Методическая статья

Встраиваемая биопечать тканеподобных структур с использованием субмикрогелевого носителя κ-каррагинана

DOI:

10.3791/66806

⸱

3 мая 2024 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Research Institute of Smart Medicine and Biological Engineering, Ningbo University, 2Health Science Center, Ningbo University, 3Key Laboratory of Precision Medicine for Atherosclerotic Diseases of Zhejiang Province, The First Affiliated Hospital of Ningbo University, 4The First Affiliated Hospital of Ningbo University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом исследовании представлена новая субмикрогелевая суспензионная ванна с κ-каррагинаном, обладающая замечательными обратимыми переходными свойствами заклинивания-расклинивания. Эти атрибуты способствуют созданию биомиметических тканей и органов при встроенной 3D-биопечати. Успешная печать тканей сердца/пищевода с высоким разрешением и ростом клеток демонстрирует высокое качество биопечати и приложений тканевой инженерии.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Встроенная трехмерная (3D) биопечать с использованием гранулированной гидрогелевой поддерживающей ванны стала критически важным методом для создания биомиметических каркасов. Тем не менее, разработка подходящей гелевой суспензионной среды, которая уравновешивает точное осаждение биочернил с жизнеспособностью и функциональностью клеток, сопряжена с множеством проблем, особенно при достижении желаемых вязкоупругих свойств. Здесь новая ванна с поддержкой геля κ-каррагинана изготавливается с помощью простого в эксплуатации процесса механического измельчения, в результате чего образуются однородные субмикроразмерные частицы. Эти субмикрогели демонстрируют типичное для Бингема текучесть с малым пределом текучести и свойствами быстрого истончения при сдвиге, что способствует плавному осаждению биочернил. Кроме того, обратимый переход гель-соль и способность к самовосстановлению микрогелевой сети κ-каррагинана обеспечивают структурную целостность напечатанных конструкций, позволяя создавать сложные, многослойные тканевые структуры с определенными архитектурными особенностями. После печати субмикрогели κ-каррагинана могут быть легко удалены с помощью простой промывки с буферизацией фосфатами и солевым раствором. Дальнейшая биопечать с использованием биочернил, насыщенных клетками, демонстрирует, что клетки в биомиметических конструкциях обладают высокой жизнеспособностью в 92% и быстро удлиняют псевдоподии, а также поддерживают надежную пролиферацию, что указывает на потенциал этой стратегии биопечати для производства тканей и органов. Таким образом, эта новая субмикрогелевая среда κ-каррагинана представляет собой многообещающее направление для встраиваемой биопечати исключительного качества, имеющей глубокие последствия для разработки in vitro инженерных тканей и органов.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Тканевые инженерные каркасы, включая электропрядущие волокна, пористые губки и полимерные гидрогели, играют ключевую роль в восстановлении и реконструкции поврежденных тканей и органов, обеспечивая структурную основу, поддерживающую рост клеток, регенерацию тканей и восстановление функции органов 1,2,3. Тем не менее, традиционные каркасы сталкиваются с проблемами точного воспроизведения нативных тканевых структур, что приводит к несоответствию между искусственными и естественными тканями. Это ограничение препятствует эффективному заживлению дефектных тканей, подчеркивая настоятельную необходимость совершенствования конструкции каркаса для достижения более точной биомимикрии. Трехмерная (3D) биопечать — это инновационная технология производства, которая точно создает сложные биологические структуры тканей слой за слоем с использованием чернил и клеток биоматериала4. Среди различных биоматериалов полимерные гидрогели являются идеальными биочернилами благодаря своей характерной сети, которая облегчает инкапсуляцию клеток in situ и, что особенно важно, поддерживает их рост 5,6. Тем не менее, многие мягкие и высокогидратированные гидрогели имеют тенденцию вызывать размытие или быстрое разрушение печатных структур каркаса в процессе печати при использовании в качестве биочернил. Чтобы решить эту проблему, встроенная технология 3D-биопечати использует микрогелевую ванну в качестве поддерживающего материала, что позволяет точно наносить мягкие биочернила. После гелеобразования гидрогелевых биочернил путем удаления микрогелевой ванны получают очищенные бионические каркасы со сложной структурой. Такие материалы, как желатин 7,8, агароза9 и геллановая камедь10,11, были использованы для создания микрогелевых ванн для встроенной 3D-биопечати, что значительно продвинуло применение мягких гидрогелей в тканевой инженерии. Тем не менее, микронный уровень и неоднородный размер частиц этих гелей отрицательно влияют на разрешение и точность 3D-печати 12,13,14. Существует острая необходимость в изготовлении гелеобразной суспензионной суспензии с мелкими и равномерно диспергированными частицами, обеспечивающими преимущества в достижении высокой точности биопечати.

В этом протоколе представлена новая ванна с суспензией κ-каррагинана из жертвенного гранулята с равномерным субмикронным уровнем для встраиваемой 3D-печати. Это инновационное поведение субмикрогелевой ванны с быстрым переходом от заклинивания к расклиниванию облегчает точное изготовление биомиметических гидрогелевых каркасов с высокой структурной точностью15. С использованием этой новой суспензионной среды успешно печатается серия биомиметических тканей и конструкций органов с многослойными тканевыми структурами с использованием композитных биочернил, состоящих из метакрилата желатина и фиброкакрилата шелка. В этом исследовании мы выбрали пищевод в качестве биомиметического объекта 3D-биопечати в основном потому, что пищевод не только имеет многослойную тканевую структуру, но и его мышечный слой демонстрирует внутреннюю круглую и внешнюю продольную сложную слоистую структуру. Обеспечение правильного выравнивания и организации этих слоев имеет важное значение для функциональной регенерации тканей. Поэтому мы очень хотим воспроизвести многослойную архитектуру пищевода. Что еще более важно, мы использовали субмикрогели κ-каррагинана в качестве суспензионной ванны и GelMA/SFMA в качестве биочернил для проектирования и создания биомиметического каркаса для тканевой инженерии. Напечатанный пищевод может быть легко освобожден путем многократного промывания фосфатно-солевым буфером. Кроме того, субмикрогелевая ванна с κ-каррагинаном не содержит цитотоксических веществ, что обеспечивает высокую цитосовместимость15. Гладкомышечные клетки, загруженные в анизотропные каркасы, проявляют заметную расширяющую активность. Эта однородная субмикрогелевая суспензионная среда открывает новые возможности для изготовления сложных тканей и органов с помощью встроенной 3D-биопечати.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Приготовление субмикрогелевой суспензионной ванны с κ-каррагинаном

