Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Построение ортотопической ксенотрансплантатной модели немелкоклеточного рака легкого, имитирующей прогрессирование заболевания и предсказывающей активность лекарственных препаратов

2.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/66787

⸱

10 мая 2024 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Thomas J. Long School of Pharmacy, University of the Pacific

В этой статье

Краткое содержание

В данном исследовании представлена модель ортотопического немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ), основанная на внутрилегочной инокуляции многоклеточных сфероидов флуоресцентных клеток A549-iRFP. Модель повторяет клинические стадии НМРЛ и реагирует на цисплатин в соответствии с динамическим мониторингом длинноволновой флуоресценции in vivo.

Аннотация

Немелкоклеточный рак легкого (НМРЛ) является высоколетальным заболеванием со сложным и неоднородным опухолевым микроокружением. В настоящее время распространенные животные модели, основанные на подкожном посеве суспензий раковых клеток, не повторяют микроокружение опухоли при НМРЛ. В данной работе мы описываем мышиную модель ксенотрансплантата ортотопического рака легкого, в которой используется внутрилегочная инокуляция трехмерных многоклеточных сфероидов (MCS). В частности, флуоресцентные клетки НМРЛ человека (A549-iRFP) культивировали в 96-луночных микропланшетах с низким уровнем прикрепления с коллагеном в течение 3 недель для формирования MCS, которые затем были инокулированы межреберно в левое легкое атимических голых мышей для создания модели ортотопического рака легких.

По сравнению с оригинальной клеточной линией A549, MCS клеточной линии A549-iRFP сходно реагировали на противоопухолевые препараты. Длинноволновый флуоресцентный сигнал клеток A549-iRFP сильно коррелировал с общими маркерами роста раковых клеток, включая объем сфероида, жизнеспособность клеток и уровень клеточных белков, что позволяет осуществлять динамический мониторинг роста рака in vivo с помощью флуоресцентной визуализации. После инокуляции мышам ксенотрансплантат A549-iRFP MCS достоверно прогрессировал через фазы, близко напоминающие клинические стадии НМРЛ, включая расширение первичной опухоли, возникновение соседних вторичных опухолей и метастазы раковых клеток в контралатеральное правое легкое и отдаленные органы. Кроме того, модель реагировала на эталонный препарат против рака легких, цисплатин, с ожидаемой токсичностью и более медленным прогрессированием рака. Таким образом, эта мышиная ортотопическая модель ксенотрансплантата НМРЛ послужит платформой для повторения прогрессирования заболевания и будет способствовать разработке потенциальных противоопухолевых препаратов.

Введение

Среди всех онкологических заболеваний рак легких не только наносит наибольшую смертность, но и занимает второе место по количеству новых пациентов каждый годв США. Это разрушительное злокачественное новообразование является основным препятствием в современном здравоохранении, призывая к более глубокому пониманию его сложной биологии и более эффективным терапевтическим методам2. Немелкоклеточный рак легкого (НМРЛ) составляет 85% случаев рака легких и имеет тенденцию развиваться в солидные опухоли3. Одной из основных проблем при раке легких является динамическое и гетерогенное микроокружение опухоли, которое оказывает глубокое влияние на прогрессирование рака и реакцию на терапевтические вмешательства 4,5,6. Более глубокое понимание взаимодействия между раковыми клетками и их микроокружением на разных стадиях НМРЛ требует уточнения патологических моделей, которые повторяют гистологические особенности прогрессирования НМРЛ.

В связи с этим ортотопические модели животных становятся перспективным направлением для исследований НМРЛ. В отличие от широко используемых моделей подкожного ксенотрансплантата7, ортотопические модели включают раковые клетки, которые непосредственно инокулируются в орган происхождения. Для рака легких это означает имплантацию раковых клеток непосредственно в легочную ткань 8,9. Следовательно, ортотопические модели рака легкого лучше имитируют нативное микроокружение опухоли, включая соседние ткани, сосуды и иммунные компоненты, тем самым повышая их физиологическую и клиническую значимость.

