Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Выделение мезенхимальных стволовых клеток желе Уортона и их производных экзосом/малых внеклеточных везикул

1.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/66778

⸱

11 ноября 2025 г.

 ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, Faculty of Pharmacy, Ain Shams University, 2School of Life and Medical Sciences, University of Hertfordshire Hosted by Global Academic Foundation, 3Department of Obstetrics and Gynecology, Faculty of Medicine, Ain Shams University, 4Department of Pharmacology and Biochemistry, Faculty of Pharmacy, The British University in Egypt, 5Health Research Center of Excellence, Drug Research and Development Group (DRD-G), The British University in Egypt

В этой статье

Краткое содержание

Ткань пуповины является богатым, легкодоступным, неинвазивным источником мезенхимальных стволовых клеток (МСК). В этом протоколе подробно описаны шаги по выделению и характеристике желейных МСК Уортона человека (WJ-МСК), за которыми следует простой короткий протокол для выделения их производных экзосом или небольших внеклеточных везикул.

Аннотация

В области регенеративной медицины особое внимание привлекли мезенхимальные стволовые клетки (МСК). МСК из ткани пуповины (ЯК), называемые желе Уортона, особенно хорошо зарекомендовали себя в различных областях. По сравнению с другими источниками МСК, желейные МСК Уортона (WJ-MSCs) обладают рядом преимуществ и изолированы от ЯК, который обычно утилизируется как медицинские отходы. Таким образом, WJ-MSC не поднимают никаких этических вопросов, подобных тем, которые относятся к эмбриональным стволовым клеткам. Для выделения WJ-MSCs из ткани UC был использован простой и воспроизводимый метод экспланта. В течение пяти-десяти дней изоляции WJ-MSCs проявляются в виде адгезивных клеток с фибробластической формой. После выделения клетки достигают около 80% конфлюенции за 14-18 дней. После этого, в пассаже 3, выделенные WJ-MSCs были полностью охарактеризованы, что привело к их дифференцировке по адипогенным, остеогенным и хондрогенным мезенхимальным линиям. Кроме того, было протестировано иммунофенотипирование по поверхностным маркерам негативного кластера дифференцировки (CD), включая CD34, CD14 и HLA-DR, а также отличительным поверхностным маркерам МСК, таким как CD105, CD90, CD73 и CD44. Кроме того, преципитирующий реагент был использован в прямом подходе для выделения экзосом/малых внеклеточных везикул (sEVs) из кондиционированной среды этих WJ-MSCs. После выделения экзосомы/sEV наблюдали под просвечивающим электронным микроскопом, и для расчета их среднего размера использовали анализ размера частиц. Таким образом, WJ-MSC обеспечивают легкодоступный, неинвазивный, возобновляемый запас стволовых клеток, которые могут быть использованы в качестве фабрик для производства экзосом/sEV. Эти WJ-MSC и их производные экзосомы/sEV могут быть использованы в широком спектре терапевтических и последующих исследовательских приложений.

Введение

Всего несколько лет назад считалось, что стволовые клетки занимают ведущее место в медицине 1,2. Тем не менее, этическая проблема, связанная с эмбриональными стволовыми клетками (ЭСК), была огромным препятствием, препятствующим быстрому прогрессу в этой области3. Это вызвало большой интерес к изучению альтернативных возобновляемых источников стволовых клеток, особенно тех, которые могут быть выделены постнатально из пуповины (ЯК)4. ЯК естественным образом соединяется с плацентой и плодом внутри беременной матери. Врожденная роль ЯК заключается в том, чтобы питать растущий плод непрерывным и достаточным кровоснабжением через кровеносные сосуды и обеспечивать защиту этих сосудов путем предотвращения любого возможного скручивания, сжатия или перекручивания плода во времяего движения. Анатомически ЯК человека состоит из двух артерий и вены, которые встроены в слизистую соединительную ткань и заключены во внешний слой амниотического эпителия6. Матрикс ЯК, или слизистая соединительная ткань, окружающая три пупочных сосуда, известен как «желе Уортона» (WJ) и в основном состоит из протеогликанов и коллагена7.

В последнее время мезенхимальные стволовые клетки (МСК) привлекают большое внимание в качестве нового эффективного терапевтического метода для широкого спектра применений регенеративной медицины 7,8,9,10,11,12. Что наиболее интригует в МСК, так это их легкость выделения, а также продемонстрированная иммуномодулирующая активность и мультипотенция 13,14,15. Другими превосходными преимуществами МСК в целом и полученных от WJ в частности являются то, что при трансплантации не проявляются тератомы, в отличие от ЭСК, и тот факт, что они сохраняют свои свойства стволовости даже после нескольких клеточных пассажей16,17. Таким образом, в настоящее время считается, что МСК действительно могут обеспечить революционные терапевтические вмешательства при различных заболеваниях 8,18,19. Важно отметить, что в 2006 году Международное общество клеточной и генной терапии (ISCT) определило конкретные минимальные критерии для правильной характеристики МСК20. Во-первых, при выращивании/культивировании в стандартных условиях культивирования МСК должны быть адгезными к пластику. Во-вторых, МСК должны экспрессировать некоторые характерные поверхностные маркеры кластера дифференцировки (CD), такие как CD90, CD105 и CD73, и не должны проявлять экспрессию других маркеров, таких как CD14, CD34 и CD45. В-третьих, МСК должны дифференцироваться на остеогенные, адипогенные и хондрогенные линии in vitro20. На сегодняшний день МСК выделяются из нескольких источников, включая ткани взрослого человека, такие как костный мозг (КМ), жировая ткань21, а также фетальные/перинатальные источники, такие как плацента, кровь ЯК (UCB) и матрикс ЯК22,23. Здесь следует отметить, что при сравнении коэффициента успешности сбора МСК, как сообщается, он достигает почти 100% из ткани WJ по сравнению с всего около 6% из UCB24,25. Таким образом, хотя UCB действительно является богатым источником гемопоэтических стволовых клеток, он также считается хорошим источником МСК, однако значительно ниже, чем WJ 26,27,28.