  1. Приготовьте 500 мл ванны с суспензией κ-каррагинана (0,35% масс./об.) путем добавления 1,75 г порошка κ-каррагинана в 500 мл раствора фосфатно-солевого буфера (PBS, pH 7,4) в стеклянном флаконе объемом 1000 мл.
  2. Вставьте в стеклянную бутылку магнитную мешалку диаметром 70 мм, чтобы перемешать водную смесь. Затяните стеклянную крышку бутылки, а затем ослабьте ее на полоборота.
  3. Поместите стеклянную бутылку на водяную баню при температуре 70 °C и нагрейте ее. Включите магнитную мешалку со скоростью 300 оборотов в минуту, поставьте бутылку, и помешивайте до полного растворения полимера.
  4. Возьмите другую стеклянную бутылку и поместите ее в автоклав для стерилизации при температуре 121 °C в течение 30 минут.
  5. После того как стерилизатор высокого давления остынет до 80 °C, извлеките бутылочку из стерилизатора и перенесите ее на ультрачистый верстак для дальнейшей обработки.
  6. Полностью растворенный раствор κ-каррагинана отфильтровать в стерилизованную стеклянную бутылку с помощью фильтра 0,22 мкм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте фильтрацию быстро, пока раствор горячий, чтобы предотвратить охлаждение κ-каррагинана и засорение фильтра.
  7. Хранить раствор κ-каррагинана при температуре 4 °C для индуцирования катионно-сшитого гелеобразования в течение 12 ч.
  8. Гидрогели κ-каррагинана механически измельчают с помощью магнитной мешалки диаметром 60 мм со скоростью перемешивания 1200 об/мин при температуре 25 °C до тех пор, пока они не превратятся в жидкое состояние, что займет примерно 60 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Храните гидрогели κ-каррагинана при температуре 25-37 °C, чтобы избежать гелеобразования при низких температурах или растворения при высоких температурах.

2. Получение желатина метакрилата/фиброина шелка метакрилатных композитных биочернил

  1. Приготовьте композитные биочернила, соединив 10% (масс./об.) метакрилата желатина (GelMA) и 6% (масс./об.) метакрилата фиброина шелка (SFMA) в растворе PBS (pH 7,4). Отдельно отвесьте 2,0 г GelMA и 1,2 г порошков SFMA.
  2. Медленно добавьте порошки в две центрифужные пробирки объемом 50 мл. Добавьте 10 мл раствора PBS отдельно в центрифужные пробирки объемом 50 мл.
  3. Добавьте к каждому магнитную мешалку 10 мм и постоянно помешивайте и нагревайте на водяной бане при температуре 45 °C. Дайте порошкам GelMA и SFMA полностью раствориться, примерно на 30 минут.
  4. Смешайте растворы GelMA и SFMA в равных объемах при непрерывном перемешивании при температуре 45 °C. Отфильтруйте композитные биочернила с помощью фильтра с размером пор 100 мкм.
  5. Стерилизуйте композитные биочернила GelMA/SFMA с помощью УФ-излучения в шкафу биобезопасности в течение 12 часов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Немедленно приготовьте и используйте биочернила, чтобы предотвратить преждевременное гелеобразование SFMA за счет самостоятельной сборки.

3. Реологическая характеристика субмикрогелевой суспензионной ванны с κ-каррагинаном

