Методическая статья

Веб-рабочий процесс для выбора ген- и тканеспецифических энхансеров

DOI:

10.3791/66840

⸱

18 июля 2025 г.

 ,  ,  , 
1Department of Paediatrics, Faculty of Medicine, Dentistry and Health Sciences, University of Melbourne, 2Australian Regenerative Medicine Institute, Monash University, 3Stem Cell Medicine Department, Murdoch Children's Research Institute, The Royal Children's Hospital, 4The Novo Nordisk Foundation Center for Stem Cell Medicine, reNEW Melbourne, Murdoch Children's Research Institute, 5Systems Biology Institute (SBI) Australia

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы представляем биологам рабочий процесс без программирования для идентификации тканеспецифичных генных энхансеров с использованием только браузерных инструментов. Наш протокол использует общедоступные гистоновые метки H3K4me1/H3K27ac и данные Hi-C, что позволяет исследователям, не имеющим опыта программирования, получать доступ, анализировать и идентифицировать потенциальные регуляторные элементы, связанные с их генами, представляющими интерес.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Энхансеры — это участки ДНК, которые регулируют экспрессию генов. Мутации в энхансерах могут привести к аномальной регуляции генов, что приводит к заболеванию. Таким образом, идентификация энхансеров, которые регулируют активность генов в конкретных тканях, имеет решающее значение для понимания генетической основы заболевания. Тем не менее, энхансеры трудно идентифицировать, поскольку они не кодируют белки. Несмотря на то, что существует множество репозиториев энхансеров и инструментов идентификации, сложность этих инструментов может представлять проблему для биологов. Чтобы помочь биологам в использовании этих ресурсов, мы представляем удобный для биологов протокол (https://github.com/Ramialison-Lab/EnhancerWorkflow), который использует существующие данные геномики на основе веб-технологий, такие как метки гистонов H3K4me1 и H3K27ac и данные анализа конформации хроматина (Hi-C), для обнаружения энхансеров, связанных с интересующим геном (GoI) в ткани-мишени, где энхансер активен. Этот протокол полностью основан на веб-технологиях и не требует навыков программирования от конечных пользователей. Мы продемонстрировали полезность этого подхода, охарактеризовав кандидаты в энхансеры, регулирующие TBX5, ген, критически важный для развития сердца. Этот протокол облегчает идентификацию энхансеров, связанных с этим геном, в левом желудочке.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Энхансеры — это некодирующие участки ДНК, которые регулируют транскрипцию, развитие и клеточную дифференцировку генов 1,2. Мутация энхансеров может привести к различным заболеваниям, включая нарушения развития, рак и другие генетические заболевания 3,4,5,6. Таким образом, понимание энхансеров имеет первостепенное значение для понимания экспрессии генов, мутаций и заболеваний.

Чтобы понять, как энхансеры взаимодействуют со своими генами-мишенями, важно определить их расположение в геноме. Тем не менее, идентификация мест расположения энхансеров не всегда проста, поскольку энхансеры могут быть расположены как близко к сайту начала транскрипции (TSS), так и гораздо дальше, охватывая десятки и сотни килооснований 2,7,8,9.

Несмотря на непредсказуемое расположение генома, энхансеры демонстрируют отчетливые биохимические и структурные сигнатуры, что позволяет их систематически отслеживать. Как правило, энхансеры имеют тенденцию обогащаться в межгенных и интронных областях, с небольшим количеством обнаруженных в экзонах 2,8. Они часто характеризуются специфическими модификациями гистонов и связыванием транскрипционного фактора, что определяет их регуляторную роль и пространственно-временную активность на различных стадиях развития и тканях10,11.

ChIP-seq используется для идентификации сайтов связывания транскрипционного фактора (TFBS) и меток модификации гистонов, таких как отличительная марка энхансеров, H3K4me1, активные энхансерные метки, метки H3K27ac и H3K4me3, которые обогащены в промоторных областях 1,12,13,14,15. Методы конформационного захвата хроматина (3C) и их производные, такие как 4C, 5C, Hi-C и ChIA-PET, используются для картирования физических взаимодействий между удаленными областями генома. В то время как 3C нацелен на конкретные взаимодействия в конкретных тканях, Hi-C предлагает полногеномную архитектуру для всех типов клеток16,17.

