Методическая статья

Оценка структурных признаков Triticum aestivum и Zea mays для фотосинтетической дифференциации C3 и C4 с использованием свободных и полутонких срезов

2.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/66843

⸱

12 июля 2024 г.

 ,  ,  , 
1Institute of Agricultural and Environmental Sciences, Estonian University of Life Sciences, 2Estonian Academy of Sciences

В этой статье

Краткое содержание

Оценка анатомических различий между поперечными сечениями листьев C3 и C4 помогает понять эффективность фотосинтеза. В данной статье описывается подготовка и исследование срезов листьев от руки и полутонких листьев, а также предостережения при подготовке к выращиванию видов Triticum aestivum и Zea mays.

Аннотация

Повышенная эффективность фотосинтезаС4 по сравнению с механизмомС3 обусловлена его способностью концентрироватьСО2 в клетках оболочки пучка. Эффективность фотосинтезаC4 и эффективность использования воды напрямую связаны с долей клеток мезофилла и листьев пучка, размером и плотностью оболочек пучка, а также размером, плотностью и толщиной клеточной стенки клеток оболочки пучка. Быстрый микроскопический анализ этих признаков может быть выполнен на свободных и полутонких срезах с использованием обычной световой микроскопии, что позволяет получить ценную информацию об эффективности фотосинтеза в культурахC4 путем идентификации и изучения конкретных типов клеток. Кроме того, показаны ошибки при препарировании произвольных и полутонких срезов, которые влияют на анатомические измерения и диагноз типов клеток, а также о том, как их избежать. Этот микроскопический подход предлагает эффективные средства сбора информации о фотосинтетической акклиматизации к изменениям окружающей среды и помогает в быстром скрининге сельскохозяйственных культур для будущего климата.

Введение

Фотосинтез – это фундаментальный процесс, при котором световая энергия преобразуется в химическую, служащую краеугольным камнем наземных трофических сетей. Большинство растений следуют пути фотосинтезаC3, где основным продуктом фотосинтеза является трехуглеродное соединение глицерат-3-фосфат. Фотосинтез C3 развился более 2 миллиардов лет назад в атмосфере с большим количеством CO2 и низким содержанием O21. Ключевой фотосинтетический фермент рибулоза 1,5 бисфосфаткарбоксилаза/оксигеназа (Rubisco), который развился в этих условиях, является неоптимальным для современных условий с низким содержаниемCO2 и высокимO2, поскольку он конкурентно реагирует сO2, инициируяфотодыхание2. Фотодыхание — это расточительный путь, который потребляет энергию вместо того, чтобы производить ее и выделятьCO2 в качестве побочного продукта. Следовательно, крайне важно поддерживать высокую концентрациюCO2 вокруг Рубиско в хлоропластах для предотвращения оксигенации 3,4. Из-за неспособностирастений С3 концентрироватьСО2 происходит значительное снижение концентрацииСО2 из окружающего воздуха в хлоропласты, что ограничивает фотосинтез и влияет на рост растений и производство биомассы 2,5,6.

В растениях типаС3 фотосинтез ограничен поступлениемСО2 через устьица, его диффузией через мезофилл и биохимической активностью фотосинтетических ферментов. ПоступлениеCO2 в первую очередь ограничивается устьичной проводимостью, которая контролируется условиями окружающей среды, такими как температура воздуха и влажность. Затем CO2 диффундирует через внутреннюю газообразную и жидкую фазу листа в Rubisco7. У растений сС3 все стадии фотосинтеза происходят в хлоропластах клеток мезофилла, и растениям необходимо поддерживать постоянный притокСО2 из атмосферы в хлоропласты. Зависимость доступностиCO2 в хлоропластах от открытости устьиц, архитектуры мезофилла, а также индивидуальных характеристик клеток и хлоропластов делает растения восприимчивыми к ограничениям окружающей среды, которые в конечном итоге влияют на фотосинтез, таким как низкая доступность воды и высокие температуры 7,8,9,10, особенно подчеркивая их уязвимость к условиям изменения климата 11.