  1. Запуск и подготовка оборудования, связанного с реологией.
    1. Включите воздушный компрессор на 30 минут и убедитесь, что давление достигает 30 фунтов на квадратный дюйм. Снимите зажим подшипника, повернув тяговый стержень против часовой стрелки. Закрепите внизу черную крышку и поверните ось ручки в верхней части прибора по часовой стрелке.
    2. Включите реометр и дайте ему инициализироваться. Включите реле циркуляционной воды и дайте температуре достичь 15 °C.
    3. Откройте программное обеспечение для управления реометром, чтобы установить онлайн-соединение.
  2. Откалибруйте реометр и установите геометрию параллельной пластины.
    1. Выполните калибровку прибора в управляющем программном обеспечении, которая в основном включает в себя регулировку инерционного пути калибровочного прибора. Установите геометрию параллельной пластины диаметром 40 мм на конец тягового стержня. Удерживайте кнопку блокировки в течение 3 секунд, чтобы переместить вал двигателя в исходное положение для равномерного размещения геометрии.
    2. Выберите Calibrate Manager (Диспетчер калибровки) в управляющем программном обеспечении, а затем нажмите кнопку Инерция, Трение (Inertion Calibration, and Rotational Mapping) для калибровки геометрии параллельной пластины.
  3. Обнулите высоту зазора реометра, выполнив стандартную процедуру обнуления зазора для обеспечения точного измерения.
  4. Настройте экспериментальные этапы, включая нарастание потока в диапазоне от 0,01 до 1000 1/с при скорости сдвига, амплитудное развертку в диапазоне от 0,1% до 100% при 10 рад/с, многоступенчатую развертку по времени колебаний продолжительностью 60 с с чередованием деформаций 1% и 100% при 10 рад/с и многоступенчатую развертку Peak Hold продолжительностью 120 с с переменной скоростью сдвига 0,1 1/с и 10 1/с.
  5. Капните 2 мл 0,35% суспензии κ-каррагинана на пластину Пельтье реометра.
  6. Установите геометрический зазор на 510 μм и удалите излишний перелив на краю зажимного устройства. Установите зазор между образцами на 500 мкм, чтобы образец немного выходил за край зажима.
  7. Проведите эксперимент с потоком, выбрав линейный поток из вариантов экспериментального плана.
    1. Выберите тест Flow Ramp в экспериментальном дизайне. Установите скорость сдвига от 0,001 до 10 1/с при температуре 25 °C.
    2. Выполните шаг 3.5 и эксперимент Flow Ramp на добавленном образце.
  8. Проведите циклическое испытание на удержание пика, чтобы оценить эффективность восстановления материала.
    1. Выберите в схеме эксперимента Peak Hold sweep и поставьте 5 последовательных экспериментов со временем 120 с при 25 °C.
    2. Установите скорость сдвига равным 0,01 1/с для первого, третьего и пятого этапов и 10 1/с для второго и четвертого этапов.
    3. Добавьте новый образец объемом 2 мл. Выполните шаг 3.5 и тест на циклическое восстановление.
  9. Выполните анализ вязкоупругости для оценки потенциального перехода гель-соль ванны с суспензией κ-каррагинана.
    1. Выберите тест Amplitude Sweep в экспериментальном дизайне. Установите деформацию колебаний от 0,1% до 100% при температуре 25 °C. Нажмите кнопку Пуск , чтобы выполнить эксперимент с разверткой амплитуды на добавленном образце.
  10. Выполнение альтернативного анализа деформации для оценки характеристик упругого восстановления материала.
    1. Выберите в схеме эксперимента Oscillation Time Sweep и задайте 5 последовательных экспериментов со временем 60 с при температуре 25 °C.
    2. Установите деформацию на 1% для первого, третьего и пятого шагов и на 100% для второго и четвертого шагов.
    3. Добавьте новый образец объемом 2 мл. Выполните шаг 3.5 и испытание на непрерывное циклическое восстановление.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Очищайте геометрическую пластину и пластину Пельтье после каждого экспериментального теста и добавляйте новый образец объемом 2 мл.

4. Печать биомиметических гидрогелевых каркасов с помощью специально разработанного микроэкструзионного биопринтера

  1. Проектируйте кубики формата STL с помощью программного обеспечения для 3D-графики и загружайте тканевые модели из 3D-базы данных (www.thingiverse.com; https://3d. nih.gov/.).
    1. Импортируйте модели формата STL в программное обеспечение PANGO и введите параметры печати. Задайте конкретные координаты X, Y и Z модели в 3D-пространстве, введите ожидаемый размер масштабирования модели в миллиметрах (мм), отрегулируйте размер и коэффициент масштабирования объекта по осям X, Y и Z, а также отрегулируйте угол поворота модели в пространстве по мере необходимости.
    2. Введите расчетный диаметр нити накала (обычно около 200-500 мкм для большинства биочернил) в поле толщины слоя, чтобы определить толщину каждого слоя по оси Z. Установите скорость печати в соответствии с ожидаемой толщиной линии (примерно 10-90 мм/с) и установите плотность заполнения на 30%-80%.
    3. Экспортируйте окончательные параметры в виде G-кода на SD-карту.
  2. Запустите биопринтер и микроэкструзионный насос.
    1. Включите контроллер микроэкструзионного насоса, выберите соответствующий объем шприца (5 мл) и установите скорость экструзии на уровне 0,08 мл/мин и продолжительность экструзии в соответствии с желаемым временем печати, полученным путем деления объема гидрогеля на скорость экструзии.
    2. Вставьте шприц с иглой с внутренним диаметром 210 мкм в слот для шприца биопринтера.
    3. Отрегулируйте контроллер шприца так, чтобы поршень шприца находился в тесном контакте с винтом.
    4. Поместите 3 мл ванны с суспензией в чашку для клеточных культур диаметром 35 мм. Расположите чашку на платформе в соответствии с настройками кода и убедитесь, что печатающая головка находится на 1 мм выше дна чашки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Проведите предварительное тестирование, чтобы убедиться в точности положения тарелки на печатной платформе во время печати.
    5. Вставьте SD-карту с кодом в 3D-биопринтер, активируйте файл с кодом, запустите биопринтер и нажмите кнопку « Пуск » на контроллере.
  3. Обработка конструкций
    1. Подвергните напечатанную конструкцию воздействию синего света с длиной волны 405 нм на 1 минуту, чтобы инициировать фотосшивку.
    2. Удалите гель κ-каррагинана с помощью пипетки объемом 1 мл с последующим добавлением 3 мл PBS (pH 7,4) для промывания и последующего удаления. Повторите этот процесс для тщательной промывки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте процесс стирки осторожно, чтобы не повредить напечатанные конструкции.

