Изучение влияния вдыхаемых загрязнителей окружающей среды на обонятельную функцию у мышей

Краткое содержание

В данной статье представлено подробное описание теста на захороненную пищу и эксперимента по различению социальных запахов для оценки влияния воздействия вдыхаемых загрязнителей окружающей среды на обонятельную функцию у мышей.

Аннотация

Нарушение обоняния является серьезной проблемой общественного здравоохранения и независимо прогнозирует риск нейродегенеративных заболеваний. Воздействие вдыхаемых загрязнителей окружающей среды может ухудшить обоняние; В связи с этим существует острая потребность в методах оценки воздействия вдыхаемых загрязнителей окружающей среды на обоняние. Мыши являются идеальными моделями для обонятельных экспериментов из-за их высокоразвитой обонятельной системы и поведенческих характеристик. Для оценки влияния воздействия вдыхаемых загрязнителей окружающей среды на обонятельную функцию у мышей проводится подробный эксперимент по тестированию закопанных продуктов питания и социальному различению запахов, включая подготовку к эксперименту, выбор и строительство экспериментальных помещений, процесс тестирования и временные индексы. Между тем, для обеспечения успеха анализа обсуждаются оборудование для измерения времени, операционные детали и экспериментальная среда. Сульфат цинка используется в качестве обработки для демонстрации осуществимости экспериментального подхода. Протокол обеспечивает простой и понятный рабочий процесс оценки воздействия вдыхаемых загрязнителей окружающей среды на обонятельную функцию у мышей.

Введение

Нарушение обоняния стало заслуживающей внимания проблемой общественного здравоохранения и независимо связано с повышенным риском нейродегенеративных заболеваний. Это состояние может негативно сказаться на общем самочувствии, способствовать развитию депрессивных симптомов и привести к снижению качества жизни. Его влияние заметно проявляется в измененном восприятии пищи, препятствиях в социальном общении и усилении негативных чувств¹. Различные факторы, включая синоназальные заболевания, инфекции верхних дыхательных путей и черепно-мозговую травму, считаются факторами, способствующими нарушению обоняния у людей². Примечательно, что вдыхаемые загрязнители окружающей среды, такие как PM2,5, по оценкам, составляют от 2% до 16%, попадают в организм через вдыхаемый воздух, пересекают носовую полость и достигают определенных областей, предназначенных для обоняния, где они откладываются 3,4,5,6,7. Последние результаты показывают, что вдыхаемые загрязнители окружающей среды, включая PM2,5 и аммиак, действительно могут нанести вред обонятельным сенсорным нейронам ^8,9,10. Тем не менее, требуется дальнейшая валидация, чтобы установить, приводит ли такое повреждение непосредственно к обонятельной дисфункции. Следовательно, тщательная оценка воздействия вдыхаемых загрязнителей окружающей среды на обонятельную функцию имеет особое значение.

В настоящее время многочисленные исследовательские лаборатории используют мышей в качестве альтернативной модели позвоночных для поведенческих экспериментов, направленных на понимание изменений в обонятельной функции 11,12,13,14. Мыши были выбраны в качестве предпочтительной модельной системы для изучения химической коммуникации позвоночных, и они демонстрируют замечательную обонятельную чувствительность, имеющую решающее значение для поиска пищи и^{социальной коммуникации.} Кроме того, постоянно развивающийся набор инструментов для наблюдения и влияния на поведение мышей сделал этот вид исключительно привлекательным для исследований обонятельной^{функции.}

В этом исследовании мы использовали тест на закопанную пищу и эксперимент по социальной дискриминации запахов для оценки обонятельных нарушений на мышиной модели, подвергшейся воздействию вдыхаемых загрязнителей окружающей среды. Чтобы повысить точность оценки, мы выбрали наиболее репрезентативный метод оценки обонятельной функции. Мы систематически совершенствовали этот метод, чтобы обеспечить простоту и ясность, что позволяет нам эффективно измерять степень обонятельной дисфункции, вызванной вдыхаемыми загрязнителями окружающей среды.

