Визуализация и количественная оценка сосудистой сети печени мышей с помощью сверхбыстрого ультразвукового допплерографа

Краткое содержание

Сверхбыстрый допплеровский ультразвук (НФУС) с высоким пространственным разрешением (100 мкм) и чувствительностью представляет собой подходящий неинвазивный метод визуализации для получения всестороннего качественного обзора сосудистой сети печени. UFUS также облегчает количественные измерения микроциркуляторного русла, стремясь улучшить наше понимание механизмов сосудистых заболеваний.

Аннотация

Неинвазивная визуализация сосудистой сети in vivo является мощным инструментом для изучения механизмов заболевания у грызунов. Для достижения высокочувствительной визуализации микроциркуляторного русла с помощью ультразвуковой допплерографии предпочтение отдается методам визуализации, использующим концепцию сверхбыстрой визуализации. Увеличивая частоту кадров ультразвукового сканера до тысяч кадров в секунду, становится возможным повысить чувствительность кровотока до 2 мм/с и получить функциональную информацию о микроциркуляции по сравнению с чувствительностью около 1 см/с в обычных допплеровских режимах. В то время как сверхбыстрая ультразвуковая допплерография (НФУС) получила широкое распространение в нейробиологии, где она может фиксировать активность мозга через нейроваскулярное взаимодействие, она представляет большие проблемы при визуализации сосудистой сети органов брюшной полости из-за более крупных движений, связанных с дыханием. Печень, анатомически расположенная под диафрагмой, особенно восприимчива к внеплоскостным движениям и колебательным дыхательным движениям. Эти артефакты не только негативно влияют на допплеровскую визуализацию, но и усложняют анатомический анализ сосудистых структур и расчет сосудистых параметров. Здесь мы представляем качественный и количественный визуальный анализ сосудистой сети печени у мышей с помощью НФУС. Мы идентифицируем основные анатомические сосудистые структуры и предоставляем графические иллюстрации макроскопической анатомии печени, сравнивая ее с углубленной анатомической оценкой сосудистой сети печени на основе допплеровских показаний. Кроме того, мы разработали протокол количественной оценки для надежных измерений объема печеночной крови микроциркуляторного русла с течением времени. Чтобы предусмотреть дальнейшие исследования, качественный сосудистый анализ дает всесторонний обзор и предлагает стандартизированную терминологию для исследователей, работающих с мышиными моделями заболеваний печени. Кроме того, он дает возможность применять ультразвук в качестве неинвазивного дополнительного метода для осмотра сосудистых дефектов печени in vivo и измерения функциональных микрососудистых изменений глубоко внутри органа перед раскрытием аномалий кровеносных сосудов на микронном уровне с помощью окрашивания ex vivo на срезах тканей.

Введение

Доклинические модели на мышах широко используются для изучения возникновения и прогрессирования микрососудистых заболеваний печени ^1,2. Продольное наблюдение является преимуществом, так как изменения капилляров крови происходят на ранней стадии заболевания, прежде чем появятся воспаления и фиброз, которые со временем могут привести к циррозу печени¹. Для изучения прогрессирования заболевания необходимы мощные инструменты визуализации, позволяющие визуализировать и измерять функцию кровеносных сосудов in vivo. Сверхбыстрый ультразвуковой допплеровский аппарат (НФУС) представляет собой подходящий метод из-за его низкой стоимости, портативности, простоты и возможности работы в режиме реального времени, а также потому, что это неинвазивная^и экономящая время процедура. По сравнению с обычным допплеровским ультразвуком, который может достигать аналогичного пространственного разрешения, но ограничен большим кровотоком, НФУС позволяет обнаружить медленный кровоток до 2 мм/с со скоростью 1 см/с, что позволяет зондировать вклад гораздо более мелких сосудов⁴. UFUS улучшает чувствительность, что достигается за счет передачи плоских волн с большим полем зрения в одной инсонификации для увеличения частоты кадров и, следовательно, количества доступных ультразвуковых изображений⁵. Большое количество временных образцов улучшает подавление сигнала, поступающего из ткани, и улучшает обнаружение эхо-сигналов, отраженных от рассеивателей крови, повышая чувствительность без необходимости использования^{контрастных веществ}. Оценивая энергию эха кроворассеивателя с помощью допплеровской оценки мощности, мы получаем величину, пропорциональную объему крови в каждом пикселе, даже если кровеносные сосуды слишком малы, чтобы их можно было разглядеть на рисунке⁷.