5. Встроенная 3D-биопечать аналогов пищеводного мышечного слоя

  1. Культивирование гладкомышечных клеток пищевода кролика (eSMCs).
    1. Начало посева в колбах Т75 с 2 x 106 клетками с использованием 15 мл среды DMEM с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки и 1% пенициллина/стрептомицина.
    2. Поддерживайте eSMC при температуре 37 °C во влажной атмосфере с содержанием 5%CO2 и 95% воздуха до тех пор, пока они не достигнут 80% конфлюенции.
  2. Приготовление биочернил из мышечного слоя пищевода
    1. Аспирируйте среду по достижении слияния и промойте eSMC 5 мл 1x PBS.
    2. Добавьте в колбу 2 мл 0,2% Трипсина-ЭДТА и инкубируйте в течение 2 минут для переваривания клеток. Коснитесь колбы, чтобы отделить ячейки от стены.
    3. Завершите разложение, добавив 2 мл DMEM, и перенесите клеточную суспензию в центрифужную пробирку объемом 15 мл. Измерьте плотность клеток с помощью клеточного счетчика с 10 μл клеточной суспензии.
    4. Центрифугируйте при 675 x g в течение 3 мин, осторожно отасуньте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в композитных биочернилах GelMA/SFMA (как приготовлено на шаге 2.1). Отрегулируйте конечную концентрацию клеток для достижения плотности 10 x 106 клеток/мл в биочернилах, тем самым оптимизируя условия для последующих применений 3D-биопечати.
  3. Подготовка 3D-биопринтера и сопутствующих материалов
    1. Автоклавирование основных печатных инструментов, включая иглы для шприцев, щипцы, магнитную мешалку и бутылку из силикатного стекла объемом 1000 мл, в стандартных условиях стерилизации (121 °C в течение 30 минут) для обеспечения асептической среды для процесса печати.
    2. Поместите биопринтер в шкаф биобезопасности и стерилизуйте его ультрафиолетовым (УФ) излучением в течение 30 минут для поддержания стерильности.
    3. Приготовьте 50 мл стерильного κ-каррагинана и 5 мл стерильных композитных биочернил GelMA/SFMA, как описано в шаге 1 и шаге 2 соответственно.
    4. Спроектируйте модель, задайте желаемые параметры и подготовьте биопринтер, как описано в шаге 4.1.
  4. Начало процесса биопечати
    1. Выполните процедуры, описанные в шагах 4.2 и 4.3, для биопечати 3D-слоя мышц пищевода с последующей промывкой и заменой PBS.
    2. Выполняйте клеточную печать стерильными методами на протяжении всего процесса печати, чтобы свести к минимуму риск загрязнения клеток в печатаемой структуре.
  5. Послепечатная замена среды для клеточных культур
    1. Осторожно аспирируйте PBS и замените его 3 мл DMEM с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки и 1% пенициллина/стрептомицина. Убедитесь, что напечатанные конструкции полностью погружены в воду, чтобы обеспечить оптимальные условия для роста клеток.
    2. Инкубируйте чашку для клеточной культуры, содержащую напечатанные конструкции, в инкубаторе, установленном при температуре 37 °C с 5%CO2. Ежедневно заменяйте среду для культивирования клеток свежей средой, каждый раз используя 3 мл, и контролируйте состояние клеток внутри конструкций с помощью световой микроскопии.

6. Оценка жизнеспособности eSMC в напечатанных конструкциях с помощью окрашивания методом Live/Dead

  1. Удалите среду для культивирования клеток через 5 ч инкубации и промойте нагруженные клетками конструкции PBS.
  2. Добавьте 2 мл стандартного раствора кальцеина-АМ/йодида пропидия (1:1000) в напечатанные конструкции с клетками и инкубируйте.
  3. Промойте конструкции 3 раза PBS после 45-минутной инкубации, а затем добавьте свежую среду для клеточной культуры.
  4. Наблюдайте за живыми и мертвыми клетками и получайте флуоресцентные изображения с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (CLSM).

7. Наблюдение за eSMC в напечатанных конструкциях с помощью окрашивания FITC-Phalloidin/DAPI

  1. Окрашивание напечатанных конструкций с использованием флуоресцеина изотиоцианата (FITC) с меченным фаллоидином (Green) на F-актин и 4',6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI, синий) для ядра после 5 дней инкубации.
  2. Приготовление раствора для фиксации
    1. Смешайте 4 мл 1x PBS с 0,16 мл параформальдегида (PFA) в полиэтиленовой (PE) пробирке объемом 5 мл, достигнув конечной концентрации 4%.
    2. Поместите чашку для культуры с биопечатными конструкциями на чистую поверхность. Извлеките среду и аккуратно накройте конструкции раствором PFA, обеспечивая их полное погружение. Дайте фиксации протекать при комнатной температуре в течение 20 минут, прежде чем выбрасывать раствор.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Осторожно обращайтесь с жидкостями во время процессов добавления и удаления, чтобы сохранить структурную целостность биопечатных конструкций.
    3. Введите 2,5 мл 1x PBS в чашку для культивирования, полностью погружая конструкции, чтобы удалить любые остаточные красящие реагенты.
  3. Пермеабилизация клеточных мембран
    1. Приготовьте 0,5% раствор Triton X-100, добавив 20 мкл Triton X-100 к 4 мл 1x PBS в полиэтиленовую пробирку объемом 5 мл.
    2. Введите раствор Triton X-100 в конструкции в течение 30 минут при комнатной температуре для проникновения в клеточные мембраны, затем удалите раствор.
    3. Введите 2,5 мл 1x PBS в чашку для культивирования, полностью погружая конструкции, чтобы удалить любые остаточные красящие реагенты.
  4. Блокировка неспецифической привязки
    1. Создайте 3% раствор для блокирования бычьего сывороточного альбумина (БСА) в полиэтиленовой пробирке объемом 5 мл, добавив 0,12 мл БСА к 4 мл 1x PBS.
    2. Введите раствор BSA в конструкции на 30 минут при комнатной температуре, чтобы заблокировать неспецифические участки, затем выбросьте раствор.
  5. Окрашивание актина ФИТК-фаллоидином
    1. Приготовьте 0,2% раствор фаллоидина FITC в полиэтиленовой пробирке объемом 5 мл с 4 мл 1x PBS и 8 мкл красящего реагента.
    2. Погрузите конструкции в этот раствор на 60 минут при комнатной температуре в темноте, затем выбросьте раствор.
    3. Добавьте 2,5 мл 1x PBS в чашку для культивирования, полностью погрузив конструкции для удаления остатков окрашивающих реагентов.
  6. Ядерное окрашивание с помощью DAPI
    1. Нанесите на конструкции 4 мл раствора для окрашивания DAPI, обеспечивая полное покрытие.
    2. Инкубируйте в темноте при комнатной температуре в течение 20 минут, прежде чем удалять раствор DAPI.
  7. Окончательная промывка и погружение PBS: Добавьте 2,5 мл 1x PBS в чашку для культуры, полностью погрузив конструкции для удаления остатков окрашивающих реагентов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Заранее приготовьте растворы для окрашивания и обращайтесь с ними аккуратно. Ни в коем случае клетки не должны подвергаться высыханию внутри культурального сосуда.
  8. Наблюдение с помощью конфокального микроскопа: Осмотрите и визуализируйте окрашенные конструкции с помощью конфокальной микроскопии, чтобы оценить рост клеток, обеспечив всестороннее документирование результатов.