Трехмерные многоклеточные сфероиды (МКС) представляют собой еще один многообещающий подход к повторению особенностей опухолевой среды. Большинство видов рака характеризуются сложным опухолевым микроокружением, включая различные межклеточные взаимодействия, внеклеточный матрикс и градиенты кислорода и питательных веществ. Традиционным культурам двумерных клеток не хватает пространственной и структурной сложности, чтобы повторить эти специфические для опухоли особенности12. Напротив, МКС соответствующего размера имеют гетерогенную структуру с гипоксическим и некротическим ядром, которое повторяет не только внутриопухолевое микроокружение, но и физиологический барьер против проникновения лекарств, что является основным механизмом лекарственной устойчивости в противоопухолевой терапии 13,14,15.

Используя преимущества как ортотопических животных моделей, так и методов культивирования MCS, MCS были привиты мышам с ослабленным иммунитетом для успешного построения ортотопических моделей рака молочной железы и рака предстательной железы16,17. В данной статье мы подробно описываем методологию построения и характеристики мышиной ортотопической модели ксенотрансплантата рака легкого. В этом методе используется внутрилегочная инокуляция 3D MCS, полученного из флуоресцентных клеток рака легких человека (A549-iRFP)18. Эта модель предоставляет исключительную возможность наблюдать за прогрессированием рака легких in vivo по стадиям, которые тесно параллельны четырем клиническим стадиям НМРЛ. Кроме того, ксенотрансплантат этой модели реагировал на клинически установленный препарат против рака легких, цисплатин.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Исследование на животных было проведено с одобрения Институционального комитета по уходу за животными и их использованию (IACUC) при Тихоокеанском университете (Протоколы для животных 19R10 и 22R10). Для настоящего исследования были использованы восемь самцов атимических голых мышей в возрасте 5-6 недель весом 20-25 г, выведенных с использованием указанной диеты грызунов и содержащихся в условиях, свободных от патогенов (SPF). Клетки, подстилка и питьевая вода были автоклавными и регулярно менялись. Схема инокуляции опухоли у мышей показана на рисунке 1. Подробные сведения обо всех материалах и инструментах, используемых в этом протоколе, см. в Таблице материалов .

1. Создание трехмерной MCS ячеек A549-iRFP

  1. Инкубировать клетки A549-iRFP (аденокарцинома легкого человека) в увлажненной атмосфере с 5%CO2 при 37 °C и выращивать их в полной питательной среде DMEM, содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки, 1% пенициллин-стрептомицина и 1 мкг/мл пуромицина.
  2. Засейте клетки A549-iRFP в 96-луночный сфероидный микропланшет со сверхнизким присоединением с круглым дном и плотностью посева 4 000 клеток/лунку, используя 100 мкл полной питательной среды с добавлением 0,3% коллагена.
  3. Центрифугируйте микропланшеты при 300 × г в течение 7 мин при 4 °C, чтобы облегчить образование MCS. Изучите морфологию MCS под микроскопом, чтобы убедиться в агрегации клеток после центрифугирования.
  4. Через 48 ч добавьте 100 мкл полной питательной среды в каждую лунку, чтобы достичь общего объема 200 мкл питательной среды на лунку.
  5. Заменяйте 100 μл питательной среды в каждой лунке свежей полной питательной средой через день.

2. Определение характеристик A549-iRFP MCS

  1. Наблюдайте и визуализируйте морфологию MCS с помощью микроскопа и оценивайте объем MCS путем моделирования с помощью программного обеспечения MATLAB на основе изображений фазово-контрастного микроскопа.
    1. Откройте один образ MCS в программе ImageJ.
    2. Используйте выбор от руки, чтобы выбрать край MCS и добавить его в ROI Manager.
    3. Нажмите Редактировать | Выбор | Создайте маску.
    4. Нажмите Редактировать | Инвертировать.
    5. Нажмите «Файл» | Сохранить как | Тифф.
    6. Откройте программу ReViSP.
    7. Откройте сохраненное изображение в формате TIFF, нажав кнопку «Обзор».
    8. Нажмите кнопку «Пуск », чтобы завершить моделирование MCS.
  2. Измерьте флуоресцентный сигнал iRFP с помощью инфракрасной системы визуализации на канале 700 нм и количественно оцените флуоресцентный сигнал с помощью программного обеспечения (например, Image Studio).
    1. Откройте программу Image Studio.
    2. На вкладке Каналы выберите 700 и Интенсивность = 5.
    3. На вкладке Элементы управления сканированием выберите 84 μм, Средний, 0,0 мм и Отразить изображение. Все остальное оставьте по умолчанию.
    4. Нажмите «Пуск», чтобы начать сканирование.
  3. Оцените и количественно оцените жизнеспособность клеток с помощью 3D-анализа жизнеспособности клеток в соответствии с протоколом поставщика.
  4. Оцените и количественно оцените клеточный белок с помощью анализа BCA в соответствии с протоколом поставщика.

