Методическая статья

ЛПС и АТФ-индуцированная гибель PMA-дифференцированных макрофагов THP-1 и ее валидация

4.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/66831

⸱

3 мая 2024 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 3Acupuncture and Tuina School, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол основан на ЛПС и АТФ-индуцированной гибели PMA-дифференцированных макрофагов THP-1. Мы используем проточную цитометрию для анализа аннексина V и двойное окрашивание 7-AAD для выявления гибели клеток, используя всю клетку и сканирующую электронную микроскопию для наблюдения за морфологией клеточной мембраны.

Аннотация

Гибель клеток является фундаментальным процессом во всех живых организмах. Протокол устанавливает индуцированное липополисахаридом (ЛПС) и аденозинтрифосфатом (АТФ) дифференцированное отложение липидов в модели моноцитов человека (ТГП-1) для наблюдения за гибелью клеток. ЛПС в сочетании с АТФ является классическим методом индукции воспаления, часто используемым для изучения пироптоза, но апоптоз и некроптоз также реагируют на стимуляцию ЛПС/АТФ. В нормальных условиях фосфатидилсерин локализуется только во внутреннем листке плазматической мембраны. Однако на ранних стадиях пироптоза, апоптоза и некроптоза клеточная мембрана остается неповрежденной и подвергается воздействию фосфатидилсерина, а на более поздних стадиях клеточная мембрана теряет свою целостность. Здесь с помощью проточной цитометрии анализировали двойное окрашивание аннексина V и 7-аминоактиномицина D (AAD) с целью выявления гибели целых клеток. Результаты показывают, что значительные клетки погибли после стимуляции ЛПС/АТФ. С помощью сканирующей электронной микроскопии мы наблюдаем возможные формы клеточной гибели в отдельных клетках. Результаты показывают, что клетки могут подвергаться пироптозу, апоптозу или некроптозу после стимуляции ЛПС/АТФ. Этот протокол направлен на наблюдение за гибелью макрофагов после стимуляции ЛПС/АТФ. Результаты показали, что гибель клеток после стимуляции ЛПС и АТФ не ограничивается пироптозом и что апоптоз и некротический апоптоз также могут происходить, что помогает исследователям лучше понять гибель клеток после стимуляции ЛПС и АТФ и выбрать лучший экспериментальный метод.

Введение

Гибель клеток является фундаментальным физиологическим процессом во всех живых организмах. В последние годы серьезные исследования показали, что гибель клеток влияет на иммунитет и баланс в организме. Изучение клеточной смерти помогает нам лучше понять возникновение и развитие заболеваний. Было описано несколько форм запрограммированной клеточной смерти, и были определены некоторые ключевые мишени в этих процессах. Пироптоз, апоптоз и некроптоз являются тремя генетически определенными запрограммированными путями гибели клеток, участвующими во внутреннем балансеи заболевании.

Пироптоз характеризуется образованием мембранных пор и выделением содержимого клеток. Активированные каспазы или гранзимы расщепляют гасдермины, разделяя их N-концевые домены, которые затем олигомеризуются, связываются с мембраной и образуют поры 2,3,4. Пора гасдермина обеспечивает атипичный канал секреции через клеточные мембраны, что приводит к нисходящим реакциям клеток, включая высвобождение содержимого и приток ионов 2,3,4. В конечном счете, клетки в конечном итоге испытывают разрыв плазматической мембраны и пироптотический лизис, чему способствует нинджурин-15. При апоптозе активированные Bax и Bak образуют олигомеры на внешней мембране митохондрий и высвобождают цитохром С, который регулируется балансом между проапоптотическими и антиапоптотическими белками семейства BCL-2, инициирующими каспазами (каспазами-8, -9 и -10) и эффекторными каспазами (каспазами-3, -6 и -7)1,6,7. Морфологические изменения апоптоза включают блеббинг мембраны, усадку клеток, фрагментацию ядер, конденсацию хроматина и образование апоптотических тел 6,8. Рецептор-взаимодействующая серин/треонин-протеинкиназа 1 (RIPK3) и доменоподобная киназа смешанной линии (MLKL) являются двумя основными компонентами механизма некроптозы1. RIPK3 рекрутирует и фосфорилирует MLKL, p-MLKL олигомеризуется, связывается с клеточной мембраной, инициирует перфорацию мембраны, вызывает приток ионов, увеличивает внутриклеточную осмолярность и, в конечном итоге, разрыв клетки 6,9. Гасдермины и MLKL связываются с плазматической мембраной и опосредуют пироптоз и некроптоз соответственно, в то время как BAX/BAK опосредует апоптоз, связываясь с внешней мембраной митохондрий.