8. Оценка пролиферации eSMC в напечатанных конструкциях с помощью анализа CCK-8

  1. Удалите питательную среду из конструкций на 7 и 14 день. Промойте конструкции PBS, чтобы удалить остатки среды и оторвавшиеся клетки.
  2. Добавьте раствор CCK-8 в каждую конструкцию, следуя инструкциям производителя. Убедитесь, что объем решения CCK-8 достаточен для полного покрытия каждой конструкции.
  3. Инкубируйте конструкции с раствором CCK-8 при 37 °C в течение 2 ч. После инкубации осторожно переложите надосадочную жидкость на новую 96-луночную пластину.
  4. Измерьте поглощение на длине волны 450 нм с помощью считывателя микропланшетов.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Гранулированная ванна с κ-каррагинановым гелем была получена путем механического дробления объемных гидрогелей в твердую гелевую суспензию. Самое последнее исследование показало, что частицы κ-каррагинана имеют средний диаметр около 642 ± 65 нм с однородной морфологией при 1000 об/мин механическогосмешивания, что значительно меньше, чем размеры микрогелей, ранее описанные в литературе 16,17,18. Более длительное время разрушения и большие скорости приводят к уменьшению размера микрочастиц со временем смешивания 60 минут при 1200 об/мин, что дает субмикрочастицы со средним диаметром 565 ± 86 нм в этом исследовании (дополнительный рисунок 1). Ожидается, что такой малый размер частиц повысит разрешающую способность процессов печати. Эти частицы собираются в гранулированный гель за счет образования водородных связей и катионных взаимодействий (рис. 1A). При воздействии на нагрузку субмикрогелевая среда κ-каррагинана проявляет характерные свойства, такие как податливость, истончение при сдвиге и обратимый переход от заклинивания к расклиниванию, которые необходимы для успешной встроенной 3D-биопечати. На рисунке 1B показаны репрезентативные характеристики текучести и истончения при сдвиге гранулированных гелей κ-каррагинана при испытании на рампу потока. При увеличении скорости сдвига с 0,001 до 10 с-1 напряжения сдвига для гранулированных гелей κ-каррагинана 0,35% (масс./об.) остаются относительно неизменными при скоростях сдвига ниже 0,3 с-1, что указывает на низкий предел текучести 3,5 Па. Впоследствии было замечено, что напряжения сдвига линейно увеличиваются со скоростью сдвига, предполагая поведение потока, напоминающее поведение жидкости Бингема. Кроме того, реологические измерения субмикрогелей κ-каррагинана с подсчетом деформации показывают характерный переход от геля к золю. Эти гели дают выход при штаммах, превышающих 10%, и претерпевают переход гель-золь при штамме 35% (рис. 1C). Малый выход гелей субмикрочастиц объясняется физической сетью, созданной посредством водородных связей и катионных взаимодействий. Такое поведение перехода гель-соль обратимо. Как показано на рисунке 1D, при деформации 100% модуль накопления субмикрогелей κ-каррагинана резко падает от 38 Па до 6 Па, что ниже модуля потерь, что указывает на зольное состояние. И наоборот, при резком снижении деформации до 1% модуль накопления быстро возвращается примерно к 38 Па. Он превышает модуль потерь в течение 5 с, что позволяет предположить, что субмикрогели κ-каррагинана способны быстро восстанавливать физические связи между частицами.

Гранулированные κ-каррагинановые гели, характеризующиеся своей небольшой и однородной морфологией, демонстрируют свойства истончения при сдвиге, быстрое самовосстановление и характеристики предела текучести, что является преимуществом для их использования во встраиваемых приложениях 3D-биопечати. Для оценки эффективности субмикрогелевой суспензии κ-каррагинана в качестве поддерживающей ванны для встроенной печати широко используемые биочернила, состоящие из 10% (масс./об.) метакрилата желатина и 6% (масс./об.) композитов метаакрилата шелкового фиброина (GelMA/SFMA), используют для испытаний печати в среде κ-каррагинана 19,20. GelMA был помечен родамином для улучшения визуализации21. Как показано на рисунке 2A, гранулированная ванна с гелем κ-каррагинана обладает высокой прозрачностью, что облегчает мониторинг процесса печати в режиме реального времени. Скорость сдвига, создаваемая соплом, колеблется от 0,66 до 6 с-1 при изменении скорости сопла в диапазоне 10-90 мм/с. Субмикрогелевая ванна с κ-каррагинаном по-прежнему проявляет способность к самовосстановлению в течение 20 с при непрерывном циклическом сдвиге с чередующимися скоростями 6 с-1 и 0,01 с-1 (дополнительный рисунок 2). Сетчатую структуру размером 15 x 15 x 2мм3 с толщиной слоя 150 мкм выдерживали в субмикрогелевой ванне κ-каррагинана. Примечательно, что сетка продемонстрировала замечательную целостность и разрешение, при этом ширина отдельных нитей составляет около 200 мкм, а расстояние между нитями составляет около 350 мкм, что подтверждено изображениями конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (CLSM) (рис. 2B, C). Кроме того, структура 3D-сетки представляла собой пористую сетку с соединенными между собой порами. Это жизненно важные характеристики, которые влияют на печатность и в конечном итоге влияют на клеточное поведение, такое как выживание клеток, пролиферация и потенциал дифференцировки.

