Динамическая многопараметрическая оценка функции тромбоцитов с помощью емкостного биосенсора

Summary

Здесь представлен протокол нового динамического многопараметрического функционального анализа тромбоцитов с использованием емкостного биосенсора. Этот подход, разработанный в полужесткой микросреде для повышения физиологической значимости, обеспечивает три выходных параметра, чувствительных к количеству тромбоцитов, силе стимуляции и путям активации.

Abstract

Тромбоциты играют фундаментальную роль в свертывании крови посредством ряда регулируемых реакций, включая адгезию, распространение, гранулярную секрецию, агрегацию и цитоскелетное сокращение. Однако современные анализы ограничены частичным анализом функции тромбоцитов в нефизиологических условиях. Таким образом, необходим улучшенный анализ, отражающий динамичный и многогранный характер функции тромбоцитов в физиологических условиях. В этом контексте представлен новый подход к измерению нескольких ключевых параметров, связанных с функцией тромбоцитов, в более физиологически значимой полужесткой микросреде ex vivo по сравнению с традиционными анализами. В этом методе используется усовершенствованный электрический биосенсор, мембранный датчик емкости (MCS), который дает уникальную информацию о процессе свертывания крови с помощью трех различных показаний. Эти показания очень чувствительны к изменениям количества тромбоцитов, интенсивности стимуляции и специфических путей активации. Будучи чисто электрической сенсорной платформой, MCS демонстрирует значительный потенциал в качестве диагностического инструмента для выявления первичных нарушений гемостатической функции, оценки эффективности терапевтического лечения и содействия более широкому пониманию роли тромбоцитов в гемостазе и тромбозе.

Introduction

Тромбоциты, специализированные клетки крови, играют ключевую роль в организации гемостатической реакции для остановки кровотечения после травмы и в содействии заживлению кровеносных сосудов¹. Кроме того, они также служат важнейшими медиаторами в тромбозе, который является основной причиной смертности, связанной с тромбоэмболической болезнью, во всем мире 2,3,4,5,6. При повреждении сосудов тромбоциты претерпевают ряд сложных, регулируемых и многоступе....

Protocol

Предложение об исследовании было одобрено Отделом по изучению человека (HSD) Совета по внутреннему обзору Вашингтонского университета (UW-IRB; ID исследования: STUDY00005211). Все добровольцы, участвовавшие в исследовании, предоставили письменное информированное согласие. Подробная информация о реагентах и оборудовании, использованных в этом исследовании, приведена в Таблице материалов.

1. Этапы изготовления мембранного емкостного датчика (MCS)

ПРИМЕЧАНИЕ: Датчик MCS был изготовлен с использованием традиционных методов микропроизводства. Этот биосе....

Results

Данное исследование направлено на проведение динамической оценки функции тромбоцитов. В соответствии с описанным выше протоколом готовили раствор c-PRP и затравливали тромбоциты на электрод с Fn-покрытием в T-MCC. Свободно плавающие тромбоциты вымывали на этапе промывки, и добавляли агонист для активации прикрепленных тромбоцитов. С подробными результатами и их обсуждением можно ознакомиться в нашем предыдущем отчете²⁸.

На рисунке 4A предст.......

Discussion

В этом исследовании впервые был использован новый емкостный метод оценки функции тромбоцитов, который оценивает как адгезию, так и динамику тромбоцитов после активации в одном устройстве, что является первым зарегистрированным случаем такого подхода. Новый экспериментальный протокол представляет собой относительно простую технику противодействия воздействию факторов образования фибрина и свертывания плазмы с помощью процедуры вымывания. Это приводит к измерениям, способным различать разл.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-додеканетиол	Sigma-Aldrich, MO, U.S.A	471364-100ML	1 mM
200-proof этанол	Sigma-Aldrich, MO, U.S.A	EX0276-1
3D-принтер	Shenzhen Creality 3D Technology Co, Ltd.	Ender-3 V3
для 3D-печати	HATCHBOX 3D, КАЛИФОРНИЯ, США	3D PLA-1KG-1.75
Аденозин 5′-дифосфат	Sigma Aldrich, U.S.A	01905-250MG-F	ADP
Аспирин	Сигма-Олдрич, Миссури, США	A2093-100G
Глубокое реактивное ионное травление	Omega Engineering, Inc.	SPTS Rapier DRIE
Диметилсульфоксид	Sigma-Aldrich, MO, U.S.A	D8418-50ML
Системы высоковакуумного осаждения	ДМСО CHA	SEC-600
Человеческий фибронектин	Sigma-Aldrich, Миссури, США	CLS356008-1EA	Fn
KOH	Sigma-Aldrich, Миссури, США	P1767-250G
LCR метр	Keithley Instruments, Inc., Огайо, США	Keithley EL 4980AL
LCR	Signatone Corporation, CA, США	SCA-50-4
	ABM, U.S.A, Inc.	ABM/6/350/NUV/DCCD/SA
Микропозиционеры	Signatone, CA, США игольчатый	S-725
	Signatone Corporation, CA, США	SCAT5T-4	12.5 μ m Радиус
Фосфатный буферный физиологический раствор	Sigma-Aldrich, Миссури, США	P4474-1L	PBS, pH 7,4
Реактивное ионное травление	Plasma-Therm, U.S.A	RIE Vision 320
Кремниевая подложка	Wafer World Inc	SKU# 1766
Стандарт 3,2% цитратных трубок	Tiger Medical, Нью-Джерси, США	Covidien / Cardinal Health 8881340478 Monoject
Thrombin	Enzyme Research Laboratories, U.S.A	HT 1002a
Ticagrelor	Sigma-Aldrich, MO, U.S.A	PHR2788-400MG
Tyrode' s буфер	Boston Bioproducts, США УФ-фоторезист	BSS-375
	AZ электронные материалы, Северная Каролина, США	AZ 9260	15 мкм