Хотя каждый путь имеет определенные механизмы и результаты, они приводят к аналогичным изменениям на клеточной мембране. В нормальных условиях фосфатидилсерин (ФС) локализуется только во внутренней створке плазматической мембраны. Однако на ранних стадиях пироптоза, апоптоза и некроптоза ФС будет подвергаться воздействию за пределами плазматической мембраны. Каспазы-3/каспазы-7 активируют семейства TMEM16 и XKR, что приводит к асимметричной клеточной мембране и экстернализирует PS во время апоптоза10. D-опосредованный гасдермином и MLKL-опосредованный притокCa2+ приводит к потере симметрии фосфолипидного бислоя на клеточной мембране и облучению PS. Воздействие происходит до потери целостности клеточной мембраны11,12. Основываясь на схожих изменениях в мембране этих трех типов запрограммированной клеточной гибели, мы используем проточную цитометрию для анализа двойного окрашивания аннексина V/7-аминоактиномицина D (7-AAD) для выявления клеточной гибели. Аннексин V, кальций-зависимый фосфолипид-связывающий белок, обладает высоким сродством к PS, который может служить чувствительным зондом для обнаружения экспонированного PS на поверхности плазматической мембраны13. 7-AAD представляет собой краситель нуклеиновой кислоты, который не может пройти через всю клеточную мембрану. Он похож на йодид пропидия (PI), широко используемый краситель нуклеиновой кислоты. Они имеют схожие флуоресцентные характеристики, но 7-AAD имеет более узкий спектр излучения и меньше помех другим каналам обнаружения. Из-за этих сходств недостаточно различать пироптоз, апоптоз и некроптоз. Мы использовали проточную цитометрию для обнаружения гибели клеток из целых клеток. Второй метод используется для захвата клеточной мембраны с помощью сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) для наблюдения за возможными формами клеточной гибели в отдельных клетках.

Мы установили липополисахаридное (ЛПС) и аденозинтрифосфат (АТФ), индуцированное форбол-12-миристат-13-ацетат (ФМА)-дифференцированное отложение липидов в модели моноцитов человека (ТГП-1) для наблюдения за гибелью клеток. Этот протокол сосредоточен на наблюдении за гибелью клеток, а не на исследовании механизмов.

Протокол

1. Клеточная линия и клеточная культура

  1. Выращивание моноцитарной клеточной линии человека THP-1 в питательной среде RPMI-1640 с 10% фетальной бычьей сыворотки, 1% пенициллин-стрептомицина и 0,05 мМ β-меркаптоэтанола. Культивируйте клетки при температуре 37 °C в увлажненном воздухе с содержанием 5%CO2 . Субкультура клеток каждые 2-3 дня.
    ПРИМЕЧАНИЕ: THP-1 - это суспензионная ячейка, выбранная для замены половины среды для субкультивирования. При наблюдении большого количества фрагментов клеток под световым микроскопом центрифугируйте при 300 х g в течение 3 мин при комнатной температуре. Ресуспендируйте клетки в предварительно подогретой свежей среде для культивирования клеток.
  2. Для всех экспериментов используйте клетки (в отрывках 4-10) в фазе логарифмического роста. Когда клетки находятся в хорошем состоянии и логарифмической фазе роста, они круглые, яркие, плотные и без сгустков и фрагментов клеток под световым микроскопом при 100-кратном увеличении.

2. Дифференцировка клеток THP-1

  1. Приготовьте стоковый раствор ПМА с концентрацией 1 мМ (растворите 1 мг РМА в 1,62 мл диметилсульфоксида). Разбавить стоковый раствор PMA полной средой для культивирования клеток до конечной рабочей концентрации 100 нМ.
  2. Соберите клетки в чашке для культивирования в стерильную центрифужную пробирку объемом 10 мл. Центрифугировать при 300 х г в течение 3 мин при комнатной температуре, ресуспендировать клетки 3 мл полной питательной среды, содержащей РМА.
  3. Откройте счетчик ячеек и программное обеспечение для подсчета. Нанесите пипеткой 20 мкл клеточной суспензии на плату счетчика клеток и вставьте ее в плату счетчика клеток. Нажмите «Предварительный просмотр B1», поверните ручку в правом нижнем углу прибора и отрегулируйте фокусное расстояние, чтобы ячейки с ярким центром и четкими контурами были в программе. Нажмите Подсчитать , чтобы начать подсчет.
  4. Основываясь на результатах подсчета, используйте полную питательную среду, содержащую PMA, для регулировки плотности клеток до 1 x 106 клеток/мл. Засейте клетки в 6-луночной тарелке, инкубируйте в планшете в течение 24 ч при 37 °C и 5%CO2 перед началом дальнейшей обработки.