WJ-МСК являются исключительными по сравнению с другими типами МСК, поскольку, хотя они являются добросовестными (типичными) МСК, обладающими свойствами, сходными со своими взрослыми аналогами, они также обладают экспрессией различных маркеров плюрипотентности/ЭСК17,29. Соответственно, считается, что WJ-MSC находятся где-то между взрослыми и эмбриональными стволовыми клетками17. Интересно, что было обнаружено, что WJ-MSCs экспрессируют как человеческие МСК, так и маркеры ESCs и способны сохранять стволовость в течение нескольких пассажей16. К счастью, при пересадке у них не образуются тератомы17. Это может быть объяснено их уникальным транскриптомным профилем по сравнению с ЭСК, а также другими МСК29,30. WJ-МСК обладают различными преимуществами по сравнению со взрослыми МСК и даже перед другими типами стволовых клеток в целом. Их средства изоляции легко доступны через ЯК, которые обычно выбрасываются при рождении и, таким образом, считаются медицинскими отходами. Таким образом, в отличие от ЭСК, WJ-МСК не имеют этических проблем, и в отличие от МКМ-МСК, которые выделяются с помощью инвазивной техники31. Более того, как и у других типов МСК, у WJ-MSC отсутствует экспрессия человеческого лейкоцитарного антигена-D (HLA-DR), и, в частности, было обнаружено, что они экспрессируют человеческий лейкоцитарный антиген-G (HLA-G), что обеспечивает им дополнительную иммунную привилегию32. Это говорит о том, что WJ-МСК проявляют иммуносупрессивную роль, моделируя то, что обычно происходит на границе плод-мать in vivo 33,34,35. Наконец, как и их аналоги, выделенные из UCB, WJ-MSC обладают большим потенциалом для банковского дела36. Учитывая все эти преимущества, WJ-MSC таким образом пропагандируются как новый золотой стандарт терапии на основе МСК.

Интересно, что большое количество исследований показало, что МСК проявляют свои терапевтические эффекты в основном через паракринную сигнализацию. Во многих случаях сообщалось, что такие эффекты возникают в ответ на экзосомы/малые внеклеточные везикулы (sEVs), секретируемые MSCs37. Экзосомы/sEV известны как биоактивные везикулы наноразмера, которые приобретаются из эндомембранной системы клетки. Они действуют как челноки, передающие специфические грузы белков, мРНК, а также некодирующие РНК, такие как микроРНК и длинные некодирующие РНК (LncRNAs), в виде сообщения в бутылке38. Как следствие, они могут перепрограммировать клетки-реципиенты и обозначаются как «сигналосомы», манипулирующие основными клеточнымифункциями. Экзосомы/sEV, полученные из МСК, продемонстрировали свое превосходство над терапией МСК в качестве возможной бесклеточной альтернативы. Было обнаружено, что подобно своим родительским МСК, экзосомы/sEV вызывают терапевтические эффекты и клеточную регенерацию при нескольких заболеваниях. Однако, в отличие от своих родительских клеток, они могут легче преодолевать биологические барьеры. Более того, они лишены критических проблем с безопасностью; Они не создают риска иммунного отторжения или долгосрочного образования опухоли40. Кроме того, экзосомы/sEV могут быть использованы для применения в генной терапии в качестве средства системы доставки лекарств, будучи естественно приспособленными для передачи генетическойинформации. Таким образом, экзосомы/sEV действительно открыли новые захватывающие возможности для новых терапевтических вмешательств при различных заболеваниях 42,43,44.

В этом протоколе представлен тщательный протокол на основе ступенчатых эксплантов для выделения и характеристики WJ-MSC из ткани ЯК. За этим последует краткий протокол выделения экзосом/sEV из кондиционированных сред этих WJ-MSC.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все эксперименты и процедуры были проведены в соответствии с утвержденными руководящими принципами и были одобрены этическими комитетами как фармацевтического факультета Университета Айн-Шамс, Каир, Египет (ACUC-FP-ASU RHDIRB2020110301 REC# 220), так и фармацевтического факультета Британского университета в Египте, Каир, Египет (CL-2309). НК были получены после получения подписанного информированного согласия от родителя (родителей).