3. Отбор MCS для посева опухоли

ПРИМЕЧАНИЕ: После того, как MCS засеяны в сфероидные микропланшеты и выращены в течение 2-3 недель с регулярной заменой питательной среды, выберите MCS со следующими подходящими характеристиками для инокуляции опухоли.

  1. Рассмотрите морфологию МКС под микроскопом и выберите МКС круглой формы с общими ровными краями, но с 5-10 шероховатыми окулировками (стрелки на рисунке 2F) и диаметром в пределах 700-800 мкм.
  2. Измерьте флуоресценцию iRFP (см. шаг 2.2) и выберите MCS, флуоресцентные сигналы которой находятся в пределах одного стандартного отклонения от среднего значения.

4. Внутрилегочная инокуляция MCS

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте спрей с 70% изопропиловым спиртом для очистки хирургической станции и инструментов перед обращением с животными.

  1. Обезболивайте каждую мышь инъекцией 80 мг/кг кетамина и 12 мг/кг ксилазина; Зажмите ножки мыши щипцами, чтобы обеспечить полноценную анестезию.
  2. Введите 10 мкл бупренорфина гидрохлорида (0,3 мг/мл) подкожно, чтобы уменьшить боль.
  3. Нанесите офтальмологическую мазь на глаза, чтобы предотвратить сухость.
  4. Поместите мышь в спинную позу и зафиксируйте конечности в растягивающем положении с помощью лент.
  5. Простерилизуйте кожу спины йодными и спиртовыми палочками-тампонами.
  6. Сделайте разрез 0,5-1 см хирургическими ножницами с левой задней стороны (рисунок 1Б). Осторожно используйте щипцы для разделения мышечной и жировой тканей до тех пор, пока не станут видны стенки грудной клетки и движения легких.
  7. С помощью пипетки перенесите одну выбранную MCS с микропланшета в стеклянную чашку Петри, содержащую ледяной PBS.
  8. Прикрепите иглу 20 г к стеклянному шприцу объемом 100 мкл, предварительно охладите их на льду и наберите 20 мкл предварительно охлажденной смеси PBS и Matrigel (1:1 v/v).
  9. С помощью шприца необходимо быстро отсасывать один МСС из чашки Петри в минимальном объеме смеси ПБС-Матригель, удерживая МСС в металлической части иглы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Крепко держите шприц и поршень, чтобы предотвратить выскальзывание MCS из иглы.
  10. Осторожно введите иглу вертикально между двумя реберными костями на глубину ~3 мм и медленно введите всю смесь PBS и Matrigel объемом 20 μL, содержащую MCS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте чрезмерного усилия во время введения, чтобы предотвратить повреждение легких, сосудистой системы или сердца.
  11. Осторожно извлеките иглу и нанесите на рану тройную мазь с антибиотиком.
  12. Заклейте разрез хирургическими зажимами, которые должны быть удалены через 2 недели.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не накладывайте швы на разрез, так как линии швов могут мешать проведению флуоресцентной визуализации. Голые мыши способны к естественному заживлению после операции.
  13. Поместите животное на инфракрасную грелку и накройте ее лабораторными салфетками для поддержания температуры тела. Наблюдайте за животным не менее 30-60 минут, пока оно не проснется и не начнет правильно двигаться.
  14. Вводите 10 мкл бупренорфина гидрохлорида (0,3 мг/мл) подкожно 3 раза в день в течение первых 48 ч для уменьшения боли.

