В данной статье представлено подробное описание теста на захороненную пищу и эксперимента по различению социальных запахов для оценки влияния воздействия вдыхаемых загрязнителей окружающей среды на обонятельную функцию у мышей.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Изучение влияния вдыхаемых загрязнителей окружающей среды на обонятельную функцию у мышей
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Нарушение обоняния является серьезной проблемой общественного здравоохранения и независимо прогнозирует риск нейродегенеративных заболеваний. Воздействие вдыхаемых загрязнителей окружающей среды может ухудшить обоняние; В связи с этим существует острая потребность в методах оценки воздействия вдыхаемых загрязнителей окружающей среды на обоняние. Мыши являются идеальными моделями для обонятельных экспериментов из-за их высокоразвитой обонятельной системы и поведенческих характеристик. Для оценки влияния воздействия вдыхаемых загрязнителей окружающей среды на обонятельную функцию у мышей проводится подробный эксперимент по тестированию закопанных продуктов питания и социальному различению запахов, включая подготовку к эксперименту, выбор и строительство экспериментальных помещений, процесс тестирования и временные индексы. Между тем, для обеспечения успеха анализа обсуждаются оборудование для измерения времени, операционные детали и экспериментальная среда. Сульфат цинка используется в качестве обработки для демонстрации осуществимости экспериментального подхода. Протокол обеспечивает простой и понятный рабочий процесс оценки воздействия вдыхаемых загрязнителей окружающей среды на обонятельную функцию у мышей.
Введение
Нарушение обоняния стало заслуживающей внимания проблемой общественного здравоохранения и независимо связано с повышенным риском нейродегенеративных заболеваний. Это состояние может негативно сказаться на общем самочувствии, способствовать развитию депрессивных симптомов и привести к снижению качества жизни. Его влияние заметно проявляется в измененном восприятии пищи, препятствиях в социальном общении и усилении негативных чувств1. Различные факторы, включая синоназальные заболевания, инфекции верхних дыхательных путей и черепно-мозговую травму, считаются факторами, способствующими нарушению обоняния у людей2. Примечательно, что вдыхаемые загрязнители окружающей среды, такие как PM2,5, по оценкам, составляют от 2% до 16%, попадают в организм через вдыхаемый воздух, пересекают носовую полость и достигают определенных областей, предназначенных для обоняния, где они откладываются 3,4,5,6,7. Последние результаты показывают, что вдыхаемые загрязнители окружающей среды, включая PM2,5 и аммиак, действительно могут нанести вред обонятельным сенсорным нейронам 8,9,10. Тем не менее, требуется дальнейшая валидация, чтобы установить, приводит ли такое повреждение непосредственно к обонятельной дисфункции. Следовательно, тщательная оценка воздействия вдыхаемых загрязнителей окружающей среды на обонятельную функцию имеет особое значение.
В настоящее время многочисленные исследовательские лаборатории используют мышей в качестве альтернативной модели позвоночных для поведенческих экспериментов, направленных на понимание изменений в обонятельной функции 11,12,13,14. Мыши были выбраны в качестве предпочтительной модельной системы для изучения химической коммуникации позвоночных, и они демонстрируют замечательную обонятельную чувствительность, имеющую решающее значение для поиска пищи исоциальной коммуникации. Кроме того, постоянно развивающийся набор инструментов для наблюдения и влияния на поведение мышей сделал этот вид исключительно привлекательным для исследований обонятельнойфункции.
В этом исследовании мы использовали тест на закопанную пищу и эксперимент по социальной дискриминации запахов для оценки обонятельных нарушений на мышиной модели, подвергшейся воздействию вдыхаемых загрязнителей окружающей среды. Чтобы повысить точность оценки, мы выбрали наиболее репрезентативный метод оценки обонятельной функции. Мы систематически совершенствовали этот метод, чтобы обеспечить простоту и ясность, что позволяет нам эффективно измерять степень обонятельной дисфункции, вызванной вдыхаемыми загрязнителями окружающей среды.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Для всех поведенческих тестов мы использовали самцов мышей C57BL/6J (возраст: 6-8 недель; вес: 20-22 г). Мышей подвергали воздействию устойчивых условий (т.е. температура 23 ± 1 °C; влажность 55% ± 5% и 12-12-часовой цикл свет-темнота с включенным освещением в 7:00). Все поведенческие тесты проводились в период с 10:00 до 17:00. Все эксперименты на животных были одобрены Этическим комитетом Профессионального комитета по экспериментам на животных Университета Циндао. После 1-недельного периода акклиматизации все мыши подверглись воздействию вдыхаемых загрязнителей окружающей среды.