3. Лечение ТГП-1клетками

  1. Приготовьте стоковый раствор ЛПС с концентрацией 1 мг/мл (растворите 1 мг ЛПС в 1 мл фосфатно-солевого буфера (ПБС)). Разбавить исходный раствор ЛПС средой, не содержащей сыворотки, до конечной рабочей концентрации 1 г/мл. Приготовьте стоковый раствор Na2АТФ с концентрацией 500 мМ (растворите 0,3026 г АТФ в 1 мл PBS).
  2. Отсадите из лунок среду, содержащую PMA, и промойте PBS 1x. Добавьте бессывороточную среду в контрольную группу и бессывороточную среду, содержащую ЛПС, в модельную группу. Инкубируйте планшет в течение 6 часов при 37 °C + 5%CO2 , прежде чем приступить к дальнейшей обработке.
  3. Через 6 ч добавьте исходный раствор АТФ в модельную группу до конечной рабочей концентрации 500 нМ. Перед началом работы инкубируйте планшет в течение 45 минут при температуре 37 °C + 5%CO2 .

4. Анализ проточной цитометрии (Метод 1)

  1. Подготовка экспериментальных образцов
    1. Засейте и инкубируйте клетки в 6-луночных планшетах в соответствии с шагом 2. Установите четыре контрольные группы без обработки: одну контрольную группу без окрашивания, две контрольные группы с одинарным окрашиванием (по одной для каждого окрашивания) и одну контрольную группу с двойным окрашиванием. Определите одну группу лечения и проводите лечение в соответствии с шагом 3.
    2. После обработки аспирируйте всю надосадочную жидкость из лунок и промойте PBS 2x. Добавьте 500 мкл 0,05% трипсина (не ЭДТА) в каждую лунку и инкубируйте в инкубаторе в течение 30 с.
    3. Добавьте 1 мл полной питательной среды RPMI-1640 в каждую лунку, чтобы остановить отслоение клеток, и соберите клетки в пробирку объемом 5 мл. Центрифуга при 300 х г в течение 3 мин при комнатной температуре.
    4. Добавьте 1 мл PBS для ресуспендирования клеток. Поместите пробирки с ячейками на водяную баню при температуре 37 °C на 3 минуты. Центрифугируйте все образцы при плотности 300 x g в течение 3 минут при комнатной температуре.
    5. Разбавьте 200 мкл 5x связывающего буфера с 800 мкл дистиллированной воды до 1x связывающего буфера. Добавьте 100 мкл 1x связывающего буфера для ресуспендирования клеток и перенесите клетки в пробирку объемом 5 мл.
    6. Добавить 5 мкл раствора Аннексина V-PE в одну пробирку клеток контрольной группы в течение 10 мин и 5 мкл раствора 7-AAD в другую пробирку клеток контрольной группы в течение 5 мин (в качестве одиночного окрашивания контрольных клеток отдельно). Аккуратно перебейте каждую пробирку, смешайте краситель и инкубируйте образцы при комнатной температуре, защищенной от света. Добавьте 400 μL PBS в каждую пробирку и осторожно сделайте вихрь, чтобы завершить инкубацию.
    7. Добавьте 5 μL раствора Аннексина V-PE в оставшиеся пробирки и инкубируйте в течение 5 минут при комнатной температуре. Аккуратно перебейте каждую пробирку, смешайте краситель и инкубируйте образцы при комнатной температуре, защищенной от света. Через 5 минут добавьте 5 μL раствора 7-AAD на 5 минут при комнатной температуре. Добавьте 400 μL PBS в каждую пробирку и осторожно сделайте вихрь, чтобы завершить инкубацию.
    8. Отфильтруйте клеточную суспензию с помощью нейлоновой сетки толщиной 35 мкм, которая входит в состав полистирольных пробирок с круглым дном объемом 5 мл. Поместите пробирку на лед и дождитесь тестирования. Аккуратно перемешайте перед тестированием, а затем вставьте его в инструмент.
  2. Проточная цитометрия
    1. Для тестирования используйте проточный цитометр для сортировки клеток, активируемый флуоресценцией. Откройте программное обеспечение для анализа данных проточного цитометра и убедитесь в работоспособности детектора и лазера. Нажмите на Цитометр и выберите Fluidics startup, подождите, пока система будет готова. Исключите пузырьки в проточной камере, нажав на «Цитометр» > «Режимы очистки» > ячейке «Дегазация».
    2. Нажмите кнопку Experiment, выберите в последовательности Новая папка, Эксперимент, Образец, Пробирка и Редактировать имя. Стрелка пятиугольной формы перед трубкой становится зеленой, когда загорается.
    3. Нажмите на иконку цитометра FACSCelesta (иконка клавиши быстрого доступа), выберите Параметр, а затем выберите FSC, SSC и PE сигнал. Нажмите на иконку глобального рабочего листа (иконка клавиши быстрого доступа), чтобы построить гистограмму PE. Для проточного цитометра, используемого в этом исследовании, используйте ПЭ для аннексина V на длине волны 586 нм и построите график по оси X; PerCP-Cy5.5 для 7-AAD на длине волны 700 нм и построении графика по оси Y.
    4. Сначала вставьте в прибор неокрашенный контрольный образец. Нажмите на иконку Панели управления приобретениями (иконка клавиши быстрого доступа), получите минимум 10 000 событий от нужной популяции. Исключение мусора с помощью строба (P1) на точечной диаграмме FSC-A и SSC-A. Отрегулируйте расход на среднюю скорость и запишите данные. Отрегулируйте напряжение, чтобы поместить популяцию элементов по диагонали гистограммы FSC/SSC, и нажмите кнопку Перезапустить. Отрегулируйте расход на среднюю скорость и запишите данные.
    5. Нажмите Next tube, запустите одинарные регуляторы окрашивания Annexin V и 7-AAD для регулировки компенсации. Запустите оставшиеся пробирки и соберите данные.