5. Послеоперационный мониторинг

  1. Измеряйте массу тела каждые 3-4 дня.
  2. Измеряйте флуоресцентный сигнал iRFP от опухолевого ксенотрансплантата каждые 3-4 дня на системе визуализации мелких животных с длиной волны 700 нм в четырех положениях: левой, правой, дорсальной и вентральной, в то время как мышей держали под наркозом путем ингаляции изофлурана (скорость потока: 1,5-2 л/мин кислорода, содержащего 1,5% изофлурана) в течение 2-3 минут.
  3. Количественно оцените чистую флуоресцентную интенсивность рака ксенотрансплантата in vivo с помощью программного обеспечения (например, Image Studio).
    1. Используйте фиксированный прямоугольник (A1, 200 x 125 пикселей) в качестве окна выборки для области груди мышей.
    2. Используйте функцию свободной руки , чтобы обвести форму мышей в прямоугольнике (A1) и измерьте интенсивность флуоресценции (F1) в области A1.
    3. Используйте другой прямоугольник меньшего размера (A2, 25 x 40 пикселей) для измерения флуоресценции фона (F2) мышей в области бедра.
    4. Используйте уравнение (1) для вычисления чистой флуоресцентной интенсивности рака ксенотрансплантата у каждой мыши:
      figure-protocol-1(1)

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Определение характеристик A549-iRFP MCS
A549-iRFP MCS были успешно культивированы в сфероидных микропланшетах с помощью коллагена и центрифугирования. Когда MCS достигал диаметра примерно 500 мкм через 1 неделю, A549 и A549-iRFP MCS подвергали воздействию различных противоопухолевых препаратов и составов в течение 3 дней, а затем поддерживали в немедикаментозной питательной среде в течение 4 дополнительных дней. Паттерн ответа A549-iRFP MCS продемонстрировал паттерн реакции, близко отражающий паттерн ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Создание A549-iRFP MCS является простой и легко воспроизводимой лабораторной процедурой и может быть переведено на формирование MCS для нескольких клеточных линий. MCS, полученный с помощью центрифугирования и коллагена, демонстрирует более цельную и солидную опухолевидную структуру в течение 3-4 дней. Этот метод обеспечивает образование крепких сфероидов, которые сохраняют свою целостную структуру в течение длительных периодов времени, обычно 2-3 недели или даже дольше, пока не начнут появляться небольшие бутонизации. И...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, о котором можно было бы заявить.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантами SAAG и SEED от Тихоокеанского университета. Мы благодарим доктора Уильяма Чана за предоставление доступа к системе инфракрасной визуализации Odyssey Infrared Imaging 205 и доктора Джона Ливси за предоставление доступа к планшетному считывателю SpectraMax iD3. Мы благодарим доктора Мелани Фелмли за технические советы по протоколам работы с животными.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
100 &микро; L Стеклянный шприцHamiltonPart/REF #80601
20 G ИглаThermo Fisher Scientific Inc.14 826D
96-луночный сфероидный микропланшет со сверхнизким уровнем крепления Corning15-100-173
A549-iRFPImanis Life Sciences CL082-STAN
AIN-93M Рацион для зрелых грызунов Исследовательские диеты, Инк.
Атимическая обнаженная мышьCharles River Laboratories, Inc.Код штамма: 490; гомозиготный
BCAPierce23227
Бупренорфина гидрохлоридPatterson VeterinaryNDC Номер: 42023-179-05
CellTiter-Glo 3D Анализ жизнеспособности клетокPromegaG9683
CollagenGibcoA1064401 
DMEMCorningMT10013CV
Фетальная бычья сыворотка (FBS)Cytiva HyCloneSH3039603
ImageJИнструмент с открытым исходным кодом (https://imagej.net/ij/)N/A
Image Studio LI-CORВерсия 5.2
ИзофлуранПаттерсона ВетеринарныйNDC Номер: 17033-0091-25
КетаминПаттерсон ВетеринарныйNDC Номер: 50989-0161-06
Микроскоп KeyenceНомер модели: BZ-X710
MatrigelCorningCB-40234
Odyssey Infrared Imaging 205 System LI-CORНомер модели: 9140
PBSСистема
Pearl Trilogy LI-CORНомер модели: 9430
Пенициллин-стрептомицин CorningMT30002CI
PuromycinThermo Fisher Scientific Inc.
программное обеспечение ReViSP от MATLAB Инструмент с открытым исходным кодом на Sourceforge (https://sourceforge.net/projects/revisp/)N/A
Surgical Clips - AutoClip SystemFine Science Tools12020-00
XylazinePatterson VeterinaryNDC Номер: 61133-6017-01
D10012M визуализации мелких животных Corning MT21040CV AAJ67236XF

