанкинская свиноферма Цюаньфу, Нанкин, Китай
полимеразной цепной реакции (ПЦР)Сучжоу Дуншэн Xingye Scientific Instrument Co., Ltd., Сучжоу, КитайETC811
Профессиональная компания по секвенированиюGeneral Biology (Anhui) Co., Ltd., Аньхой, Китай
PyridineShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Шанхай, КитайP111516
ShakerTaicang Qiangle Experimental Equipment Co., Ltd., Тайцан, КитайHYL-C
Silicagel GF254 тонкослойная пластинаYantai Huayang New Material Co., Ltd., Яньтай, КитайHPT-HSGF5025023
хлорид натрия (NaCl)Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd., Шанхай, КитайS805275
цитрат натрияSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd., Шанхай, КитайC39197100001
растворимый крахмалShanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd., Шанхай, КитайS817547
Термостат водяная баняShanghai Heheng Instrument Equipment Co., Ltd., Шанхай, КитайDK-8D
TryptoneShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Шанхай, КитайT139519
Ultra GelRedNanjing Vazyme Biotechnology Co., Ltd., Нанкин, КитайGR501-01
Инструмент для ультрачистой водыMerck KGaA Co., Ltd., ГерманияMilli Ультразвуковой очиститель Direct-Q8
Jiangsu Huaguan Electric Appliance Group Co., Ltd., Цзянсу, КитайSB-100DT
Штангенциркуль Sanfeng Company, ЯпонияN20P
Порошок дрожжевого экстрактаVicbio Biotechnology Co., Ltd., Пекин, КитайLP0021
Амплификатор

Ссылки

  1. Shleeva, M. O., Kondratieva, D. A., Kaprelyants, A. S. Bacillus licheniformis: A producer of antimicrobial substances, including antimycobacterials, which are feasible for medical applications. Pharmaceutics. 15 (7), 1893(2023).
  2. Muras, A., Romero, M., Mayer, C., Otero, A. Biotechnological applications of Bacillus licheniformis. Crit. Rev. Biotechnol. 41 (4), 609-627 (2021).
  3. He, H., et al. Biotechnological and food synthetic biology potential of platform strain: Bacillus licheniformis. Syn Syst Biotechno. 8 (2), 281-291 (2023).
  4. Sun, Y., et al. Enhanced β-mannanase production by Bacillus licheniformis by optimizing carbon source and feeding regimes. Prep Biochem Biotech. 52 (7), 845-853 (2022).
  5. Trunet, C., et al. Suboptimal Bacillus licheniformis and Bacillus weihenstephanensis spore incubation conditions increase heterogeneity of spore outgrowth time. Appl Environ Microb. 86 (6), e02061-e02119 (2020).
  6. Lee, N. K., Kim, W. S., Paik, H. D. Bacillus strains as human probiotics: characterization, safety, microbiome, and probiotic carrier. Food Sci Biotechnol. 28 (5), 1297-1305 (2019).
  7. Yi, W., et al. Dietary novel alkaline protease from Bacillus licheniformis improves broiler meat nutritional value and modulates intestinal microbiota and metabolites. Anim Microbiome. 6 (1), 1-16 (2024).
  8. Vasileios, B., et al. Safety and efficacy of Bacillus licheniformis DSM 32457 as a silage additive for all animal species. EFSA Journal. 17 (8), e05787(2019).
  9. Birgit, V., et al. The complete genome sequence of Bacillus licheniformis DSM13, an organism with great industrial potential. J Mol Microb Biotech. 7 (4), 204-211 (2004).
  10. Zhu, J., et al. Microbial synthesis of bacitracin: Recent progress, challenges, and prospects. Synth Syst Biotechnol. 8 (2), 314-322 (2023).
  11. Shleeva, M. O., Kondratieva, D. A., Kaprelyants, A. S. Bacillus licheniformis: A producer of antimicrobial substances, including antimycobacterials, which are feasible for medical applications. Pharmaceutics. 15 (7), 1893(2023).
  12. Willdigg, J. R., et al. The Bacillus subtilis cell envelope stress-inducible ytpAB operon modulates membrane properties and contributes to bacitracin resistance. J Bacteriol. 206 (3), e0001524(2024).
  13. Silva, K. G. S., et al. Effects of bacterial direct-fed microbial mixtures offered to beef cattle consuming finishing diets on intake, nutrient digestibility, feeding behavior, and ruminal kinetics/fermentation profile. J Anim Sci. 102, skae003 (2024).
  14. Jia, D., et al. Probiotic Bacillus licheniformis ZW3 alleviates DSS-induced colitis and enhances gut homeostasis. Int J Mol Sci. 25 (1), 561(2024).
  15. Wang, X., et al. Dietary supplementation with Bacillus mixture modifies the intestinal ecosystem of weaned piglets in an overall beneficial way. J Appl Microbiol. 130 (1), 233-246 (2021).
  16. James, N., et al. Unravelling the potential plant growth activity of halotolerant Bacillus licheniformis NJ04 isolated from soil and its possible use as a green bioinoculant on Solanum lycopersicum L. Environ. Res. 216 (2), 114620(2024).
  17. Shen, P., et al. Exploitation of ammonia-inducible promoters for enzyme overexpression in Bacillus licheniformis. J Ind Microbiol Biot. 48 (5-6), kuab037 (2021).
  18. Hou, Y., et al. Rhodiola crenulata alleviates hypobaric hypoxia-induced brain injury by maintaining BBB integrity and balancing energy metabolism dysfunction. Phytomedicine. 128, 155529(2024).
  19. Fan, B., Chen, T. Y., Zhang, S., Wu, B., He, B. F. Mining of efficient microbial UDP-glycosyltransferases by motif evolution cross plant kingdom for application in biosynthesis of salidroside. Sci Rep. 7 (1), 463(2017).
  20. Hugo, R. O., Bernardo, R. B., Alejandra, C. S. R. Potential application of the probiotic Bacillus licheniformis as an adjuvant in the treatment of diseases in humans and animals: A systematic review. Front Microbiol. 13, 993451(2022).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Производство бацитрацинавыделение из фекалиймикробиота свинейочистка бацитрацинатонкослойная хроматографиявысокоэффективная жидкостная хроматографияингибирование Micrococcus luteusфилогенетический анализбиохимическая характеристика

Эта статья была опубликована

Видео скоро будет доступно

Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.