5. Визуализация СЭМ (метод 2)

  1. Подготовка экспериментальных образцов
    1. Высевайте и инкубируйте клетки в 6-луночных планшетах в соответствии с этапом 2 и обрабатывайте в соответствии с этапом 3.
    2. После обработки отаспирируйте всю надосадочную жидкость из лунок и промойте 2 раза PBS. Добавьте 500 мкл 0,05% трипсина (не ЭДТА) в каждую лунку и инкубируйте в инкубаторе в течение 30 с.
    3. Добавьте 1 мл полной питательной среды RPMI-1640 в каждую лунку, чтобы остановить отслоение клеток, и соберите клетки в пробирку объемом 5 мл. Центрифуга при 300 х г в течение 3 мин при комнатной температуре.
    4. Зафиксировать ячейки с помощью 500 мкл фиксатора электронного микроскопа (2,5% глутарового диальдегида, 100 мМ солей фосфора) в течение 2 ч при комнатной температуре, а затем провести ночь при 4 °С.
    5. Приготовьте раствор квасцов хрома: добавьте 1,0 г желатина в 100 мл сверхчистой воды, нагревая водяную баню 70 °C, и равномерно перемешайте. Добавьте 0,05 г квасцов хрома, равномерно перемешайте и процедите фильтровальной бумагой. Опустите чистое защитное стекло в раствор квасцов хрома на 2 часа при температуре 37 °C и высушите в духовке при температуре 37 °C для последующего использования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Цель состоит в том, чтобы предотвратить отслоение клеток во время эксперимента.
    6. Соберите клетки из неподвижного раствора. Центрифуга при 300 х г в течение 3 мин при комнатной температуре. Добавьте 100 μL PBS и аккуратно продуйте клетки. Опустите подвес ячейки на покровное стекло, дайте постоять 5 минут. Отсадите всю надосадочную жидкость и промывайте 3 раза PBS в течение 5 минут каждый раз.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Операцию необходимо проводить осторожно, чтобы предотвратить отслоение клеток. Не встряхивайте сильно, двигайтесь медленно и медленно добавляйте жидкость вдоль стены.
    7. Добавьте 500 мкл 1% фиксации осмиевой кислотой на 1 час. Отсадите всю надосадочную жидкость и промывайте 3 раза PBS в течение 5 минут каждый раз.
    8. Последовательно обезвоживайте образцы в нескольких концентрациях этанола (EtOH) (30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, 100%) в течение 15 мин на раствор EtOH.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Защитные стекла можно хранить при 100% EtOH в течение нескольких дней при температуре 4 °C, но они должны высохнуть как можно скорее, чтобы избежать чрезмерного обезвоживания.
    9. Включите сушилку для критических точек, откройте бак CO2 , охладите камеру до 10 °C. Быстро оберните образец фильтровальной бумагой, когда давление в камере составит 0 фунтов на квадратный дюйм, и поместите его в камеру.
    10. Откройте впускной клапан, понаблюдайте через смотровое окно CO2 , поднимите уровеньCO2 жидкости между двумя красными линиями (не превышайте верхний предел), закройте впускной клапан. Замочите образец на 10 минут. Откройте впускной и выпускной клапаны одновременно, чтобы выровнять CO2 в течение 1 мин (жидкий CO2 вытесняет EtOH). Закройте выпускной клапан, чтобы поднять уровеньCO2 жидкости до указанного положения, закройте впускной клапан.
    11. Установите температуру 35 °C и давление 1250 фунтов на квадратный дюйм. Как только температура и давление стабилизируются, сбросьте давление со скоростью 100 фунтов на квадратный дюйм/мин. Извлеките пробу, когда давление в камере равно нулю, и выключите прибор.
    12. Монтируйте образцы на держатели из алюминия SEM с помощью проводящей ленты. С помощью распылительной коатерки покройте образцы слоем золота (2-5 нм).
  2. Отображение
    1. Используйте СЭМ излучения холодного поля с высоким разрешением для визуализации. Установите ускоряющее напряжение РЭМ на 3 кВ. Установите рабочее расстояние на 10 мм. Установите увеличение на 1 000x, чтобы наблюдать за панорамой. Установите увеличение на 5 000x и 20 000x, чтобы найти плазматическую мембрану и получить изображение образца.
      Примечание: Процесс визуализации PMA-дифференцированных макрофагов THP-1 с помощью SEM аналогичен другим типам клеток и тканей и зависит от используемых инструментов. В ссылке14 представлен подробный протокол SEM с сопровождающими видео.

