Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Измерение содержания углерода в макрофагах дыхательных путей, контактирующих с углеродсодержащими твердыми частицами

1.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/66781

⸱

12 июля 2024 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Environmental and Occupational Health, School of Public Health, Qingdao University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

В данной статье описан подробный экспериментальный протокол измерения содержания углерода в макрофагах дыхательных путей с целью оценки дозы внутренней экспозиции на уровне воздействия отдельных твердых частиц.

Аннотация

Легочные макрофаги демонстрируют дозозависимый характер фагоцитирующих частиц. После поглощения эти макрофаги впоследствии выводятся с мокротой, что делает макрофаги и частицы видимыми и поддающимися количественной оценке с помощью световой микроскопии. Примечательно, что элементарный углерод в организме млекопитающих происходит исключительно из внешних загрязнителей. Следовательно, содержание углерода в макрофагах дыхательных путей (CCAM) служит валидным биомаркером воздействия, точно оценивая индивидуальное воздействие углеродсодержащих твердых частиц (PM). В этой статье описан протокол, включающий сбор, сохранение, обработку, подготовку и окрашивание мокроты, а также получение и анализ фотографий макрофагов. После удаления ядер макрофагов была рассчитана доля площади цитоплазмы, занимаемой частицами углерода (PCOC), для количественной оценки содержания углерода в каждом макрофаге. Полученные результаты свидетельствуют о повышении уровня CCAM после воздействия углеродсодержащих ТЧ. Таким образом, этот неинвазивный, точный, надежный и стандартизированный метод позволяет напрямую измерять углеродные частицы в клетках-мишенях и используется для крупномасштабного количественного определения отдельных CCAM с помощью индуцированной мокроты.

Введение

Загрязнение атмосферного воздуха связано со смертностью вследствие респираторных и сердечно-сосудистых заболеваний, представляющих серьезную угрозу для здоровья человека 1,2. Эпидемиологические данные свидетельствуют о том, что хроническое воздействие твердых частиц из окружающей среды диаметром менее 2,5 мкм (PM2,5) является причиной преждевременной смерти от 4 до 9 миллионов человек во всем мире. PM2,5 был признан пятым по значимости фактором риска глобальной смертности в исследовании «Глобальное бремя болезней, травм и факторов риска» (GBD) в 2015 году3,4,5,6. Исследования показали, что соблюдение рекомендаций ВОЗ по загрязнению воздуха может предотвратить 51 213 смертей в год от воздействия PM2,53. В настоящее время в большинстве исследований отсутствует оценка внутрииндивидуального воздействия, и они основаны только на грубых оценках на более крупных региональных участках мониторинга, которые далеки от индивидуальных уровней воздействия. Имеющиеся биомаркеры внутреннего воздействия, такие как ПАУ с мочой и бенз(а)пирен, не отражают связи между воздействием твердых частиц и воздействием на здоровье 7,8,9. Это приводит к невозможности установить точную взаимосвязь с последствиями для здоровья. Таким образом, поиск маркеров, отражающих уровень воздействия твердых частиц на человека, является одним из ключей к точной оценке воздействия на людей.

Частицы, вдыхаемые в бронхи, могут выводиться с мокротой через ресничные колебания в бронхах. Отсутствие реснитчатой системы транспортировки слизистого потока в альвеолах означает, что основной путь выведения частиц, поступающих в альвеолы, лежит через фагоцитоз и транслокацию макрофагами10,11. Исходя из анатомического строения легкого, его выведение из нерастворимых частиц инородных тел происходит медленно. Это позволяет твердым частицам взаимодействовать с клетками легких в течение длительных периодов времени и инициировать различные биологические эффекты, вызывая повреждение легочной ткани и других органов12,13. Стимуляция твердыми частицами приводит к активации макрофагов, запуская каскад воспалительных факторов в легких, которые могут вызвать системную воспалительную реакцию14. Учитывая решающую роль цитофагов макрофагов в возникновении цитокиновых штормов в легких, предполагается, что частицы углерода из макрофагов легких могут отражать биологически эффективную дозувоздействия частиц углерода в воздухе. Кроме того, поскольку в клетках млекопитающих отсутствует агрегация элементарного углерода и углеродсодержащие частицы могут наблюдаться в виде черных твердых частиц под световым микроскопом, сбор альвеолярных и бронхиальных макрофагов и измерение содержания углерода в них может служить маркером для оценки воздействия твердыхчастиц16.