1. Выделение WJ-MSC из пуповины человека

  1. Поместите около 30-40 мл фосфатно-солевого буфера (PBS) в контейнер (герметичный мешок для сбора) для сбора пуповины (UC) (длиной около 15 см) сразу после доставки. Храните собранный ЯК на льду и обрабатывайте его в течение максимум 4-5 часов после сбора.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Образец нельзя обрабатывать через 4-5 часов, так как это значительно уменьшит выход МСК. Убедитесь, что PBS и контейнер стерильны.
  2. Готовьте полноценные питательные среды для WJ-МСК, состоящие из модифицированной орлиной среды с низким содержанием глюкозы Dulbecco (LG-DMEM) с добавлением 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота (FBS), 100 ЕД/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 2 мМ L-глутамина и 0,25 мкг/мл амфотерицина B.
  3. Поместите 3 мл готовой среды на лунку в 6-луночные планшеты, затем поместите эти 6-луночные планшеты со средой в инкубатор с CO2 при температуре 37 °C и 5% CO2 для нагрева и подготовки.
  4. В шкафу биобезопасности приготовьте восемь 10-сантиметровых чашек для клеточных культур, каждая из которых заполнена 10 мл стерильного PBS.
  5. Осторожно, используя стерилизованные щипцы, перенесите ЯК из герметичного полиэтиленового пакета в первую чашку Петри, содержащую PBS, чтобы смыть кровь (повторяйте этот шаг, пока вся кровь не будет вымыта из образца).
  6. Распылите 70% этанол на стерильный тампон и протрите им UC в течение 30 секунд.
  7. Переложите UC в новую чашку Петри, наполненную стерильным PBS, чтобы удалить остатки этанола.
  8. Переложите UC в другую чашку Петри, предварительно заполненную стерильным PBS, и с помощью стерильных ножниц разрежьте UC на более мелкие кусочки (около 3 см каждая). Затем переместите эти кусочки длиной 3 см в другую чашку Петри со свежим стерильным PBS, чтобы избежать выделения крови в процессе разрезания.
    ПРИМЕЧАНИЕ: С этого момента кусочки UC должны оставаться на льду, а также на всех последующих этапах обработки. Это действительно важно для того, чтобы избежать выделения студенистого вещества и обеспечить успех процедуры выделения WJ-MSC из ткани ЯК. Обработка собранного ЯК в течение максимум 4-5 часов имеет решающее значение для успеха процесса изоляции. Ранее ЯК обрабатывался в течение более длительных периодов времени после сбора, и, к сожалению, процедура не показывала успешных результатов (данные не отображались).
  9. Начните обрабатывать кусочки UC одну за другой (на льду) в чашке Петри, наполненной стерильным PBS. Используйте стерильные ножницы и щипцы, чтобы вырезать кровеносные сосуды и изолировать ткань желе Уортона (WJ). Затем положите прозрачные кусочки WJ в другую чашку Петри, наполненную стерильным PBS, на лед.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Во время выделения ткани WJ из кусочка ЯК первый разрез делается на прозрачной стороне кусочка ЯК, вдали от кровеносных сосудов, чтобы избежать разрезания сосуда. После этого кровеносные сосуды зажимаются, разрезаются и оттягиваются.
  10. Повторите предыдущий шаг на всех кусочках ЯК, чтобы получить прозрачную ткань WJ без кровеносных сосудов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости замените чашку Петри PBS во время обработки кусочков UC и удаления кровеносных сосудов, если раствор PBS становится кровянистым или непрозрачным во время выделения тканей WJ.
  11. Собранные кусочки WJ промойте PBS, переложив их в свежую 10-сантиметровую чашку для клеточной культуры, наполненную стерильным PBS.
  12. С помощью стерильного, острого скальпеля и щипцов разрежьте собранные салфетки WJ на небольшие кусочки длиной 10 мм.
  13. Переложите кусочки WJ в заранее подготовленные 6-луночные планшеты на шаге 1.3. Поместите 5-6 кусочков WJ в лунку, затем инкубируйте 6-луночные планшеты, содержащие тканевые экспланты WJ, во влажной атмосфере с 5%CO2 при 37 °C в инкубаторе CO2 и оставьте в покое на 3 дня.
  14. На4-й день после установки тканевых эксплантов WJ осторожно добавьте 1 мл среды в лунку, стараясь не потревожить экспланты.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не прикасайтесь к нижней части пластины, к которой прикреплены детали WJ, и не царапайте их.
  15. Повторите предыдущий шаг на6-й день после установки тканевых эксплантов WJ.
  16. На8-й день после установки тканевых эксплантов WJ (т.е. почти через неделю после установки экспланта) начните менять половину среды на лунку через день до 12-14-го дня после установки экспланта. Замените половину питательных сред из каждой лунки, удалив около 2,5 мл из каждой лунки и добавив свежие 2,5 мл полной теплой среды (37 °C).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Извлеките фильтрующий материал с поверхности лунки и не прикасайтесь к дну пластины, к которой прикреплены детали WJ. WJ-MSCs обычно появляются под и вокруг тканевых эксплантов WJ в течение 5-10 дней после их размещения.
  17. Регулярно наблюдайте за 6-луночными планшетами под инвертированным микроскопом (10-кратное увеличение), и если высвобожденные клетки пролиферируют и их слияние увеличивается, достигая 50-60%, переходите к следующему этапу; Если нет, повторите шаг 1.16. снова. Детали WJ со временем значительно уменьшаются в размерах.
  18. Аккуратно снимите экспланты WJ, прикрепленные к дну лунок, и удалите все среды. Удаление эксплантных частей WJ обычно производится на 12-14-й день после их первоначальной установки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Слегка наклоните пластины под углом 45° при извлечении носителя, чтобы убедиться, что все носители удалены.
  19. Промойте каждую лунку 2 мл PBS, аккуратно взболтайте пластину, а затем выбросьте PBS. Повторите этот шаг стирки дважды.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Аккуратно добавьте PBS к стенке лунки и избегайте прикосновения к дну лунок, чтобы не нарушать клетки вообще.
  20. Аккуратно добавьте 2 мл теплой сплошной среды на лунку (среда с точным составом, как описано в шаге 1.2) и инкубируйте 6-луночные планшеты во увлажненных условиях с 5%CO2 при 37 °C.
  21. Полностью меняйте среду через день (2 мл полной среды на лунку) до тех пор, пока клетки не достигнут примерно 80% конфлюенции.
  22. Когда клетки достигают примерно 80% конфлюенции, пропускают клетки с помощью трипсина-ЭДТА в колбы для клеточных культур Т25 (общее количество клеток, полученных из одного 6-луночного планшета, можно пропустить в одну колбу для культуры Т25, используйте 8-9 мл полной среды на колбу Т25). Эти WJ-МСК обозначаются как клетки P1.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не оставляйте клетки слишком долго с Trypsin-EDTA, чтобы избежать токсических эффектов; Как правило, достаточно 3 минут для отслойки клеток. Различные поставщики могут предоставить Трипсин-ЭДТА с переменной эффективностью. Соответственно, это нужно учитывать при указании времени инкубации.
  23. Меняйте носители через день. После того, как клетки достигнут примерно 80% конфлюенции, пропустите клетки с помощью Trypsin-EDTA в колбы для клеточных культур T75 (общее количество клеток, полученных из одной колбы для культуры T25, можно пропустить в одну колбу для культуры T75; используйте 15-18 мл готовой среды на колбу T75); эти WJ-МСК обозначаются как Р2-клетки.
  24. Меняйте носители через день. Как только клетки достигнут примерно 80% конфлюенции, отделите клетки с помощью Trypsin-EDTA, затем засейте WJ-MSCs с плотностью около 0,75 x 106-1 x10 6 клеток на колбу T75. Эти WJ-МСК обозначаются как Р3-клетки.
    Примечание: Используйте клетки между P3-P5 для будущих экспериментов, описанных в этом протоколе.
  25. Криоконсервируйте выделенные WJ-MSCs в жидком азоте с использованием криоконсервирующей среды, состоящей на 80% из FBS, на 10% из полной среды (как описано в шаге 1.2) и на 10% из диметилсульфоксида (ДМСО).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Схематическое представление всех этапов изоляции WJ-MSC представлено на рисунке 1.

2. Характеристика выделенных WJ-MSC методом иммунофенотипирования с использованием проточного цитометрического анализа для различных поверхностных маркеров БК

  1. Отделите клетки с помощью Trypsin-EDTA в месте прохождения 4. Промойте клетки PBS дважды и подсчитайте их количество с помощью гемоцитометра.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Минимальное время инкубации (в течение 3 минут) во время трипсинизации имеет решающее значение для успешного отделения клеток без нанесения каких-либо повреждений. Длительная инкубация с Trypsin-EDTA может привести к повреждению маркеров клеточной поверхности и негативно повлиять на результаты иммунофенотипического анализа.
  2. Инкубируйте около 100 000 клеток (в темноте) в течение 20 мин при 4 °C с человеческими моноклональными антителами, меченными либо фикоэритрином (ПЭ), либо флуоресцеином изотиоцианатом (ФИТК), следующим образом: анти-CD90 ПЭ, анти-CD73 ПЭ, анти-CD105 FITC, анти-CD44 ПЭ, анти-CD34 ПЭ, анти-CD14 ПЭ и анти-HLA-DR FITC, и используйте неокрашенные клетки в качестве контроля.
  3. Промойте клетки PBS и затем повторно суспендируйте их в 500 мкл буфера FACS; Анализ с помощью проточной цитометрии45.