Протокол

Для всех поведенческих тестов мы использовали самцов мышей C57BL/6J (возраст: 6-8 недель; вес: 20-22 г). Мышей подвергали воздействию устойчивых условий (т.е. температура 23 ± 1 °C; влажность 55% ± 5% и 12-12-часовой цикл свет-темнота с включенным освещением в 7:00). Все поведенческие тесты проводились в период с 10:00 до 17:00. Все эксперименты на животных были одобрены Этическим комитетом Профессионального комитета по экспериментам на животных Университета Циндао. После 1-недельного периода акклиматизации все мыши подверглись воздействию вдыхаемых загрязнителей окружающей среды.

1. Воздействие загрязняющих веществ

1. Интраназальное введение методом инстилляции
   1. Растворите вдыхаемые загрязнители окружающей среды в 0,9% физиологическом растворе. Используйте 5% раствор сульфата цинка один раз, который, как было доказано, вызывает обонятельную дисфункцию¹⁷. Для контрольных мышей вводят 0,9% обычный физиологический раствор.
   2. Обезболивайте мышь путем внутрибрюшинного введения 1% пентобарбитала натрия¹⁸ и оцените глубину анестезии с помощью рефлекса пальцев ног. Нанесите ветеринарную мазь на глаза мыши, чтобы предотвратить сухость. Расположите мышь на спине на наклонной поверхности головой вниз.
   3. С помощью пистолета-пипетки введите 10 мкл раствора в одну ноздрю мыши, что позволяет естественным образом вдыхать раствор в носовую полость.
   4. Чтобы обеспечить хорошее самочувствие мыши и предотвратить возможный дискомфорт, повторите ингаляцию для другой ноздри с интервалом в 10 минут.
   5. Через 3 дня после интраназального введения путем инстилляции мышам проведите тест с закопанной пищей.

2. Тест на закопанную пищу

1. Проведите депривацию пищи за 18-24 ч до испытания, удалив все гранулы корма из бункера для корма домашней клетки. Смените материалы подстилки для мышей. Не вынимайте бутылку с водой.
2. Расположите операционный стол так, как описано ниже.
   1. За 1 ч до начала теста отведите клетку с мышами в операционную для отдыха.
   2. Обустройте операционную в этот период. Используйте и обозначьте прозрачные стандартные клетки для мышей из ПВХ как A, так как они создают знакомую среду. Используйте и обозначьте испытательную клетку как B, которая представляет собой прозрачную клетку для белок стандартного ПВХ. Отметьте общую клетку, в которую помещали мышей после эксперимента, как клетку С.
   3. Накройте клетки А и В 3 см подстилочного материала и отмерьте их линейкой. Расположите клетки рядом, с расстоянием 0,5 м между каждой клеткой (Рисунок 1).
   4. Определите экспериментальную зону как область радиусом 2 м, где центром являются центры клеток. Определите область за пределами диапазона 2 м в качестве зоны наблюдения.
   5. Держите клетку C и клетки с непроверенными мышами как можно дальше от экспериментальной зоны.
3. Запишите время, необходимое для поиска еды, как описано ниже.
   1. Выберите случайным образом место в клетке Б, закопайте корм на 1 см ниже поверхности подстилки и разровняйте поверхность подстилки.
   2. Поместите мышь в клетку А на 4 минуты. По окончании тайминга перенесите мышей в клетку В, включите видеоустройство и вернитесь в зону наблюдения.
   3. Когда мышь возьмет блок корма передней лапой, остановите видеозапись. В некоторых случаях можно увидеть, как мыши едят, склонив голову над едой. Такое поведение также указывает на успех испытания, даже если мышь не держит пищу передней лапой.
   4. Запись данных. Запишите время от контакта с ковриком на дне клетки B до того, как будет найден корм для каждой мыши. Если мыши не находят пищу через 4 минуты, запишите время поиска как время задержки в 240 с.
   5. Поместите мышь в клетку C после теста.
   6. Выньте корм из клетки Б и положите его в герметичный пакет. Замените корм в клетке B и проверьте следующую мышь после смены материала подстилки, как описано ниже.
      1. Для мышей, содержащихся в одной клетке, тестируйте с одним и тем же набором материалов подстилки в клетке В. Для мышей в разных клетках очистите клетку спиртом и замените подстилочные материалы.
   7. Добавляйте мышам корм и воду после эксперимента. Проведите эксперимент по распознаванию социальных запахов через 1 день.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Маски необходимо носить на протяжении всего процесса, а прозрачные перчатки необходимо менять после того, как каждая мышь закончит эксперимент, чтобы максимально избежать пересечения запахов. Амплитуда движений должна быть как можно меньше, чтобы избежать стресса у мыши.