В этом исследовании был определен метод точной оценки уровней воздействия отдельных твердых частиц, известный как содержание углерода в макрофагах дыхательных путей (CCAM). В частности, образцы мокроты были собраны после того, как участники вдохнули гипертонический раствор, полученный ультразвуковым небулайзером. Затем эти образцы были законсервированы с помощью фиксирующего раствора. Макрофаги дыхательных путей были изолированы, окрашены и сфотографированы под световым микроскопом для идентификации макрофагов, содержащих углеродсодержащие частицы, которые затем были количественно определены. Этот метод обеспечивает биологический маркер для точной оценки уровней воздействия отдельных твердых частиц. Он закладывает методологическую основу для изучения взаимосвязи между воздействием твердых частиц и воздействием на здоровье человека, а также служит исследовательской основой для изучения связей между воздействием твердых частиц и последствиями для здоровья, такими как заболевания легких.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Исследование получило одобрение Комитета по медицинской этике Института гигиены труда и токсикологического контроля Китайского центра по контролю и профилактике заболеваний (NIOHP201604) с письменным информированным согласием, полученным от всех субъектов до начала исследования и сбора биологических образцов. Для этого исследования были отобраны упаковщики технического углерода, которые работали на заводе технического углерода более 1 года и подвергались воздействию аэрозолей технического углерода. Рабочие водопроводных сооружений на водопроводном заводе, не подвергавшиеся значительному профессиональному воздействию вредных факторов, были набраны из местного района в качестве контрольной популяции для проведения исследования. Критерии включения и исключения для исследуемой популяции включали прямой контакт с сажей в течение большинства смен и минимум один год работы в зоне воздействия технического углерода. Работники водопроводных сооружений были включены, если они не подвергались профессиональному воздействию технического углерода или других загрязняющих веществ в своей рабочей среде. Критерии исключения охватывали работников с хроническими заболеваниями, такими как рак, тех, кто подвергался рентгеновскому облучению в течение последних трех месяцев, лиц с туберкулезом легких, легочной хирургией, вирусным миокардитом, врожденным пороком сердца, недавней лихорадкой или воспалением, а также работников, которые недавно принимали антибиотики. Реагенты и оборудование, использованные в исследовании, перечислены в Таблице материалов.

1. Сохранение мокроты

  1. Приготовьте фиксирующий раствор, выполнив следующие действия:
    1. Растопить 2% полиэтиленгликоль (PEG1500) на водяной бане. Возьмите 20 мл расплавленного PEG1500 в центрифужную пробирку. Добавьте 20 мл 50% этанола в пробирку центрифуги и тщательно встряхните смесь, чтобы получить маточный раствор.
    2. Постепенно влейте 40 мл маточного раствора в 960 мл 50% этанола. Хорошо встряхните раствор, чтобы образовался фиксирующий раствор Саккомано. Хранят раствор в прохладном, темном месте.
  2. Добавьте 20-30 мл приготовленного фиксирующего раствора в центрифужную пробирку, содержащую примерно 2 мл мокроты. Тщательно перемешайте содержимое.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что общий объем не превышает 40 мл.
  3. Запечатайте трубку центрифуги герметизирующей пленкой. Хранят его в прохладном, темном месте. Транспортируйте пробирку в лабораторию для дальнейшей обработки, когда она будет готова.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда растопите PEG1500 на водяной бане и используйте в соответствии с предписанной дозировкой.