В дополнение к существующим методам были разработаны специализированные подходы для определения характеристик энхансеров, включая объединенные базы данных энхансеров, такие как EnhancerAtlas или EnhancerFinder18,19. Тем не менее, эти инструменты часто требуют от исследователей интеграции нескольких наборов данных для исследования нескольких энхансеров во многих тканях, что может быть непосильной задачей для биологов, не имеющих опыта в биоинформатике и интеллектуальном анализе данных.

В этой статье мы опишем удобный для пользователя протокол для выбора энхансеров, полностью основанный на существующих веб-инструментах. Это позволяет исследователям запрашивать ген, представляющий интерес (ГОИ) и извлекать соответствующие энхансеры. Протокол здесь отбирает энхансеры на основе определенного набора критериев: модификации гистонов, взаимодействия хроматина и тканевая специфичность 1,12,13,14,15,16,17,20,21. Энхансеры, обнаруженные в интронах, с большей вероятностью проявляют тканеспецифичную активность по сравнению с межгенными энхансерами, которые расположены в областях генома между генами22. Чтобы обеспечить полный охват потенциальных активных энхансеров, мы определили диапазон поиска между двумя соседними GoI, чтобы увеличить вероятность захвата регуляторных элементов, расположенных за пределами тел генов. Мы использовали энхансер-специфичную эпигенетическую марку H3K4me1 и активную энхансерную метку H3K27ac для составления списка кандидатов в энхансеры. Затем эти кандидаты были усовершенствованы на основе данных Hi-C, сохраняя энхансеры при физическом взаимодействии с соответствующим промотором. Этот протокол предназначен для того, чтобы помочь биологам в процессе идентификации энхансеров с использованием только общедоступных веб-инструментов. Интегрируя данные об эпигенетическом взаимодействии и взаимодействии хроматина, описанный здесь подход предлагает практическую основу для создания гипотез о потенциальных энхансерах для дальнейшей экспериментальной проверки.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ПРИМЕЧАНИЕ: Пошаговое руководство доступно по адресу https://github.com/Ramialison-Lab/EnhancerWorkflow. Данные, используемые в протоколе, обобщены в таблицах 1 и 2. Информация об устранении неполадок доступна в дополнительном файле 1.

1. Определение местоположения правительства Индии (Рисунок 1)

  1. Откройте браузер генома EnsEMBL (https://www.EnsEMBL.org).
  2. Выберите подходящую сборку генома, соответствующую виду и версии.
  3. Введите GoI в поле поиска и нажмите Go.
  4. Выберите ссылку на соответствующий идентификатор гена EnsEMBL.
  5. Нажмите на ссылку для просмотра вкладки «Регион в деталях », расположенной под разделом сводки, чтобы перемещаться по региону, окружающему ПИ.

2. Определение области обнаружения энхансера (Рисунок 2)

  1. Определите два соседних гена ГОИ, чтобы определить область обнаружения. Используйте трек Gene Legend для поиска этих генов, которые аннотированы как визуальные элементы, относящиеся к объединенному EnsEMBL/Havana, в треке Basic Gene Annotations from GENCODE . Определите направленность ГОИ по признакам < и > на соответствующее имя гена в треке GENCODE.
  2. Щелкните и перетащите, чтобы выбрать межгенную область между этими генами, и нажмите Перейти к области во всплывающем окне, чтобы визуализировать выбранную область. Переопределите область интереса в любое время, повторив этот шаг.
  3. (НЕОБЯЗАТЕЛЬНО) Настройте отображение, выбрав «Добавить/удалить треки » в верхней части окна просмотра треков. Модулируйте уровень масштабирования с помощью элементов управления масштабированием/навигацией над просмотрщиком дорожек.

3. Анализ меток гистонов (Рисунок 3)

