Методическая статья

Трехцветная трансгенная мышиная модель для изучения повреждения пластин роста

1.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/66841

⸱

6 сентября 2024 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1University of Connecticut Health Center

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол описывает усовершенствованную мышиную модель для травм пластин роста костей у подростков. Используя трансгенных мышей с трехлинейными флуоресцентными репортерами для коллагеновых типов I, II и X, первичных матриц, связанных с тремя различными субстратами пластины роста, размещение травмы определяется с помощью нативной флуоресценции под микроскопом.

Аннотация

Хрящевые пластины роста в костях детей позволяют удлинять конечности, но они слабы по отношению к кости, что делает их склонными к переломам при перегрузке костей. Необходимы более эффективные методы лечения сильно сломанных пластин роста, потому что реакцией на травму является костный мост, который преждевременно срастается с пластинкой роста, что приводит к задержке роста и/или искривлению конечностей. Мышиные модели повреждения пластинок роста полезны для механистических исследований, но сложны, потому что трудно визуализировать и точно повредить небольшие пластинки роста у молодых мышей. Мы описываем здесь улучшенную модель повреждения пластин роста с использованием трансгенных мышей с трехлинейными флуоресцентными репортерами для коллагена типов I, II и X.

У этих мышей наблюдается нативная флуоресценция, связанная с тремя основными субстратами пластинки роста. Травма пластины роста, аналогичная травме Солтера-Харриса II типа, создается воспроизводимым образом с помощью бора с использованием гипертрофического участка пластины роста в качестве эталона во время визуализации в реальном времени под контролем флуоресцентной стереомикроскопии. Замороженный гистологический анализ нативной флуоресценции упрощает оценку клеточного ответа на травму. Эта методология представляет собой существенный скачок в исследованиях повреждений пластин роста, обеспечивая подробный и воспроизводимый метод исследования патологии и оценки новых терапевтических стратегий.

Введение

Пластины роста костей играют ключевую роль в продольном росте длинных костей в детстве и подростковом возрасте1. Расположенная на концах длинных костей, пластинка роста состоит из нескольких зон, при этом хондроциты являются ключевыми клеточными компонентами, ответственными за производство и поддержание этой динамической области роста. Эндохондральная оссификация пластинки роста происходит для удлинения и расширения костей за счет последовательной прогрессии пролиферации хондроцитов, гипертрофии, апоптоза, инвазии кровеносных сосудов, рекрутирования остеопрогениторных клеток и, наконец, формирования кости2. Поскольку пластинка роста относительно мягче костной, она очень подвержена переломам при перегрузке костей во время занятий спортом или других занятий. Классификация Солтера-Харриса выделяет пять различных типов повреждений пластин роста3. Перелом II типа через гипертрофированную зону ростовой пластинки и прилегающую нижнюю костную ткань является наиболее распространенным4. Костный мост часто образуется в ответ на травмы гипертрофической зоны или прилегающей кости и приводит к преждевременному сращению прилегающих длинных участков кости5. Костяные мостики препятствуют нормальному расширению пластины роста. В настоящее время не существует профилактических методов лечения образования костного моста, и некоторые из них остаются нелеченными в зависимости от возраста пациента, размера и расположения костного моста6. При серьезном пороке развития конечностей хирургические варианты включают удаление с последующей имплантацией интерпозиционных материалов, таких как жир или силиконовый каучук, или корректирующую остеотомию и процедуры удлинения кости; Тем не менее, костлявый мост все еще может восстановиться6. Необходимы дополнительные исследования для предотвращения образования костных мостов и улучшения исходов у детей с травмами костной пластины.

Было создано несколько животных моделей для изучения основных механизмов и разработки новых стратегий для предотвращения нарушения костного мостика пластин роста после травмы 7,8,9,10,11,12. Эти животные модели часто сосредотачиваются на проксимальном отделе большеберцовой кости и дистальном отделе бедренной кости в качестве основного места повреждения, учитывая, что именно здесь обычно происходят травмы у человека. Костные дефекты животных создаются либо боковым подходом, аналогичным фактическому пути перелома, либо подходом сверху или снизу пластины роста, ведущим к центральному отверстию в пластине роста. В ранее описанной модели на крысах дефект пластины роста создается путем установки зубного бора через кортикальное окно в среднем стволе большеберцовой кости и сверления вверх через костный мозг к коленному суставу для центрального повреждения пластины роста 7,13. В качестве альтернативы, в недавней модели мыши используется латеральный подход с иглой малого диаметра для создания плоской траектории иглы через ростовую пластину8. В широко используемой модели на крысе дефект создается в пластинке роста дистального отдела бедренной кости путем сверления суставного хряща между мыщелками 9,14. У более крупных животных, таких как кролики и овцы, дефекты пластинки роста были вызваны как латерально, непосредственно в проксимальном отделе большеберцовой кости, так и в дистальном отделе бедренной кости путем сверления или разреза в пластине роста или путем приближения снизу и создания центрального дефекта, оставляя края пластинки роста неизменными 10,11,12,15.

Мышиные модели повреждений ростовых пластин полезны для механистических исследований, которые могут быть проведены с генетически модифицированными мышами, таких как исследования по отслеживанию линии стволовых клеток8. Тем не менее, существенной проблемой на мышиных или крысиных животных моделях является достижение последовательного и точного повреждения определенной подобласти пластины роста. Травмирование определенных зон пластинки роста и прилегающей кости должно имитировать одну из клинически значимых траекторий перелома, описанных классификацией Солтера-Харриса. Проблемы, с которыми на сегодняшний день сталкиваются модели грызунов, в первую очередь связаны с отсутствием визуальных средств идентификации субстратов пластинки роста во время хирургического создания травмы. В этом протоколе описана усовершенствованная методика создания дефектов пластинок роста в целевых субстратах мышиной пластинки роста с использованием трех трансгенных мышей, экспрессирующих коллаген I, II и X флуоресцентных репортеров 16,17,18. Различная цветная флуоресценция этих коллагенов в каждой из первичных зон пластинки роста позволяет визуально различать различные участки пластины роста под флуоресцентным стереомикроскопом во время хирургического создания повреждения пластины роста. Использование этих трансгенных мышей позволяет добиться беспрецедентной точности травмирования у молодой мыши, находящейся на стадии развития, сопоставимой с детьми, получившими травмы.