Ссылки

  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics. CA Cancer J Clin. 70 (1), 7-30 (2020).
  2. Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: Globocan estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 68 (6), 394-424 (2018).
  3. Travis, W. D., Brambilla, E., Riely, G. J. New pathologic classification of lung cancer: Relevance for clinical practice and clinical trials. J Clin Oncol. 31 (8), 992-1001 (2013).
  4. Ducote, T. J., et al. Using artificial intelligence to identify tumor microenvironment heterogeneity in non-small cell lung cancers. Lab Invest. 103 (8), 100176(2023).
  5. Lim, Z. F., Ma, P. C. Emerging insights of tumor heterogeneity and drug resistance mechanisms in lung cancer targeted therapy. J Hematol Oncol. 12 (1), 134(2019).
  6. Wang, D. C., Wang, W., Zhu, B., Wang, X. Lung cancer heterogeneity and new strategies for drug therapy. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 58, 531-546 (2018).
  7. Peterson, J. K., Houghton, P. J. Integrating pharmacology and in vivo cancer models in preclinical and clinical drug development. Eur J Cancer. 40 (6), 837-844 (2004).
  8. Madero-Visbal, R. A., et al. Bioluminescence imaging correlates with tumor progression in an orthotopic mouse model of lung cancer. Surg Oncol. 21 (1), 23-29 (2012).
  9. Mclemore, T. L., et al. Novel intrapulmonary model for orthotopic propagation of human lung cancers in athymic nude mice. Cancer Res. 47 (19), 5132-5140 (1987).
  10. Zanoni, M., et al. 3d tumor spheroid models for in vitro therapeutic screening: A systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained. Sci Rep. 6, 19103(2016).
  11. Kim, J. B. Three-dimensional tissue culture models in cancer biology. Semin Cancer Biol. 15 (5), 365-377 (2005).
  12. Chaicharoenaudomrung, N., Kunhorm, P., Noisa, P. Three-dimensional cell culture systems as an in vitro platform for cancer and stem cell modeling. World J Stem Cells. 11 (12), 1065-1083 (2019).
  13. Mehta, G., Hsiao, A. Y., Ingram, M., Luker, G. D., Takayama, S. Opportunities and challenges for use of tumor spheroids as models to test drug delivery and efficacy. J Control Release. 164 (2), 192-204 (2012).
  14. Huang, B. W., Gao, J. Q. Application of 3d cultured multicellular spheroid tumor models in tumor-targeted drug delivery system research. J Control Release. 270, 246-259 (2018).
  15. Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again. J Biotechnol. 148 (1), 3-15 (2010).
  16. Sethi, P., et al. 3d tumor tissue analogs and their orthotopic implants for understanding tumor-targeting of microenvironment-responsive nanosized chemotherapy and radiation. Nanomedicine. 11 (8), 2013-2023 (2015).
  17. Valta, M. P., et al. Spheroid culture of lucap 136 patient-derived xenograft enables versatile preclinical models of prostate cancer. Clin Exp Metastasis. 33 (4), 325-337 (2016).
  18. Huang, Y., et al. Intrapulmonary inoculation of multicellular spheroids to construct an orthotopic lung cancer xenograft model that mimics four clinical stages of non-small cell lung cancer. J Pharmacol Toxicol Methods. , 10.1016/j.vascn.2020.106885 106885(2020).
  19. Lemjabbar-Alaoui, H., Hassan, O. U., Yang, Y. W., Buchanan, P. Lung cancer: Biology and treatment options. Biochim Biophys Acta. 1856 (2), 189-210 (2015).
  20. Detterbeck, F. C., Boffa, D. J., Kim, A. W., Tanoue, L. T. The eighth edition lung cancer stage classification. Chest. 151 (1), 193-203 (2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Многоклеточные сфероидыопухолевое микроокружениевнутрилегочная инокуляцияфлуоресцентная визуализацияклетки A549-iRFPпрогнозирование ответа на препаратмониторинг прогрессирования опухолитехника хирургических операций на животных
Построение ортотопической ксенотрансплантатной модели немелкоклеточного рака легкого, имитирующей прогрессирование заболевания и предсказывающей активность лекарственных препаратов
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.