2. Приготовление клеточной суспензии в мокроте

  1. Приготовьте пищеварительный раствор, растворив 0,1 г дитиотреитола в 100 мл физиологического раствора в соответствии с фактической дозировкой. Приготовленный раствор хранить при температуре 4 °C до 48 часов.
  2. Центрифугируйте пробирку, содержащую мокроту, при концентрации 1,998 х г в течение 30 мин при 4°С.
  3. Выбросьте надосадочную жидкость. Добавьте к осадку равный объем переваренной мокроты. Вортсируйте и тщательно встряхните смесь.
    1. Поместите тюбик на водяную баню при температуре 37 °C до полного разжижения (10-15 минут).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Непрерывно встряхивайте трубку во время процесса сжижения.
  4. Отфильтруйте сжиженную смесь с помощью фильтрующей мембраны 70 мкм.
  5. Центрифугируйте отфильтрованный раствор при температуре 500 x g в течение 7 минут при 4 °C.
  6. Откажитесь от надосадочной жидкости, задерживая в клетке осадок.
  7. Ресуспендируйте осадок клеток в фосфатном буфере Дюшенна. Центрифугируйте ресуспендированный раствор при давлении 500 x g в течение 7 мин при 4 °C до получения чистого клеточного осадка.

3. Подготовка мазка из клеток

  1. Добавьте 200-600 мкл фосфатного буфера в осадок клетки. Тщательно перемешайте содержимое; Отрегулируйте объем буфера в зависимости от результатов подсчета ячеек (стремитесь к >1,0 × 105 ячеек).
  2. Возьмите 20 μл клеточной суспензии и сделайте клеточный мазок методом гематокрита17.
  3. Дайте мазку высохнуть на воздухе естественным образом (в течение 48 часов). Закрепите мазок с помощью имеющегося в продаже раствора для окрашивания в течение 10 с.
  4. Погрузите мазок в раствор для окрашивания на 8 с. Во время окрашивания аккуратно поднимайте предметное стекло вверх и вниз, а излишки пятна смывайте проточной водой.
  5. Окрашивайте мазок в раствор для окрашивания В течение 8 с. Поднимите предметное стекло во время окрашивания и смойте излишки пятна под проточной водой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Растворы для окрашивания A и B доступны в коммерчески доступном наборе для окрашивания.
  6. Дважды окуните предметное стекло в безводный этанол, каждый раз на 2-3 с.
  7. После высыхания нанесите соответствующее количество нейтральной камеди. Закройте затвор покровными стеклами.

4. Количественный анализ CCAM

  1. Используйте световой микроскоп со 100-кратным масляным объективом. Получение изображений случайно выбранных, хорошо окрашенных и морфологически интактных макрофагов. Сделайте 50 снимков макрофагов случайным образом для каждого образца.
  2. Выполните анализ изображений в программном обеспечении Image J, выполнив следующие действия:
    1. Измерьте масштаб и определите фактическую длину и преобразование пикселей в пиксели (282 пикселя = 10 мкм). Установите масштаб в Image J (Analyze > Set scale), введите Расстояние в пикселях, фактическую длину, единицу длины (μм) и отметьте галочкой Global.
    2. Используйте неправильную форму, чтобы обвести клетки. Удалите фон (выделение от руки, Редактировать > Очистить снаружи). Измерьте общую площадь ячеек (Анализ > Измерение).
    3. Вырежьте ядро (Edit > Cut). Преобразуйте изображение в оттенках серого в черно-белое (Тип изображения > > 8 бит).
    4. Отрегулируйте значение оттенков серого, специфичное для окрашивания каждой ячейки, для точного подсчета частиц углерода (Изображение > Настройка порога > > Применить, Анализировать >> Измерять).
    5. Рассчитайте содержание углерода в 50 макрофагах в образце на основе измеренной площади и анализа изображений в программном обеспечении Image J.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