Для дальнейшего подтверждения пригодности субмикрогелевой среды κ-каррагинана для создания сложных тканевых и органных структур модель сердца человека и трехстворчатый сердечный клапан были изготовлены с использованием чернил GelMA/SFMA с высокой плотностью заполнения 80%. Напечатанная модель сердца точно воспроизводит 3D-анатомическую форму, включая основные вены и артерии (Рисунок 2D), и демонстрирует механическую стабильность после удаления воды (Рисунок 2E). Трехстворчатый сердечный клапан имеет отчетливые створки клапана и поддерживающие структуры (Рисунок 2F). Кроме того, нити внутри конструкций легко отслаиваются (рисунок 2G). Кроме того, точно воссоздается иерархическая циклическая модель, такая как пищевод. Как показано на рисунках 2H и 2I, напечатанный пищевод демонстрирует четкую стратификацию с четкими границами между отдельными слоями для репликации соответствующих слоев пищеводной ткани, что позволяет предположить, что субмикрогелевая среда κ-каррагинана поддерживает структурную сложность, необходимую для тканевой инженерии. В то время как текущая модель не в состоянии воспроизвести полную функциональность подлинных тканей и органов человека, субмикрогелевая ванна с κ-каррагинаном потенциально предлагает жизнеспособную и многообещающую стратегию для изготовления in vitro сложных тканей и органов с потенциальными применениями в исследованиях, терапии и диагностике.

Решетчатые каркасы с продольной и поперечной анизотропией имитируют мышечный слой пищевода (рис. 3A, B), состоящий из отчетливого внутреннего круглого мышечного слоя и внешнего продольного мышечного слоя. Чтобы воспроизвести эту анизотропную архитектуру in vitro, гладкомышечные клетки пищевода кролика (eSMC) были тщательно внедрены в биочернила GelMA/SFMA. С помощью субмикрогелевой среды κ-каррагинана был успешно получен биомиметический каркас с eSMC, который очень напоминал двухслойную мышечную структуру пищевода. Жизнеспособность клеток, инкапсулированных в гидрогели, оценивали с помощью окрашивания «живой/мертвый» после 5 ч культивирования. Было выявлено преобладающее присутствие живых клеток (окрашенных в зеленый цвет) и минимальная доля мертвых клеток (окрашенных в красный цвет) в гидрогелевых сетях, что указывает на высокую жизнеспособность клеток (рис. 3C). Количественный анализ показал удивительно высокую выживаемость — до 92% (Рисунок 3D). Эти результаты указывают на биосовместимость гидрогелевого материала, а также на эффективность методологий печати и сшивания в сохранении целостности клеток. Для дальнейшего изучения морфологии клеток в конструкциях GelMA/SFMA были получены изображения фаллоидина (зеленый)/DAPI (синий) после 3 дней культивирования клеток. Как показано на рисунке 3E, значительное количество eSMC в биомиметических конструкциях проецировало обилие псевдоподиев и демонстрировало выравнивание вдоль микроволокон, как показано после 3 дней культивирования. 3D-реконструкция еще раз подтверждает точную репликацию мышечных слоев пищевода (дополнительный рисунок 3). Кроме того, пролиферацию eSMC оценивали с помощью анализа CCK-8 на 1, 7 и 14 день. Значения степени поглощения при длине волны 450 нм заметно увеличивались с 1-го по 7-й и 14-й день, что отражает устойчивое пролиферативное поведение (дополнительный рисунок 4). Эти результаты указывают на значительный потенциал субмикрогелевой среды κ-каррагинана в содействии высококачественной биомиметической биопечати.

figure-results-1
Рисунок 1: Самоорганизующаяся субмикрогелевая среда κ-каррагинана и анализ ее реологии. (A) Схематическое изображение субмикрогелевого поплавка κ-каррагинана, образованного в результате водородных связей и катионных взаимодействий для встроенной 3D-биопечати. (B) Нарастание потока на 0,35% (масс./об.) застрявших субмикрогелях κ-каррагинана при 25 °C. (C) Измерения перехода гель-золь в субмикрогелях κ-каррагинана с помощью амплитудного развертки от 0,1% до 100% при 25 °C. (D) Анализ самовосстановления в субмикрогелях κ-каррагинана 0,35% (масс./об.) при непрерывном циклическом сдвиге при чередовании 1% и 100% деформаций при 25 °C. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-2
Рисунок 2: Высокоточная встроенная 3D-биопечать меченых родамином чернил GelMA/SFMA с использованием субмикрогелевой суспензионной ванны κ-каррагинана. (A) Наблюдение за встроенной 3D-печатью в субмикрогелевой суспензионной ванне κ-каррагинана в режиме реального времени. (В, В) Изображения с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа, иллюстрирующие (B) 3D-реконструкцию и (C) внутреннюю структуру напечатанных сеток. (Д, Д) Фотографии напечатанной на 3D принтере модели сердца в водном растворе (D) и в естественном состоянии (E). (F) Изображения трехстворчатого сердечного клапана и (G) нитей, отслаивающихся от конструкций. (H) Фотографии сверху и (I) Фотографии вида спереди, на которых запечатлена модель пищевода, напечатанная чернилами GelMA/SFMA, демонстрирующие иерархические четырехслойные структуры. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-3
Рисунок 3: Встроенная клеточная биопечать с использованием субмикрогелевой суспензионной ванны κ-каррагинана. (A, B) Принципиальные диаграммы (A) внутренней круглой и внешней продольной мышечной структуры пищевода и (B) анизотропного биомиметического каркаса пищеводного мышечного слоя, полученного методом встроенной 3D-биопечати. (C) Изображения окрашивания живых/мертвых и (D) количественная жизнеспособность eSMC, выращенных в каркасе GelMA/SFMA в течение 5 ч. (E) Проекционные изображения eSMC, выращенных в каркасах GelMA/SFMA на 3-й день. Слева направо: ядро, F-актин и вид слияния. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Дополнительный рисунок 1: (A) Изображение сканирующей электронной микроскопии, показывающее гомогенную морфологию субмикрогелей κ-каррагинана. (B) Распределение микрочастиц κ-каррагинана по диаметру измеряли с помощью лазерного нанометрового анализатора размера частиц. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 2: Анализ самовосстановления субмикрогелей κ-каррагинана в концентрации 0,35% (масс./об.) при непрерывном циклическом сдвиге при чередовании 0,01 с-1 и 6 с-1 при 25 °C. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 3: 3D-реконструкция изображения напечатанных сеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 4: Пролиферативная активность eSMC, инкапсулированных в гидрогель GelMA/SFMA через 1, 7 и 14 дней, оценивалась с помощью анализа CCK-8 (n = 3). Статистическая значимость была проанализирована с помощью одностороннего анализа ANOVA с последующим апостериорным анализом Тьюки между тремя группами: **p<0,01, ****p < 0,0001. Данные отображаются в виде среднего ± стандартного отклонения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Приготовление субмикрогелевых суспензионных ванн κ-каррагинана для использования в биопечати представляет собой тщательно организованный процесс, который включает в себя несколько критически важных этапов, чтобы убедиться, что полученная среда проявляет желаемые свойства для поддержки биочернил. Первоначально раствор κ-каррагинана получают путем растворения порошка κ-каррагинана в деионизированной воде при повышенных температурах, создавая однородную смесь. Концентрация раствора является ключевой и должна быть оптимизирована для последующего гелеобразования. 0,3-0,6% (масс./об.) κ-каррагинан продемонстрировал отличные характеристики при встраиваемой 3D-биопечати15. После остывания этот раствор переходит в объемный гель.