Учитывая проблемы, связанные с неэффективностью путиС3, а также ограничениями в поддержании оптимального уровняСО2 и восприимчивости к факторам окружающей среды, у некоторых растений развился другой путь – путь фотосинтезаС4. Характерно, что растенияС4 имеют два пространственно разделенных биохимических пути; Первоначальная фиксацияCO2 происходит в клетках мезофилла фосфоенолпируваткарбоксилазой, которая имеет более высокое сродство кCO2, чем Rubisco, а также обладает недостаточной активностью оксигенации. Образовавшийся продуктС4 далее транспортируется в клетки оболочки пучка, где он декарбоксилируется, аСО2 снова высвобождается и фиксируется Рубиско (фотосинтезС3)12,13,14. Большее сродство ПЭП-карбоксилазы кCO2 и толстые клеточные стенки клеток оболочки пучка позволяют концентрироватьCO2 в клетках оболочки пучка, и, таким образом, растенияC4 минимизируют фотодыхание за счет пространственной сегрегации фиксацииCO2 и цикла Кальвина. Принятие траектории C4 демонстрирует адаптивную реакцию природы на экологические ограничения, позволяя получить представление о потенциальных стратегиях повышения продуктивности и устойчивости сельскохозяйственных культур к изменяющимся климатическим условиям15.

Специализированная анатомия структуры листьев у растенийС4 характеризуется жилками, окруженными увеличенными клетками сосудистой оболочки пучка, содержащими хлоропласты, и с радиальным расположением клеток мезофилла во внешнем кольце, расположенном вокруг клеток оболочки пучка. Клетки мезофилла находятся в непосредственной близости от клеток оболочки пучка, что обеспечивает быстрый и непрерывный транспорт метаболитов между двумя типами клеток. Расположение этой ячейки типично для растений типаС4 и обозначается как анатомия Кранца16. У видов C3 специализация и расположение клеток мезофилла могут варьироваться, но клетки оболочки пучка заметно меньше и имеют несколько хлоропластов или вообще не имеют хлоропластов. Специфическая анатомия Кранца позволяет концентрироватьСО2 в хлоропластах в клетках оболочки пучка, где расположен С3-карбоксилирующий фермент Рубиско, эффективно препятствуя фотодыханию 4,17,18. Несмотря на кажущуюся сложность, эти изменения происходили независимо друг от друга несколько раз в эволюции покрытосеменных растений, что указывает на то, что это относительно возможный эволюционный путь 19,20,21, и было показано, что различные таксоны находятся на промежуточной стадии между метаболизмом углерода C3 и C 4, называемым C3-C 4 или C2. обладание способностью концентрироваться и повторно ассимилировать CO2 22,23,24,25.

Многие растенияC4 являются культурами с высоким экономическим значением, и генная инженерия культурC3, таких как рис, для повышения их устойчивости к изменению климата и обеспечения урожайности была темой интереса в последние десятилетия26,27. Тем не менее, инженерные усилия требуют детального понимания специализированной анатомии C4 и того, как она контролирует фотосинтез 2,28.

Установление анатомии Кранца C4 является предпосылкой для достижения амбициозной цели по созданию фотосинтеза C4 в культурах C3 25. Тем не менее, современное понимание регуляции анатомии Кранца и методов быстрого скрининга его ключевых анатомических признаков ограничено, что затрудняет идентификацию гибридных видов. Предыдущие исследования показали, что ключевые признаки, регулирующие эффективность фотосинтеза у растений типаС3 иС4, включают расстояние между жилками, диаметр комплекса оболочки пучка и размер клеток оболочки пучка14,29. Эти признаки могут быть легко отсеяны с помощью срезов от руки и количественно проанализированы с помощью полутонких срезов. В данной статье мы описываем метод оценки признаков, которые позволяют проводить диагностику анатомической дифференцировкиС3 иС4 с помощью перекрестной и световой микроскопии свободной руки, а именно площадь оболочки пучка, межжилковое расстояние и частоту появления вен.

Протокол

1. Условия роста растений

  1. Выберите пшеницу (Triticum aestivum L. Var. Озимая пшеница, "Fredis") и кукурузу (Zea mays L. Var. Saccharata, "Golden Bantam") в качестве представителейС3 иС 4 соответственно. Выращивайте оба вида растений в камере роста с контролируемой средой из семян.
  2. Поддерживайте относительную влажность воздуха на уровне 55% при температуре воздуха 25 °C/18 °C (день/ночь) с 12-часовым световым периодом. Поддерживайте плотность потока фотосинтетических фотонов (Q) на поверхности растений на уровне 1200 мкмоль/м2/с, чтобы представить их естественные условия произрастания. Выращивайте все растения при концентрацииCO2 в окружающей среде 400 моль/моль.
  3. Поливайте растения каждые2-й день дистиллированной водой и удобряйте раствором Хогланда через 10 дней после появления всходов. Выращивайте растения в заданных условиях в течение 60 дней и используйте полностью раскрывшиеся листья для микроскопических анализов.