3. Оценка дифференцировочного потенциала изолированных WJ-MSC в отношении различных мезенхимальных линий

  1. Адипогенная дифференцировка
    1. Ресуспендируйте клетки в полной пролиферирующей среде (как описано в шаге 1.2). После этого культивируют клетки с плотностью 3,7 x 104 клеток/лунку (0,5 мл среды/лунки) в 24-луночном планшете для культивирования тканей. Затем инкубируйте во увлажненных условиях с содержаниемCO2 5% при 37 °C. Далее, Далее, через день меняйте среды до тех пор, пока клетки не достигнут почти 100% конфлюенции; Обычно это занимает около 3-4 дней.
    2. Удалите пролиферирующую среду и замените ее средой адипогенной дифференцировки, чтобы вызвать адипогенез. Дополните среду LG-DMEM 100 мкг/мл стрептомицина, 100 ЕД/мл пенициллина, 0,25 мкг/мл амфотерицина B и адипогенную добавку, входящую в набор для функциональной идентификации мезенхимальных стволовых клеток. После этого аккуратно меняйте среду (0,5 мл/лунка) каждые 3 дня и избегайте нарушения липидных вакуолей.
    3. Примерно через 21 день, используя микроскопическое исследование, окрасьте липидные вакуоли масляным красным для оценки адипогенной дифференцировки.
    4. Приготовьте свежий исходный раствор Oil Red; Растворите 30 мг красителя Oil Red в 10 мл изопропанола и дайте отдых не менее 30 минут при комнатной температуре. Затем приготовьте рабочий раствор, смешав 2 части дважды дистиллированной воды (ddH2O) с 3 частями исходного раствора, хорошо перемешав их и дав отдохнуть 10 минут при комнатной температуре. После этого отфильтруйте с помощью фильтра 0,22 или 0,45 мкм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для достижения наилучших результатов окрашивания, только что приготовьте масляно-красное пятно.
    5. Для успешной документации адипогенной дифференцировки дважды промойте клетки PBS и зафиксируйте их нейтральным буферным 10% формалином (0,75 мл/лунку) в течение 15 минут. После этого дважды промойте клетки PBS, используя 1 мл / лунку (прежде чем выбрасывать PBS после каждой промывки, инкубируйте клетки около 5 минут).
      Примечание: Клетки, поддерживаемые в пролиферативных средах (описанных в шаге 1.2), используются в качестве контрольных, неиндуцированных клеток. Добавляйте нейтральный буферный формалин медленно к стенкам, а не непосредственно к клеткам, чтобы избежать повреждения клеток. После окончательной стирки PBS решающее значение имеет полная аспирация PBS перед добавлением рабочего раствора Oil Red Stain, чтобы избежать неэффективного окрашивания.
    6. После окончательной промывки окрасьте клетки (1 мл/лунку) рабочим раствором Oil Red и инкубируйте их в течение 60 минут при температуре 37 °C. Далее извлеките и выбросьте раствор пятна и аккуратно дважды прополощите ячейки PBS. Затем под микроскопом понаблюдайте за окрашенными липидными каплями.
  2. Остеогенная дифференцировка
    1. Ресуспендируйте клетки в полной пролиферирующей среде (как описано в шаге 1.2). После этого в 24-луночный планшет для культуры тканей засейте 7,4 x 103 клеток/лунку (добавьте 0,5 мл среды/лунки) и инкубируйте их в течение 3 дней во влажных условиях при 5% CO2 при 37 °C до почти 70% конфлюенции.
    2. При конфлюенции около 70% замените пролиферационные среды на среды для индукции дифференцировки, включающие остеогенную добавку, входящую в набор для функциональной идентификации мезенхимальных стволовых клеток, в среде LG-DMEM, дополненную 10% FBS, вместе со 100 ЕД/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 2 мМ L-глутамина и 0,25 мкг/мл амфотерицина В.
    3. Заменяйте дифференцировочные среды один раз в 3 дня и продолжайте остеогенную индукцию около 21 дня.
    4. Приготовьте рабочий раствор красителя Ализарин Красный S; внесите 9 мл ddH2O и растворите в нем 200 мг красителя Alizarin Red S, а затем с помощью гидроксида аммония и HCl доведите pH до 4,1-4,3. Затем доведите объем до 10 мл с помощью ddH2O. После этого отфильтруйте раствор с помощью фильтра (0,22 или 0,45 мкм) для удаления любых осадков.
    5. В конце индукционного периода дважды промойте клетки PBS, а затем зафиксируйте их с помощью нейтрального буферизованного 10% формалина (0,75 мл/лунка) и дайте им отдохнуть в течение 15 минут. После этого дважды промойте клетки с помощью PBS (1 мл/лунка) и обязательно инкубируйте клетки в течение 5 минут при каждом промывании.
      Примечание: Клетки, поддерживаемые в пролиферативных средах (описанных в шаге 1.2), используются в качестве контрольных, неиндуцированных клеток.
    6. Добавьте 2% рабочий раствор Ализарин-Ред С, приготовленный на шаге 3.2.4, в те неподвижные клетки, которые были получены на предыдущем этапе, и инкубируйте в темноте около 45-60 минут при комнатной температуре.
    7. Затем выбросьте раствор красителя и промойте клетки ddH2O дважды, а затем PBS один раз, затем оцените успешную остеогенную дифференцировку под микроскопом, наблюдая за окрашенным внеклеточным матриксом, богатым кальцием.
  3. Хондрогенная дифференциация
    1. Ресуспендируйте клетки в полной пролиферирующей среде (как описано в шаге 1.2). После этого в 24-луночный планшет для культивирования тканей засейте 7,4 x 103 клеток /лунку (добавьте 0,5 мл среды/лунки) и инкубируйте их во влажных условиях при 5%CO2 при 37 °C в течение 3 дней до почти 90% конфлюенции.
    2. При примерно 90% конфлюенции начните индуцировать хондрогенную дифференцировку с использованием бессывороточного DMEM/F12 с добавлением инсулин-трансферрина селена (ITS) и хондрогенной добавки, входящей в комплект для функциональной идентификации мезенхимальных стволовых клеток, вместе с 0,25 мкг/мл амфотерицина В, 100 ЕД/мл пенициллина, 2 мМ L-глутамина и 100 мкг/мл стрептомицина46.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Полная среда для индукции хондрогенной дифференцировки хранится в темноте при температуре 2-8 °C.
    3. Продолжайте индукцию хондрогенной дифференцировки в течение примерно 21 дня; Между тем, меняйте носители каждые 3 дня.
    4. Приготовьте рабочий раствор для морилки Alcian Blue следующим образом: Сначала приготовьте 3% ледяную уксусную кислоту в ddH2O (добавьте 3 мл ледяной уксусной кислоты и заполните до 100 мл ddH2O). Затем приготовьте рабочий раствор для окрашивания Alcian Blue, добавив от 20 мг до 20 мл 3% раствора ледяной кислоты, выдерживая его около 30 минут, а затем отфильтруйте с помощью фильтра 0,22 мкм или 0,45 мкм для удаления любых осадков.
    5. В конце индукционного периода дважды промойте клетки PBS, затем зафиксируйте их с помощью 10% нейтрального буферизованного формалина (0,75 мл/лунку) и дайте им отдохнуть в течение 15 минут. После этого дважды промойте клетки с помощью PBS (1 мл/лунка). Каждый раз инкубируйте клетки в течение 5 минут.
      Примечание: Клетки, поддерживаемые в пролиферативных средах (как описано в шаге 1.2), используются в качестве контрольных, неиндуцированных клеток.
    6. Инкубировать неподвижные клетки в 0,1% подготовленном рабочем растворе Alcian blue в течение примерно 60 мин при 37 °C. Промойте клетки ddH2O дважды и PBS один раз, чтобы удалить остаточное пятно. Затем с помощью микроскопического исследования наблюдают за окрашенными сульфатированными протеогликанами.