Результаты

Образцы клеток обрабатывались в соответствии с описанием протокола и проводилась проточная цитометрия. Нормальные клетки нельзя окрашивать Аннексином V и 7-AAD (Аннексин V-/7-AAD-). На ранних стадиях пироптоза, апоптоза и некроптоза PS подвергался воздействию и связывался с аннексином V, но клеточная мембрана оставалась неповрежденной и исключала 7-AAD из внеклеточного пространства (аннексин V+/7-AAD-). На более поздних стадиях клеточная мембрана теряет свою целостность, клетки одновременно окрашиваются аннексином V и 7-AAD, показывая двойные положительные результаты (аннексин V+/7-AAD+). Некротические клетки окрашивали только 7-AAD (аннексин V-/7-AAD+). На рисунке 1 показано, что после стимуляции ЛПС/АТФ количество клеток в области Q2 значительно увеличилось, что указывает на гибель клеток.

Мы используем SEM для захвата поверхности плазматической мембраны, непосредственно наблюдая за характеристиками мембраны от одной клетки. На рисунке 2A показаны контрольные клетки, на рисунке 2B-D показаны клетки после стимуляции ЛПС/АТФ. Мы наблюдали клетки с характеристиками пироптоза, включая блеббинг мембраны и разрыв мембраны (рисунок 2B), клетки с апоптотическими характеристиками, включая блеббинг мембраны и усадку клеток (рисунок 2C), и клетки с характеристиками некроптоза, включая набухание клеток и разрыв мембраны (рисунок 2D).

figure-results-1
Рисунок 1: Обнаружение двойного окрашивания аннексина V/7-AAD с помощью проточной цитометрии. (A) Аннексин V отрицательное и 7-AAD отрицательное окрашивание (Q4), положительное и 7-AAD отрицательное двойное окрашивание (Q3), положительное и 7-AAD положительное окрашивание Аннексин V и 7-AAD положительное окрашивание (Q2) и отрицательное и 7-AAD положительное окрашивание (Q1). (В) Количественные данные по пункту (А). Данные представлены в виде среднего ± SD (n=3), непарного t-критерия, **p < 0,01. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2: Сканирующие электронные микроскопические изображения PMA-дифференцированных макрофагов THP-1. (A) Контрольная группа, увеличение 5 000x/20 000x. (В, В, Г) В группе ЛПС/АТФ наблюдаются мембранный блекбинг, разрыв мембраны (↑), набухание клеток (↑) и усадка клеток (↑) при увеличении 5000x/2000x. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Обсуждение

В данной рукописи были использованы два метода для выявления ЛПС и АТФ-индуцированной гибели РМА-дифференцированных макрофагов ТГП-1. Использовали двойное окрашивание аннексином V/7-AAD, результаты которого анализировали с помощью проточной цитометрии из общего окрашивания. Как и при другом проточном цитометрическом анализе, группа неокрашенных клеток и две группы одинарно окрашенных клеток были настроены для исключения ложноположительных и ложноотрицательных результатов. Результаты показывают, что после стимуляции ЛПС/АТФ несколько клеток потеряли целостность мембраны, что указывает на возможную гибель клеток. Этот метод обнаружения позволяет оценить гибель целых клеток. Стоит отметить, что двойное окрашивание Аннексином V/7-AAD недостаточно для различения пироптоза, апоптоза и некроптоза. На ранних стадиях этих трех форм PS будет подвергаться воздействию за пределами плазматической мембраны, а окрашивание аннексином V является положительным. Целостность мембраны теряется на поздней стадии этих трех форм, и результаты окрашивания показывают двойное положительное окрашивание. Поэтому мы использовали СЭМ для дальнейшего наблюдения за возможными формами гибели клеток, которые могут произойти.

При апоптозе происходит образование пор BAX/BAK на наружной мембране митохондрий, последующее усадка клеток и блеббирование клеточной мембраны. При некроптозе MLKL используется для открытия пор в клеточной мембране, в то время как сигнал пироптоза активирует гасдермин для образования пор в клеточной мембране. Стоит отметить, что как пироптоз, так и некроптоз сопровождаются разрывом клеточной мембраны в конечной стадии. Однако поры газедермина намного больше, чем поры MLKL, поэтому поры гасдермина не обладают ионной селективностью. Некроптозные клетки демонстрируют значительное набухание морфологии15. В конечном итоге они заканчиваются разрывом мембраны. Независимо от сигнального пути до активации проницаемости клеточной мембраны, изменения в клеточной мембране сопровождают эти три формы клеточной смерти. Мы использовали SEM для дальнейшего наблюдения за клеточной мембраной, что обеспечивает интуитивно понятный способ изучения клеточной гибели. Мы наблюдали характеристики пироптоза, включая блеббинг мембраны и разрыв мембраны, и некроптоза, включая набухание клеток и разрыв мембраны, что согласуется с характеристиками, изученными предыдущими исследователями15. Мы наблюдали блеббинг мембраны и усадку клеток, что согласуется с характеристиками апоптоза, изученными предыдущими исследователями16.