Протокол

Исследование проводилось в соответствии с институциональными рекомендациями. Все процедуры для животных были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Центра здоровья Университета Коннектикута до начала работ. Схема протокола приведена на рисунке 1 .

figure-protocol-1
Рисунок 1: Схема протокола повреждения пластины роста у трехцветных мышей с коллагеновым репортером. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

1. Разведение мышей и подготовка к операции

  1. Разводите трехцветных трансгенных коллагеновых мышей-репортеров, экспрессирующих Col1a1-GFPTpz, Col2a1-CFP и Col10a1-mCherry 16,17,18,19,20,21 в соответствии со стандартными процедурами разведения, чтобы получить щенков для операции в возрасте 2 недель (± 1 день). Проверьте экспрессию тройного трансгена путем генотипирования фрагмента кончика хвоста под флуоресцентным микроскопом. Используйте только мышей с положительным результатом на все три цвета, чтобы максимизировать пользу от репортерной системы во время последующего гистологического анализа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот возраст 2 недели (± 1 день) выбран потому, что их пластины роста костей находятся на той же стадии развития, что и у22-летнего подростка. Этот протокол распространяется на мышей обоих полов.
  2. В день операции или за день до нее однозначно идентифицируйте каждую мышь, используемую для операции, с помощью ушного прокола после дезинфекции уха и ушного прокола спиртовыми антисептическими подушечками, взвесьте каждую мышь и запишите значение.
  3. Выбрейте всю правую заднюю конечность от бедра до стопы электрической машинкой для стрижки, пока мышь находится под действием изофлурановой анестезии. Чтобы вызвать анестезию у мышей, используйте смесь изофлурана (2-3%) и 100% кислорода, вводимую со скоростью потока 1 л/мин в индукционной камере объемом 1-2 л. Извлеките мышь и убедитесь, что глубина анестезии достаточна, ущипнув палец ноги, который не должен заставить мышь двигаться.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Такая глубина анестезии будет достаточно длительной, чтобы провести бритье без необходимости использования носового конуса для анестезии.
  4. Используйте рентгеновскую визуализацию с настройкой мощности 26 кВ (800 мА) для получения изображений большеберцовой кости у живых мышей под индуцированной изофлураном анестезией для записи начальной длины конечности.
    1. Перед помещением мышей в рентгеновский кабинет необходимо ввести состояние глубокой анестезии с помощью смеси изофлурана (2-3%) и 100% кислорода, вводимой со скоростью потока 1 л/мин в индукционной камере объемом 1-2 л.
    2. Поместите трех мышей под наркозом одновременно на их животы в рентгеновском кабинете на высоте полки, которая позволяет получить одно изображение, включающее всех трех мышей. Расставьте ноги, чтобы большеберцовые кости не заслонялись под мышкой. Для повышения точности измерений расположите рентгеноконтрастные весы рядом с мышью во время визуализации (рисунок 2A).
  5. Верните подготовленных мышей в их клетку с матерью-мышью, чтобы дождаться последующих хирургических процедур.

2. Подготовка хирургических принадлежностей и стерильной рабочей зоны

  1. Простерилизуйте следующие предметы: 10-20 марлевых салфеток, ватные тампоны для аппликаторов, зубные боры (диаметр 0,5 мм), стоматологические наконечники, щипцы Грефе, изогнутые кровоостанавливающие щипцы от комаров, изогнутые тонкие ножницы, иглодержатели, пародонтальные зонды и резчики по дискоидам зубов.
  2. Соберите дополнительные необходимые стерильные принадлежности: инъекционную суспензию бупренорфина, иглы 20 г, шприцы 1 мл, простыни для полотенец, 5-0 неокрашенных, плетеных, покрытых, викрильных швов, повидон-йод, фосфатно-солевой буфер, спиртовые антисептические салфетки, скальпели #15, хирургические перчатки, защитную поверхность окружающей среды трубку sox, глазную смазку, 70% этаноловый спрей. Включите стерилизатор со стеклянными шариками для дополнительной стерилизации предметов во время операции и электрическую грелку под чистой клеткой для мыши со стерилизованной подстилкой.
  3. Очистите и простерилизуйте предметный столик флуоресцентного стереомикроскопа, прилегающие поверхности и подставку для хирургических инструментов, используя 70% этанол. Закройте эти области, которые станут хирургическим рабочим местом, стерильными простынями для полотенец.
  4. Соберите электронную высокоскоростную систему сверления зубов. Подключите электронный ножной контроллер к блоку управления и накройте шнур наконечника продезинфицированной поверхностью барьерной трубки sox. Прикрепите стерильный круглый зубной бор толщиной 0,5 мм. Включите контроллер и установите его на передаточное число 1:1 и максимум 30 000 об/мин.
  5. Закрепите с помощью ленты гибкий изофлуран машинный шланг, который заканчивается носовым обтекателем, накрытым продезинфицированной поверхностной барьерной трубкой на предметном столике флуоресцентного стереомикроскопа.
  6. Включите флуоресцентный стереомикроскоп и вспомогательное оборудование и откройте программное обеспечение для получения изображений.

figure-protocol-2
Рисунок 2: Основные этапы процедуры травмирования мышиной пластины роста с помощью трехлинейного флуоресцентного репортера. (A) Измерение длины большеберцовой кости с помощью факситронной рентгеновской визуализации с использованием рентгеноконтрастной линейки, размещенной рядом с мышами в рентгеновском кабинете. (В) Правильное положение мыши, находящейся под наркозом, для проведения операции под флуоресцентным стереомикроскопом. Проксимальный отдел большеберцовой кости обозначен черной стрелкой. (C) Пример разреза, сделанного для доступа к пластине роста. (D) Флуоресцентная стереомикроскопия с выделением гипертрофированной зоны пластинки роста (белая стрелка). Прилегающая пролиферативная зона обозначена желтой стрелкой. (E) Яркое световое освещение хирурга, помещающего зубной бор диаметром 0,5 мм в пластину роста. (F) Точное размещение зубного бора осуществляется с помощью флуоресцентной стереомикроскопии в гипертрофической зоне. (G) Пример дефекта пластины роста типа II, подобного Солтеру-Харрису (белая стрелка). Масштабные линейки = 1 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

3. Процедура травмирования наростовой пластины проксимального отдела большеберцовой кости