UFUS предлагает благоприятное сочетание пространственного и временного разрешения, что делает его подходящим инструментом для качественной оценки сосудистой архитектуры печени. В то время как работа с ультразвуковым сканером относительно проста, требуется всестороннее понимание анатомии печени для навигации по печеночной сосудистой сети различных долей печени у мышей. В последних исследованиях основное внимание уделялось описанию анатомии печени мышей и сосудистого дерева печени с помощью микрокомпьютерной 3D-томографии (μ-КТ)^8,9. Несмотря на^{то, что} некоторые морфологические различия между печенью человека и мыши хорошо задокументированы, исследования, проводимые на грызунах, часто используют анатомическую терминологию, относящуюся к человеку, что приводит к некоторой путанице в контексте четвероногих животных. Даже признанная стандартизированная номенклатура, такая как Nomina Anatomica Veterinaria (NVA), не имеет достаточной информации о согласованной терминологии для^{сосудистых структур печени} грызунов. Помимо проблемы плохо документированных анатомических структур у грызунов, еще большие трудности возникают при интерпретации ультразвуковых показаний, особенно когда предполагается воспроизводимый подход.

Получение неинвазивной функциональной информации о живых органах в различных пространственных масштабах представляет собой проблему для визуализации in vivo ³. Высококлассные методы визуализации печени, такие как КТ, магнитно-резонансная томография и ангиография (МРТ/МРА) или традиционная допплерография с использованием сфокусированных волн, имеют важное значение для оценки прогрессирования заболевания, но они не могут охватить большую часть динамики кровотока, за исключением фотоакустической визуализации 12,13,14. НФУС обладает высокой чувствительностью и позволяет обнаруживать медленный кровоток в мелких сосудах, который не ограничивается потоком больше сантиметра в секунду ^4,15. Недавно мы разработали индивидуальный метод визуализации, основанный на анатомических соображениях с использованием UFUS, что позволяет надежно измерять объем печеночной крови в мышиной модели с расширением сосудов¹⁶.

В этом протоколе мы описываем процедуру неинвазивной НФУС визуализации печени с использованием коммерчески доступной ультразвуковой платформы, первоначально разработанной для функциональной визуализации мозга. Чтобы оптимизировать процесс и улучшить поиск информации, мы предлагаем комплексную иллюстрацию печени мыши с анатомической номенклатурой и полным методом анализа. Кроме того, мы предоставляем подробное представление полученных показаний изображений в качестве эталона с указанием общих анатомических структур и ориентиров, чтобы помочь оператору выбрать плоскость, зависящую от оператора. Кроме того, мы включили соответствующую иллюстрацию как качественного, так и количественного анализа сосудистой сети печени.

Протокол

Все эксперименты на животных проводились в соответствии с европейским законодательством (Директива 2010/63/ЕС) и директивами правительства Нидерландов и одобрены Комитетом по этике животных Медицинского центра Лейденского университета.

1. Подготовка мыши к визуализации НФУС (время ~ 10 мин)

1. Подготовка к установке визуализации
   1. Центрифуга для ультразвуковой пропускания гель в пробирках объемом 50 мл при давлении 100 x g в течение 3-5 минут для предотвращения образования пузырьков воздуха.
   2. Включите грелку и прогрейте до 35 °C. Наполните напечатанный на 3D-принтере резервуар для воды деионизированной водой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пузырьки воды или мелкие частицы, присутствующие в воде, могут нарушить доплеровское измерение.
2. Обезболивание животного
   1. Взвесьте животное. Использовались самцы и самки в возрасте 8-16 недель с массой тела 19-32 г. Приготовьте смесь для анестезии из кетамина с дозой введения 100 мг/кг и ксилазина 10 мг/кг в 0,9% NaCl. Готовьте смесь стерильной и свежей каждый день, потому что смесь не стабильна и может потерять потенцию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Предпочтительная масса тела животного составляет от 23 до 30 г.
   2. Продезинфицируйте место инъекции, т.е. нижний правый или левый квадрант брюшной полости, используя марлю и 70% этанол. Введите 10 мкл/г массы тела внутрибрюшинно (ip) с помощью иглы 27G и одноразового шприца объемом 1 мл или инсулинового шприца 30G.
   3. Поместите животное обратно в клетку на грелку, не закрывая крышку клетки. Запустить таймер.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Глубокая анестезия должна длиться около 40 минут. Если требуется более длительный сеанс визуализации, рассмотрите возможность использования обратимой анестезии, такой как смеси кетамина 60 мг/кг и медетомидина 0,4 мг/кг в 0,9% NaCl с последующей реверсивной инъекцией подкожного введения атипамезола 1 мг/кг. Инъекционная анестезия предпочтительнее ингаляционной анестезии из-за установки визуализации.
   4. Проверьте эффективность анестезии. Подтвердите, работает ли анестезия, осторожно ущипнув задние лапы примерно через 5 минут. Если животное все же реагирует, подождите еще 2-3 минуты для достижения полного наркоза.
   5. Применяйте офтальмологическую мазь для предотвращения высыхания роговицы и травмирования глаз, когда животное находится в глубоком сне. Проверьте рефлексы еще раз и приступайте к процедуре только тогда, когда животное не проявляет реакции на щипки.
3. Подготовка области визуализации (Рисунок 1)
   1. Аккуратно обрежьте живот животного с помощью триммера от ветеринара, пока он находится на грелке. Выполняйте обрезку очень аккуратно, не накладывая компрессию на грудь или живот.
   2. Нанесите крем для депиляции не более чем на 2 минуты.
      ВНИМАНИЕ: Не продлевайте время инкубации крема для депиляции, так как это может вызвать воспаление кожи. Это не только влияет на качество изображения, но и может вызвать дискомфорт у животного.
   3. Удалите крем для депиляции с помощью бумажных салфеток и аккуратно промойте теплой водой.
4. Расположите животное и установку визуализации для доплеровских измерений (рис. 2A).
   1. Расположите животное дорсально на грелке и аккуратно закрепите лапы с помощью скотча. Увлажните кожу небольшим количеством теплой воды.
   2. Нанесите центрифугированный гель для пропускания ультразвука непосредственно на выбритую кожу с помощью шприца объемом 20 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пузырьки воздуха могут влиять на допплеровскую визуализацию и вызывать артефакты.
   3. Поместите напечатанный на 3D-принтере резервуар для воды, наполненный водой, над животным. Убедитесь, что высота резервуара для воды подходит для животного, примерно на 1 мм выше него, и не сдавливает животное.
   4. Проверьте наличие воздуха между фильтрующим гелем для ультразвука и полиметилпентеновым термопластиком (PMP) резервуара для воды.