В мокроте, законсервированной и обработанной фиксирующим раствором, при морфологическом исследовании под оптическим микроскопом была отмечена неповрежденная морфология макрофагов. Макрофаги представляли собой прозрачные, круглые или почковидные, легко окрашиваемые ядра клеток. После окрашивания ядра клеток стали голубовато-фиолетовыми, в то время как цитоплазма была светло-розовой или светло-голубой. Микроскопическое поле показало минимальное количество примесей, что способствовало легкой идентификации клеток. Внутри яче...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В этом исследовании представлен подробный экспериментальный протокол использования CCAM, полученного из индуцированной мокроты, в качестве биологического маркера внутреннего воздействия атмосферных твердых частиц. CCAM может быть обнаружен и количественно определен с помощью оптической микроскопии, что служит точным биомаркером внутреннего воздействия, отражающим связь с последствиями для здоровья. Таким образом, существует необходимость в создании и оптимизации удобного, надежного и эфф...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Эта работа была финансово поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (82273669, 82241086, 42207488), Программой ученых Тайшань провинции Шаньдун (No tsqn202211121) и Программой инноваций и технологий для выдающихся молодых ученых в области высшего образования провинции Шаньдун (2022KJ295).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
3 мл стерильные соломинкиShanghai YEASEN Biotechnology Co., LTD84202ES03
50 мл центрифужная трубкаThermo Fisher Scientific, США 339652
Абсолютный этиловый спиртSinopharm Group Chemical Reagent Co. LTD64-17-5
Кедровое маслоShanghai McLean Biochemical Technology Co., LTDC805296
Дифференциальное окрашивание растворShanghai YEASEN Biotechnology Co., LTD40748ES76
ДитиотреитолSolebo Bio Co., LTDD8220
Буфер фосфата Дюшенна (DPBS)Thermo Fisher Scientific, США14190144
Камера для микроскопаOlympus Corporation of JapanDP72
Нейтральная древесная камедьSolebo Bio Co., LTDG8590
Нейлоновая фильтрующая мембрана 70 мкмBD Falcon Bioscience, США211755
Оптический микроскопOlympus Corporation of JapanBX60
ПолиэтиленгликольSinopharm Group Chemical Reagent Co. LTD25322-68-3
УльтрацентрифугаThermo Fisher Scientific, СШАSL40R
Вязкое предметное стеклоJiangsu SHitAI EXPERIMENTAL Equipment Co. LTD
188105