  1. Обезболивают мышь в анестезиологической камере изофлурана, регулируя концентрацию изофлурана до 2-3% и скорость потока кислорода до 1 л/мин. Дождитесь индукции глубокого обезболивающего состояния, подтвержденного тестом с щипцом ноги и наблюдением за дыхательными паттернами.
  2. Вводите половину назначенной дозы бупренорфина подкожно сразу после удаления мыши из камеры. Дозировка бупренорфина осуществляется в соответствии с утвержденным протоколом для животных.
  3. Нанесите глазную смазку, чтобы защитить глаза мыши от пересыхания во время операции, и перенесите мышь в лежачем положении на носовой конус изофлурана на предметном столике стереомикроскопа (рис. 2B). Отрегулируйте поток анестезии через носовой конус до 2% и скорость потока кислорода до 1 л/мин.
  4. Продезинфицируйте правую заднюю конечность, тазовую область, переднюю часть левой задней конечности и хвост последовательно повидон-йодом с последующим добавлением 70% этанола.
  5. Убедитесь в длительной стабильной глубине анестезии с помощью дополнительного теста на щипки пальцев ног и наблюдения за респираторными паттернами до начала операции.
  6. Под ярким световым освещением с помощью скальпеля #15 сделайте разрез на коже чуть ниже коленного сустава начальной длиной около 5 мм, чтобы открыть проксимальный конец правой большеберцовой кости (Рисунок 2C). При необходимости используйте ножницы, чтобы удлинить разрез. Держите левую контралатеральную большеберцовую кость неповрежденной, чтобы она служила внутренним неповрежденным контролем.
  7. Выполните вертикальное тупое рассечение через вышележащую мышцу в проксимальном отделе большеберцовой кости с помощью тыльной стороны скальпеля #15, удаляя мягкие ткани для четкого обнажения пластины роста.
  8. Выключите свет в операционной и выберите правильный канал флуоресценции, чтобы осветить нужную область пластины роста. Для визуализации каждого из флуоресцентных коллагенов требуются следующие наборы фильтров: Col 2 голубой: ET436/20x (возбуждение), ET480/40 м (излучение), Col 10 mCherry: ET577/20x (возбуждение), ET640/40 м (излучение), Col 1 Топаз: ET500/20x (возбуждение), ET535/30 м (излучение). Расположите мышь так, чтобы наблюдать за проксимальной пластинкой роста большеберцовой кости (рисунок 2D). Отрегулируйте отверстие кожи немного проксимальнее, а затем дистальнее, чтобы убедиться, что в поле зрения находится пластина роста большеберцовой кости, а не пластинка роста бедренной кости.
  9. Создайте поражение типа Солтера-Харриса типа II, глядя в окуляр микроскопа, расположив бор стоматологической бормашины диаметром 0,5 мм параллельно большеберцовой оси в середине зоны гипертрофированной пластинки роста, используя латеральный доступ (рис. 2E, F). Чтобы воспроизвести дефект, имитирующий поражение Солтера-Харриса II типа, держите конечность параллельно рабочей поверхности, чтобы путь входа бора не был наклонен в эпифиз. Надавите на педаль сверла, чтобы начать вращение бора, и осторожно вдавите бор в пластину роста, остановившись, прежде чем дефект углубится глубже, чем диаметр бора (Рисунок 2G).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вторая пара рук, помогающая стабилизировать конечность мыши, полезна.
  10. Орошите место поражения каплей стерильного PBS, чтобы удалить любой мусор.
  11. Подтвердите глубину дефекта на расстоянии 0,5 мм с помощью пародонтального зонда.

4. Процедуры после травмы и закрытие

  1. Для определения характеристик с нулевым дефектом по времени соберите поврежденную заднюю конечность и контролируйте ее перед закрытием тканей. Следите за забором тканей и подготовкой к последующей микрокомпьютерной томографии (микрокомпьютерной томографии) и криогистологической визуализации в разделе 6.
    Примечание: Для экспериментов, включающих имплантацию терапевтического вещества в дефект пластинки роста, сам дефект может вместить только кусок биоматериала, который имеет примерно сферическую форму и диаметром 0,5 мм или объемом 0,082мм3 (0,082 мкл).
  2. Используйте щипцы под микроскопической визуализацией для введения биоматериала или введения жидкого терапевтического средства в дефект внутри ростовой пластинки. Используйте больший объем биоматериала или вводимого вещества, если дизайн исследования не требует, чтобы терапевтическое лечение ограничивалось только дефектом.
  3. Осторожно выровняйте края кожи, убедившись, что имплантированный материал, если таковой имеется, надежно остается в месте дефекта.
  4. Используйте прерывистые методы наложения швов с полигликолевой кислотой 5-0, чтобы эффективно закрыть разрез кожи.
  5. Тщательно очистите участки за пределами хирургической области от остатков повидон-йода с помощью тампонов со стерильной водой, стараясь избегать контакта с раной и близко прилегающими участками.
  6. Извлеките мышь из изофлуранового носового конуса на предметном столике микроскопа в клетку для восстановления, расположив ее сбоку на свежей подстилке над грелкой.
  7. Внимательно наблюдайте за частотой дыхания мыши в течение примерно 5 минут, вводя оставшуюся дозу бупренорфина для обезболивания как раз в тот момент, когда эффекты изофлурановой анестезии уменьшаются, на что указывает увеличение частоты дыхания, но до начала подвижности. Держите мышь в изолированной клетке для восстановления до тех пор, пока она не продемонстрирует полную способность к передвижению, после чего воссоедините ее с матерью и братьями и сестрами.
  8. Проводите ежедневные осмотры в течение первых 48 часов после операции, а затем еженедельные обследования вплоть до момента эвтаназии. Сосредоточьтесь на признаках инфекции, эффективности передвижения, доступности пищи и целостности швов.
  9. Отлучите мышей от груди в стандартное время (т.е. в возрасте 3 недель).

5. Измерение длины конечностей

  1. Основываясь на временных точках, определенных экспериментальной гипотезой и дизайном, обезболить мышей изофлураном и провести рентгенографическую визуализацию по всей длине как поврежденных, так и неповрежденных большеберцовых костей, как показано на рисунке 2А и описано в разделе 1.4. Подходящими ориентирами для последовательных измерений длины конечностей являются верхняя часть эпифиза большеберцовой кости и дистальный конец большеберцовой кости в большеберцовом суставе, как показано на рисунке 3.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Визуализация используется для оценки разницы в длине и длине конечностей из-за травмы, а также развития костного моста в тканях пластины роста через определенные послеоперационные интервалы.