2. Работа датчика и выбор плоскости (Время ~ 10 мин)

1. Запустите программное обеспечение и создайте экспериментальный сеанс в системе. Запустите программу сканирования.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение для сканирования интегрировано в систему.
2. Центрируйте двигатели, нажав « Да » во всплывающем окне. Моторизованная система используется для дистанционного управления датчиком с помощью программного обеспечения для сканирования. Центрируя двигатели, зонд будет автоматически перемещаться в трех направлениях, то есть вертикально, вбок и вращаться. Следите за тем, чтобы никакие предметы не препятствовали траектории движения щупа, чтобы не повредить оборудование.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Крайне важно отцентрировать двигатели; Невыполнение этого требования может привести к дисфункции программного обеспечения.
3. Создайте новый экспериментальный сеанс, выбрав в меню пункт Сеанс . Заполните необходимую информацию на панели сеанса, включая проект, тему, сессию, имя пользователя, комментарий и тег. Нажмите кнопку Проверить.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Сеанс необходимо создать перед получением или сохранением данных изображения. Информация о сеансе может быть изменена во время эксперимента, но помните, что это также приведет к изменению места назначения для сохранения данных.
4. Установите щуп. Линейный ультразвуковой датчик 15 МГц со 128 элементами подключен к системе через моторизованную систему, состоящую из четырехосевого моторного модуля, то есть трех поступательных и одного вращательного направления движения.
   1. Перейдите в меню «Переместить зонд» и используйте управляемую компьютером систему позиционирования, чтобы переместить зонд в воду в резервуаре для воды, напечатанном на 3D-принтере. Используйте кнопки управления, указанные в положении датчика, для перемещения двигателей, определяя шаги в мм для поступательного движения (X, Y и Z) или в ° для вращательного движения (R). Чтобы предотвратить аварии в направлении Z, определите предел Z в поле Безопасность.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Крайне важно, чтобы элементы зонда находились в контакте с водой. Однако не перемещайте щуп полностью в воду, так как это может повредить оборудование. Если двигатели не достигают этого положения, отображается предупреждение Out of workspace (Вне рабочего пространства).
   2. Сохраните координаты в качестве опорного положения, нажав на кнопку «Установить домой». Не изменяйте переводы и повороты одновременно, потому что R относится к X, Y и Z. Всегда нажимайте кнопку «Установить домой » перед изменением R.
   3. Определение параметров визуализации и визуализации. Перейдите в меню просмотра в реальном времени и нажмите « Играть », чтобы выбрать интересующую вас плоскость.
      ВНИМАНИЕ: Запускайте просмотр в реальном времени или съемку только тогда, когда элементы ультразвукового датчика окружены средой, соответствующей акустическому сопротивлению, чтобы обеспечить срок службы оборудования и предотвратить перегрев.
5. Выберите параметры изображения в разделе Предустановка.
   1. С помощью кнопки Load Sequence загрузите доплеровскую сверхчувствительную ультразвуковую последовательность длительностью 10 мс, например, 11 составных плоских волн (углы от -10° до 10°) с напряжением изображения 25 В и доплеровской частотой кадров 10 мс.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Нет необходимости использовать быструю допплеровскую последовательность (например, 10 мс) для визуализации и фильтрации дыхательных движений органа во время анализа.
   2. Определите глубину изображения в диапазоне от 1 мм до 50 мм с максимальной глубиной изображения 50 мм. По умолчанию используется глубина 9 мм от 1 мм до 10 мм, рекомендуемая глубина от 2 мм до 12 мм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от размера животного и резервуара для воды, глубина визуализации может быть адаптирована к конкретным потребностям.
6. Выберите параметры визуализации.
   1. Выберите Допплер для визуализации сосудистой сети.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Интенсивность пикселей в A.U. представляет собой объем крови и должна сравниваться только при использовании одного и того же зонда и последовательности.
   2. Выберите Усреднение для применения временного усреднения для оптимизации отношения сигнал/шум.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Временное усреднение изображений повышает качество изображения, но снижает частоту кадров. В зависимости от поставленной цели следует найти подходящий компромисс.
   3. Выберите Сжатие изображения: логарифмическое (высокое), Квадратный корень (среднее) или Линейное (низкое). В качестве альтернативы можно настроить диапазон контрастности автоматически или вручную с помощью ползунков для параметров высокой и низкой контрастности.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выбор сжатия изображения не влияет на данные; Это влияет только на отображение изображения в реальном времени.
   4. Выберите масштаб цветовой карты от черного до белого, установив флажок «Серый », или от красновато-черного до желтого, установив флажок «Горячий».
7. Выбор плоскости (Рисунок 2B)
   1. Выберите плоскость визуализации на анатомических ориентирах. Переключайтесь между визуализацией допплера и B-режимом для ознакомления с анатомией долей печени и сосудистой системы.
   2. Остановите просмотр в реальном времени, нажав на значок «Стоп ».
   3. Перейдите в меню «Переместить щуп» для навигации по щупу и выберите плоскость, нажав « Установить домой », чтобы сохранить координаты в качестве опорного положения. Убедитесь, что сосудистое дерево четко очерчено и видно с минимальным количеством сигнала вне плоскости.
   4. Вернитесь в меню Live view и нажмите на значок Stop .