2. Подготовка и просмотр разделов от руки

  1. Выберите по 3 зрелых нестареющих листа с каждого растения и держите их в дистиллированной воде. Используя новое одностороннее лезвие бритвы, сделайте один выравнивающий разрез, чтобы сформировать прямой угол с поверхностью листа, чтобы убедиться, что сечения имеют поперечное сечение, сделанное перпендикулярно поверхности листа.
  2. Поместите образец листа на стеклянную пластину на кусок стоматологического воска, чтобы стабилизировать образец и избежать скольжения. Режьте, перемещая лезвие прямо вниз по экземпляру листа, чтобы чисто прорезать ячейки. Срезы хранить в дистиллированной воде.
  3. Закрепите образцы на предметном стекле, поместив их на каплю воды и накрыв их стеклянным покровным стеклом для микроскопического просмотра и визуализации. Избегайте попадания пузырьков воздуха.
  4. Посмотрите на предметное стекло под микроскопом сложной подсветки с 10-кратным и 20-кратным увеличением. Сохраните изображения в соответствии с руководством по программному обеспечению вместе с соответствующим масштабом.

3. Подготовка полутонких срезов

  1. Вырежьте на стеклянной пластине участки размером приблизительно 3 мм х 5 мм из межреберных областей вдоль средней жилки из листьев как Z. mays, так и T. aestivum , как показано на этапе 2.2. Следите за тем, чтобы длина среза проходила вдоль волокон листа.
  2. Растительный материал поместить в шприц с 1 мл фиксирующего буфера (4% глутарового альдегида в 0,1 М фосфатном буфере, рН = 6,9, табл. 1).
  3. Держите шприц вертикально, удалите воздух, и, держа палец на кончике, накачайте шприц для создания вакуума. Повторяйте до тех пор, пока образцы не лягут на дно шприца, что указывает на успешную инфильтрацию.
  4. Переложите содержимое шприца в стеклянный флакон с этикеткой и храните при температуре 4 °C в течение 48 часов перед следующим этапом (Таблица 2).
  5. Для каждого флакона аккуратно снимите фиксатор с помощью пипетки и добавьте фосфатный буфер до тех пор, пока образец не будет покрыт. Оставить на 30 минут. Повторите этот шаг 3 раза.
  6. Удалите фосфатный буфер с помощью пипетки и добавьте тетраоксид осмия (ВНИМАНИЕ) до тех пор, пока образец не будет покрыт. Образцы и другие органические вещества станут черными. Используйте двойные перчатки. Оставить на 1 ч.
  7. Удалите предыдущий раствор с помощью пипетки и залейте образцы дистиллированной водой. Оставьте на 30 минут, повторите этот шаг 3 раза и надевайте двойные перчатки.
  8. Удалите предыдущий раствор с помощью пипетки и накройте образцы дистиллированным водно-этаноловым раствором 50/50. Оставить на 30 минут. Повторите этот шаг с дистиллированными водно-этаноловыми растворами в следующих сериях: 30/70, 20/80, 10/90 и 2x со 100% этанолом. Образцы в любом из этих растворов можно оставить на ночь при температуре 4 °C.
  9. Удалите предыдущий раствор с помощью пипетки и залейте образцы на 1/3 раствором смолы-этанола. Выложите образцы на тарелку миксера и оставьте на 2 часа. Повторите этот шаг с растворами смолы и этанола в следующих сериях: 1/2, 1/1, 2/1, 3/1 и 2x со 100% смолой. Образцы в любом из этих растворов можно оставить на ночь при температуре 4 °C.
  10. Закройте полости плоской закладной формы (16 полостей, размеры полости: 14 Д x 4,8 Ш x 3 Г (мм)) 100% смолой и поместите образцы на один конец полости. Подготовьте бумажные этикетки, написанные карандашом, для каждого образца и поместите их на другой конец полости.
  11. Полностью заполните все полости 100% смолой и расправьте образцы и этикетки, если они переместились. Накройте форму закладной пленкой и полимеризуйте в духовке в соответствии с рекомендациями по продукту из акриловой смолы.
  12. Установите полимеризованный блок с образцом в держатель образца ультрамикротома. Обрежьте блок с помощью грубого ножа для стекла до тех пор, пока ткань не станет видимой и не будут устранены излишки смолы.
  13. Полутонкие срезы разрежьте поперечно (1 мкм) с помощью стеклянного или алмазного ножа. Соберите срезы с помощью металлической петли для прививки от поверхности воды и поместите их на предметное стекло. Высушите предметное стекло на горячей плите (60 °C), чтобы зафиксировать секции на стекле.
  14. Неподвижные участки окрашивать толуидиновым синим (1% водным раствором) в течение 5 с перед промыванием дистиллированной водой и повторной сушкой на горячей плите.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что процесс химической фиксации выполняется под вытяжным шкафом. Стеклянные ножи следует периодически заменять, чтобы обеспечить острые надрезы, которые позволяют получать срезы без разрывов и искажений.