  1. На боковой панели средства просмотра вкладки «Регион в подробностях » выберите «Настроить эту страницу».
  2. На боковой панели вкладки «Настроить изображение области » в раскрывающемся списке «Регулирование » выберите «Активность по клеткам/тканям».
  3. Используйте строку поиска клеток/тканей для поиска и выбора интересующих тканей. Кроме того, используйте алфавитную панель навигации под строкой поиска, чтобы найти интересующие вас ткани.
  4. Выберите вкладку «Эксперименты » рядом с пунктом «Клетка/ткань».
  5. Выберите H3K4me1 и H3K27ac в качестве маркера энхансеров, а H3K4me3 — в качестве маркера промоторов.
  6. Выберите Настроить отображение дорожки.
  7. Выберите Просмотр дорожек , чтобы визуализировать области, помеченные H3K4me1, в области обнаружения энхансера и области, помеченные H3K4me3, выше по течению от GoI.
  8. Для кандидатов в энхансеры получите координаты областей генома, отмеченных H3K4me1 в пределах определенных областей обнаружения, щелкнув по цветным визуальным элементам/элементам блока в недавно добавленных треках H3K4me1. Это открывает всплывающее окно «Hists & Pols», которое содержит информацию о расположении генома элемента в паре оснований (bp).
    1. Чтобы получить кандидатов на активные усилители, выберите области H3K4me1, в которых перекрываются цветные визуальные элементы/элементы блока H3K4me1 и H3K27ac. Степень детализации уровня масштабирования может повлиять на количество кандидатов-энхансеров, отображаемых в этой дорожке.
    2. В качестве альтернативы можно вручную определить области интереса для каждого геномного признака, щелкнув и перетащив дорожку, чтобы инкапсулировать пики графика под дорожкой H3K4me1/H3K27ac. Скопируйте координаты геномного местоположения в текстовый файл и сохраните в формате .bed .
  9. Аналогичным образом, для промоторных областей повторите шаг 3.8 с использованием трека H3K4me3, сосредоточившись на области, расположенной выше по течению от ГОИ.

4. Анализ захвата конформации хроматина (Hi-C) (Рисунок 4)

  1. Получите доступ к порталу данных 4DN (https://data.4dnucleome.org/). На главной линейчатой диаграмме с накоплением на главной странице 4DN (рис. 5) убедитесь, что в качестве оси Y выбран параметр Наборы экспериментов , в качестве оси X выбран тип эксперимента , а график сгруппирован по организму.
  2. Вдоль оси X основной гистограммы найдите бар Hi-C in situ. Нажмите на часть панели, которая сгруппирована для наборов для экспериментов на людях, а затем нажмите кнопку «Обзор» во всплывающем окне. Отфильтруйте релевантные наборы данных с помощью левой боковой панели.
  3. Нажмите на ссылку в столбце «Название » соответствующего биообразца для интересующей ткани.
  4. Щелкните Исследовать данные на вкладке Обработанные файлы , чтобы изучить набор данных Hi-C более подробно.
  5. Введите координаты идентифицированного промотора в интересующей ткани (из шага 3.9) и отметьте область горизонтально, щелкнув правой кнопкой мыши по тепловой карте (рис. 4). Добавленные линии гарантируют, что промоутерная область визуально отслеживается на тепловой карте. Удалите случайные линии, щелкнув линию правой кнопкой мыши и выбрав правило по горизонтали/вертикали и Закрыть ряд.
  6. Введите координаты всех экспериментально подтвержденных усилителей управления23 , чтобы рассчитать порог взаимодействия на основе их минимума. Ранее было подтверждено, что эти усилители контроля взаимодействуют с промоторной областью, что служит ориентиром для определения минимально значимого взаимодействия.
  7. Определите пороговое значение промотор-усилитель с помощью усилителей контроля на основе наименьшей ненулевой оценки взаимодействия в соответствии с цветовым ключом в правой части матрицы.
  8. Введите геномные координаты всех областей, связанных с H3K4me1 (из шага 3.8), и отметьте их вертикально на тепловой карте Hi-C. Это позволяет создать модель перекрестной проверки, в которой пересечение между H3K4me1-мечемеченными энхансерами (вертикальными) и промоторной областью (горизонтальными) может быть изучено на предмет значимых взаимодействий.
    1. Затем отфильтруйте слабо взаимодействующие области, сравнив оценки взаимодействия областей, помеченных H3K4me3, с порогом взаимодействия (шаг 4.6).
    2. Выберите геномные координаты, частоты взаимодействия которых превышают заданный порог на тепловой карте портала 4DN. Эти области отображаются на тепловой карте как более концентрированные (более темные) сигналы, за исключением формата BED.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Чтобы проиллюстрировать использование представленного протокола, мы исследовали ген TBX5 в человеческом сердце, исследуя энхансеры, связанные с TBX5, используя комплексный рабочий процесс, включающий данные H3K4me1, H3K27ac и Hi-C. TBX5 — это ген, который способствует развитию конечностей и сердца, включая формирование четырех камер и разделение перегородки24. Мутация в этом гене является основной причиной синдрома Холта-Орама (HOS), который вызывает аномалии конечностей и врожденные пороки сердца (ВПС), включая дефекты перегородки24. Мутация TBX5-ассоциированных сердечных усилителей может критически влиять на ИБС24. Предыдущее исследование обнаружило три известных энхансера TBX5 в сердечно-специфической ткани человека, а именно "Enhancer 2", "Enhancer 9" и "Enhancer 16" (Дополнительный файл 2), которые продемонстрировали сравнительные фенотипы у трансгенных мышей23.