4. Выделение экзосом/sEV из кондиционированных сред WJ-MSCs

  1. Ресуспендируйте WJ-MSCs в полной пролиферирующей среде (как описано на шаге 1.2) и засейте этими WJ-MSC 6-луночные тканевые культуральные планшеты с плотностью 150 000 клеток/лунку (2 мл среды/лунку) и инкубируйте их при 37 °C во влажных условиях при 5%CO2.
  2. Готовят бессывороточные (SF) среды для сбора экзосом следующим образом: модифицированную орлиную среду Dulbecco's с низким содержанием глюкозы (LG-DMEM) с добавлением 2 мМ L-глутамина, 100 ЕД/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 0,25 мкг/мл амфотерицина В.
    Примечание: Среда для сбора экзосом имеет тот же состав, что и полная среда пролиферации (описана в шаге 1.2), но без FBS.
  3. Следуйте за 6-луночными планшетами (подготовленными на шаге 4.1) и заменяйте среду через день, используя пролиферативную среду (как описано в шаге 1.2). Наблюдайте за клетками под микроскопом до тех пор, пока они не достигнут примерно 75-80% конфлюенции.
  4. При достижении 70% конфлюенции дважды промойте клетки PBS (1 мл/лунка), затем добавьте бессывороточные (SF) среды для сбора экзосом (1,5 мл/лунку) (описано в шаге 4.2) и инкубируйте в течение 48 ч при 37 °C во влажных условиях при 5%CO2.
  5. Через 48 ч соберите кондиционированную среду WJ-MSC из 6-луночных планшетов для культивирования тканей, помещенных на предыдущем этапе, в пробирки для сбора центрифугирования объемом 15 мл. Затем проведите следующие последовательные этапы центрифугирования и фильтрации для очистки собранной кондиционированной среды47.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используя исключительный краситель трипанового синего с последующим подсчетом клеток с помощью гемоцитометра, оцените процент жизнеспособности клеток, первоначально использованных для получения собранной кондиционированной среды; Жизнеспособных клеток в идеале должно быть более 90%. После этого храните собранную клеточную гранулу при температуре -80 °C на случай, если она понадобится для будущих исследований.
    1. Центрифугируйте собранную кондиционированную среду при 300 x g в течение 10 минут при 4 °C, чтобы избавиться от любых взвешенных элементов. Затем соберите надосадочную жидкость и выполните следующий этап центрифугирования для этой собранной надосадочной жидкости (кондиционированной среды).
    2. Кондиционированную среду, полученную на стадии 4.5.1, центрифугируют при 3000 x g в течение 15 мин при 4°С для избавления от некротических клеток, а также клеточного мусора.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этапы центрифугирования предпочтительно проводить при температуре 4 °C, но также можно проводить при комнатной температуре с аналогичными результатами.
    3. Отфильтруйте надосадочную жидкость, полученную на предыдущем этапе, пропустив ее через фильтр 0,22 мкм в новую полипропиленовую пробирку объемом 50 мл, чтобы избавиться от любого остаточного клеточного мусора и крупных EV.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Отфильтрованную кондиционированную среду можно немедленно использовать для последующих этапов выделения экзосом/sEV, хранить в холодильнике при температуре 4 °C и использовать не более 3 дней, или хранить при температуре -80 °C для длительного хранения до тех пор, пока не потребуется выделение экзосом/sEV. Очищенные кондиционированные среды, хранящиеся при температуре -80 °C, предпочтительно обрабатывать в течение максимум 1-3 месяцев; Чем раньше, тем лучше.
  6. Поместите 7,5 мл очищенной кондиционированной среды (полученной на этапе 4.5) в центрифужную пробирку объемом 15 мл и добавьте 1,5 мл реагента. Добавляйте реагент в среду в соотношении 1:5 (т.е. 1 мл осаждающего реагента Exoquick-TC на каждые 5 мл среды). После этого переверните трубку вверх и вниз и несколько раз поверните ее, чтобы обеспечить правильное смешивание осаждающего реагента с средой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Осаждающий реагент представляет собой тяжелый, вязкий реагент. Таким образом, требуемый объем следует извлекать медленно и осторожно, чтобы обеспечить полную передачу нужного объема.
  7. Пробирку со средой с осаждающим реагентом при температуре 4 °C хранят в вертикальном стоячем положении в течение примерно 16 ч (не менее 12 ч).
  8. На следующий день центрифугируйте смесь среды/осаждающего реагента при 1500 x g в течение 30 минут при 4 °C. После центрифугирования гранула экзосом/sEVs выглядит как очень маленькая белая или бежевая гранула, которая оседает на дне пробирки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап центрифугирования также может быть выполнен при комнатной температуре с аналогичными результатами. В случае, если гранула экзосом/sEVs не видна в конце этой стадии центрифугирования, можно добавить дополнительное время центрифугирования при 3000 x g в течение дополнительных 20-30 минут при 4 °C. Иногда гранулы экзосом/ВВ остаются невидимыми даже после длительного времени центрифугирования, что означает, что существует небольшое количество экзосом/ВВ. В этом случае приступайте к протоколу, оставив на дно 5-10 мкл пробирки.
  9. Отсадите надосадочную жидкость и центрифугируйте смесь остаточной среды/осаждающего реагента при 1500 x g в течение 5 мин при 4 °C. Затем очень осторожно отсасывайте оставшиеся следы жидкости, не нарушая осажденные гранулы экзосом/sEVs.
  10. Суспендируйте гранулы экзосом/sEVs в 100-300 мкл стерильного PBS в соответствии с размером гранулы и видимостью. После этого эти экзосомы/sEV могут быть либо немедленно использованы, либо храниться в ультраморозильной камере при температуре -80 °C для последующих экспериментов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В случае запуска с более чем одной центрифужной пробиркой для одной и той же среды (описанной в шаге 4.9), и гранулы экзосом/sEVs (полученные на шаге 4.10) невидимы, гранулы экзосом/sEVs, собранные из всех них, могут быть объединены с использованием около 100-300 μL стерильного PBS для суспензии всех их вместе.
  11. Количественно оцените собранные экзосомы/sEV относительно содержания в них белка с помощью коммерчески доступного набора для количественного определения белка бицинхониновой кислоты (BCA), как указано производителем.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Схематическое представление всех этапов выделения экзосом/sEV, полученных из WJ-MSCs, представлено на рисунке 2.