3. Эксперимент по социальной дискриминации запахов

1. Сбор мочи
   1. Отдельно соберите мочу половозрелых самцов мышей и самок мышей и аликвоту в пробирки в равных объемах¹⁹. Упакуйте в микроцентрифужные пробирки объемом 2 мл по 300 мкл мочи в каждой пробирке.
   2. Храните образцы при температуре -80 ° C до использования. Встряхните пробирки, чтобы равномерно распределить образец после размораживания. Не размораживайте и не замораживайте образец повторно.
2. Расположите операционный стол так, как описано ниже.
   1. За 1 ч до начала теста отведите клетку с мышами в операционную для отдыха.
   2. Организуйте операционную в течение этого периода, как описано в шагах 2.2.2-2.2.5.
3. Запишите время обнаружения мочи, как описано ниже.
   1. Сделайте канавку с помощью ленты вокруг каждой из двух широких сторон клетки В, достаточно большую, чтобы вместить микроцентрифужную пробирку, содержащую 300 мкл мужской и женской мочи. Поместите трубки и пока держите две крышки трубок закрытыми.
   2. Поместите мышь в клетку А и установите обратный отсчет на 4 минуты. Откройте две пробирки клетки B в конце тайминга.
   3. Перенесите мышь в среднее положение клетки В, на одинаковом расстоянии от двух трубок, затем включите видеозаписывающее оборудование и аккуратно и медленно отойдите к зоне наблюдения.
   4. Когда мышь обнюхивает стенку/рот трубки или даже внутри трубки, трубка успешно чувствует запах. В это время нажмите секундомер и запишите время как время запаха трубки (M s), затем продолжайте записывать время пребывания (X с), пока мышь не отойдет от трубки.
   5. Продолжайте отсчитывать время, нюхая другую трубку. Когда мышь обнюхивает стенку/рот трубки или даже внутри трубки, трубка успешно чувствует запах. Нажмите секундомер и запишите время, затраченное на то, чтобы понюхать другую трубку (N с), затем продолжайте записывать время пребывания (Y с), пока мышь не отойдет от трубки.
   6. В конце эксперимента перенесите мышь в клетку C.
   7. Меняйте пробирки для мочи и материал подстилки клетки B после каждого теста на мышах. Положите использованную крысиную мочу в чистый пакет в соответствии с полом.
   8. Смените перчатки и проверьте следующую мышь, как описано выше.
4. Проводите эксперимент в лабораторных условиях без явного запаха. Избегайте средств личной гигиены, которые выделяют резкие запахи. Надевайте перчатки и маски на протяжении всей процедуры, чтобы по возможности избежать пересечения запаха. Амплитуда движений должна быть как можно меньше, чтобы избежать стресса у мыши.

Результаты

Вдыхаемые загрязнители окружающей среды нарушают обонятельную функцию у мышей. Доказано, что атмосферный цинк, выделяемый из мусоросжигательных заводов и автомобилей, является вдыхаемым загрязнителем, который может привести к аллергическому воспалению^{легких20}. Сульфат цинка считается одним из типичных соединений, вызывающих обонятельную дисфункцию²¹. Поэтому мы используем сульфат цинка в качестве средства для воздействия на мышей путем интраназального закапывания и теста с использованием теста на закопанную пищу и эксперимента по различению социального запаха. В тесте на захоронение пищи мышам, подвергшимся воздействию сульфата цинка, потребовалось более 240 с, чтобы найти пищу, по сравнению с контрольной группой (рис. 2). Лишенные пищи мыши с нормальным обонянием обычно находят закопанную пищу в течение 1 минуты. Когда у мышей развивалась обонятельная дисфункция, им требовалось больше времени для поиска пищи или они даже не могли найти ее. По сравнению с контрольной группой, мышам в подвергшейся воздействию группе требовалось больше времени, чтобы найти пищу, с некоторыми случаями, когда они не могли найти пищу в течение 240 секунд, что указывает на повреждение обонятельной функции.