1. Воздействие загрязняющих веществ
- Интраназальное введение методом инстилляции
- Растворите вдыхаемые загрязнители окружающей среды в 0,9% физиологическом растворе. Используйте 5% раствор сульфата цинка один раз, который, как было доказано, вызывает обонятельную дисфункцию17. Для контрольных мышей вводят 0,9% обычный физиологический раствор.
- Обезболивайте мышь путем внутрибрюшинного введения 1% пентобарбитала натрия18 и оцените глубину анестезии с помощью рефлекса пальцев ног. Нанесите ветеринарную мазь на глаза мыши, чтобы предотвратить сухость. Расположите мышь на спине на наклонной поверхности головой вниз.
- С помощью пистолета-пипетки введите 10 мкл раствора в одну ноздрю мыши, что позволяет естественным образом вдыхать раствор в носовую полость.
- Чтобы обеспечить хорошее самочувствие мыши и предотвратить возможный дискомфорт, повторите ингаляцию для другой ноздри с интервалом в 10 минут.
- Через 3 дня после интраназального введения путем инстилляции мышам проведите тест с закопанной пищей.
2. Тест на закопанную пищу
- Проведите депривацию пищи за 18-24 ч до испытания, удалив все гранулы корма из бункера для корма домашней клетки. Смените материалы подстилки для мышей. Не вынимайте бутылку с водой.
- Расположите операционный стол так, как описано ниже.
- За 1 ч до начала теста отведите клетку с мышами в операционную для отдыха.
- Обустройте операционную в этот период. Используйте и обозначьте прозрачные стандартные клетки для мышей из ПВХ как A, так как они создают знакомую среду. Используйте и обозначьте испытательную клетку как B, которая представляет собой прозрачную клетку для белок стандартного ПВХ. Отметьте общую клетку, в которую помещали мышей после эксперимента, как клетку С.
- Накройте клетки А и В 3 см подстилочного материала и отмерьте их линейкой. Расположите клетки рядом, с расстоянием 0,5 м между каждой клеткой (Рисунок 1).
- Определите экспериментальную зону как область радиусом 2 м, где центром являются центры клеток. Определите область за пределами диапазона 2 м в качестве зоны наблюдения.
- Держите клетку C и клетки с непроверенными мышами как можно дальше от экспериментальной зоны.
- Запишите время, необходимое для поиска еды, как описано ниже.
- Выберите случайным образом место в клетке Б, закопайте корм на 1 см ниже поверхности подстилки и разровняйте поверхность подстилки.
- Поместите мышь в клетку А на 4 минуты. По окончании тайминга перенесите мышей в клетку В, включите видеоустройство и вернитесь в зону наблюдения.
- Когда мышь возьмет блок корма передней лапой, остановите видеозапись. В некоторых случаях можно увидеть, как мыши едят, склонив голову над едой. Такое поведение также указывает на успех испытания, даже если мышь не держит пищу передней лапой.
- Запись данных. Запишите время от контакта с ковриком на дне клетки B до того, как будет найден корм для каждой мыши. Если мыши не находят пищу через 4 минуты, запишите время поиска как время задержки в 240 с.
- Поместите мышь в клетку C после теста.
- Выньте корм из клетки Б и положите его в герметичный пакет. Замените корм в клетке B и проверьте следующую мышь после смены материала подстилки, как описано ниже.
- Для мышей, содержащихся в одной клетке, тестируйте с одним и тем же набором материалов подстилки в клетке В. Для мышей в разных клетках очистите клетку спиртом и замените подстилочные материалы.
- Добавляйте мышам корм и воду после эксперимента. Проведите эксперимент по распознаванию социальных запахов через 1 день.
ПРИМЕЧАНИЕ: Маски необходимо носить на протяжении всего процесса, а прозрачные перчатки необходимо менять после того, как каждая мышь закончит эксперимент, чтобы максимально избежать пересечения запахов. Амплитуда движений должна быть как можно меньше, чтобы избежать стресса у мыши.
3. Эксперимент по социальной дискриминации запахов
- Сбор мочи
- Отдельно соберите мочу половозрелых самцов мышей и самок мышей и аликвоту в пробирки в равных объемах19. Упакуйте в микроцентрифужные пробирки объемом 2 мл по 300 мкл мочи в каждой пробирке.
- Храните образцы при температуре -80 ° C до использования. Встряхните пробирки, чтобы равномерно распределить образец после размораживания. Не размораживайте и не замораживайте образец повторно.
- Расположите операционный стол так, как описано ниже.
- За 1 ч до начала теста отведите клетку с мышами в операционную для отдыха.
- Организуйте операционную в течение этого периода, как описано в шагах 2.2.2-2.2.5.