В предыдущих исследованиях комбинация ЛПС и АТФ часто использовалась для индукции пироптоза. Интересно, что мы наблюдали особенности апоптоза и некроптоза. Хотя все три формы могут возникать при ЛПС/АТФ-индуцированной гибели клеток, предыдущие исследования показали, что пироптоз остается доминирующим способом смерти. ЛПС является одним из наиболее характерных патоген-ассоциированных молекулярных паттернов. АТФ, выделяемый из умирающих клеток, имеет высокую концентрацию внутри клетки. Внеклеточный АТФ является одним из связанных с опасностью молекулярных паттернов17. ЛПС/АТФ является классическим двухступенчатым методом стимуляции для индуцирования пироптоза. Исследования показали, что добавление АТФ к ЛПС-стимулированным клеткам может быстро активировать каспазу-18, в то время как подавление гена каспазы-1 может значительно обратить вспять ЛПС/АТФ-индуцированную гибель клеток19. В предыдущих исследованиях мы также обнаружили ЛПС/АТФ-индуцированную активацию апоптотических и некроптотических белков-мишеней20,21. Хотя ЛПС/АТФ является классическим индуктором пироптоза, он также может вызывать апоптоз и некроптоз.

На самом деле, эти три формы часто не существуют независимо друг от друга, а перекрестные помехи между сигнальными каскадами. Например, белки гасдермина нацелены на митохондрии, способствуя высвобождению цитохрома с для усиления митохондриального путиапоптоза 22. Активация каспазы-3 может расщепить гасдермин Е и затем вызвать пироптоз23. Исследование предполагает, что передача сигналов MLKL/PIPK3 участвует в активации инфламмасом NLRP324. Эта сложная перекрестная связь привела к концепции PANoptosis, определяемой как воспалительный путь запрограммированной гибели клеток, регулируемый комплексом PANoptosome, с ключевыми особенностями пироптоза, апоптоза и/или некроптоза, которые не могут быть объясненыни одним из этих запрограммированных путей клеточной смерти в отдельности. Поскольку была предложена концепция PANoptosis, ученые более полно описали возникновение запрограммированной гибели клеток, что также подчеркивает сложность запрограммированной гибели клеток. Между тем, это также указывает на ограниченность данного метода исследования. Хотя пироптоз считается доминирующим в ЛПС/АТФ-индуцированной гибели клеток, невозможно определить долю этих форм смерти или все ли они существуют, даже включая другие формы запрограммированной смерти. Это может быть областью для исследования в будущем.

Этот протокол основан на ЛПС и АТФ-индуцированной гибели макрофагов. Мы описали метод тестирования от целого до индивидуального, который применим и к другим моделям и клеткам. Результаты указывают на то, что клетки, возможно, подверглись пироптозу, апоптозу или некроптозу, который не ограничивается пироптозом, что помогает исследователям лучше понять гибель клеток после стимуляции ЛПС и АТФ и выбрать лучший экспериментальный метод. В предыдущих исследованиях для указания на возникновение апоптоза26,27 обычно использовалось двойное окрашивание Annexin V/7-AAD или двойное окрашивание Annexin V/PI, некоторые исследователи также использовали его для изучения апоптоза28. На самом деле, мы не можем различить три типа клеточной смерти из-за этого двойного окрашивания. Этот протокол напоминает исследователям, особенно начинающим, что двойное окрашивание Annexin V/7-AAD или Annexin V/PI не может квалифицировать тип клеточной гибели. Он может указывать только на повреждение и смерть клетки в целом или на то, что клетка могла претерпеть какую-либо форму смерти. В более целенаправленных исследованиях необходимо ввести контрольную группу, которая подавляет другие смерти, чтобы показать, что окончательно запрограммированная смерть близка. Аналогичным образом, дальнейшие механистические исследования будут исследовать критические цели различных запрограммированных смертей.

Кроме того, в ходе подготовки эксперимента мы обнаружили, что в настоящее время существует множество подробных экспериментальных процедур для СЭМ адгезивных клеток, при этом суспензии суспендированные клетки описаны мало. Здесь мы приводим более подробное описание метода подготовки образцов для взвешенных клеток. Шаг 5.5 является необходимым для помощи в иммобилизации взвешенных клеток на предметных стеклах. Последующие операции необходимо проводить аккуратно, чтобы предотвратить отслоение клеток. В дополнение к раствору квасцов хрома, поли-L-лизин также может иммобилизовать клетки.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Выражаем огромную благодарность Цзяи Сунь и Лу Яну из Инновационного института китайской медицины и фармации Университета традиционной китайской медицины Чэнду за помощь в проведении проточной цитометрии, Цуйпин Чэню из Государственной ключевой лаборатории ресурсов юго-западной китайской медицины за помощь в проведении сканирующей электронной микроскопии. Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая [82104491], Фондом естественных наук провинции Сычуань [2023NSFSC0674] и Фондом постдокторантуры Китая [2021M693789].