5. Визуализация изолированных экзосом/sEV с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ)

  1. Суспензируйте свежевыделенные экзосомы/sEVs в 100-300 мкл стерильной PBS в соответствии с размером гранул и видимостью (как описано ранее в шаге 4.11).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для визуализации ПЭМ предпочтительно использовать свежевыделенные, а не замороженные экзосомы/sEV
  2. Пипеткой нанесите 20 мкл суспензии экзосом/sEVs на сетку с углеродным покрытием и дайте высохнуть в течение 10 минут.
  3. Зафиксировать размещенные экзосомы/sEV с помощью раствора глутарового альдегида (2% в дистиллированной воде) в течение примерно 15 минут.
  4. После этого окрасьте неподвижные экзосомы/sEV 2% уранилацетата и оставьте примерно на 3 минуты в темноте, затем рассмотрите их под просвечивающим электронным микроскопом (ПЭМ) (увеличение 20000) с использованием стандартных настроек ПЭМ.

6. Определение среднего размера выделенных экзосом/sEV с помощью анализатора размера частиц

  1. Разбавьте свежевыделенные экзосомы/sEVs стерильным PBS pH 7,4 в соотношении 1:250.
  2. Измерьте среднее распределение частиц по размерам изолированных экзосом/sEV с помощью анализатора размера частиц при температуре 25 °C.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Изоляция и определение характеристик WJ-MSC

Как показано на рисунке 3, небольшие фибробластоподобные клетки первоначально появлялись под и вокруг тканей экспланта WJ в течение 5-10 дней после посева этих эксплантов (рисунок 3A). Эти высвобожденные WJ-MSC продолжают размножаться и обычно достигают около 80% конфлюенции в...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В этом протоколе мы смогли представить подробные шаги по выделению WJ-MSC из ткани ЯК человека, а также по выделению их производных экзосом/sEV. ЯК является легкодоступным неиспользованным неинвазивным источником для получения МСК, и для сбора или обработки не требуется специального оборудования 11,15,30,32,48. Для выделения W...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Все соавторы заявляют об отсутствии конфликта интересов, связанного с данной работой.

Благодарности

Эта работа была частично профинансирована Университетом Айн-Шамс - грант поддержки исследований стратегического плана (2024/2025), Египет, и Исследовательским центром нанотехнологий (NTRC) - премия доступа (2019/2020), Британский университет в Египте (BUE), Каир, Египет.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Alcian Blue 8GXСигма-Олдрич, СШАA3157
Ализарин Ред ССигма-Олдрич, СШАA5533
Гидроксид аммонияFisher Scientific, Германия1336-21-6
Антитела к человеческому CD-105, FITCR& D systems Inc., Миннесота, СШАFAB10971F
Антитела к человеку CD-14, ТЭБекман Коултер, СШАIM0650U
Антитела к человеческому CD-34, ПЭБекман Коултер, СШАIM1420
Антитела к человеку CD-44, ТЭБекман Коултер, СШАA32537
Антитела к человеку CD-73, ПЭR& D systems Inc., Миннесота, СШАFAB5795P
Антитела к человеку CD-90, ТЭR& D systems Inc., Миннесота, СШАFAB2067P
Антитела к человеку HLA-DR, FITCБекман Коултер, СШАIM1638U
Набор для количественной оценки белков по бицинхониновой кислоте (BCA)Термофишер23227
Шкаф для биобезопасности, ламинарный поток, MSC AdvantageThermo Scientific, США
CO2 инкубатор, Direct FormaThermo Scientific, США
Охлаждающая центрифугаСигма, Германия
Охлаждающая центрифугаЭппендорф, Германия
CytoFLEX Flow Cyto Бекман Коултер, Флорида, США
Диметилсульфоксид (DMSO)Fisher Scientific, ГерманияBP231-100
DMEM — низкий уровень глюкозы 1 г/лЛонца, Швейцария12-707F
DMEM/F12 Лонца, Швейцария12-719F
Вода без ДНК/РНКGibco Thermo Fisher, США10977-035
Этанол абсолют, класс молекулярной биологииСигма-Альдрих, Германия24103
ExoQuick-TCСистемные бионауки (SBI), СШАEXOTC50A-1Осаждающий агент
Сыворотка для плода быка (FBS)Gibco Thermo Fisher, Бразилия10270-106
Формальдегид 37%Fisher ScientificBP531-500
Ледниковая уксусная кислотаСигма Олдрих, ГерманияA38S-500
раствор глутаральдегида СигмаG7776
Соляная кислота (HCl)Fisher Scientific, ГерманияA144-212
Инвертированный микроскопОлимп, Япония
L-глутаминGibco Thermo Fisher, США25030-024
Набор функциональной идентификации мезенхимальных стволовых клеток;R& D systems Inc., Миннесота, СШАSC006
Считыватель микропластинChromate, Awareness Technologies, США
Масляно-красное пятноСигма-Олдрич, СШАO0625
Пенициллин-стрептомицин-амфотерицинGibco Thermo Fisher, США15240062
Фосфатный буферный физиологический раствор, 1 раз, без Ca/MgЛонца, ШвейцарияBE17-516F
Трясущая водяная баняДайхан Вайзбат, Корея
Фильтр для шприца, 0,2 микронаКорнинг, США431224
Трансмиссионный электронный микроскопJEM-1200EX II, Чёль, Германия
Трипан синий Gibco Thermo Fisher, США15250061
Trypsin-Versene-EDTA, 1xЛонца, ШвейцарияCC-5012
Раствор уранилацетата (2%)Electronic Microsopy Sciences, США22400-2
УФ-видимый спектрофотометрСимадзу, Япония
ВихрьSciLogex
Zeta-сайзер Nano ZNMalvern Panalytical Ltd, Великобритания  Анализатор размера частиц