- Запишите время обнаружения мочи, как описано ниже.
- Сделайте канавку с помощью ленты вокруг каждой из двух широких сторон клетки В, достаточно большую, чтобы вместить микроцентрифужную пробирку, содержащую 300 мкл мужской и женской мочи. Поместите трубки и пока держите две крышки трубок закрытыми.
- Поместите мышь в клетку А и установите обратный отсчет на 4 минуты. Откройте две пробирки клетки B в конце тайминга.
- Перенесите мышь в среднее положение клетки В, на одинаковом расстоянии от двух трубок, затем включите видеозаписывающее оборудование и аккуратно и медленно отойдите к зоне наблюдения.
- Когда мышь обнюхивает стенку/рот трубки или даже внутри трубки, трубка успешно чувствует запах. В это время нажмите секундомер и запишите время как время запаха трубки (M s), затем продолжайте записывать время пребывания (X с), пока мышь не отойдет от трубки.
- Продолжайте отсчитывать время, нюхая другую трубку. Когда мышь обнюхивает стенку/рот трубки или даже внутри трубки, трубка успешно чувствует запах. Нажмите секундомер и запишите время, затраченное на то, чтобы понюхать другую трубку (N с), затем продолжайте записывать время пребывания (Y с), пока мышь не отойдет от трубки.
- В конце эксперимента перенесите мышь в клетку C.
- Меняйте пробирки для мочи и материал подстилки клетки B после каждого теста на мышах. Положите использованную крысиную мочу в чистый пакет в соответствии с полом.
- Смените перчатки и проверьте следующую мышь, как описано выше.
- Проводите эксперимент в лабораторных условиях без явного запаха. Избегайте средств личной гигиены, которые выделяют резкие запахи. Надевайте перчатки и маски на протяжении всей процедуры, чтобы по возможности избежать пересечения запаха. Амплитуда движений должна быть как можно меньше, чтобы избежать стресса у мыши.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Вдыхаемые загрязнители окружающей среды нарушают обонятельную функцию у мышей. Доказано, что атмосферный цинк, выделяемый из мусоросжигательных заводов и автомобилей, является вдыхаемым загрязнителем, который может привести к аллергическому воспалениюлегких20. Сульфат цинка считается одним из типичных соединений, вызывающих обонятельную дисфункцию21. Поэтому мы используем сульфат цинка в качестве средства для воздействия на мышей путем интраназального закапывания и теста с ...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В этой статье представлены два фундаментальных протокола, предназначенных для быстрой оценки нарушения обоняния у мышей. Различные вдыхаемые загрязнители окружающей среды приводят к различным уровням обонятельной дисфункции у мышей. Тест на закопанную пищу используется для оценки способности обнаруживать летучие запахи, в то время как эксперимент по различению социальных запахов оценивает способность животного различать и дифференцировать различные социальные запахи. Протокол здесь служит для оценки токсического воздейст...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Благодарности
Эта работа была выполнена при финансовой поддержке Национального фонда естественных наук Китая (82204088, 82273669) и Фонда естественных наук провинции Шаньдун, Китай (ZR2021QH209).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 0,5-10 мкм; Л регулируемая микропипетка | Eppendorf, Германия | 3123000225 | Интраназальное закапывание |
| 0,9% физиологического раствора | Solarbio | 7647-14-5 | Растворение загрязняющих веществ |
| Безводный сульфат цинка | Macklin | 7733-02-0 | Экспонирование мышей |
| Центрифужная трубка (2 мл) | Biosharp Incorporated | BS-20-M | Размещение мочи |
| Электронные весы | Changzhou Ohaus Co. | EX125DZH | Весовые анестетики и загрязняющие вещества |
| GraphPad Prism | GraphPad Программное обеспечение | 8.0.1 | статистический анализ |
| Ручной пылеулавливатель | TSI Встроенный | DuatTrak  8532 | Мыши, подвергшиеся воздействию вдыхания, |
| Видеозаписывающее оборудование | Apple Inc. | iPhone 6s Plus | Время активности мышей было записано |
| вихревым миксером | Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co. | Вихрь-5 | Смешанный раствор |
Ссылки
- Schäfer, L., Schriever, V. A., Croy, I. Human olfactory dysfunction: causes and consequences. Cell Tissue Res. 383 (1), 569-579 (2021).
- Keller, A., Malaspina, D. Hidden consequences of olfactory dysfunction: a patient report series. BMC Ear Nose Throat Disord. 13 (1), 8(2013).
- Schroeter, J. D., et al. Application of physiological computational fluid dynamics models to predict interspecies nasal dosimetry of inhaled acrolein. Inhal Toxicol. 20 (3), 227-243 (2008).