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,25% раствор фермента поджелудочной железы (за исключением ЭДТА)BOSTER Biological Technology co.ltdPYG0068
5 мл полистирольная трубка с круглым дномCORNING352235
центрифужная пробирка 5 млLabgic Technology Co., Ltd. BS-50-M
6-луночный планшет Sorfa Life Science Research Co., Ltd220100
Аннексин V-PE/7-AAD набор для анализа апоптозаAbsin (Shanghai) Biological Technology co.ltdabs50007Аннексин V-PE, 7-AAD, 5&раз; Связывающий буфер, раствор для положительного контроля апоптоза
для селкультуры CO2 инкубаторEsco (Shanghai) Enterprise Development Co., Ltd.Н/Д
чашка для клеточной культуры, 100 ммSorfa Life Science Research Co., Ltd230301
Счетчик флуоресцентных клеток K2Nexcelom Bioscience LLCЦеллометр K2
Селометр SD100 Счетные камерыNexcelom Bioscience LLCCHT4-SD100-002
центрифугаHunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., LtdL530
Квасцы хрома Guangdong Wengjiang Chemical Reagent Co., Ltd.
защитные стекла, 9 ммLabgic Technology Co., Ltd. BS-09-RC
сушилка для критических точекQuorum TechnologiesK850
диметилсульфоксидBOSTER Biological Technology co.ltdPYG0040
электронный микроскопфиксатор Servicebio Technology co.ltd G11022,5% глутаровый диальдегид, 100 мМ фосфорные соли
электронные весыSHIMADZUATX124
абсолют этанолаChengdu Kelong Chemical Co., Ltd2021033102
проточный цитометрBecton,Dickinson and CompanyFACSCanto figure-materials-1
обеспечение для анализа проточной цитометрииBecton, Dickinson and CompanyBD FACSDivaTM Программное обеспечение
желатинаGuangdong Wengjiang Chemical Reagent Co., Ltd.PA00256 
Сканирующий электронный микроскоп высокого разрешения холодного поляTITACHIRegulus 8100
линия моноцитарных клеток человека THP-1Procell Life Science& Технологическая компания Лтд.CL0233
Инвертированный микроскоп Leica Microsystems Co., LtdDMi1
IR вихревой смесительVELP Scientifica SrlZX4
липополисахарид Пекин Соларбио Наука и Технологическая компания, ООО L8880LPS получен из Escherichia coli 055:B5
Na2ATPBeijing Solarbio Science & Технологическая компания, ООО A8270
форбол-12-миристат-13-ацетат Пекин Соларбио Наука и Технологическая компания, ООО P6741
фосфатно-солевой буферServicebio Technology co.ltd G4202
Наконечники для дозатораEppendorf AGN/A
, 10 μ LServicebio Technology co.ltd Наконечники для пипеток T-10PL
, 1 млСервисбио Технолоджи Ко.Лтд.T-1250L
наконечники для пипеток, 200 μ LServicebio Technology co.ltd T-200L
RPMI-1640 полная питательная средаProcell Life Science& Технологическая компания Лтд.CM0233RPMI-1640 + 10% FBS + 0,05 мМ β-меркаптоэтанол + 1%/с
RPMI-1640 питательные среды Шанхай  БазальМедиа  Технологии Ко., Лтд.
жидкость для оболочкиBECKMAN COULTER8546733
распылитель для нанесения покрытийCressington Scientific Instruments Ltd108
термостатическая водяная баняGUOHUA Electric Appliance CO.,Ltd НЧ-1
PA04354программное K211104