Аналогичные результаты наблюдались в эксперименте по социальной дискриминации запахов. У мышей, подвергшихся воздействию сульфата цинка, в течение установленного времени наблюдения не удавалось понюхать ни самку, ни самку мочи (рис. 3А). По истечении установленного времени мыши, подвергшиеся воздействию сульфата цинка, кратковременно понюхали мочу самок и самцов, но время обнюхивания было значительно меньше, чем у контрольных мышей (рис. 3B). Когда одновременно подаются равные объемы женской и мужской мочи, самцы мышей обычно предпочитают мочу самки²². Мышам в подвергшейся воздействию группе требовалось больше времени, чтобы различать женскую и мужскую мочу, или они даже не могли их различить. В частности, по сравнению с контрольной группой, мыши в подвергшейся воздействию группе проводили больше времени, нюхая мочу, и проводили меньше времени вблизи мочи.

Рисунок 1: Схема таблицы операций. Клетки А и В содержались на расстоянии 0,5 м. Видеозаписывающее оборудование управлялось над клеткой B с помощью держателя мобильного телефона, а видеополе было настроено для записи внутренней среды клетки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Результаты теста закопанных продуктов питания. Статистический анализ контрольных мышей и мышей, подвергшихся воздействию сульфата цинка в поисках пищи. Мыши в контрольной группе находили пищу в течение 30 с, а мыши, подвергшиеся воздействию сульфата цинка, находили пищу более 240 с, что было рассчитано как 240 с. Для сравнения различий между двумя группами был использован независимый выборочный t-критерий. Данные представлены в виде среднего ± SD (n = 3 мыши в группе); ** p < 0,01. Если какое-либо животное не находило пищу через 240 с, время поиска пищи регистрировалось как 240 с, как и в случае со всеми обработанными животными. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3: Эксперимент по различению социальных запахов. (A) Статистический анализ контрольных мышей и мышей, подвергшихся воздействию сульфата цинка в поисках мочи. Мыши в контрольной группе обнаружили мочу в течение 30 с, а мыши, подвергшиеся воздействию сульфата цинка, потратили более 240 секунд на поиск женской или мужской мочи, которая составила 240 секунд. Если какое-либо животное не находило флакон с мочой через 240 с, время нахождения флакона регистрировалось как 240 с, как и в случае со всеми обработанными животными. (B) Время пребывания в контакте с мочой было статистически проанализировано для контрольных мышей и мышей, подвергшихся воздействию сульфата цинка. Для сравнения различий между двумя группами был использован независимый выборочный t-критерий. Данные представлены в среднем ± SD (n = 3 мыши в группе); ** p < 0,01, * p < 0,5. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Обсуждение

В этой статье представлены два фундаментальных протокола, предназначенных для быстрой оценки нарушения обоняния у мышей. Различные вдыхаемые загрязнители окружающей среды приводят к различным уровням обонятельной дисфункции у мышей. Тест на закопанную пищу используется для оценки способности обнаруживать летучие запахи, в то время как эксперимент по различению социальных запахов оценивает способность животного различать и дифференцировать различные социальные запахи. Протокол здесь служит для оценки токсического воздействия загрязнителей окружающей среды на обонятельную функцию.

Вдыхаемые загрязнители окружающей среды, включая озон, аммиак и выхлопные газы дизельного топлива, обладают запахами, которые могут влиять на обонятельное восприятие мышей во время обнюхивания образца^23,24. Важно отметить, что проведение поведенческих экспериментов на мышах сразу после завершения воздействия потенциально может привести к ложноотрицательным^{результатам}. Для решения этой проблемы были реализованы мероприятия по повышению надежности экспериментов. В частности, клетки были тщательно очищены, а материалы подстилки заменены по истечении периода воздействия. В дальнейшем были проведены поведенческие эксперименты с интервалом 24 часа после воздействия²². Эта процедурная корректировка направлена на обеспечение точных и значимых результатов.