3. Получение допплеровского сканирования (Время ~ 20 мин)

1. Запустите допплеровский захват с частотой кадров 10 мс.
   1. Перейдите в меню fUS 2D , чтобы отобразить изменения гемодинамики с течением времени в определенном положении (Рисунок 3). Для повышения контрастности вводите в хвостовую вену боклюс объемом 50 мкл внутривенно (в/в) микропузырьков с концентрацией 2 x 10⁸ микропузырьков на мл.
   2. На тапе «Предустановка» задайте общую продолжительность записи в секундах (30 с). Выберите непрерывный режим без пауз между изображениями, установив Время между изображениями в значение 0 с.
   3. Нажмите кнопку Запись , чтобы начать 2D-сканирование. Запись можно отменить, нажав кнопку «Стоп ». Данные могут быть потеряны, если сбор прерван до его завершения.
2. Визуализируйте и адаптируйте полученную запись.
   1. При необходимости измените контрастность и цветовую карту в разделе Визуализация. При необходимости повторите запись, прокрутив кадры с помощью ползунка, который входит в функцию Время.
3. Сохраните данные.
   1. Укажите имя полученной записи, чтобы сохранить файл в формате .scan в папке сеанса. Всплывающее окно для сохранения данных автоматически предлагается в конце каждой записи. Данные сохраняются автоматически.
4. Запустите еще одно приобретение, щелкнув вкладку « Предустановка », и повторите этот шаг, начиная с шага 3.1.1.
5. Снимите установку визуализации и позаботьтесь о животном.
   1. Перейдите в меню «Переместить щуп», чтобы вертикально переместить зонд вверх за пределы резервуара для воды, напечатанного на 3D-принтере. Снимите установку и ультразвуковой гель и снимите с животного фиксацию.
   2. Усыпить животное, когда план эксперимента достигнет конечной точки; В противном случае выполните следующие действия.
   3. Нанесите немного увлажняющего крема на выбритый участок кожи животного, если предполагается продольные измерения.
   4. Поместите животное обратно в клетку и дайте ему проснуться от анестезии под тепловой лампой, чтобы предотвратить переохлаждение. Следите за животным во время выздоровления.
   5. Поместите животное обратно в индивидуально вентилируемую стойку для клетки, когда оно снова начнет нормально ходить. Завершите эксперименты на лабораторных животных перед анализом набора данных.