Ссылки

  1. Bertheloot, D., Latz, E., Franklin, B. S. Necroptosis, pyroptosis and apoptosis: an intricate game of cell death. Cell Mol Immunol. 18 (5), 1106-1121 (2021).
  2. Rao, Z., et al. Pyroptosis in inflammatory diseases and cancer. Theranostics. 12 (9), 4310-4329 (2022).
  3. Huston, H. C., Anderson, M. J., Fink, S. L. Pyroptosis and the cellular consequences of gasdermin pores. Semin Immunol. 69, 101803(2023).
  4. Kovacs, S. B., Miao, E. A. Gasdermins: Effectors of pyroptosis. Trend Cell Biol. 27 (9), 673-684 (2017).
  5. Kayagaki, N., et al. NINJ1 mediates plasma membrane rupture during lytic cell death. Nature. 591 (7848), 131-136 (2021).
  6. Ketelut-Carneiro, N., Fitzgerald, K. A. Apoptosis, pyroptosis, and necroptosis-Oh my! The many ways a cell can die. J Mol Biol. 434 (4), 167378(2022).
  7. Kakarla, R., Hur, J., Kim, Y. J., Kim, J., Chwae, Y. J. Apoptotic cell-derived exosomes: messages from dying cells. Exp Mol Med. 52 (1), 1-6 (2020).
  8. Imre, G. Cell death signalling in virus infection. Cell Signal. 76, 109772(2020).
  9. Zhan, C., Huang, M., Yang, X., Hou, J. MLKL: Functions beyond serving as the Executioner of Necroptosis. Theranostics. 11 (10), 4759-4769 (2021).
  10. Lemke, G. How macrophages deal with death. Nat Rev Immunol. 19 (9), 539-549 (2019).
  11. Yang, X., et al. Bacterial endotoxin activates the coagulation cascade through gasdermin D-dependent phosphatidylserine exposure. Immunity. 51 (6), 983-996 (2019).
  12. Gong, Y. N., et al. ESCRT-III acts downstream of MLKL to regulate necroptotic cell death and its consequences. Cell. 169 (2), 286-300 (2017).
  13. Dong, H. P., et al. Evaluation of cell surface expression of phosphatidylserine in ovarian carcinoma effusions using the annexin-V/7-AAD assay: clinical relevance and comparison with other apoptosis parameters. Am J Clin Pathol. 132 (5), 756-762 (2009).
  14. JoVE, JoVE. Scanning Electron Microscopy (SEM), JoVE Science Education Database, Analytical Chemistry. JoVE. , Cambridge, MA. (2024).
  15. Chen, X., et al. Pyroptosis is driven by non-selective gasdermin-D pore and its morphology is different from MLKL channel-mediated necroptosis. Cell Res. 26 (9), 1007-1020 (2016).
  16. Herr, D. R., et al. Ultrastructural characteristics of DHA-induced pyroptosis. Neuromol Med. 22 (2), 293-303 (2020).
  17. Xie, Q., et al. Lipopolysaccharide/adenosine triphosphate induces IL-1β and IL-18 secretion through the NLRP3 inflammasome in RAW264.7 murine macrophage cells. Int Mol Med. 34 (1), 341-349 (2014).
  18. Gurung, P., et al. FADD and caspase-8 mediate priming and activation of the canonical and noncanonical Nlrp3 inflammasomes. J Immunol. 192 (4), 1835-1846 (2014).
  19. Liu, W., et al. Ablation of caspase-1 protects against TBI-induced pyroptosis in vitro and in vivo. J Neuroinflam. 15 (1), 48(2018).
  20. Wang, S. H., et al. GSK-3β-mediated activation of NLRP3 inflammasome leads to pyroptosis and apoptosis of rat cardiomyocytes and fibroblasts. Euro J Pharmacol. 920, 174830(2022).
  21. Chen, J., et al. RIP3 dependent NLRP3 inflammasome activation is implicated in acute lung injury in mice. J Transl Med. 16 (1), 233(2018).
  22. Rogers, C., et al. Gasdermin pores permeabilize mitochondria to augment caspase-3 activation during apoptosis and inflammasome activation. Nat Comm. 10 (1), 1689(2019).
  23. Wang, Y., et al. Chemotherapy drugs induce pyroptosis through caspase-3 cleavage of a gasdermin. Nature. 547 (7661), 99-103 (2017).
  24. Kang, S., et al. Caspase-8 scaffolding function and MLKL regulate NLRP3 inflammasome activation downstream of TLR3. Nat Comm. 6, 7515(2015).
  25. Wang, Y., Kanneganti, T. D. From pyroptosis, apoptosis and necroptosis to PANoptosis: A mechanistic compendium of programmed cell death pathways. Comput Str Biotechnol J. 19, 4641-4657 (2021).
  26. Hou, Y., et al. Rhodiola crenulata alleviates hypobaric hypoxia-induced brain injury by maintaining BBB integrity and balancing energy metabolism dysfunction. Phytomedicine. 128, 155529(2024).
  27. Shuwen, H., et al. Cholesterol induction in CD8+ T cell exhaustion in colorectal cancer via the regulation of endoplasmic reticulum-mitochondria contact sites. Cancer Immunol Immunother. 72 (12), 4441-4456 (2023).
  28. Luo, X., et al. Cyclophosphamide induced intestinal injury is alleviated by blocking the TLR9/caspase3/GSDME mediated intestinal epithelium pyroptosis. Int Immunopharmacol. 119, 110244(2023).

Перепечатки и разрешения

Теги

Стимуляция ЛПС и АТФдифференцировка PMAклеточная гибельпироптозапоптознекроптозпроточная цитометриясканирующая электронная микроскопияокрашивание аннексином V
ЛПС и АТФ-индуцированная гибель PMA-дифференцированных макрофагов THP-1 и ее валидация
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.