4. Визуализация образцов

  1. Визуализация срезов свежей листвы
    1. Настройте составной световой микроскоп с помощью прилагаемого программного обеспечения в соответствии с инструкцией.
    2. Поставьте предметное стекло на сцену. Отрегулируйте окуляр и просмотрите разрез с 10-кратным увеличением для получения обзора, затем с 20-кратным и 40-кратным увеличением объективов.
    3. На каждой цели перемещайтесь по каналу «Трансляция», сосредоточьтесь на интересующей области и найдите клетки оболочки пучка вокруг вены.
    4. Сфокусировавшись, нажмите кнопку «Заморозить » и добавьте масштаб, нажав кнопку «Масштабная линейка » на вкладке «Инструменты». Сохраните изображение в формате . Формат TIF для анализа изображений.
  2. Визуализация инфильтрированных смолой срезов
    1. Настройте автоматический световой микроскоп в сочетании с прилагаемым программным обеспечением на компьютере.
    2. Загрузите прозрачный канал и поместите предметное стекло на предметный столик микроскопа. Сфокусируйтесь на участке с помощью 40-кратного увеличения объектива и отрегулируйте яркость, чтобы убедиться, что все клеточные структуры видны.
    3. Установите область расположения сечения с помощью функции навигатора, чтобы убедиться, что изображен весь раздел, и нажмите кнопку « Сшить ».
    4. Нажмите «Готово», а затем «Пуск», чтобы микроскоп мог получить изображение всего разреза. Откройте программное обеспечение для анализа изображений и откройте плитки, снятые микроскопом.
    5. С помощью функции «Выровнять» убедитесь, что плитки не перекрываются. После создания изображения отрегулируйте расположение, яркость и поворот с помощью вкладки «Настройка».
    6. Распечатайте масштаб на изображении перед сохранением в формате . Формат TIF.
  3. Анатомические измерения с помощью программного обеспечения ImageJ
    1. Откройте программу ImageJ и загрузите изображение, перетащив его в окно.
    2. С помощью инструмента «Линия» откалибруйте масштаб следующим образом: нарисуйте линию над масштабной линейкой, выберите «Анализ» > «Установить масштаб», измените известное расстояние до длины масштабной линейки и измените единицу измерения длины на правильную единицу измерения.
    3. Измерьте предполагаемый признак, выбрав инструмент Линия (Line Tool), проведя линию через область интереса и нажав клавишу M .
    4. Для измерения площади выберите инструмент «Выделение полигона » и нарисуйте вокруг интересующей ткани. Завершите нажатием клавиши M . Измерения отображаются в виде всплывающего окна, которое можно скопировать в электронную таблицу для дальнейшего анализа данных.

Результаты

На рисунке 1А показана правильная ориентация для среза листа как для свежего среза, так и для световой микроскопии. Метод вырезания свежих срезов с помощью односторонней бритвы и листа стоматологического воска можно увидеть на рисунке 1В. Полученные сечения показаны на рисунке 1С.

На рисунке 2 показаны срезы от руки репрезентативных листьев растения C3 T . aestivum и растения C4 Z. mays. Вокруг жилы видны клетки пучковой оболочки, при этом кукуруза имеет более округлые и зеленые клетки, что указывает на более высокое присутствие хлоропластов. По этим изображениям можно получить толщину листа и общую площадь оболочки пучка; Однако дальнейшая характеристика мезофилла с помощью этого метода невозможна.