В эксперименте по захоронению пищи ключевым параметром было время, затраченное мышами на то, чтобы найти спрятанную пищу. Стоит отметить, что мыши, подвергшиеся стрессу, как правило, демонстрируют повышенную активность и сниженную концентрацию внимания во время тестирования, что потенциально может привести к ложноположительным результатам 25,26,27,28. Поэтому крайне важно следить за тем, чтобы мыши сохраняли спокойствие и не подвергались чрезмерной нагрузке на этапе тестирования. Чтобы избежать возможных помех, мышей перевели из их жилища в зону тестирования за 1 ч до начала эксперимента. Этот шаг был предпринят, чтобы позволить мышам акклиматизироваться и снизить стресс. Для облегчения точной записи времени видеорегистратор активировался при помещении мышей в экспериментальную клетку В, после чего наблюдатели немедленно удалялись в зону наблюдения. Наблюдатели располагались на оптимальном расстоянии 2 м от клетки, что обеспечивало четкое наблюдение без создания помех. Критерии для определения успешного обнаружения пищи включали случаи, когда мыши использовали передние лапы или склоняли голову над пищей. Оба эти поведения были сочтены признаками поиска пищи, что соответствовало общепринятым стандартам¹⁹. В тех случаях, когда несколько мышей в одной и той же группе дозы нуждались в тестировании, их не возвращали в исходную клетку для выращивания, а временно помещали в обычную клетку С. Только после тестирования всех мышей в одной клетке они коллективно возвращались в исходное жилье. Учитывая потенциальный запах тестируемых продуктов, были приняты меры предосторожности для предварительного хранения их в герметичных пакетах и повторного запечатывания или помещения в герметичные контейнеры после использования. Эти меры были реализованы для сохранения целостности условий эксперимента и обеспечения достоверных результатов.

В экспериментах по социальной дискриминации запахов важно использовать образцы мочи, полученные от половозрелых мышей^. Определение половой зрелости основано на возрасте мышей, параметре, который варьируется в зависимости от линии мышей. После сбора мужскую и женскую мочу рекомендуется хранить отдельно в холодильнике при температуре -80 °C. В предыдущих исследованиях для определения времени использовались секундомеры. Однако этот метод имел ограничения, такие как расположение наблюдателей на значительном расстоянии от экспериментальной клетки, что приводило к потенциальным проблемам, таким как неясные наблюдения и неточное время 19,22,29. Чтобы решить эти проблемы, мы усовершенствовали процедуры хронометража, включив в них видеооборудование вместо секундомеров. Эта модификация не только облегчает получение более точных данных, но и позволяет собирать данные от нескольких экспериментальных групп.

В этих экспериментах видеоустройство использовалось для записи поведения мышей, что имеет преимущество в снижении частоты кадров видео и предоставлении возможности наблюдателям более точно регистрировать время различных поведенческих действий мышей, компенсируя недостаток, заключающийся в том, что наблюдатели не могли наблюдать за поведением мышей в зоне наблюдения. Однако недостатком использования видеозаписывающего оборудования является то, что время анализа увеличится. В конце эксперимента нам нужно было снова посмотреть видео, чтобы записать время различных поведенческих действий каждой мыши. Когда количество мышей большое, необходимо анализировать видео каждой мыши, что увеличит трудозатраты лаборатории.

Результаты исследований показывают, что различные вдыхаемые загрязнители окружающей среды могут негативно влиять на обонятельную функцию. В этой статье представлен быстрый, несложный и достаточно точный подход к оценке обонятельной токсичности, связанной с вдыхаемыми загрязнителями окружающей среды. Этот метод имеет решающее значение при проведении оценки риска обонятельной дисфункции, связанной с загрязнителями окружающей среды, у человека.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
0,5-10 мкм; Л  регулируемая микропипетка	Eppendorf, Германия	3123000225	Интраназальное закапывание
0,9% физиологического раствора	Solarbio	7647-14-5	Растворение загрязняющих веществ
Безводный сульфат цинка	Macklin	7733-02-0	Экспонирование мышей
Центрифужная трубка (2 мл)	Biosharp Incorporated	BS-20-M	Размещение мочи
Электронные весы	Changzhou Ohaus Co.	EX125DZH	Весовые анестетики и загрязняющие вещества
GraphPad Prism	GraphPad Программное обеспечение	8.0.1	статистический анализ
Ручной пылеулавливатель	TSI  Встроенный	DuatTrak 8532	Мыши, подвергшиеся воздействию вдыхания,
Видеозаписывающее оборудование	Apple Inc.	iPhone 6s Plus	Время активности мышей было записано
вихревым миксером	Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co.	Вихрь-5	Смешанный раствор