6. Диссекция тканей, фиксация, микрокомпьютерная томография и встраивание

  1. Усыпляйте мышь с помощью удушьяСО2 , предпочтительно с использованием автоматизированной системы индукцииСО2 с подтверждением смерти альтернативным методом, таким как вывих шейки матки.
  2. Изолируйте обе неповрежденные задние конечности и удалите кожу и мышцы из области кости и капсулы колена в рамках подготовки к гистологическому анализу и микрокомпьютерной томографии.
    1. Перед тем, как поместить задние конечности в фиксатор, осторожно иссеките надколенник, отрезав его с помощью микрорассекающих ножниц для облегчения фиксирующего проникновения в коленную полость. Используйте инсулиновый шприц 29 г для тщательного распределения холодного 10% буферного формалина по всем областям коленной полости. Тяжелая диафизарная область бедренной и большеберцовой костей для улучшения фиксирующего доступа к пространству костного мозга. Поддерживайте ткань сустава в полностью вытянутом положении в пределах фиксатора в течение 24-36 ч при температуре 4 °C, привязав ее марлей к тонкому дюбелю.
      ВНИМАНИЕ: Формалин токсичен и должен работать в вытяжном шкафу с использованием соответствующих средств индивидуальной защиты.
  3. Через 24-48 ч фиксации формалина при 4 °С провести рентгенографическую микрокомпьютерную томографию с высоким разрешением контралатеральных и поврежденных образцов методом микрокомпьютерной томографии после переноса образцов в PBS для оценки развития костного моста. Используйте размер вокселя 6,0 мкм, время дискретизации 330 000 мс и настройки энергии 55 000 В с интенсивностью 145 мкА.
  4. После микрокомпьютерной томографии и дополнительных 24 ч фиксации формалина при 4 °C промойте образцы в 1X PBS в течение 3 x 5 минут, а затем погрузите образцы в 10% сахарозу в 1X PBS на 1 ч, 20% сахарозу в 1X PBS на 1 ч и 30% сахарозу в 1X PBS на ночь. Используйте инсулиновый шприц 29 г, наполненный раствором сахарозы, чтобы раствор сахарозы проник во все области коленной полости. Переложите в морозильную камеру при температуре -80 °C, если она не засыпается, после ночного погружения сахарозы, чтобы обеспечить сохранение репортера GFP и ферментативной активности тканей.
  5. Удалите остатки мышечной ткани из области сустава перед внедрением. Уравновесьте образец криосредой в течение ночи, способствуя проникновению среды в коленную полость.
  6. Просмотрите изображения микрокомпьютерной томографии, чтобы определить, где находится дефект и костный мост до встраивания. Нанесите тонкий слой криоэмбедирующей среды на криомолд и поместите рассеченную и все еще соединенную большеберцовую кость/бедренную кость/сустав таким образом, чтобы интересующая область была обращена под углом 90° к поверхности закладной среды.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Такая ориентация позволяет при разрезании захватывать боковой вид дефекта, созданного сбоку. Если костный мост находится вблизи края дефекта, то такая ориентация также позволит избежать возможности пропустить интересующую область во время первых более толстых участков, проходящих через ткань.
  7. Поместите криомолд на сухой лед до тех пор, пока криосреда не затвердеет, закрепив образец. Продолжайте заполнять криомолд средой, держа ее на сухом льду.
  8. Закрепив образец, погрузите криомолд в охлажденный сухим льдом 2-метил-бутан до полного замерзания. После замораживания удалите избыток 2-метил-бутана, заверните криоформы в целлофан и храните при температуре -20 °C или -80 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При длительном хранении более 1-2 месяцев в криозаверточной среде рекомендуется температура -80 °C для предотвращения высыхания. Ленточная криосекция и адгезия сечений к предметным стеклам описаны ранее23.

7. Последовательная визуализация, окрашивание и повторная визуализация

  1. Реализуйте последовательную процедуру визуализации, окрашивания и повторной визуализации для облегчения обнаружения и колокализации множественных биологических сигналов в пределах одного и того же участка ткани, как описано ранее23. В частности, для срезов пластины роста у мышей трехцветного коллагенового репортера рекомендуется выполнить следующие действия. Такой упорядоченный подход обеспечивает комплексную визуализацию как молекулярных сигналов, так и структурных деталей.
    1. Первоначально захватите эндогенные флуоресцентные сигналы для трех коллагенов в первом раунде визуализации.
    2. Нанесите окрашивание кальцеиновым синим цветом и изображение для минерализованной ткани23, а затем окрашивание и визуализацию ферментативной активностью тартрат-резистентной кислой фосфатазы (TRAP)23.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Несмотря на то, что результаты окрашивания ферментативной активностью TRAP здесь не отображаются, этот этап окрашивания выполняется, поскольку он необходим для удаления минерала до того, как результаты окрашивания Safranin O/Fast Green представлены в разделе репрезентативных результатов.
    3. Проведите ядерное окрашивание 4',6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI), как описано ниже, а затем сделайте изображение.
      1. Поместите предметные стекла, прошедшие предварительную визуализацию, в банку Coplin, содержащую 1x PBS. Оставьте их погруженными до тех пор, пока покровные стекла не отсоединятся от слайдов. После отсоединения снимите и тщательно высушите покровные стекла.
      2. Нанесите противопятнящий раствор DAPI на покровные стекла, используя разведение DAPI в соотношении 1:1000 в смеси 50% глицерина и 1x PBS. Продолжайте процесс визуализации после нанесения.
    4. Завершите нанесением красителя Safranin O/Fast Green для акцентирования архитектуры тканей, а затем и изображения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните этот шаг в качестве заключительного шага для корреляции хромогенных изображений с флуоресцентными сигналами.
      1. Приготовьте растворы гематоксилина железа Weigert. Приготовьте раствор А, растворив 1 г гематоксилина в 100 мл 95% этанола, и раствор В, смешав 4 мл 29% раствора хлорида железа, 95 мл деионизированной воды и 1 мл концентрированной HCl. Смешайте равные части раствора А и В, чтобы получить рабочий раствор гематоксилина Вайгерта, стабильный в течение примерно 4 недель.
      2. Погрузите горки в деионизированную воду на 2 х 2 минуты для увлажнения.
      3. Нанесите рабочий раствор гематоксилина Вейгерта на 5 минут.
      4. Промойте предметные стекла в водопроводной воде в течение 5 минут, затем кратковременно в деионизированной воде на 1 минуту.
      5. Окрашивать 0,2% раствором Fast Green (0,2 г Fast Green FCF в 100 мл деионизированной воды) в течение 2 мин.
      6. Кратковременно промыть в 1% уксусной кислоте в течение 1 мин.
      7. Окрашивать 0,1% раствором Сафранина О (0,1 г Сафранина О в 100 мл деионизированной воды) в течение 1 мин.
      8. Промойте в деионизированной воде до достижения визуально сбалансированного цвета, примерно 5 минут.
      9. Установите предметные стекла с 30% глицерином в деионизированную воду (избегайте PBS) и немедленно приступайте к визуализации, чтобы предотвратить диффузию цвета из ткани. Для выделения клеток зоны покоя ростовой пластины проводят изображение с помощью фильтра Cy5: ET640/30x (EX), ET690/50 m (EM).