4. Количественный анализ (Тайминг ~ 1 ч)

1. Откройте сценарий анализа gui_analysis.m.m, доступный в Дополнительном файле 1.
2. Выберите скан и задайте количественные параметры в настройках: 10 областей интереса (ROI) с размером вокселя 2 х 2. Выберите 40 мс для каждого кадра, чтобы выполнить доплеровскую интеграцию.
3. Нарисуйте сосудистую периферию органа; 10 ROI автоматически размещаются между четко видимыми артериями и при необходимости могут быть скорректированы вручную (Рисунок 4A). Закройте плавающее диалоговое окно, когда его устраивает расположение. Обеспечьте стабильное получение данных (Рисунок 4B) для надежного расчета объема крови, избегая сбора данных, подверженных влиянию сильных артефактов движения (Рисунок 4C).
4. Количественно оцените средний объем печеночной крови в А.Е. из общих 10 ROI путем автоматической оценки среднего значения и стандартного отклонения значений спокойного кадра в течение 30 секунд записи (рис. 4D).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Таблица данных об интенсивности ROI может быть скопирована/вставлена непосредственно в файл электронной таблицы.
5. Повторите анализ по крайней мере для двух дополнительных плоскостей, -0,3 мм и -0,6 мм, в каудальном направлении. Количественно оцените все данные сбора данных перед выполнением статистического анализа.
6. Проверьте стандартное отклонение интенсивности на всем изображении и определите порог как общее среднее значение (μ) с 2 стандартными отклонениями (2σ), чтобы объективно исключить измерения, подверженные артефактам движения (рис. 4E).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Среднее значение и стандартное отклонение значений тихого кадра, оцененных по всему изображению, приведены в первой строке таблицы данных.
   ВНИМАНИЕ: Артефакты движения препятствуют надежной количественной оценке и должны быть объективно идентифицированы на основе анализа всего временного изображения.
7. Возьмем среднее значение среднего объема крови в печени, количественно выраженного в 3 различных плоскостях в 30 ROI на животное на шаге 4.3 (рисунок 4F). Примените тест ROUT 1% в программном обеспечении для статистического анализа, чтобы определить выбросы ROI, прежде чем усреднить 30 ROI на животное. Чтобы улучшить оценку объема крови, записывайте дополнительные плоскости на каждое животное.
8. Для проведения обработки транспортного средства продезинфицируйте место инъекции, т.е. нижний правый или левый квадрант брюшной полости, используя марлю и 70% этанол. Введите 20 μL физиологического раствора или DMSO ip с помощью иглы 27G и одноразового шприца объемом 1 мл или инсулинового шприца 30G или введите 100 μL (гидроксипропил) метилцеллюлозы через зонд с помощью многоразовой иглы для кормления 30G с круглым наконечником. График данных 3 когорт, получавших физиологический раствор или ДМСО путем вп или перорального введения (po) целлюлозы (рис. 4G). Проводите анализ вслепую, не раскрывая состояние и/или полученное лечение.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Применение в автомобиле не влияет на измерение объема крови.

Результаты

В соответствии с протоколом визуализация сосудистой сети печени облегчается на основе стандартизации анатомических структур и соответствующей терминологии (рис. 1). Чтобы предложить стандартизированную номенклатуру для исследователей, использующих доклинические модели печени, мы схематически изобразили общее расположение печени в брюшной полости мышей (рис. 1А), обеспечили структурное расположение различных долей печени (рис. 1В) и уточнили артериальную сосудистую сеть (рис. 1В). Обладая анатомическими знаниями, визуализация НФУС in vivo была выполнена с использованием напечатанного на 3D-принтере резервуара для воды для уменьшения артефактов движения (Рисунок 2A). Акустическое сопротивление корректировалось путем введения зонда в воду и нанесения пропускающего геля ультразвука непосредственно на выбритую кожу животного. При использовании этой установки уменьшается дыхание и другие двигательные артефакты, поскольку зонд не находится в прямом контакте с движущейся грудью и животом животного. Таким образом, мы визуализировали сосудистую структуру правой и левой долей, которые легко доступны для УНЛО благодаря их поверхностному расположению (рис. 2B). Другие доли печени, такие как хвостатая и квадратная доля, расположены глубже в организме, что затрудняет анатомическую правильную идентификацию сосудистой сети печени с помощью НЛО.

Продемонстрировав важность стандартизированных и общепринятых анатомических показаний и интерпретаций сосудистых структур, мы выполнили несколько допплеровских сканирований в различных плоскостях, чтобы получить всесторонний обзор сосудистой сети печени, визуализированной с помощью НФУС с контрастным усилением у мышей (рис. 3). Мы описали печеночную артериальную сеть отдельных долей печени, т.е. левую латеральную (LL), левую медиальную (LM), правую латеральную (RL) и правую медиальную (RM) доли. Кроме того, маркируются крупные артерии, такие как брюшная аорта (АА), печеночная артерия (ГК), левая латеральная печеночная артерия (ЛЛГК) и правая медиальная печеночная артерия (РМХА). Важно отметить, что доли печени могут располагаться немного по-разному в зависимости от расположения и перистальтического движения тонкой кишки (СМ), а также состояния наполнения желудка (S). Этот обзор всей сосудистой сети печени мыши с контрастным усилием представляет собой комплексный сосудистый атлас для визуализации печени in vivo с помощью UFUS.