На рисунке 3 показаны полутонкие поперечные сечения T. aestivum и Z. mays. При таком методе все ткани листа видны и измеримы. Анатомия Кранца очевидна у Z. mays, с клетками мезофилла, расположенными вокруг вен. Оболочки пучков увеличены и заполнены хлоропластами, заметно сконцентрированными по направлению к клеткам мезофилла. Это обеспечивает быстрый обмен метаболитами между клетками оболочки пучка и клетками мезофилла. На основе этих изображений были измерены следующие структурные особенности листьев: межжилковое расстояние между малыми и крупными жилками, диаметр пучковой оболочки, общая площадь оболочки пучка, площадь жилок, доля площади клеток оболочки пучка, площадь клеток оболочки пучка, частота прожилок в пределах 500 мкм и толщина листа. Ящичковые диаграммы на рисунке 4 показывают разницу в таких признаках между T. aestivum и Z. mays. Все признаки, кроме одного, межжилкового расстояния между крупными жилками, значительно различаются на 95% доверительном интервале с p-значением < 0,05.

На рисунке 4 показана коллекция ящичковых диаграмм, которые представляют различия в анатомических признаках между T. aestivum и Z. mays, иллюстрирующие различия между структурами пучков C3 и C4 . Существует существенное различие между межжилковыми расстояниями между видами сельскохозяйственных культур, диаметром пучковой оболочки (при одинаковых условиях выращивания), долей клеток оболочки пучка и нефотосинтезирующим материалом (т.е. жилками) и частотой прожилок при ширине сечения 500 мкм - все это убедительно свидетельствует о том, что ожидается между анатомией листьев C3 и C4 .

На рисунке 5 показаны некоторые примеры ошибок, которые могут возникнуть при резке или подготовке образцов. Анатомия листа на этих изображениях замаскирована или деформирована и, таким образом, не является надежной для характеристики. Чрезмерное окрашивание толуидиновым синим может происходить на срезах, срезанных ультрамикротомом, в которых пятно остается слишком долго, тем самым скрывая клеточную структуру (рис. 5A, B). Распространенные ошибки могут возникать во время протокола инфильтрации, при котором смола не полностью проникает в ткани листа (Рисунок 5C, D). Поперечные сечения листьев, разрезанные вдоль волокон, приводят к образованию продолговатых ячеек, в которых клетки мезофилла и пучковой оболочки не могут быть расположены или правильно измерены (рис. 5F, G, H).

Статистический анализ проводился в R (версия 4.3.1) для создания диаграмм размаха. Анатомические признаки листьев измеряли в трех экземплярах (3 листа на растение, 3 растения на вид).

Установка хроматографии листового среза; экстракция зеленого пигмента. Схема этапов отделения пигмента.
Рисунок 1: Правильный метод резки поперечных сечений свежих листьев. (А) Ориентация срезов листьев для получения поперечного сечения. (В) Техника разрезания листьев с помощью одностороннего бритвенного лезвия на куске плоского зубного воска. (C) Полученные поперечные сечения выглядят как тонкие листовые полоски, готовые к установке на предметное стекло и просмотру под микроскопом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Микроскопия поперечного сечения структуры листьев растений, чешуек 50 мкм и 100 мкм, деталей сосудистой ткани.
Рисунок 2: Свободные срезы репрезентативных листьев. (A) Растение C3 Triticum aestivum (400-кратное увеличение); и (B) растение C4 Zea может работать при (200-кратном увеличении). Тип клетки обозначен стрелками, где V = жилка, BSC = клетка оболочки пучка, а MC = мезофилловая клетка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Диаграмма анатомии растения, показывающая поперечное сечение сосудистого пучка с метками для тканей и структур.
Рисунок 3: Полутонкие поперечные срезы. (A) Zea mays и (B) Triticum aestivum для демонстрации различий в пучковых оболочках и положениях хлоропластов у видов C4 с анатомией Кранца (A) и видов C3 без анатомии Кранца (B). Сокращения: Tl = толщина листа, BS = пучковая оболочка, SV = маленькая жилка, ID = межжилковое расстояние, и LV = большая жилка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Ящичковые диаграммы, сравнивающие T. aestivum и Z. mays с использованием T-критерия; метрики включают SY-HD, LV-ID и VBA.
Рисунок 4: Ящичковые диаграммы, показывающие разницу в анатомических признаках между Triticum aestivum и Zea mays. (A) межжилковое расстояние между маленькими жилками, (B) межжилковое расстояние между крупными жилками, (C) диаметр оболочки пучка, (D) общая площадь оболочки пучка, (E) площадь жилок, (F) доля клеток оболочки пучка, (G) площадь клеток оболочки пучка, (H) частота прожилок в пределах 500 μм и (I) толщина листа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Микроскопические изображения поперечных сечений тканей растений, подчеркивающие клеточную структуру и анатомию.
Рисунок 5: Примеры распространенных ошибок, которые могут возникнуть при обработке тканей, обозначены красными стрелками. Переокрашивание в образцах, внедренных в акриловую смолу LR White (A) Triticum aestivum и (B) Zea mays; разрывы смолы в секциях, встроенных в эпоксидную смолу Spurr (C) Ceratozamia robusta и (D) Dioon mejiae; T. aestivum - срезы от руки, показывающие (Е) поперечное сечение и (F) продольное сечение; смещение в разрезании из-за косых разрезов у (G) Annona muricata и (H) Encephalartos villosus. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