Мы исследовали обогащенные H3K4me1- и H3K27ac области между RBM19 и TBX3, которые являются двумя фланкирующими генами ниже и выше по течению TBX5 у человека, чтобы получить предполагаемые энхансеры в локусе TBX5 (рис. 1 и рис. 2). Для идентификации сердечных энхансеров были выбраны клетки сердечной мышцы. Предполагаемые области сердечного энхансера TBX5 были получены в виде координат (chr12: начало-конец), и были идентифицированы 22 области, ассоциированные с H3K4me1- и H3K27ac (рисунок 3 и дополнительный файл 3). Предполагаемые сердечные усилители TBX5 были извлечены из геномной базы данных EnsEMBL для перекрестного сопоставления данных Hi-C, хранящихся в базе данных 4DNucleome (рис. 4). Это было сделано для оценки возможных взаимодействий между потенциальными энхансерами и сердечным промотором TBX5 . В соответствии с описанным здесь протоколом было подтверждено, что 21 из 22 областей генома взаимодействуют с промотором TBX5 (chr12: 114400143-114410103) в клетках сердечной мышцы (Дополнительный файл 4). Была одна область, которая не имела физического взаимодействия с промотором (рис. 4, шаг 4.8). Наконец, мы сравнили этот протокол с этими биологически валидированными энхансерами и текущей золотой стандартной базой данных сердечных энхансеров, VISTA Cardiac Enhancers Browser, и выявили дополнительные энхансеры, которые в настоящее время не охвачены базой данных25.

Мы провели перекрестное сравнение 21 энхансера TBX5 , полученных с помощью представленного здесь протокола, с существующими базами данных. Мы извлекли 4 энхансера TBX5 из браузера VISTA Cardiac Enhancer (Дополнительный файл 5)25. Из 4 сердечных усилителей, идентифицированных с помощью VISTA, 3 энхансера, hs2329, mm1282 и m370 перекрывались с областями, идентифицированными с помощью этого веб-протокола обнаружения энхансеров (рис. 5). Каждый из предсказанных энхансеров также имел общие участки генома с ранее экспериментально проверенными энхансерами из Smemo et al.23, Enhancer 2 (chr12:114025907-114026275, GRCh38) и Enhancer 16 (chr12:114415466-114420433, GRCh38), в то время как они не показали перекрытия с Enhancer 9 (chr12:114263402-114266886, GRCh38). Один из энхансеров, идентифицированных в VISTA, hs498 не перекрывался с какими-либо предсказанными энхансерами по этому протоколу или с экспериментально валидированными энхансерами23 Smemo et al. (рисунок 5), даже несмотря на то, что область показала частичное перекрытие с метками H34Kme1 (рисунок 5). Аналогичным образом, энхансер 9 не перекрывался с предсказанными энхансерами по этому конвейеру, но был связан с метками H3K4me1 (рис. 5).