Результаты

В этом протоколе используются трехлинейные флуоресцентные мыши-репортеры для точного индуцирования дефекта латеральной пластинки роста в проксимальном отделе большеберцовой кости за счет использования присущей ей красной флуоресценции, излучаемой коллагеном типа X, для хирургического контроля. Вид хирурга, который он видит, глядя в окуляр стереомикроскопа с набором фильтров mCherry, показан на рисунке 2D. Нативная флуоресценция типа X позволяет хирургу поместить бор в гипертрофическую зону и создать травму, которая имитирует распространенный тип повреждения пластинки роста, приводящего к костному мосту (Рисунок 2F). Флуоресценция под красным каналом самая яркая и, следовательно, рекомендуется для использования при установке бора. В качестве альтернативы, создание дефекта может быть направлено на использование других цветов нативной флуоресценции тройных трансгенных мышей, если целью эксперимента является изучение повреждений других зон пластинки роста, отличных от гипертрофированной зоны и прилегающей кальцинированной области.

Создание дефекта Солтера-Харриса типа II в гипертрофической зоне пластинки роста и прилегающей нижней костной ткани с использованием зубного бора диаметром 0,5 мм было подтверждено с помощью микрокомпьютерной томографии и криогистологической визуализации поврежденных (время 0) проксимальных отделов большеберцовой кости по сравнению с неповрежденными боковыми контрольными группами у мышей N = 3 (рис. 4). Дефекты было трудно увидеть на 3D-изображениях микрокомпьютерной томографии, но они были обнаружены в двумерных сечениях (рис. 3A, B, E, F). На рисунке 3G показано распределение коллаген-продуцирующих костных клеток I типа (зеленая флуоресценция), коллаген-продуцирующих пролиферативных хондроцитов II типа (голубая флуоресценция) и коллаген-продуцирующих гипертрофических хондроцитов типа X. На изображении травмированной мыши (рис. 4G) наблюдается нарушение гипертрофической зоны, временно кальцинированного слоя и некоторых новейших сформированных костей по сравнению с контролем, при этом пролиферативная зона нарушена лишь незначительно. Окрашивание Safranin O/Fast Green (Рисунок 4H) лучше всего иллюстрирует расположение дефекта в поврежденной пластинке роста, поскольку все клетки хорошо видны.

Рентгенологический анализ дает некоторое представление о влиянии этого типа повреждения пластинки роста на длину большеберцовой кости и формирование костного мостика с течением времени (Рисунок 3). Сравнительная визуализация неповрежденных (Рисунок 3A) и поврежденных (Рисунок 3B) большеберцовых костей, сделанная до операции и через 3 недели после нее, показывает большой объем роста конечностей, истончение пластин роста и отчетливую непрозрачную область, которая развилась в области поврежденной пластины роста через 3 недели. Это помутнение в ростовой пластинке отсутствует ни у неповрежденного аналога, ни у мышей до операции. Таким образом, факситрон является одним из способов наблюдения за патологическими изменениями, вызванными травмой у живых мышей, такими как образование костного мостика и изменения длины конечностей.

Микрокомпьютерная томография рассеченных костей обеспечивает детальную визуализацию формирования костного мостика в поврежденных пластинах роста через три недели после операции (Рисунок 5). Как видно на изображениях от шести различных травмированных мышей, показанных на рисунке 5, у всех мышей наблюдается устойчивое развитие костного мостика. С помощью программного обеспечения Scanco Medical был рассчитан объем костного мостика путем рассмотрения каждого участка проксимального отдела большеберцовой пластинки роста, определения площади костного мостика (рис. 5B) с помощью инструмента select, а затем интеграции каждой области участка по всему объему пластины роста для получения общего объема24. Рассчитанный таким образом объем костного мостика составил 0,0761мм3 ± 0,0246 (среднее значение ± стандартное отклонение, N = 6). Большинство костных мостиков образуются около середины пластины роста, несмотря на боковой подход, который повреждает внешний край, а также центр пластины роста. Это явление можно объяснить тем, чтоза образование костного мостика отвечают мезенхимальные стволовые клетки (МСК) из костного мозга, а не из надхрящного дерева.

У этих трехцветных трансгенных мышей криогистологический анализ поврежденной пластинки роста обогащен нативной флуоресценцией коллагена (рис. 6). Он выявляет сложное взаимодействие костных клеток и хондроцитов в месте повреждения. Изображения микрокомпьютерной томографии, показанные на рисунке 6J, K, были предоставлены технику-гистологу для руководства внедрением и срезом. Коллаген-продуцирующие костные клетки I типа показаны на рисунке 6L, O, P (зеленая флуоресценция), в то время как пролиферативные хондроциты II типа, продуцирующие коллаген, видны на рисунке 6L, O, Q (голубая флуоресценция). Гипертрофированные хондроциты типа X, продуцирующие коллаген, видны на рисунке 6L,O,R (красная флуоресценция). Этот многоцветный флуоресцентный подход позволяет детально изучить послеоперационную дифференцировку хондроцитов в области костного мостика на фоне минерализованной ткани. Окрашивание DAPI было использовано для подтверждения распределения всех типов клеток в области пластинки роста (Рисунок 6M). Окрашивание Safranin O/Fast Green демонстрирует сложную и структурную организацию хряща и кости в поврежденной пластинке роста (Рисунок 6N). Визуализация этих окрашенных участков с помощью набора фильтров Cy5 заметно осветляет клетки зоны покоя на границе между эпифизарной костью и хрящом.