Ссылки

  1. Zakrzewski, W., Dobrzyński, M., Szymonowicz, M., Rybak, Z. Stem cells: past, present, and future. Stem Cell Res Ther. 10 (1), 68(2019).
  2. Humes, H. D. Stem cells: the next therapeutic frontier. Trans Am Clin Climatol Assoc. 116, discussion 183-164 167-184 (2005).
  3. Sugarman, J. Ethical issues in stem cell research and treatment. Cell Res. 18 (1), S176(2008).
  4. Weiss, M., Troyer, D. Stem cells in the umbilical cord. Stem Cell Rev. 2 (2), 155-162 (2006).
  5. Kim, D., et al. Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells: phenotypic characterization and optimizing their therapeutic potential for clinical applications. Int J Mol Sci. 14 (6), 11692-11712 (2013).
  6. Ellis, H. Anatomy of fetal circulation. Anesth Intensive Care Med. 6 (3), 73(2005).
  7. Cook, H. J. Thomas Wharton's adenographia, first published in London in 1656. Med Hist. 42 (3), 411-412 (1998).
  8. Kamal, M., Kassem, D., Haider, K. H. Handbook of Stem Cell Therapy. , Springer. Singapore. (2022).
  9. Kassem, D. H., Kamal, M. M. Therapeutic efficacy of umbilical cord-derived stem cells for diabetes mellitus: a meta-analysis study. Stem Cell Res Ther. 11 (1), 484(2020).
  10. Nabil, M., Kassem, D. H., Ali, A. A., El-Mesallamy, H. O. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells ameliorate cognitive impairment in Alzheimer's disease rat model: emerging role of SIRT1. BioFactors. 49 (6), 1121-1142 (2023).
  11. Kassem, D. H., Kamal, M. M. Wharton's jelly MSCs: potential weapon to sharpen for our battle against DM. Trends Endocrinol Metab. 31 (4), 271-273 (2020).
  12. Kassem, D. H., Kamal, M. M. Mesenchymal stem cells and their extracellular vesicles: a potential game changer for the COVID-19 crisis. Front Cell Dev Biol. 8, 587866(2020).
  13. Han, Y., et al. Mesenchymal stem cells for regenerative medicine. Cells. 8 (8), 886(2019).
  14. Habib, S. A., Kamal, M. M., El-Maraghy, S. A., Senousy, M. A. Exendin-4 enhances osteogenic differentiation of adipose tissue mesenchymal stem cells through the receptor activator of nuclear factor-kappa B and osteoprotegerin signaling pathway. J Cell Biochem. 123 (5), 906-920 (2022).
  15. Kamal, M. M., Kassem, D. H. Therapeutic potential of Wharton's jelly mesenchymal stem cells for diabetes: achievements and challenges. Front Cell Dev Biol. 8, 16(2020).
  16. Nekanti, U., et al. Long-term expansion and pluripotent marker array analysis of Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells Dev. 19 (1), 117-130 (2009).
  17. Troyer, D., Weiss, M. Concise review: Wharton's jelly-derived cells are a primitive stromal cell population. Stem Cells. 26 (3), 591-599 (2008).
  18. Wang, S., Qu, X., Zhao, R. Clinical applications of mesenchymal stem cells. J Hematol Oncol. 5, 19(2012).
  19. Batsali, A., Kastrinaki, M., Papadaki, H., Pontikoglou, C. Mesenchymal stem cells derived from Wharton's jelly of the umbilical cord: biological properties and emerging clinical applications. Curr Stem Cell Res Ther. 8 (2), 144-155 (2013).
  20. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  21. Kassem, D. H., Habib, S. A., Badr, O. I., Kamal, M. M. Isolation of rat adipose tissue mesenchymal stem cells for differentiation into insulin-producing cells. JoVE. (186), e63348(2022).
  22. Da Silva Meirelles, L., Chagastelles, P., Nardi, N. Mesenchymal stem cells reside in virtually all post-natal organs and tissues. J Cell Sci. 119 (11), 2204-2213 (2006).
  23. Ma, S., et al. Immunobiology of mesenchymal stem cells. Cell Death Differ. 21 (2), 216-225 (2014).
  24. Shetty, P., Cooper, K., Viswanathan, C. Comparison of proliferative and multilineage differentiation potentials of cord matrix, cord blood, and bone marrow mesenchymal stem cells. Asian J Transfus Sci. 4 (1), 14-24 (2010).
  25. El-Demerdash, R. F., Hammad, L. N., Kamal, M. M., Mesallamy, H. O. E. A comparison of Wharton's jelly and cord blood as a source of mesenchymal stem cells for diabetes cell therapy. Regen Med. 10 (7), 841-855 (2015).
  26. Sibov, T. T., et al. Mesenchymal stem cells from umbilical cord blood: parameters for isolation, characterization and adipogenic differentiation. Cytotechnology. 64 (5), 511-521 (2012).
  27. Arutyunyan, I., Elchaninov, A., Makarov, A., Fatkhudinov, T. Umbilical cord as prospective source for mesenchymal stem cell-based therapy. Stem Cells Int. 2016, 6901286(2016).
  28. Knudtzon, S. In vitro growth of granulocytic colonies from circulating cells in human cord blood. Blood. 43 (3), 357(1974).
  29. Fong, C., et al. Human Wharton's jelly stem cells have unique transcriptome profiles compared to human embryonic stem cells and other mesenchymal stem cells. Stem Cell Rev Rep. 7 (1), 1-16 (2011).
  30. El Omar, R., et al. Umbilical cord mesenchymal stem cells: the new gold standard for mesenchymal stem cell based therapies. Tissue Eng Part B Rev. 20, 523-544 (2014).
  31. Hass, R., Kasper, C., Böhm, S., Jacobs, R. Different populations and sources of human mesenchymal stem cells (MSC): a comparison of adult and neonatal tissue-derived MSC. Cell Commun Signal. 9, 12(2011).
  32. La Rocca, G., et al. Isolation and characterization of Oct-4+/HLA-G+ mesenchymal stem cells from human umbilical cord matrix: differentiation potential and detection of new markers. Histochem Cell Biol. 131 (2), 267-282 (2009).
  33. Moffett, A., Loke, Y. The immunological paradox of pregnancy: a reappraisal. Placenta. 25 (1), 1-8 (2003).
  34. Chao, K., Chao, K., Fu, Y., Liu, S. Islet-like clusters derived from mesenchymal stem cells in Wharton's jelly of the human umbilical cord for transplantation to control type 1 diabetes. PLoS One. 3 (1), e1451(2008).
  35. Tsai, P., et al. Transplantation of insulin-producing cells from umbilical cord mesenchymal stem cells for the treatment of streptozotocin-induced diabetic rats. J Biomed Sci. 19, 47(2012).
  36. Chatzistamatiou, T., et al. Optimizing isolation culture and freezing methods to preserve Wharton's jelly's mesenchymal stem cell (MSC) properties: an MSC banking protocol validation for the Hellenic Cord Blood. Transfusion. 54 (12), 3108-3120 (2014).
  37. Newton, W. C., Kim, J. W., Luo, J. Z. Q., Luo, L. Stem cell-derived exosomes: a novel vector for tissue repair and diabetic therapy. J Mol Endocrinol. 59 (4), R155-R165 (2017).