figure-results-1
Рисунок 1: Пошаговое руководство по поиску ГОИ в браузере генома EnsEMBL.Сначала пользователь открывает домашнюю страницу EnsEMBL (1.1), выбирает вид (Человек) и вводит ген в строку поиска (1.2-1.3). Из списка результатов выбирается соответствующий идентификатор гена (1.4), после чего открывается страница с кратким описанием гена. Затем пользователь щелкает гиперссылку « Область в деталях » (1.5), чтобы визуализировать область генома, окружающую ГОИ, включая соседние элементы и регуляторные особенности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2: Определение области обнаружения энхансера вокруг ГОИ с помощью браузера генома EnsEMBL .Чтобы определить область обнаружения энхансера, определите два соседних гена, фланкирующих ГОИ, с помощью основных аннотаций генов из трека GENCODE , где гены показаны в виде темно-желтых блоков, помеченных объединенными аннотациями EnsEMBL/Гавана. Транскрипционное направление каждого гена обозначается стрелками (< или >) рядом с именем гена (2.1). Чтобы выбрать межгенную область между соседними генами, щелкните и перетащите курсор по интересующей области, затем выберите «Перейти к области » во всплывающем окне, чтобы увеличить масштаб (2.2). Чтобы добавить аннотации, связанные с нормативными требованиями или улучшениями, нажмите кнопку Добавить/удалить дорожки (2.3). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-3
Рисунок 3: Конфигурация треков модификации гистонов в области обнаружения энхансера с помощью браузера генома EnsEMBL .На левой панели инструментов нажмите «Настроить эту страницу » (3.1), чтобы получить доступ к панели настройки трека, и перейдите к разделу «Активность клеток/тканей» в разделе «Регулирование» (3.2). В открывшейся вкладке выберите раздел «Эксперименты» (3.3), и используйте строку поиска «Клетка/ткань», чтобы найти и выбрать интересующую вас ткань (клетку сердечной мышцы) (3.4). На панели меток гистонов (3.5) включите H3K4me1 и H3K27ac в качестве активных усилителей и H3K4me3 в качестве промоторной метки, затем нажмите «Настроить отображение трека» (3.6). После подтверждения выбора треков нажмите «Просмотреть треки» (3.7), чтобы вернуться к просмотрщику генома. Пики гистоновых меток теперь отображаются в области обнаружения (3.8) в виде цветных блоков под соответствующей меткой ткани (желтый: H3K4me1, синий: H3K27ac и оранжевый: H3K4me3). Всплывающее окно "Hists & Pols", содержащее геномные координаты региона в парах оснований (chr:start-end), которые можно скопировать и сохранить для последующего анализа. Всплывающее окно «Hists & Pols» появляется после нажатия на цветные элементы на трассе. Всплывающее окно содержит геномные координаты области в парах оснований (например, chr12:11443450-114451611 для промоторной области), которые могут быть скопированы и сохранены для последующего анализа (3.8). Аналогичным образом, чтобы извлечь потенциальные энхансеры, приоритизируйте области, где пики H3K4me1 и H3K27ac перекрываются, как показано вертикальным выравниванием пиков и прямоугольников поперек дорожек (3.9). Перекрывающиеся области можно выбрать напрямую, щелкнув по их полям или вручную перетащив их по выровненным пикам, чтобы определить регион (например, chr12:114400143-114410103 для активного региона-кандидата). Координаты, отображаемые во всплывающем окне, должны быть сохранены в формате BED для последующей проверки или визуализации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-4
Рисунок 4: Визуализация взаимодействий промотор-энхансер хроматина с использованием тепловых карт Hi-C с портала данных 4D Nucleome. На главной странице портала данных 4D Nucleome отображается линейчатая диаграмма с накоплением, обобщающая доступные типы экспериментов по организмам. Набор данных "in situ Hi-C" для образцов человека выбирается путем нажатия на соответствующий раздел панели (4.1). Отображается отфильтрованный список релевантных наборов данных; Выбран набор данных Hi-C, полученный из клеток H9, дифференцированных в сердечные миобласты (4.2). Выбранный набор данных (4.3) открывается в браузере HiGlass с помощью кнопки «Исследовать данные » (4.4). Представляющая интерес область генома вводится в поле координат (4.5), а контактная матрица визуализируется в виде тепловой карты с цветовой шкалой. Более темные цвета (от насыщенного красного до черного) указывают на более высокую частоту контакта хроматина, в то время как более светлые цвета (от белого до оранжевого) представляют более слабые взаимодействия. Горизонтальное правило помещается в координату промотора, а вертикальные правила рисуются в положениях трех экспериментально подтвержденных усилителей контроля (4.6). Эти пересечения используются для определения строгого порога взаимодействия, задаваемого самым сильным видимым сигналом (самым темным цветом) среди контактов промотор-усилитель (4.7). Дополнительные вертикальные правила рисуются в местах расположения потенциальных энхансеров, помеченных H3K27ac и H3K4me1 (из шага 3.8). Кандидаты, у которых пересечения промотор-усилитель равны порогу или темнее порога, сохраняются, в то время как кандидаты с более слабыми сигналами (более светлые цветные квадраты) исключаются (4.8). Сохраненные координаты извлекаются вручную и сохраняются в формате BED для последующего анализа. (a. Enhancer 2, b. Enhancer 9 и c. Enhancer 16) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-5
Рисунок 5: Геномный браузерный просмотр предсказанных энхансеров TBX5 в сравнении с сердечными энхансерами, валидированными VISTA, и контрольными энхансерами. Снимки браузера генома отображают диапазон поиска энхансеров (ШАГ 2), сравнивая предсказанные энхансеры, полученные по веб-протоколу (внизу), с энхансерами, валидированными в VISTA (вверху) и экспериментально валидированными контрольными энхансерами (в центре). На главной панели показан полный геномный локус с аннотированными регуляторными элементами, включая специфические для клеток сердечной мышцы H3K4me1 (желтый), H3K27ac (синий) и пики H3K4me3 (оранжевый). Три увеличенных рисунка фиксируют согласованность между полученными протоколом, VISTA и усилителями управления. Перекрытие с усилителями контроля обведено красными прямоугольниками. Координаты для каждого подрегиона отображаются в нижних панелях браузера. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Таблица 1: Данные, использованные в исследовании. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 2: Веб-инструменты, использованные в исследовании. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Дополнительный файл 1: Инструкции по устранению неполадок в браузере генома EnsEMBL. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 2: Файл BED в формате GRCh38, экспериментально проверенные усилители сердечного контроля TBX5 23. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный файл 3: Файл BED в формате GRCh38, сердечные усилители TBX5, полученные с помощью STEP3 от EnsEMBL. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный файл 4: Файл BED в формате GRCh38, сердечные усилители TBX5, полученные с помощью STEP4 от EnsEMBL. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный файл 5: Файл BED в формате GRCh38, сердечные усилители TBX5, полученные из браузера сердечных усилителей VISTA25. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Описанный здесь веб-протокол функционирует как рабочий процесс для извлечения энхансера, а не для прогнозирования энхансера. Используя общедоступные наборы данных о конкретных тканях, модификации гистонов (H3K4me1 и H3K27ac) и данные о взаимодействии Hi-C, он сужает круг потенциальных энхансеров, связанных с GoI. В отличие от вычислительных инструментов прогнозирования, которые зависят от машинного обучения или моделей на основе последовательностей, наш подход фокусируется на извлечении энхансеров только на основе экспериментальных данных. Инструкции по устранению неполадок для браузера генома EnsEMBL приведены в дополнительном файле 1.