figure-results-1
Рентгеновские снимки контралатерального контроля и поврежденных большеберцовых костей мышей были сделаны непосредственно перед травмой, когда мышам было 2 недели, и через 3 недели после операции, когда мышам было 5 недель, демонстрируя степень роста, который происходит в этот период. (В) Повреждение большеберцовой кости от той же мыши в те же моменты времени, что и на рисунке (А). Ориентирами, используемыми для измерения длины большеберцовой кости, являются вершина проксимальной головки большеберцовой кости до конца большеберцовой кости в голеностопном суставе (красные двунаправленные стрелки). Непрозрачный костный мост виден в поврежденной проксимальной пластинке роста большеберцовой кости на 5 неделе. Масштабные линейки = 5,00 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-2
Рисунок 4: МикроКТ и гистологические изображения контралатерального контроля с нулевым временем и поврежденных проксимальных большеберцовых костей мыши. (A,E) и (B,F) отображают 3D и поперечные 2D изображения микрокомпьютерной томографии, с дефектом, обозначенным красными стрелками в (E) и (F). (С,Г) Составные объединенные криогистологические изображения объединяют три слоя врожденной флуоресценции с минерализованным слоем ткани. Зеленые клетки (Col3.6GFPtpz) — это коллаген-продуцирующие костные клетки I типа, клетки голубого цвета (Col2A1GFPcyan) — пролиферативные хондроциты II типа, продуцирующие коллаген, а красные клетки (Col10A1RFPchry) — гипертрофические хондроциты типа X, продуцирующие коллаген. (Д,Н) Окрашивание Safranin O/Fast Green той же области, что и (C) и (G). Масштабные линейки = 1,0 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-3
Рисунок 5: Микрокомпьютерная томография костных мостиков, сформированных по этому протоколу. (A,C,E,G,I,K) Поперечные срезы проксимальной пластинки роста большеберцовой кости шести разных мышей через 3 недели после создания дефекта. Мост Бони обведен красной пунктирной линией в точке (А). (B,D,F,H,J,L) 3D-реконструкции со срезанной продольной плоскостью. Мост Бони обведен красной пунктирной линией в (B). Масштабные линейки = 1,0 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-4
Рисунок 6: МикроКТ и гистологические изображения контралатерального контроля и поврежденной проксимальной большеберцовой кости мыши с образованием костного мостика. (A,J) и (B,K) отображают 3D и поперечные 2D изображения микрокомпьютерной томографии, где костный мостик обозначен желтыми стрелками в (J) и (K). (К,Л) Составные объединенные криогистологические изображения объединяют три слоя врожденной флуоресценции с минерализованным слоем ткани. Зеленые клетки (Col3.6GFPtpz) — это коллаген-продуцирующие костные клетки I типа, клетки голубого цвета (Col2A1GFPcyan) — пролиферативные хондроциты II типа, продуцирующие коллаген, а красные клетки (Col10A1RFPchry) — гипертрофические хондроциты типа X, продуцирующие коллаген. Белая рамка указывает на большее увеличение, показанное на панелях F и O. (Д,М) Минерализованная ткань и окрашивание DAPI в области пластин роста панелей C и L. (Э,Н) Окрашивание Safranin O/Fast Green той же области, что и (D) и (M), отсканированное с помощью cy5 флуоресценции. (Ф,О) Большее увеличение площади пластины роста на объединенном изображении панелей C и L. (Г-И,-Р) Отдельные каналы нативной флуоресценции показаны на фоне минерализованной ткани. Масштабные линейки = 1,0 мм (A-E) и (J-N), = 250 μм in (F-I) и (O-R). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Обсуждение

Инновационное использование трехцветных мышей с коллагеновым репортером позволяет создавать дефекты пластинок роста с заранее определенным размером и расположением, что значительно повышает точность экспериментальных моделей мышей для травм пластинок роста. Учитывая небольшой размер 2-недельных мышей, крайне важно использовать небольшой бор 0,5 мм для создания травмы, чтобы избежать ослабления конечности и перелома на всю толщину. Хирург также должен прикладывать достаточное давление при создании дефекта, чтобы избежать слишком глубокого сверления кости по той же причине. Использование периозонда имеет решающее значение для подтверждения постоянной глубины травмы.

Как и при любой операции, важно подтвердить достаточную глубину анестезии, подтвержденную периодическим защемлением пальца ноги, и поддерживать стерильность на протяжении всего лечения. Еще одним важным хирургическим моментом является то, что было описано тупое препарирование с помощью резчика, потому что оно позволяет избежать повреждения мягких тканей и помогает обеспечить мышам возможность передвигаться сразу после восстановления после анестезии, чтобы добраться до матери-мыши для питания и комфорта. По нашему опыту, раны, закрытые швами, остаются успешно закрытыми и зажимы для раны не требуются. Рекомендуется хирургическое вмешательство на мышах в возрасте 2 недель, чтобы наилучшим образом имитировать маленького ребенка, у которого есть переломы пластин роста. Одним из недостатков этого протокола является то, что, учитывая непредсказуемый характер родов, использование этой модели мыши требует доступности хирурга в кратчайшие сроки.

Что касается расположения бора для создания дефекта, протокол описывает создание травмы с помощью набора красных фильтров mCherry/Texas, который освещает гипертрофическую зону внутри пластины роста из-за яркости флуоресценции коллагена X. Чтобы убедиться в том, что травма образовалась внутри пластины роста большеберцовой кости, полезно слегка сдвинуть отверстие мягких тканей влево и вправо, чтобы подтвердить, что в поле зрения находится проксимальная пластинка роста большеберцовой кости, а не бедренная кость. Переключение между каналами набора фильтров для освещения зоны пролиферативных хондроцитов или прилегающих участков кости полезно для подтверждения точного размещения относительно местоположения пролиферативной зоны и прилегающих участков кости.

В то время как пролиферативная зона хондроцитов и эпифизарная и метафизарная кость могут быть различимы с помощью флуоресцентной микроскопии у живых мышей, реальная ценность коллагеновых репортеров типа II и I реализуется во время гистологического анализа пластины роста. Учитывая водную природу криогистологических процессов, традиционные протоколы осаждения хромогенных красителей не подходят из-за потенциального несовпадения цвета с флуоресцентной визуализацией, вызванного стадиями обезвоживания. Несмотря на то, что водный протокол позволяет получить картину окрашивания, аналогичную той, которая наблюдается в парафиновых срезах, быстрая визуализация после окрашивания необходима для предотвращения диффузии красителя из ткани. Использование 30% глицерина в дистиллированной воде в качестве монтажной среды может замедлить эту диффузию, что позволяет проводить многократное хромогенное окрашивание одного и того же участка, включая хрящи с помощью Safranin O/Fast Green.

Процесс эндохондрального окостенения хорошо виден с красными хондроцитами, выстилающими развивающийся костный мостик (Рисунок 6). Дополнительное использование иммуногистохимических методов, для которых доступно множество мышиных антител, может еще больше улучшить механистические исследования, проводимые на этих трансгенных мышах. В целом, комбинация методов факситронной, микрокомпьютерной томографии и криогистологической визуализации в этой трансгенной модели мыши обеспечивает всестороннее понимание макроскопических и микроскопических изменений, которые происходят в ответ на повреждения пластинок роста, прокладывая путь для будущих терапевтических вмешательств для смягчения таких неблагоприятных исходов. Дальнейшие генетические манипуляции с этими трансгенными мышами могут быть проведены, чтобы позволить исследованиям по отслеживанию линии понять происхождение клеток, которые во времени и пространстве участвуют в заживлении. Эксперименты на мышах с дополнительными модификациями позволили бы изучить заболевания хряща, такие как остеохондрома – чрезмерное разрастание хряща и кости вблизи пластины роста.

