Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Изменение уровней фолиевой кислоты или холина в рационе матери для изучения влияния дефицита на состояние здоровья потомства

1.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/66827

⸱

28 июня 2024 г.

 ,  , 
1Department of Biomedical Sciences, Midwestern University, 2Department of Basic Medical Sciences, College of Medicine Phoenix, University of Arizona, 3Department of Anesthesiology, Pharmacology, & Therapeutics, Faculty of Medicine, University of British Columbia, 4Center of Metabolomics, Institute of Metabolic Disease, Baylor Scott & White Research Institute, 5Department of Physiology, Southern Illinois University, 6Department of Child Health, College of Medicine Phoenix, University of Arizona, 7Department of Neuroscience, Carleton University

В этой статье

Краткое содержание

В этом протоколе описан метод снижения потребления фолиевой кислоты или холина с пищей самками мышей до наступления беременности с целью изучения влияния диеты матери на состояние здоровья потомства.

Аннотация

Материнское питание в период беременности и лактации играет важную роль в нервном развитии потомства. Одноуглеродный (1С) метаболизм, который сосредоточен вокруг фолиевой кислоты и холина, а также других витаминов группы В, играет ключевую роль во время закрытия нервной трубки развивающегося плода. Тем не менее, влияние этих дефицитов питательных веществ у матерей во время беременности на состояние здоровья потомства после рождения остается относительно неопределенным. Кроме того, дефицит фолиевой кислоты или холина в рационе матери может повлиять на другие последствия для здоровья потомства, что делает эту модель ценной. Этот протокол направлен на то, чтобы описать процедуру индуцирования дефицита метаболизма 1С у самок мышей путем модификации рациона. Самок сажают на диету при отъеме, до 2-месячного возраста, за 4-6 недель до спаривания и остаются на диете на протяжении всей беременности и лактации. Потомство от этих самок может быть оценено на предмет состояния здоровья. Самки могут быть использованы несколько раз для получения потомства, а ткани самок могут быть собраны для измерения метаболитов 1С. Этот протокол дает представление о том, как вызвать дефицит фолиевой кислоты или холина в рационе матери для изучения последствий для здоровья потомства.

Введение

Питание матери во время беременности и лактации играет жизненно важную роль в развитии потомства. Одноуглеродный (1С) метаболизм является ключевой метаболической сетью, которая объединяет питательные сигналы с биосинтезом, окислительно-восстановительным гомеостазом и эпигенетикой. Фолиевая кислота и холин являются центральными компонентами 1С, которые играют важную роль в закрытии нервной трубки. Женщинам рекомендуется принимать добавки с фолиевой кислотой и холином в детородном возрасте1. В то время как критическая роль фолиевой кислоты в развитии плода четко установлена, основные механизмы остаются неясными. Женщинам детородного возраста рекомендуется принимать фолиевую кислоту до наступления беременности, так как закрытие нервной трубки происходит в течение первого триместра2. Беременные женщины с дефицитом фолиевой кислоты или других компонентов 1С, таких как холин, имеют более высокую частоту рождения потомства с дефектами нервной трубки из-за высокой потребности в синтезе нуклеотидов и других процессах, необходимых для раннего гестационного периода3.

Долгосрочное влияние рациона матерей с недостаточным потреблением метаболизма 1С на состояние здоровья потомства плохо изучено. Исследования, проведенные в наших лабораториях, а также в других лабораториях, показали, что рацион матерей с дефицитом фолиевой кислоты или холина действительно влияет на состояние здоровья потомства после ишемического инсульта с использованием доклинических моделей 4,5,6. Влияние материнской диеты также было показано в клинических исследованиях, где были описаны меньшие объемы мозга и измененные уровни метилирования7. Теория происхождения здоровья и болезней в развитии (DOHaD) предполагает, что перспективные хронические заболевания запрограммированы в утробе матери 8,9, и материнская диета играет важную роль.