Этот рабочий процесс интегрирует ключевые элементы, такие как метки гистонов и данные о взаимодействии хроматина, подобно передовым методам, таким как ChIA-PET и PLAC-seq, которые отображают взаимодействия энхансер-промотор с более высокой точностью10,11. Тем не менее, этот метод полезен, когда экспериментальные методы с высоким разрешением невозможны, так как протокол менее ресурсоемок и значительно экономит время.

Основным ограничением представленного выше подхода является его зависимость от доступности и качества существующих наборов данных, что может повлиять на точность получаемых взаимодействий. Исследование активности энхансеров во время развития сердца в контексте генетических мутаций, связанных с TBX5, требует тканеспецифического разрешения. Для такого анализа эмбриональная сердечная ткань была бы наиболее подходящей, учитывая ее отношение к регуляции развития. Тем не менее, ни один эмбриональный набор данных, включающий данные о модификации гистонов, не был общедоступен на момент анализа. Чтобы учесть это, интеграция альтернативных ресурсов, таких как ENCODE, Enhancer Atlas 2.0 или EnhancerFinder, может расширить полезность конвейера за счет предоставления дополнительных наборов данных для идентификации и проверки энхансера18,19.

В TBX5 REPFIX анализ на основе H3K4me1 выявил 22 предполагаемых энхансера в качестве отправной точки для дальнейших исследований. Последующий анализ Hi-C показал, что 21 из 22 кандидатов-энхансеров на основе предыдущих меток модификации гистонов взаимодействовали с промотором TBX5 в клетках сердечной мышцы (рис. 5). Это подтверждает надежность подхода, основанного на метках модификации гистонов, при прогнозировании областей интереса.

Мы решили не отдавать приоритет сохранению последовательности у разных видов в этом протоколе, хотя это общий критерий для идентификации энхансеров. Поскольку ранее было доказано, что он менее эффективен для тканевых или видоспецифичных энхансеров, многие из которых не сильно сохраняются в ходе эволюции26. Учитывая это, мы решили сосредоточиться на маркерах на основе хроматина, которые более непосредственно указывают на активность функционального энтенсера. Тем не менее, сохранение последовательности может по-прежнему иметь ценность в определенных контекстах, таких как изучение энхансеров с эволюционным значением. В этом случае он может быть добавлен в качестве необязательного шага для пользователей, заинтересованных в сохранении элементов регулирования.