Согласованность нашей модели демонстрируется воспроизводимым формированием костных мостиков у всех мышей без необходимости отбраковки мышей из группы из-за повреждения суставного хряща. Это улучшение по сравнению с предыдущими моделями, которые приближались к пластине роста из кортикального окна ниже пластины роста и наклоняли острый инструмент или бор вверх к пластине роста и иногда выходили за пределы суставного хряща. Дополнительная травма суставного хряща не имитирует обычно встречающиеся травмы ростовой пластинки у детей. Более точное повреждение этой животной модели уменьшает количество мышей, необходимых для эксперимента, и это еще одно улучшение. Использование трансгенных мышей позволяет исследователю сосредоточить повреждение на подразделах пластинки роста, таких как гипертрофическая/временно кальцинированная область или область эпифиза/зоны покоя/пролиферативной зоны, не затрагивая суставной хрящ. Однако ограничением этой модели является изменчивость объема костного мостика, который может отличаться до 30% у травмированных животных. Следовательно, обнаружение клинически значимого влияния на формирование костного мостика по-прежнему требует большого количества животных для достижения статистической значимости.

Преимущества описанной здесь модели мышей по сравнению с ранее опубликованными моделями повреждения пластин роста крыс или кроликов 7,9,10,14 включают меньшее количество используемых животных, снижение затрат, эффективный размер реплики благодаря воспроизводимому образованию костных стержней, более короткие временные рамки исследования и более точное размещение травмы благодаря визуализации тройных трансгенных мышей в реальном времени. Хотя эта модель мыши не обсуждается подробно, ее можно использовать для тестирования тканеинженерных имплантатов или биоматериалов, доставляющих факторы роста. Заметным ограничением этого метода является то, что размер имплантата, используемого для доставки терапевтических препаратов или клеток, ограничен объемом дефекта примерно в 0,5 мм в диаметре сферы. Только более крупные животные модели могут вместить тот объем исследуемого материала, который был бы использован у людей. Дефект бора, созданный в этом протоколе, не имеет той же геометрии, что и тонкий перелом, и поэтому отличается от реальных человеческих травм. Тем не менее, у этой мышиной модели много преимуществ, и латеральный подход позволяет избежать повреждения суставного хряща, которое может произойти при слепом приближении выше или ниже пластины роста на одной линии с длинной осью большеберцовой кости. Эта методология представляет собой существенный скачок в исследованиях повреждений пластин роста, обеспечивая подробный и воспроизводимый метод исследования патологии и оценки новых терапевтических стратегий.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантом от Национальных институтов здравоохранения, Национального института артрита, скелетно-мышечных и кожных заболеваний (NIAMS) 1R21AR079153 и грантом Университета Коннектикута по программе улучшения исследований (REP). Авторы выражают признательность за помощь Ренате Рыдзик из Университета Коннектикута MicroCT Imaging Core.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
2-метил-бутанSigma AldrichM32631
Спиртовые антисептические прокладкиAcme United CorporationH305-200
Axio Scan.Z1Carl Zeiss AGAxio Scan.Z1
AxioVision программное обеспечениеCarl Zeiss AG
Бетадина раствор (10% повидон-йод)Avrio Health L.P.67618-150-01
КальцеинSigma AldrichC0875
Кальцеин Синий SigmaAldrichM1255
CFP Набор фильтровChroma Technology Corp.49001
CryomatrixThermo Scientific6769006
CryomoldsFisher ScientificFisherbrand #22-363-554
CryostatLeica Biosystems3050s
Криостатные лезвияThermo Scientific3051835
Секция криолентыLabCryofilm 2C
Изогнутая мелкая ножницы Fine Science Tools14061-11
Изогнутые кровоостанавливающие щипцы от комаровHuFriedyGroupH3
cy5 filter setChroma Technology Corp.49009
DAPIThermoFisher Scientific62247
Набор фильтров DAPIChroma Technology Corp.49000
Стоматологический бор (диаметр 0,5 мм)
Стоматологический клеоидный дисковидный резчикACE Surgical Supply Inc.6200097A-EA
Стерилизатор сухих стеклянных шариков (Inotech Steri 350)Inotech Bioscience, LLCIS-250
Ушной пробойникFine Science Tools24212-01
Электрическая грелка
Электронное ножное управлениеNouvag AG1866nou
Электронные двигатели 31 ESSNouvag AG2063nou
Поверхностный барьер для окружающей среды (3 x 12 дюймовые трубы)Patterson Companies, Inc.BB-0312H
Этанол (70%)
Ethiqa XR (инъекционная суспензия бупренорфина с пролонгированным высвобождением) 1,3 мг/млFidelis Animal Health86084-100-30
Факситронный рентгеновский кабинетKubtech ScientificParameter
Флуоресцентный стереомикроскопCarl Zeiss AG LumarV12
GFP набор фильтровChroma Технологическая корпорация49020
Ледяная уксусная кислотаSigma AldrichARK2183
Предметные стекла для микроскопаThermo Scientific3051
ГлицеринSigma AldrichG5516
Щипцы GraefeFine Science Tools11051-10
Наконечник (противоположный угол 32:1 кнопка)Nouvag AG5201
Блок управления системой имплантологии/челюстно-лицевой хирургии (Straumann)Nouvag AGSEM 
Мгновенно запечатывающийся стерилизационный пакет с двойными внутренними/внешними индикаторами процесса (3 1/2 x 5 1/4  дюйм)Fisher Scientific01-812-50
Мгновенно запечатывающийся стерилизационный пакет с двойными внутренними/внешними индикаторами процесса (5 4/1 x 10 дюймов)Fisher Scientific01-812-54
Инсулиновый шприц (29 г)Exel International26028
Изофлуран& НБСП;Dechra Pharmaceuticals plc17033-091-25
Изофлуран анестетик
система mCherry filter setChroma Technology Corp.39010
Микропрепарирующие ножницыFine Science Tools14084-08
NaHCO3Sigma AldrichS5761
Игла (20 G)Becton, Dickinson and Company305178
Держатель иглHuFriedyGroupNHCW
нейтральный буферизованный формалин (10%)Sigma AldrichHT501128-4L
Нестерильные тампоны для аппликаторовAllegro Industries205
Нетканая марля (3 x 3 дюйма)Оптический клей Fisher Scientific22028560
Norland, 61Оптическийклей Norland, 61
Офтальмологическая мазь (смазка для глаз Optixcare)CLC Medica
PBSSigma AldrichP5368
Пародонтальный зондHuFriedyGroupPQW
Фосфатный буферный раствор (PBS) pH 7,4 (1x)Gibco, by Life Technologies10-010-023
Пластиковые предметные стекла для микроскопаElectron Microscopy Sciences71890-01
Профессиональная машинка для стрижки/триммер (Wahl Classic Peanut)Wahl Clipper Corporation8685
РоликЭлектронная микроскопия Науки62800-46
Scanco Медицинское программное обеспечениеSCANCO MedicalScanco μ CT 50
Ацетат натрия безводныйSigma AldrichS2889
Нитрит натрияSigma AldrichS2252
Тартрат натрия диосновной дигидратSigma AldrichT6521
Диск для образцовLeica Biosystems14037008587
Нержавеющая сталь #15 хирургическое лезвие Аспен Хирургик Продактс, Инк.
Стерильные хирургические перчаткиCardinal Health, Inc.2D72PT65X
Стерильная простыня для полотенец (18 x 26 дюймов)IMCO4410-IMC
Шприц SucroseSigma AldrichS9378
(1 мл)Becton, Dickinson and Company309659
Неокрашенный плетеный шов с викриловым покрытием (5-0)Ethicon Inc.J490G
УФ-черный светGeneral ElectricF15T8-BLB
371615