Затем объемный гель подвергается стратегии механического измельчения для получения субмикрогелевых частиц. При этом действуют механические силы с большими сдвиговыми усилиями, которые разбивают гель на частицы одинакового размера. Параметры процесса измельчения, включая интенсивность сдвига, время и температуру, точно контролируются для достижения желаемого распределения частиц по размерам. После измельчения субмикрогелевые частицы хранятся при температуре 25-37 °C для предотвращения агрегации или растворения, что необходимо для поддержания однородной суспензии, поддерживающей сложные задачи биопечати. Рекомендуется готовить и использовать гель незамедлительно.

Производство субмикрогелевых суспензионных ванн с κ-каррагинаном простое в эксплуатации, что обеспечивает соответствие промышленным приложениям и растущему спросу на крупномасштабные усилия в области тканевой инженерии и регенеративной медицины. Кроме того, в субмикрогелевых суспензионных ваннах κ-каррагинана в качестве растворителя используется совместимая с клетками PBS или культуральная среда, что обеспечивает превосходную биосовместимость и делает ее идеальной средой для поддержки клеток в биопечатных конструкциях. Срок годности гранулированного геля составляет около 1 месяца в условиях асептического приготовления.

Субмикрогелевая ванна κ-каррагинана, характеризующаяся пластическим потоком по методу Бингема (рис. 1B), демонстрирует превосходные свойства истончения при сдвиге в сочетании со способностью к быстрому самовосстановлению (рис. 1C, D), что имеет решающее значение для повышения точности напечатанных конструкций. Применение этой субмикрогелевой ванны доказало свою эффективность при создании тканей с многоуровневой архитектурой (Рисунок 2), обеспечивая создание структур с высокой точностью и разрешением. Следует отметить, что способность к быстрому распространению псевдоподиев в клетках, встроенных в нагруженные клетками биочернила (рис. 3), подчеркивает совместимость ванны с клеточными процессами. Следовательно, эта субмикрогелевая ванна с κ-каррагинаном имеет революционные перспективы в области производства тканей и органов in vitro. Он окажет глубокое влияние на тканевую инженерию и регенеративную медицину, позволяя разрабатывать более сложные, жизнеспособные и функционально интегративные тканевые конструкции.

Несмотря на значительный потенциал субмикрогелевого ванны κ-каррагинана для применения в биопечати и тканевой инженерии, все еще существует ряд проблем и ограничений. Основная проблема заключается в том, что его состав должен быть очень похож на среду для культивирования клеток, что имеет решающее значение для поддержания жизнеспособности клеток при длительной печати больших органов. Субмикрогели κ-каррагинана преимущественно производятся с использованием PBS в качестве растворителя, что требует включения различных сред для клеточных культур для растворения материала. В дополнение к PBS, κ-каррагинан также желатинизируется с помощью раствора хлорида кальция. Однако раствор хлорида кальция может вызвать токсичность для клеток или создать дисбаланс осмотического давления. Таким образом, использование среды для культивирования клеток было бы идеальным для растворителей κ-каррагинана и сшивающих агентов. Кроме того, достижение высокой производительности стерильного производства микрогелей представляет собой серьезную проблему. Стерилизация растворов κ-каррагинана требует фильтрации через фильтр 0,22 мкм при повышенных температурах. Однако выход стерильного κ-каррагинана часто затруднен различными факторами, в том числе качеством раствора PBS и охлаждением κ-каррагинана в процессе фильтрации. В результате каждой партии фильтрации обычно получается всего 20-50 мл стерильного κ-каррагинана, что создает значительный барьер для высокопроизводительного производства микрогелей κ-каррагинана. Следовательно, будущие исследования будут сосредоточены на оптимизации процесса биопроизводства, оценке долгосрочной жизнеспособности и функции клеток, а также изучении интеграции напечатанных тканей в живые системы.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют финансовой заинтересованности в продуктах, описанных в данной рукописи.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было поддержано Фондом естественных наук Нинбо (2022J121, 2023J159), ключевым проектом Фонда естественных наук города Нинбо (2021J256), Открытым фондом Государственной ключевой лаборатории молекулярной инженерии полимеров (Университет Фудань) (K2024-35) и Ключевой лабораторией точной медицины атеросклеротических заболеваний провинции Чжэцзян, Китай (2022E10026). Благодарим за техническую поддержку со стороны Центра медицинских наук Университета Нинбо Core Facilities.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
3D биопринтерСпециально разработанный
4',6-Diamidino-2-PhenylindoleSolarbio Life ScienceC0065Готовый к использованию
405 нм УФ-светEFLXY-WJ01
Счетчик клетокCorningCyto smart 6749
Конфокальный лазерный сканирующий микроскопLeicaSTELLARIS 5
DMEM с высоким содержанием глюкозыVivaCellC3113-0500высоким содержанием глюкозы, с пируватом натрия и L-глутамином
Динамический ротационный реометрTA InstrumentDiscovery HR-20
Гладкомышечные клетки пищеводаПредоставлено Департаментом клеточной биологии и регенеративной медицины, Центром медицинских наук, УниверситетПервичные клетки из пищевода кролика
Фетальная бычья сывороткаUEF9070L
Флуоресцеин изотиоцианат меченый фаллоидинSolarbio Life ScienceCA1610300T
Желатин метакрилатEFL EFL-GM-6060% замена
k-каррагинанАладдинC121013-100гРеагент марки
Лития Фенил (2,4,6-триметилбензоил) фосфинатАладдинL157759-1г365~405 нм
Набор Live-DeadbeyotimeC2015M
Микропланшетный считывательPotenovPT-3502B
ПараформальдегидSolarbio Life ScienceP1110 4%
Пенициллин/стрептомицинSolarbio Life ScienceMA0110100 &aute;
Фосфатно-солевой буферVivaCellC3580-0500pH 7,2-7,4
Метакрилат фиброина шелкаEFL EFL-SilMA-00139% замена
Triton X-100Solarbio Life ScienceT8200
Трипсин-ЭДТАVivaCellC100C10,25%, без фенола красного
с Нинбо