Этот протокол разработан для того, чтобы описать метод изменения потребления 1С с пищей у самок мышей до беременности с целью изучения влияния питания матери на состояние здоровья потомства.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Этот протокол был одобрен, и все животные были использованы в соответствии с руководящими принципами Комитета по институциональному уходу за животными и их использованию Университета Среднего Запада (Протокол 2983). В исследовании использовались самки мышей C57BL/6J в возрасте 2 месяцев (масса тела ~20 г). В целом, самки мышей репродуктивного возраста могут быть использованы10. Чтобы избежать эффекта помета, необходимо использовать несколько самок для каждой диеты11. Подробная информация о реагентах и оборудовании, использованном в исследовании, приведена в Таблице материалов.

1. Подготовка к эксперименту

  1. Получите диету с дефицитом фолиевой кислоты или холина от коммерческих производителей кормов для грызунов. В таблице 1 приведен подробный список микро- и макроэлементов, включая точное количество фолиевой кислоты или холина, необходимых при дефиците рациона питания.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Также необходимо заказать соответствующую контрольную диету; Подробности приведены в таблице 1. Эти рационы были основаны на AIN93G и содержали рекомендуемые питательные вещества для грызунов10.
  2. В сотрудничестве с производителем определите окраску рационов, так как это может помочь с распределением правильных рационов питания во время экспериментальных исследований. В этом исследовании использовался зеленый цвет для диет с дефицитом фолиевой кислоты, желтый для холина и белый для контрольной диеты. Все они легко различимы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ограничений по потреблению воды нет. Вода не содержит фолиевой кислоты, холина и других метаболитов 1С.

2. Индуцирование дефицита фолиевой кислоты или холина в рационе

  1. Перед тем, как посадить самок на диеты, взвесьте всех животных. Это будет называться базовым весом.
  2. В зависимости от индивидуальной конфигурации лабораторной клетки (вентилируемая или невентилируемая, см. Таблицу материалов) несколько раз в неделю заменяйте или пополняйте специальные диетические гранулы для каждой клетки. Не переполняйте клеточные обручи специальными диетами, так как это может привести к порче гранул при их взаимодействии со слюной животных и порче со временем.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что диетический запас хранится в соответствии с рекомендациями производителя и используется до истечения срока годности.
  3. Поддерживайте самок мышей на диете в течение 4-6 недель до спаривания.
  4. Поместите самцов мышей в клетки самок для спаривания. Убедитесь, что самцы попадают в клетки для самок после того, как самки находятся на специальной диете в течение как минимум 4-6 недель. Посадите одного самца в одну клетку для самки на срок от одного до нескольких дней.
    Примечание: В настоящем исследовании самцы содержались с самками в течение всего эксперимента (~ 4 месяца) для увеличения количества производимых детенышей, поскольку спаривание у мышей может происходить после рождения12 лет. Девочки в возрасте старше 6 месяцев не использовались в каких-либо исследованиях.
  5. Ежедневно проверяйте самок мышей на наличие копулятивной пробки, которая указывает на то, что произошло размножение.
  6. Еженедельно измеряйте вес самок мышей, чтобы отслеживать их здоровье и состояние беременности.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для самок безопасно поддерживать диету во время беременности (~21 день) и лактации (~21 день).
  7. Когда потомство будет отлучено от матери (~21 день после рождения), посадите его на диету с дефицитом фолиевой кислоты и холина, а также на контрольную диету. Подробнее см. раздел с результатами.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При изучении влияния материнской диеты на состояние здоровья потомства рекомендуется, чтобы потомство было помещено на контрольную диету после отлучения от груди. Контрольная диета должна содержать достаточное количество витаминов и питательных веществ для выживания.
  8. В конце исследования (определение еженедельного веса для мониторинга общего состояния здоровья женщин, содержащихся на диете с дефицитом фолиевой кислоты или холина) усыпляют матерей с использованием передозировки CO2 (дозировка, 10-30% смещения объема в минуту, в соответствии с утвержденными в учреждении протоколами) и собирают ткани (шаг 3) для подтверждения дефицита питательных веществ.