Точный выбор анатомических плоскостей имеет решающее значение для получения количественных показаний, полученных из одной доли печени. Надежные измерения объема крови могут быть достигнуты путем ручного выбора 10 областей интереса (ROI) в каждой плоскости (Рисунок 4A). Для надежного количественного определения объема крови для микроциркуляции необходима стабильная регистрация с малыми вариациями средней интенсивности изображения. Это определяется на основе среднего значения изображения (MIV) всего изображения с течением времени (рисунок 4B), в отличие от записи, которая подвержена значительным артефактам движения (рисунок 4C). Для обработки артефактов движения был использован автоматический выбор низкого MIV для надежной количественной оценки измерений объема печеночной крови (рисунок 4D) путем построения графика стандартного отклонения всех временных низких MIV всего изображения (рисунок 4E). Допплеровское сканирование нескольких плоскостей на каждом животном показывает приемлемую внутри- и межвариабельность внутри и между мышами из 3 разных когорт после обработки выбросами на 30 ROI на животное с тестом ROUT 1% (рис. 4F). Чтобы улучшить оценку объема крови на животное, рекомендуется регистрировать дополнительные плоскости или увеличить количество выбранных ROI для каждой плоскости. Кроме того, показания объема крови могут быть использованы для мониторинга медикаментозного лечения, в частности, нацеленного на микроциркуляторное русло. Проводя транспортное средство двумя способами введения, мы продемонстрировали, что это не влияет на измерения объема печеночной крови (рис. 4G). Эти результаты указывают на то, что введение носителя не влияет на делецию гена или доставку лечения, что обеспечивает надежный экспериментальный дизайн. В целом, для будущих исследований по изучению сосудистых дефектов печени на различных моделях мышей предоставлен объективный и воспроизводимый количественный протокол.

Рисунок 1: Анатомия печени мышей. (А) Схематический обзор положения печени в брюшной полости под диафрагмой мыши. (В) Схематическое описание печени мыши с четырьмя долями печени, т.е. левой, квадратной, хвостатой и правой долей, и портальной триадой, состоящей из воротной вены, печеночной артерии и желчного протока. (В) Схематическое изображение артериальной сети тактильной сосудистой сети. Проведена идентификация печеночных артерий (ГА) и ветвей (ветвей) с латинской номенклатурой. Сокращение: HA = Печеночная артерия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Сверхбыстрая ультразвуковая допплерография (НФУС) сосудистой сети печени у мышей. (A) Схематический обзор экспериментальной установки для неинвазивной визуализации in vivo . (B) Схематические иллюстрации направления визуализации и связанных с ними представителей правой и левой медиальной доли, а также левой латеральной доли, визуализированных с помощью UFUS. Сокращение: AA = Брюшная аорта, LLL = Левая латеральная доля, люби мою жизнь = Левая медиальная доля, RML = Правая медиальная доля. Масштабная линейка = 1 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3: Репрезентативный ультрабыстрый ультразвуковой допплеровский узи (НФУС) мышиной печеночной сосудистой сети с контрастным усилением. Обзор всей сосудистой сети печени взрослой мыши, изображенной в 3 положениях, т.е. латерально справа, медиально и латерально слева, в 4 плоскостях от краниальной к каудальной. Эталон расположен непосредственно под диафрагмой, которая визуализируется в медиальном направлении и на 1 см латерально справа и слева, с теми же плоскостями в каудальном направлении. Абдоминальная аорта, HA = печеночная артерия, LLL = левая латеральная доля, LLHA = левая боковая печеночная артерия, love my life = левая медиальная доля, RLL = правая боковая доля, RMHA = правая медиальная печеночная артерия, RML = правая медиальная доля, SI = тонкая кишка, S = желудок. Масштабная линейка 1 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4: Сверхбыстрое ультразвуковое допплеровское исследование (НФУС) количественное измерение объема печеночной крови. (A) Представители медиальной доли (ML) взрослых мышей C57BL/6 дикого типа контрольного типа в плоскости 1, выбранной под диафрагмой, соответствующей 0 мм, плоскости 2 при -0,3 мм и плоскости 3 при -0,6 мм с выбором из 10 областей интереса (ROI). Масштабная линейка 1 мм. Иллюстрация мощного допплера 30-х годов со стабильным регистрацией (В) (серый) и (С) движением тканей (красный) на основе средних значений изображения в условных единицах (А.Е.) всего изображения для количественной оценки. (D) Автоматическое распознавание низких интенсивностей (АЕ) для количественного измерения объема крови с течением времени. (E) Стандартное отклонение (St. Deviation) низких интенсивностей, построенное на графике для выявления нестабильных приобретений (красный), вызванных артефактами движения, обозначенных отсечением общего среднего (μ) от числа (N) животных из 3 когорт с 2 SD (2σ) оценкой стандартного отклонения (SD) низкой интенсивности (A.U.) в физиологическом состоянии (серый) у взрослых контрольных мышей дикого типа C57BL/6. (F) Количественная оценка измеренных in vivo изменений объема крови с течением времени, усредненных по 3 плоскостям, т.е. 30 ROI в сумме на животное, представлена в виде интенсивности пикселей (A.M.). Обнаружение выбросов по тесту ROUT 1%. (G) Нет никакой разницы между типом транспортного средства доставки и маршрутом доставки. Когорта 1 (n=6) получала внутрибрюшинную (ip) инъекцию физиологического раствора, когорта 2 (n=3) ip инъекцию ДМСО и когорта 3 (n=6) пероральное введение (po) целлюлозы. Однофакторный ANOVA с тестом множественных сравнений Даннетта, нс P > 0,05. Сокращение: A.U. = Условные единицы, ДМСО = Диметилсульфоксид, ip = Внутрибрюшинное, po = Пероральное введение, ROI = Область интереса, St. Deviation = Стандартное отклонение, UFUS = Ультрабыстрое допплеровское ультразвук. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Дополнительный файл 1: Сверхбыстрый ультразвуковой допплеровский аппарат (НФУС) количественного анализа объема печеночной крови. Скрипт gui_analysis.m предоставляет графический интерфейс для автоматического позиционирования области интереса (ROI) для измерения объема крови. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Обсуждение