Ссылки

  1. Iannotti, J. P. Growth plate physiology and pathology. Orthop Clin North Am. 21 (1), 1-17 (1990).
  2. Chung, R., Foster, B. K., Xian, C. J. Injury responses and repair mechanisms of the injured growth plate. Front Biosci (Schol Ed). 3 (1), 117-125 (2011).
  3. Salter, R. B., Harris, W. R. Injuries involving the epiphyseal plate. JBJS. 45 (3), 587-622 (1963).
  4. Cepela, D. J., Tartaglione, J. P., Dooley, T. P., Patel, P. N. Classifications in brief: Salter-harris classification of pediatric physeal fractures. Clin Orthop Relat Res. 474 (11), 2531-2537 (2016).
  5. Macsai, C. E., Hopwood, B., Chung, R., Foster, B. K., Xian, C. J. Structural and molecular analyses of bone bridge formation within the growth plate injury site and cartilage degeneration at the adjacent uninjured area. Bone. 49 (4), 904-912 (2011).
  6. Shaw, N., et al. Regenerative medicine approaches for the treatment of pediatric physeal injuries. Tissue Eng Part B Rev. 24 (2), 85-97 (2018).
  7. Xian, C. J., Zhou, F. H., Mccarty, R. C., Foster, B. K. Intramembranous ossification mechanism for bone bridge formation at the growth plate cartilage injury site. J Orthop Res. 22 (2), 417-426 (2004).
  8. Muruganandan, S., et al. A foxa2+ long-term stem cell population is necessary for growth plate cartilage regeneration after injury. Nat Commun. 13 (1), 2515(2022).
  9. Coleman, R. M., et al. Characterization of a small animal growth plate injury model using microcomputed tomography. Bone. 46 (6), 1555-1563 (2010).
  10. Lee, E. H., Gao, G. X., Bose, K. Management of partial growth arrest: Physis, fat, or silastic. J Pediatr Orthop. 13 (3), 368-372 (1993).
  11. Planka, L., et al. Nanotechnology and mesenchymal stem cells with chondrocytes in prevention of partial growth plate arrest in pigs. Biomed Pap Med Fac Univ Palacky Olomouc Czech Repub. 156 (2), 128-134 (2012).
  12. Foster, B. K., et al. Reimplantation of growth plate chondrocytes into growth plate defects in sheep. J Orthop Res. 8 (4), 555-564 (1990).
  13. Erickson, C. B., et al. A rat tibial growth plate injury model to characterize repair mechanisms and evaluate growth plate regeneration strategies. J Vis Exp. (125), e55571(2017).
  14. Coleman, R. M., Schwartz, Z., Boyan, B. D., Guldberg, R. E. The therapeutic effect of bone marrow-derived stem cell implantation after epiphyseal plate injury is abrogated by chondrogenic predifferentiation. Tissue Eng Part A. 19 (3-4), 475-483 (2013).
  15. Mccarty, R. C., Xian, C. J., Gronthos, S., Zannettino, A. C., Foster, B. K. Application of autologous bone marrow derived mesenchymal stem cells to an ovine model of growth plate cartilage injury. Open Orthop J. 4, 204-210 (2010).
  16. Chen, J., et al. Isolation and characterization of murine mandibular condylar cartilage cell populations. Cells Tissues Organs. 195 (3), 232-243 (2012).
  17. Clearfield, D. S., Xin, X., Yadav, S., Rowe, D. W., Wei, M. Osteochondral differentiation of fluorescent multireporter cells on zonally-organized biomaterials. Tissue Eng Part A. 25 (5-6), 468-486 (2019).
  18. Dyment, N. A., et al. Response of knee fibrocartilage to joint destabilization. Osteoarthritis Cartilage. 23 (6), 996-1006 (2015).
  19. Kalajzic, I., et al. Use of type i collagen green fluorescent protein transgenes to identify subpopulations of cells at different stages of the osteoblast lineage. J Bone Miner Res. 17 (1), 15-25 (2002).
  20. Maye, P., et al. Generation and characterization of col10a1-mcherry reporter mice. Genesis. 49 (5), 410-418 (2011).
  21. Chokalingam, K., et al. Three-dimensional in vitro effects of compression and time in culture on aggregate modulus and on gene expression and protein content of collagen type ii in murine chondrocytes. Tissue Eng Part A. 15 (10), 2807-2816 (2009).
  22. Dutta, S., Sengupta, P. Men and mice: Relating their ages. Life Sci. 152, 244-248 (2016).
  23. Dyment, N. A., et al. multi-image cryohistology of mineralized tissues. J Vis Exp. (115), e54468(2016).
  24. Chavez, M. B., et al. Guidelines for micro-computed tomography analysis of rodent dentoalveolar tissues. JBMR Plus. 5 (3), e10474(2021).
  25. Chung, R., Xian, C. J. Recent research on the growth plate: Mechanisms for growth plate injury repair and potential cell-based therapies for regeneration. J Mol Endocrinol. 53 (1), T45-T61 (2014).

Перепечатки и разрешения

Теги

Трансгенная модель мышимыши с флуоресцентным репортеромрегенерация хрящаформирование костного мостикагипертрофированные хондроцитыперелом Салтера-Харриса II типафлуоресцентная стереомикроскопияудлинение конечностидифференцировка хондроцитов
Трехцветная трансгенная мышиная модель для изучения повреждения пластин роста
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.