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Xu, X., et al. Biodegradable engineered fiber scaffolds fabricated by electrospinning for periodontal tissue regeneration. J Biomater Appl. 36 (1), 55-75 (2021).
  2. Amann, E., et al. A graded, porous composite of natural biopolymers and octacalcium phosphate guides osteochondral differentiation of stem cells. Adv Healthcare Mater. 10 (6), e2001692(2021).
  3. Afjoul, H., et al. Freeze-gelled alginate/gelatin scaffolds for wound healing applications: An in vitro, in vivo study. Mater Sci Eng C. 113, 110957(2020).
  4. Hasanzadeh, R., et al. Biocompatible tissue-engineered scaffold polymers for 3D printing and its application for 4D printing. Chem Eng J. 476, 146616(2023).
  5. Fu, L., et al. Cartilage-like protein hydrogels engineered via entanglement. Nature. 618 (7966), 740-747 (2023).
  6. Bertsch, P., et al. Self-healing injectable hydrogels for tissue regeneration. Chem Rev. 123 (2), 834-873 (2023).
  7. Hinton, T. J., et al. Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels. Sci Adv. 1 (9), e1500758(2015).
  8. Wang, S., et al. 3d bioprinting of neurovascular tissue modeling with collagen-based low-viscosity composites. Adv Healthcare Mater. 12 (25), e2300004(2023).
  9. Sreepadmanabh, M., et al. Jammed microgel growth medium prepared by flash-solidification of agarose for 3d cell culture and 3d bioprinting. Biomed Mater. 18 (4), 045011(2023).
  10. Zeng, J., et al. Comparative analysis of the residues of granular support bath materials on printed structures in embedded extrusion printing. Biofabrication. 15 (3), 035013(2023).
  11. Terpstra, M. L., et al. Bioink with cartilage-derived extracellular matrix microfibers enables spatial control of vascular capillary formation in bioprinted constructs. Biofabrication. 14 (3), 034104(2022).
  12. Compaan, A. M., et al. Gellan fluid gel as a versatile support bath material for fluid extrusion bioprinting. ACS Appl Mater Inter. 11 (6), 5714-5726 (2019).
  13. Compaan, A. M., Song, K., Chai, W., Huang, Y. Cross-linkable microgel composite matrix bath for embedded bioprinting of perfusable tissue constructs and sculpting of solid objects. ACS Appl Mater Inter. 12 (7), 7855-7868 (2020).
  14. Zhang, H., et al. Direct 3D printed biomimetic scaffolds based on hydrogel microparticles for cell spheroid growth. Adv Funct Mater. 30 (13), 1910573(2020).
  15. Zhang, H., et al. Cation-crosslinked κ-carrageenan sub-microgel medium for high-quality embedded bioprinting. Biofabrication. 16, 025009(2024).
  16. Lee, A., et al. 3d bioprinting of collagen to rebuild components of the human heart. Science. 365 (6452), 482-487 (2019).
  17. Yao, J., et al. Slightly photo-crosslinked chitosan/silk fibroin hydrogel adhesives with hemostasis and anti-inflammation for pro-healing cyclophosphamide-induced hemorrhagic cystitis. Mater Today Bio. 25, 100947(2024).
  18. Senior, J. J., et al. Agarose fluid gels formed by shear processing during gelation for suspended 3d bioprinting. J Vis Exp. (195), e64458(2023).
  19. Roche, C. D., et al. durability, contractility and vascular network formation in 3d bioprinted cardiac endothelial cells using alginate-gelatin hydrogels. Front Bioeng Biotech. 9, 63657(2021).
  20. Wang, D., et al. Microfluidic bioprinting of tough hydrogel-based vascular conduits for functional blood vessels. Sci Adv. 8 (43), eabq6900 (2022).
  21. Shao, L., Hou, R. X., Zhu, Y. B., Yao, Y. D. Pre-shear bioprinting of highly oriented porous hydrogel microfibers to construct anisotropic tissues. Biomater Sci. 9 (20), 6763-6771 (2021).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Kappa Carrageenan Microgels3D BioprintingTissue EngineeringGranular Hydrogel BathBioink DepositionMechanical GrindingCell Laden BioinksPhoto Cross Linking

Похожие статьи