Ссылки

  1. Münzel, T., et al. Environmental stressors and cardio-metabolic disease: part I-epidemiologic evidence supporting a role for noise and air pollution and effects of mitigation strategies. Eur Heart J. 38 (8), 550-556 (2017).
  2. Guarnieri, M., et al. Lung function in rural Guatemalan women before and after a chimney stove intervention to reduce wood smoke exposure: results from the randomized exposure study of pollution indoors and respiratory effects and chronic respiratory effects of early childhood exposure to respirable particulate matter study. Chest. 148 (5), 1184-1192 (2015).
  3. Khomenko, S., et al. Premature mortality due to air pollution in European cities: a health impact assessment. Lancet Planet Health. 5 (3), e121-e134 (2021).
  4. Kulkarni, N., Pierse, N., Rushton, L., Grigg, J. Carbon in airway macrophages and lung function in children. N Engl J Med. 355 (1), 21-30 (2006).
  5. Krzyzanowski, M. WHO air quality guidelines for Europe. J Toxicol Environ Health A. 71 (1), 47-50 (2008).
  6. Cohen, A. J., et al. Estimates and 25-year trends of the global burden of disease attributable to ambient air pollution: An analysis of data from the Global Burden of Diseases Study 2015. Lancet. 389 (10082), 1907-1918 (2017).
  7. Hajat, A., et al. The association between long-term air pollution and urinary catecholamines: Evidence from the multi-ethnic study of atherosclerosis. Environ Health Perspect. 127 (5), 57007(2019).
  8. Traffic-related air pollution: A critical review of the literature on emissions, exposure, and health effects. , Available from: https://www.healtheffects.org/publication/traffic-related-air-pollution-critical-review-literature-emissions-exposure-and-health (2010).
  9. Uccelli, R., et al. Female lung cancer mortality and long-term exposure to particulate matter in Italy. Eur J Public Healt.h. 27 (1), 178-183 (2017).
  10. Zhang, L., et al. Indoor particulate matter in urban households: sources, pathways, characteristics, health effects, and exposure mitigation. Int J Environ Res Public Health. 18 (21), 11055(2021).
  11. Wang, K., Zeng, R. Cough and expectoration. Handbook of Clinical Diagnostics. , 27-29 (2020).
  12. Qi, Y., et al. Passage of exogeneous fine particles from the lung into the brain in humans and animals. PNAS. 119 (26), e2117083119(2022).
  13. Comunian, S., Dongo, D., Milani, C., Palestini, P. Air pollution and COVID-19: The role of particulate matter in the spread and increase of COVID-19's morbidity and mortality. Int J Environ Res Public Health. 17 (12), 4487(2020).
  14. Sharma, J., et al. Emerging role of mitochondria in airborne particulate matter-induced immunotoxicity. Environ Pollut. 270, 116242(2021).
  15. Uribe-Querol, E., Rosales, C. Phagocytosis: Our current understanding of a universal biological process. Front Immunol. 11, 1066(2020).
  16. Kupiainen, K., Klimont, Z. Primary emissions of fine carbonaceous particles in Europe. Atmos Environ. 41 (10), 2156-2170 (2007).
  17. Tueller, C., et al. Value of smear and PCR in bronchoalveolar lavage fluid in culture positive pulmonary tuberculosis. Eur Respir J. 26 (5), 767-772 (2005).
  18. Takiguchi, H., et al. Macrophages with reduced expressions of classical M1 and M2 surface markers in human bronchoalveolar lavage fluid exhibit pro-inflammatory gene signatures. Sci Rep. 11 (1), 8282(2021).
  19. Andelid, K., et al. Lung macrophages drive mucus production and steroid-resistant inflammation in chronic bronchitis. Resp Res. 22 (1), 172(2021).
  20. Weiszhar, Z., Horvath, I. Induced sputum analysis: Step by step. Eur Respiratory Soc. 9, 300-306 (2013).
  21. Popov, T., et al. Some technical factors influencing the induction of sputum for cell analysis. Eur Respir J. 8 (4), 559-565 (1995).
  22. Sumner, H., et al. Predictors of objective cough frequency in chronic obstructive pulmonary disease. Am J Respir Crit Care Med. 187 (9), 943-949 (2013).
  23. Brugha, R. E., et al. Carbon in airway macrophages from children with asthma. Thorax. 69 (7), 654-659 (2014).
  24. Simpson, J. L., Timmins, N. L., Fakes, K., Talbot, P. I., Gibson, P. G. Effect of saliva contamination on induced sputum cell counts, IL-8 and eosinophil cationic protein levels. Eur Respir J. 23 (5), 759-762 (2004).
  25. Risse, E. K., Van't Hof, M. A., Laurini, R. N., Vooijs, P. G. Sputum cytology by the Saccomanno method in diagnosing lung malignancy. Diagn Cytopathol. 1 (4), 286-291 (1985).
  26. Eells, T. P., Pratt, D. S., Coppolo, D. P., Alpern, H. D., May, J. J. An improved method of cell recovery following bronchial brushing. Chest. 93 (4), 727-729 (1988).
  27. Bai, Y., et al. Mitochondrial DNA content in blood and carbon load in airway macrophages. A panel study in elderly subjects. Environ Int. 119, 47-53 (2018).
  28. Jary, H., Rylance, J., Patel, L., Gordon, S. B., Mortimer, K. Comparison of methods for the analysis of airway macrophage particulate load from induced sputum, a potential biomarker of air pollution exposure. BMC Pulm Med. 15, 1-9 (2015).
  29. Gilbert, D. F., Meinhof, T., Pepperkok, R., Runz, H. DetecTiff: A novel image analysis routine for high-content screening microscopy. J Biomol Screen. 14 (8), 944-955 (2009).
  30. Dai, Y., et al. Effects of occupational exposure to carbon black on peripheral white blood cell counts and lymphocyte subsets. Environ Mol Mutagen. 57 (8), 615-622 (2016).
  31. Cheng, W., et al. Carbon content in airway macrophages and genomic instability in Chinese carbon black packers. Arch Toxicol. 94 (3), 761-771 (2020).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

воздействие твердых частицсбор мокротыколичественное определение углерода в цитоплазмесветовая микроскопияокрашивание клетоканализ в ImageJиндуцированная мокротаизмерение биомаркеров
Измерение содержания углерода в макрофагах дыхательных путей, контактирующих с углеродсодержащими твердыми частицами
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.