3. Забор тканей для измерения 1С и связанных с ним метаболитов

ПРИМЕЧАНИЕ: При усыплении животных важно убедиться, что животные не реагируют на щипки на ногах. Как только животные перестают реагировать, можно начинать рассечение тканей. Ткань, которая будет рассекаться, должна быть определена заранее 13,14, а материалы должны быть подготовлены. К таким материалам относятся пробирки для хранения, соответствующие инструменты для вскрытия, а также сухой лед или жидкий азот.

  1. Забор крови и тканей печени в соответствии с ранее опубликованными протоколами15,16.
    1. Соберите ~500-1000 мкл крови с помощью пункции сердца, следуя приведенным ниже шагам. Для получения подробной информации обратитесь к Parasuraman et al.17:
      1. Сделайте V-образный разрез через кожу и брюшную стенку. Отодвиньте органы брюшной полости в сторону и введите иглу через диафрагму в сердце, чтобы собрать образец крови.
      2. Поместите образцы крови в пробирки с покрытием ЭДТА. Пробирку можно оставить при комнатной температуре до тех пор, пока не будут собраны все пробы.
    2. Открутите образцы крови в центрифуге при 1000-2000 x g в течение 7 минут при 4 °C, чтобы изолировать плазму крови. Соберите плазму в пробирку для микрофуги объемом 1,5 мл и храните ее при температуре -80 °C до анализа.
    3. Чтобы удалить печень, вскрыть брюшную полость и рассечь всю печень в соответствии с ранее опубликованнымпротоколом 15.
      1. После извлечения печени из полости тела разрежьте ткань на более мелкие кусочки маленькими ножницами и заморозьте их с помощью сухого льда или жидкого азота.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Замороженные кусочки ткани можно поместить в криогенную микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл и хранить при температуре -80 °C до проведения анализа.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Основное внимание в этом исследовании уделялось изучению влияния дефицита рациона питания матерей на фолиевую кислоту или холин на состояние здоровья потомства. Еженедельный вес был определен для мониторинга общего состояния здоровья женщин, находящихся на диете с дефицитом фолиевой кислоты или холина. В нашей предыдущей работе не наблюдалось изменений массы тела между группами питания матерей4. На рисунке 1 показан исходный и еженедельный вес самок, которые находилис...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

При внедрении этого протокола в исследовательских лабораториях есть несколько важных моментов, которые исследователи должны учитывать до начала экспериментов. Во-первых, при производстве диеты необходимо дать достаточно времени для изготовления диеты до начала экспериментального исследования. Время выполнения заказа может варьироваться от компании к компании, и доставка диеты также должна быть учтена. Самки мышей, находящиеся в репродуктивном возрасте (~2-2,5 месяца), могут быть помещены на диету за 4-6 недель до спарива...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Пробирки объемом 1,5 млEppendorf
C57BL/6 Самки мышейCharles River27Мышей также можно разводить в домашних условиях.
Диета с дефицитом холинаEnvigoTD.06119
Контрольная диетаEnvigoTD.190790
Трубки ЭДТА Диета
дефицитом фолиевой кислотыEnvigoTD.01546
Призмаhttps://www.graphpad.com/features
Корпус для грызуновLab Products, LLCOne КлеткиВентилируемые стеллажи и Кейджи
Жидкостная хроматография-тандемная масс-спектрометрия (LC-MS/MS)SCIEX, Фрамингем, Массачусетс5500 QTrap
Сверхпроизводительная жидкостная хроматография (UPLC)Шимадзу, Колумбия, Мэриленд, СШАNexera
с GraphPad