В этом протоколе мы демонстрируем, как выполнять неинвазивную UFUS-визуализацию сосудистой сети печени мыши. Мы представляем подробное описание процедуры визуализации, охватывающей обращение с животными, работу с ультразвуковым сканером и анализ данных для вычисления изменений объема крови in vivo. Чтобы облегчить интерпретацию ультразвуковых данных, мы предоставляем всесторонний обзор анатомических структур, которые могут быть четко визуализированы с помощью НФУС. Кроме того, мы описываем стандартизированную процедуру количественной оценки для надежных измерений сосудистых параметров. Достижение подходящего разрешения возможно без использования контрастного вещества, что позволяет безопасно и просто количественно оценить объем печеночной крови в микроциркуляции. Мы подчеркиваем использование стандартизированной анатомической номенклатуры для предотвращения путаницы и неправильной интерпретации, особенно при оценке количественных измерений микроциркуляторного русла.

Ранее сообщалось о визуализации сосудистой сети мышей с помощью НФУС, в первую очередь в области неврологии⁷. Артефакты движения не оказывают негативного влияния на визуализацию мозга, в отличие от печени, которая очень восприимчива к дыхательным движениям. Из-за анатомического положения под диафрагмой удаление волос в области живота должно выполняться очень осторожно, чтобы избежать появления нерегулярного дыхания за счет минимизации физических нагрузок на грудь и область живота. Кроме того, достижение надлежащей степени анестезии имеет важное значение для обеспечения регулярного осциллирующего дыхания, фактор, который можно относительно легко исправить на этапах постобработки. Чувствительность UFUS была повышена за счет применения фильтра разложения сингулярных значений (SVD) для удаления артефактов движения⁶ и дальнейшей цензуры кадров с высоким уровнем движения. Фильмы с высокой частотой кадров Power Doppler получены здесь с точностью до 10 мс, что позволяет нам дополнительно визуализировать и измерить влияние дыхания на кадры, которые генерируют пики высокого значения из-за артефактов движения. Частота дыхания может быть определена по пику в быстром преобразовании Фурье среднего сигнала изображения, а соответствующие пиковые кадры, соответствующие высокому движению органа, могут быть отброшены.

Воспроизводимая ультразвуковая допплеровская визуализация у одного животного с течением времени, а также у животных с разной массой тела, все еще может иметь ряд ограничений. Во-первых, на положение печени могут влиять такие факторы, как сильно наполненный желудок и перистальтическое опорожнение кишечника. Это влияние особенно выражено при выборе левой латеральной доли печени в качестве опорной. Поэтому мы рекомендуем выбирать левую латеральную долю только у крупных животных и отдавать предпочтение правой или левой медиальной доле у более мелких животных. Во-вторых, у животных, находящихся в бедственном положении, могут возникать тяжелые неколебательные дыхательные движения, что приводит к артефактам движения, которые трудно исправить и, следовательно, они не могут быть использованы для расчета объема крови. Таким образом, правильный выбор анестезии, а также дозировка, адаптированная к массе тела, имеют решающее значение. Наконец, предел разрешения ограничивает визуализацию микроциркуляторного русла печени, т.е. кровеносные сосуды могут быть визуализированы с диаметром до 100^мм3.