Протокол оказался эффективным при извлечении 21 специфичного для сердца энхансера гена TBX5 с веб-сайта EnsEMBL, который ранее ускользал от идентификации с помощью существующей платформы VISTA Cardiac Enhancers Browser. Несмотря на то, что описанный здесь протокол не смог извлечь один из энхансеров, hs498, что предполагает возможность ограничения в обнаружении, этот подход выявил некоторые энхансеры, не обнаруженные браузером VISTA Cardiac Enhancers. Тем не менее, необходима дальнейшая валидация извлеченных энхансеров, поскольку протокол позволяет получить большее количество предполагаемых областей по сравнению с курируемыми базами данных VISTA. Это большее количество увеличивает риск ложноположительных результатов, и большее количество прогнозируемых энхансеров не обязательно указывает на улучшенную специфичность или функциональную релевантность. Включение дополнительных экспериментальных наборов данных или функциональных анализов, таких как анализ экспрессии генов, пертурбация CRISPR или репортерные анализы, будет иметь решающее значение для подтверждения биологической валидности этих кандидатов, как это было выполнено в Smemoet al. Исследование23.

Перекрестное сравнение с тремя экспериментально подтвержденными энхансерами показало частичное перекрытие с предсказанными областями (рис. 5). Предсказанный энхансер «e1» был расположен более широко, чем валидированный энхансер 2, в то время как «e18» показал частичное перекрытие с энхансером 16 (рис. 5). Эти результаты свидетельствуют о том, что этот подход успешно идентифицирует области с известной регуляторной активностью, хотя более широкий диапазон прогнозируемых энхансеров может отражать гибкость границ энхансеров. Энхансеры часто функционируют как модульные элементы, и их активность может зависеть от контекста хроматина, типа клеток и сроков развития 2,27. Таким образом, предсказанные области могут включать основные активные центры с соседними последовательностями, которые вносят свой вклад в регуляторную функцию, несмотря на необходимость экспериментальной валидации для определения того, какие части этих более широких предсказаний являются функционально активными в тканеспецифичном контексте или контексте развития. В то время как VISTA Cardiac Enhancer Browser идентифицировал четыре области в пределах определенного диапазона, только один энхансер, mm370, частично перекрывался с экспериментально подтвержденным энхансером, Enhancer 16, в частности, в области, отмеченной H3K4me1 (Рисунок 5)23. Оставшаяся часть mm370, которая не перекрывается с энхансером 16, может указывать на нефункциональную или неактивную субобласть энхансера28,29.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не сообщают о каких-либо конкурирующих интересах.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим сотрудников лаборатории Ramialison (Транскриптомика и биоинформатика, reNEW Bioinformatics Hub) за полезные дискуссии. MR и HTN поддерживаются грантом NHMRC Ideas Grant (APP1180905). Мы благодарим Ричарда Саффери за поддержку. MR финансируется стипендией Heart Foundation Future Leader Fellowship (107328). Дополнительное финансирование инфраструктуры для Детского научно-исследовательского института Мердока было предоставлено Национальным советом по здравоохранению и медицинским исследованиям Австралии по схеме поддержки инфраструктуры независимых исследовательских институтов. Австралийский институт регенеративной медицины финансируется за счет грантов от правительства штата Виктория и правительства Австралии. Центр медицины стволовых клеток Фонда Ново Нордиск поддерживается грантами Фонда Ново Нордиск (NNF21CC0073729).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Компьютерная рабочая станцияН/ДН/ДКомпьютер с поддержкой веб-браузера, операционная система Windows/Mac/Linux
Портал данных 4DNПортал данных 4DNhttps://data.4dnucleome.org/
ГалактикаГалактикаhttps://usegalaxy.org/published/history?id=aff5db4e07064445
ГитхабГитхабhttps://github.com/Ramialison-Lab/EnhancerWorkflow
VISTA Браузер VISTA Cardiac Enhancerhttps://portal.nersc.gov/dna/RD/heart/