  38. Wei, W., et al. Mesenchymal stem cell-derived exosomes: a promising biological tool in nanomedicine. Front Pharmacol. 11, 590470(2021).
  39. Bjorge, I. M., Kim, S. Y., Mano, J. F., Kalionis, B., Chrzanowski, W. Extracellular vesicles, exosomes and shedding vesicles in regenerative medicine-a new paradigm for tissue repair. Biomater Sci. 6 (1), 60-78 (2018).
  40. Zhang, K., Cheng, K. Stem cell-derived exosome versus stem cell therapy. Nat Rev Bioeng. 1 (9), 608-609 (2023).
  41. Colao, I. L., Corteling, R., Bracewell, D., Wall, I. Manufacturing exosomes: a promising therapeutic platform. Trends Mol Med. 24 (3), 242-256 (2018).
  42. Zheng, W., et al. Identification of scaffold proteins for improved endogenous engineering of extracellular vesicles. Nat Commun. 14 (1), 4734(2023).
  43. Herrmann, I. K., Wood, M. J. A., Fuhrmann, G. Extracellular vesicles as a next-generation drug delivery platform. Nat Nanotechnol. 16 (7), 748-759 (2021).
  44. Cheng, L., Hill, A. F. Therapeutically harnessing extracellular vesicles. Nat Rev Drug Discov. 21 (5), 379-399 (2022).
  45. Krishnamurthy, H., Cram, L. S. Basics of Flow Cytometry. Applications of Flow Cytometry in Stem Cell Research and Tissue Regeneration. , Wiley-Blackwell. (2010).
  46. Kassem, D. H., Kamal, M. M., El-Kholy, A. E. -L. G., El-Mesallamy, H. O. Exendin-4 enhances the differentiation of Wharton's jelly mesenchymal stem cells into insulin-producing cells through activation of various β-cell markers. Stem Cell Res Ther. 7 (1), 108(2016).
  47. Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. 3 (Unit 3.22), (2006).
  48. Xu, Y., et al. Umbilical cord-derived mesenchymal stem cells isolated by a novel explantation technique can differentiate into functional endothelial cells and promote revascularization. Stem Cells Dev. 19 (10), 1511-1522 (2010).
  49. Han, Y. F., et al. Optimization of human umbilical cord mesenchymal stem cell isolation and culture methods. Cytotechnology. 65 (5), 819-827 (2013).
  50. Seshareddy, K., Troyer, D., Weiss, M. Method to isolate mesenchymal-like cells from Wharton's jelly of umbilical cord. Methods Cell Biol. 86, 101-119 (2008).
  51. Hua, J., et al. Comparison of different methods for the isolation of mesenchymal stem cells from umbilical cord matrix: proliferation and multilineage differentiation as compared to mesenchymal stem cells from umbilical cord blood and bone marrow. Cell Biol Int. 38 (2), 198-210 (2013).
  52. Alstrup, T., Eijken, M., Bohn, A. B., Moller, B., Damsgaard, T. E. Isolation of adipose tissue-derived stem cells: enzymatic digestion in combination with mechanical distortion to increase adipose tissue-derived stem cell yield from human aspirated fat. Curr Protoc Stem Cell Biol. 48 (1), e68(2019).
  53. Taghizadeh, R. R., Cetrulo, K. J., Cetrulo, C. L. Collagenase impacts the quantity and quality of native mesenchymal stem/stromal cells derived during processing of umbilical cord tissue. Cell Transplant. 27 (1), 181-193 (2018).
  54. Kassem, D. H., Kamal, M. M., El-Kholy, A. E. -L. G., El-Mesallamy, H. O. Association of expression levels of pluripotency/stem cell markers with the differentiation outcome of Wharton's jelly mesenchymal stem cells into insulin-producing cells. Biochimie. 127, 187-195 (2016).
  55. El-Asfar, R. K., Kamal, M. M., Abd El-Razek, R. S., El-Demerdash, E., El-Mesallamy, H. O. Obestatin can potentially differentiate Wharton's jelly mesenchymal stem cells into insulin-producing cells. Cell Tissue Res. 372 (1), 91-98 (2018).
  56. Börger, V., et al. Mesenchymal stem/stromal cell-derived extracellular vesicles and their potential as novel immunomodulatory therapeutic agents. Int J Mol Sci. 18 (7), 1450(2017).
  57. Matsuzaka, Y., Yashiro, R. Therapeutic strategy of mesenchymal-stem-cell-derived extracellular vesicles as regenerative medicine. Int J Mol Sci. 23 (12), 6480(2022).
  58. Kou, M., et al. Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles for immunomodulation and regeneration: a next generation therapeutic tool. Cell Death Dis. 13 (7), 580(2022).
  59. Huang, L., et al. Research advances of engineered exosomes as drug delivery carrier. ACS Omega. 8 (46), 43374-43387 (2023).
  60. Sun, Y., et al. Mesenchymal stem cells-derived exosomes for drug delivery. Stem Cell Res Ther. 12 (1), 561(2021).
  61. Chopra, N., et al. Biophysical characterization and drug delivery potential of exosomes from human Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells. ACS Omega. 4 (8), 13143-13152 (2019).
  62. Gao, J., et al. Recent developments in isolating methods for exosomes. Front Bioeng Biotechnol. 10, 1100892(2023).
  63. Kamei, N., et al. Comparative study of commercial protocols for high recovery of high-purity mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicle isolation and their efficient labeling with fluorescent dyes. Nanomedicine. 35, 102396(2021).
  64. Peterson, M. F., Otoc, N., Sethi, J. K., Gupta, A., Antes, T. J. Integrated systems for exosome investigation. Methods. 87, 31-45 (2015).
  65. Correll, V. L., et al. Optimization of small extracellular vesicle isolation from expressed prostatic secretions in urine for in-depth proteomic analysis. J Extracell Vesicles. 11 (2), e12184(2022).
  66. Manning, R. R., et al. Analysis of peptides using asymmetrical flow field-flow fractionation (AF4). J Pharm Sci. 110 (12), 3969-3972 (2021).
  67. Yang, Y. K., Ogando, C. R., Wang See, C., Chang, T. Y., Barabino, G. A. Changes in phenotype and differentiation potential of human mesenchymal stem cells aging in vitro. Stem Cell Res Ther. 9 (1), 131(2018).
  68. Zhao, A. G., Shah, K., Freitag, J., Cromer, B., Sumer, H. Differentiation potential of early- and late-passage adipose-derived mesenchymal stem cells cultured under hypoxia and normoxia. Stem Cells Int. 2020, 8898221(2020).
  69. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. J Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  70. Lötvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. J Extracell Vesicles. 3, 26913(2014).
  71. Witwer, K. W., et al. Updating MISEV: evolving the minimal requirements for studies of extracellular vesicles. J Extracell Vesicles. 10 (14), e12182(2021).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Wharton

Эта статья была опубликована

Видео скоро будет доступно

Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.