- Schroeter, J. D., Garcia, G. J., Kimbell, J. S. A computational fluid dynamics approach to assess interhuman variability in hydrogen sulfide nasal dosimetry. Inhal Toxicol. 22 (4), 277-286 (2010).
- Keyhani, K., Scherer, P. W., Mozell, M. M. Numerical simulation of airflow in the human nasal cavity. J Biomech Eng. 117 (4), 429-441 (1995).
- Hahn, I., Scherer, P. W., Mozell, M. M. Velocity profiles measured for airflow through a large-scale model of the human nasal cavity. J Appl Physiol. 75 (5), 2273-2287 (1993).
- Zhang, Z., et al. Exposure to particulate matter air pollution and Anosmia. JAMA Netw Open. 4 (5), e2111606(2021).
- Ekström, I. A., et al. Environmental air pollution and olfactory decline in aging. Environ Health Perspect. 130 (2), 27005(2022).
- Adams, D. R., et al. Nitrogen dioxide pollution exposure is associated with olfactory dysfunction in older U.S. adults. Int Forum Allergy Rhinol. 6 (12), 1245-1252 (2016).
- Prah, J. D., Benignus, V. A. Decrements in olfactory sensitivity due to ozone exposure. Percept Mot Skills. 48 (1), 317-318 (1979).
- Shi, Z., et al. Chronic exposure to environmental pollutant ammonia causes damage to the olfactory system and behavioral abnormalities in mice. Environ Sci Technol. 57 (41), 15412-15421 (2023).
- Hernández-Soto, R., et al. Chronic intermittent hypoxia alters main olfactory bulb activity and olfaction. Exp Neurol. 340, 113653(2021).
- Islam, S., et al. Odor preference and olfactory memory are impaired in Olfaxin-deficient mice. Brain Res. 1688, 81-90 (2018).
- Wang, H., et al. Inducible and conditional activation of ERK5 MAP kinase rescues mice from cadmium-induced olfactory memory deficits. Neurotoxicology. 81, 127-136 (2020).
- Chamero, P., Leinders-Zufall, T., Zufall, F. From genes to social communication: molecular sensing by the vomeronasal organ. Trends Neurosci. 35 (10), 597-606 (2012).
- Mohrhardt, J., et al. Signal detection and coding in the accessory olfactory system. Chem Senses. 43 (9), 667-695 (2018).
- Liu, X., et al. Type 3 adenylyl cyclase in the MOE is involved in learning and memory in mice. Behav Brain Res. 383, 112533(2020).
- Li, X., et al. Polyhexamethylene guanidine aerosol triggers pulmonary fibrosis concomitant with elevated surface tension via inhibiting pulmonary surfactant. J Hazard Mater. 420, 126642(2021).
- Yang, M., Crawley, J. N. Simple behavioral assessment of mouse olfaction. Curr Protoc Neurosci. , Chapter 8, Unit 8.24 (2009).
- Huang, K. L., et al. Zinc oxide nanoparticles induce eosinophilic airway inflammation in mice. J Hazard Mater. 297, 304-312 (2015).
- Burd, G. D. Morphological study of the effects of intranasal zinc sulfate irrigation on the mouse olfactory epithelium and olfactory bulb. Microsc Res Tech. 24 (3), 195-213 (1993).
- Zou, J., et al. Methods to measure olfactory behavior in mice. Curr Protoc Toxicol. 63, 1-21 (2015).
- Ryalls, J. M. W., et al. Anthropogenic air pollutants reduce insect-mediated pollination services. Environ Pollut. 297, 118847(2022).
- Schiffman, S. S. Livestock odors: implications for human health and well-being. J Anim Sci. 76 (5), 1343-1355 (1998).
- Albrechet-Souza, L., Gilpin, N. W. The predator odor avoidance model of post-traumatic stress disorder in rats. Behav Pharmacol. 30, 2 and 3-Spec Issue 105-114 (2019).
- Davies, D. A., et al. Inactivation of medial prefrontal cortex or acute stress impairs odor span in rats. Learn Mem. 20 (12), 665-669 (2013).
- Landers, M. S., Sullivan, R. M. The development and neurobiology of infant attachment and fear. Dev Neurosci. 34 (2-3), 101-114 (2012).
- Drobyshevsky, A., et al. Antenatal insults modify newborn olfactory function by nitric oxide produced from neuronal nitric oxide synthase. Exp Neurol. 237 (2), 427-434 (2012).
- Arbuckle, E. P., et al. Testing for odor discrimination and habituation in mice. J Vis Exp. (99), e52615(2015).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