Ссылки

  1. Van Gool, J. D., Hirche, H., Lax, H., De Schaepdrijver, L. Folic acid and primary prevention of neural tube defects: A review. Reprod Toxicol. 80, 73-84 (2018).
  2. Ali, S. A., Economides, D. L. Folic acid supplementation. Curr Opin Obstet Gynecol. 12 (6), 507-512 (2000).
  3. Osterhues, A., Ali, N. S., Michels, K. B. The role of folic acid fortification in neural tube defects: a review. Crit Rev Food Sci Nutr. 53 (11), 575966(2013).
  4. Hurley, L. Maternal dietary deficiencies in folic acid and choline result in larger damage volume, reduced neuro-degeneration and -inflammation and changes in choline metabolites after ischemic stroke in middle-aged offspring. Nutrients. 15 (7), 1556(2023).
  5. Clementson, M. Maternal dietary deficiencies in folic acid or choline worsen stroke outcomes in adult male and female mouse offspring. Neural Regen Res. 18 (11), 2443-2448 (2023).
  6. Pull, K., et al. Impact of maternal dietary folic acid or choline dietary deficiencies on vascular function in young and middle-aged female mouse offspring after ischemic stroke. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 325 (6), H1354-H1359 (2023).
  7. Virdi, S., Jadavji, N. M. The impact of maternal folates on brain development and function after birth. Metabolites. 12 (9), 8766(2022).
  8. Barker, D. J. P. Fetal nutrition and cardiovascular disease in later life. Br Med Bull. 53 (1), 96-108 (1997).
  9. Barker, D. J. P. Maternal nutrition, fetal nutrition, and disease in later life. Nutrition. 13 (9), 807-813 (1997).
  10. Jackson, S. J. Does age matter? The impact of rodent age on study outcomes. Lab Anim. 51 (2), 160-169 (2017).
  11. Jiménez, J. A., Zylka, M. J. Controlling litter effects to enhance rigor and reproducibility with rodent models of neurodevelopmental disorders. J Neurodev Disords. 13 (1), 2(2021).
  12. Breeding and Reproduction of Mice - All Other Pets. Merck Veterinary Manual. , Available from: https://www.merckvetmanual.com/all-other-pets/mice/breeding-and-reproduction-of-mice 159-185 (2024).
  13. Jena, S., Chawla, S. The anatomy of the laboratory mouse. Essentials of Laboratory Animal Science: Principles and Practices. , 159-185 (2021).
  14. The anatomy of the laboratory mouse. , Available from: https://www.informatics.jax.org/cookbook/imageindex.shtml (2024).
  15. Mortimer, T., Welz, P. S., Benitah, S. A., Sassone-Corsi, P., Koronowski, K. B. Collecting mouse livers for transcriptome analysis of daily rhythms. STAR Protoc. 2 (2), 100539(2021).
  16. Aboghazleh, R. Rodent brain extraction and dissection: A comprehensive approach. MethodsX. 12, 102516(2024).
  17. Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. J Parmacol Pharmacother. 1 (2), 87-93 (2010).
  18. Jadavji, N. M., Deng, L., Malysheva, O. V., Caudill, M. A., Rozen, R. MTHFR deficiency or reduced intake of folate or choline in pregnant mice results in impaired short-term memory and increased apoptosis in the hippocampus of wild-type offspring. Neuroscience. 300, 1-9 (2015).
  19. Pickell, L., et al. High intake of folic acid disrupts embryonic development in mice. Birth defects research. Birth Defects Res A Clin Mol Teratol. 91 (1), 8-19 (2011).
  20. Mikael, L. G., Deng, L., Paul, L., Selhub, J., Rozen, R. Moderately high intake of folic acid has a negative impact on mouse embryonic development. Birth Defects Res A Clin Mol Teratol. 97 (1), 47-52 (2013).
  21. Mikael, L. G., Pancer, J., Wu, Q., Rozen, R. Disturbed one-carbon metabolism causing adverse reproductive outcomes in mice is associated with altered expression of apolipoprotein ai and inflammatory mediators. J Nutr. 142 (3), 411-418 (2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Питание материдефицит фолиевой кислотыдефицит холинаодноуглеродный обмензакрытие нервной трубкирацион материповеденческая нейробиологияэпигенетические инструментыизмерение метаболитов
Изменение уровней фолиевой кислоты или холина в рационе матери для изучения влияния дефицита на состояние здоровья потомства
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.