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Barral, A., Déjardin, J. The chromatin signatures of enhancers and their dynamic regulation. Nucleus. 14 (1), 2160551(2023).
  2. Pennacchio, L. A., Bickmore, W., Dean, A., Nobrega, M. A., Bejerano, G. Enhancers: five essential questions. Nat Rev Genet. 14 (4), 288-295 (2013).
  3. Kleinjan, D. A., van Heyningen, V. Long-range control of gene expression: emerging mechanisms and disruption in disease. Am J Hum Genet. 76 (1), 8-32 (2005).
  4. Kvon, E. Z., Waymack, R., Gad, M., Wunderlich, Z. Enhancer redundancy in development and disease. Nat Rev Genet. 22 (5), 324-336 (2021).
  5. Smith, E., Shilatifard, A. Enhancer biology and enhanceropathies. Nat Struct Mol Biol. 21 (3), 210-219 (2014).
  6. Sur, I., Taipale, J. The role of enhancers in cancer. Nat Rev Cancer. 16 (8), 483-493 (2016).
  7. Panigrahi, A., O'Malley, B. W. Mechanisms of enhancer action: the known and the unknown. Genome Biol. 22 (1), 108(2021).
  8. Bulger, M., Groudine, M. Functional and mechanistic diversity of distal transcription enhancers. Cell. 144 (3), 327-339 (2011).
  9. Krivega, I., Dean, A. Enhancer and promoter interactions-long distance calls. Curr Opin Genet Dev. 22 (2), 79-85 (2012).
  10. Zhang, Y., et al. Chromatin connectivity maps reveal dynamic promoter-enhancer long-range associations. Nature. 504 (7479), 306-310 (2013).
  11. Fang, R., et al. Mapping of long-range chromatin interactions by proximity ligation-assisted ChIP-seq. Cell Res. 26 (12), 1345-1348 (2016).
  12. Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nat Rev Genet. 10 (10), 669-680 (2009).
  13. Thurman, R. E., et al. The accessible chromatin landscape of the human genome. Nature. 489 (7414), 75-82 (2012).
  14. Heintzman, N. D., et al. Distinct and predictive chromatin signatures of transcriptional promoters and enhancers in the human genome. Nat Genet. 39 (3), 311-318 (2007).
  15. Visel, A., et al. ChIP-seq accurately predicts tissue-specific activity of enhancers. Nature. 457 (7231), 854-858 (2009).
  16. Belton, J. -M., McCord, R. P., Gibcus, J. H., Naumova, N., Zhan, Y., Dekker, J. Hi-C: a comprehensive technique to capture the conformation of genomes. Methods. 58 (3), 268-276 (2012).
  17. de Wit, E., de Laat, W. A decade of 3C technologies: insights into nuclear organization. Genes Dev. 26 (1), 11-24 (2012).
  18. Gao, T., Qian, J. EnhancerAtlas 2.0: an updated resource with enhancer annotation in 586 tissue/cell types across nine species. Nucleic Acids Res. 47 (D1), D117-D123 (2019).
  19. Erwin, G. D., et al. Integrating diverse datasets improves developmental enhancer prediction. PLoS Comput Biol. 10 (6), e1003677(2014).
  20. Heintzman, N. D., et al. Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression. Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).
  21. Spicuglia, S., Vanhille, L. Chromatin signatures of active enhancers. Nucleus. 3 (2), 126-131 (2012).
  22. Borsari, B., et al. Enhancers with tissue-specific activity are enriched in intronic regions. Genome Res. 31 (8), 1325-1336 (2021).
  23. Smemo, S., Campos, L. C., Moskowitz, I. P., Krieger, J. E., Pereira, A. C., Nobrega, M. A. Regulatory variation in a TBX5 enhancer leads to isolated congenital heart disease. Hum Mol Genet. 21 (14), 3255-3263 (2012).
  24. Boogerd, C. J., Evans, S. M. TBX5 and NuRD divide the heart. Dev Cell. 36 (3), 242-244 (2016).
  25. Dickel, D. E., et al. Genome-wide compendium and functional assessment of in vivo heart enhancers. Nat Commun. 7 (1), 12923(2016).
  26. Pennacchio, L. A., Visel, A. Limits of sequence and functional conservation. Nat Genet. 42 (7), 557-558 (2010).
  27. Local, A., et al. Identification of H3K4me1-associated proteins at mammalian enhancers. Nat Genet. 50 (1), 73-82 (2018).
  28. Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (50), 21931-21936 (2010).
  29. Visel, A., Minovitsky, S., Dubchak, I., Pennacchio, L. A. VISTA Enhancer Browser-a database of tissue-specific human enhancers. Nucleic Acids Res. 35 (Database), D88-D92 (2007).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

H3K4me1H3K27acHi CEnsembl

Похожие статьи