Недавно было предложено использовать контрастные вещества для получения детального изображения сосудистой сети мыши путем отслеживания микропузырьков. Такой подход позволяет достичь высокого пространственного разрешения и обеспечить количественные измерения скорости крови¹⁷. Тем не менее, отслеживание микропузырьков остается очень сложной задачей для перемещения внутренних органов, особенно когда они получены в 2D.

Здесь мы показали, что стабильные измерения объема печеночной крови, полученные с помощью сверхбыстрой допплерографии, могут быть получены у контрольных мышей из трех когорт, получавших различные носители, вводимые инъекциями ip или пероральным зондированием. Недавно такие измерения объема крови были успешно использованы на мышиной модели¹⁶ с заболеванием печени. В частности, расширение сосудов было обнаружено на электронно-микроскопическом уровне и подтверждено количественными измерениями с помощью НФУС. В этом исследовании была подчеркнута чувствительность оценки in vivo для изучения сосудистых дефектов на функциональном и количественном уровнях, даже при сохранении печеночной ангиоархитектуры, что является перспективным для клинической диагностики и мониторинга.

Таким образом, данный протокол служит руководством для неинвазивных качественных и количественных исследований сосудистой сети печени у мышей. Он также может быть использован для лонгитюдного наблюдения благодаря своей неинвазивной и простой процедуре. Кроме того, он обладает потенциалом для обеспечения функциональной оценки кровеносных сосудов.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
(Гидроксипропил)метилцеллюлоза HPMC	Sigma-Aldrich	H7509	0,5% HPMC
Центрифуга ZentriMix 380 R	Hettich	3200
Центрифуга Пробирки 50 мл коническая Стерильный полипропилен	CELLSTAR Пробирки	227 261
Ватные наконечники	Meditip Clean	G80215
Деионизированная вода	в доме
Крем для депиляции	рядом с аптекой
Диметилсульфоксид (ДМСО)	Sigma	D2650-5X5ML	стерильный
абсолютный этанол	FRESENIUS KABI	010-0622-1
Игла для кормления, многоразовая	FST Fine Science Tools	18064-20
Щипцы с тонким наконечником Dumont #5 щипцы	FST Fine Science Tools	11252-00
Марлевые салфетки 5 x 5 см	Klinipress	175 004
GraphPad Prism	GraphPad Software, Inc	Version 9
Скрипт анализа графического интерфейса	Inserm	gui_analysis.m	требуется допплеровское сканирование 10 мс
Грелка 17 x 17 см, 6 Вт	ThermoLux Acculux	461265
Инсулиновый шприц 30G 0,30 x 8 мм, 0,3 мл и 0,5 мл	BD Microfine + Demi	25636
Кетамин Анескетин	Dechra	REG NL 111764	100 мг/мл
Kimwipes KIMTECH салфетка с низким ворсом	ULINE	S-8115
Лабораторная лента 19 мм x 50 м x 0,125 мм	Stokvis	M451
MATLAB программное обеспечение	MathWorks	Version R2022b
Увлажняющий крем	рядом аптека
Игла желтая 30G 0,3 x 13 мм	BD Microlance	304000
Офтальмологическая мазь Oculentum Simplex	Added Pharma	220201
Бумажные салфетки	в домашних
Перманентный лабораторный маркер	VWR	52877-310
Физиологический раствор соли (NaCl 0,9%)	FRESENIUS KABI	B102986	стерильный
контейнер Sharps одноразовый Medical Dispo 2,5 л	APmedical	UN3291
Стерильный сейф-замок 1,5 мл	Tubes Eppendorf	0030 120.086
Шприц 1 мл	BD Plastipak	303172
Шприц 20 мл Luer-Lok	BD Plastipak	300629
Таймер	West Bend	40053
Триммер	Exacta Aesculap	GT416
Ultrafast ультразвуковая платформа	Iconeus &   INSERM 'Biomedical Ultrasound' ART	Iconeus Один прототип	с последовательностью 10 мс
Гель для пропускания ультразвука Aquasonic 100	Parker Laboratories INC.	BT-025-0037N
Резервуар для воды 3D-печать 10 x 10 x 1,5 см полиметилпентен (PMP) 0,125 мм	GoodFellow Cambridge limited	ME311100/2	CAD файл по запросу
Xylazine Sedamun	Dechra	REG NL 10084	20 мг/мл