РешениеПодготовкаИтоговый объем
База для буфера 1Растворите 7,12 г Na2HPO4 . 2H2O в 200 мл дистиллированной воды200 мл
База для буфера 2Растворите 7,12 г NaH2PO4 . 2H2O в 200 мл дистиллированной воды200 мл
Фосфатный буферный растворСмешайте 36 мл основания 1, 14 мл основания 2 и 50 мл дистиллированной воды100 мл
Фиксирующий растворСмешайте 9,25 мл 5% глутаральдегида (внимание: см. таблицу материалов), 12,5 мл фосфатного буфера и 28,25 мл дистиллированной воды. Хранить при температуре 4 °C.50 мл

Таблица 1: Рецепт фиксаторного раствора.

ШагОписаниеДлительностьПовторять
1Ополаскивание с буферомАккуратно снимите фиксатор с помощью пипетки и добавьте фосфатный буфер до тех пор, пока образец не будет покрыт. Оставить на 30 минут.30 минВ 3 раза
2Окрашивание 1% тетраоксидом осмия(Внимание: см. Таблицу материалов): Удалите фосфатный буфер с помощью пипетки и добавьте тетраоксид осмия до тех пор, пока образец не будет покрыт. Образцы и другие органические вещества станут черными. Используйте двойные перчатки.60 мин1
3Промывка образцов дистиллированной водойУдалите предыдущий раствор с помощью пипетки и залейте образцы дистиллированной водой. Оставить на 30 минут. Повторите этот шаг 3 раза. Используйте двойные перчатки.30 мин3 раза
4Инфильтрация этанолаУдалите предыдущий раствор с помощью пипетки и накройте образцы дистиллированным водно-этаноловым раствором 50/50. Оставить на 30 минут. Повторите этот шаг с дистиллированными водными растворами этанола в следующих рядах: 30/70, 20/80, 10/90 и 100% этанол.30 мин1
5Инфильтрация серии смола и этанолУдалите предыдущий раствор с помощью пипетки и залейте образцы на 1/3 раствором смолы-этанола. Выложите образцы на тарелку миксера и оставьте на 2 часа. Повторите этот шаг с растворами смолы и этанола в следующих сериях: 1/2, 1/1, 2/1, 3/1 и 100% смола.120 мин1
6Хранить в холодильнике в течение 72 ч до полимеризации
7Полимеризуйте инфильтрированные срезы листьев в соответствии со спецификациями продукта для получения образцов, залитых смолой.

Таблица 2: Протокол инфильтрации смолы.

Обсуждение

В этой статье мы обсудим как количественные, так и качественные методы измерения анатомии листьев и способы их оптимизации. Кроме того, методология применяется к репрезентативным видам сельскохозяйственных культур, чтобы определить, какие анатомические признаки являются наиболее полезными для различения поперечных сечений C3 и C4. Понимание этих черт имеет важное значение, поскольку гибридные виды, называемые фотосинтезомC2, становятся все более перспективным направлением исследований. На данный момент только один вид сельскохозяйственных культур, Diplotaxis tenuifolia (руккола), был идентифицирован как использующий фотосинтез C2, но вполне вероятно, что их больше, чем указано в текущих записях25. Высокий уровень внутривидового фотосинтетического разнообразия и пластичности присутствует в линияхC2. Это означает, что для подтверждения возникновения фотосинтеза C2 требуется множество доказательств, таких как точка компенсации CO2, ультраструктурный анализ и иммуногистохимия.

Свободные и полутонкие срезы использовались для идентификации и измерения конкретных тканей растений в течение многих лет, но эта статья направлена на обсуждение конкретного случая использования анатомических структур листьев, которые влияют на фотосинтетическую дифференциацию между культурными растениями C3 и C4 . Существуют предостережения как в отношении свободных, так и полутонких срезов, которые следует учитывать. Срезы от руки, хотя их можно быстро получить, могут привести к получению срезов листьев с непостоянной толщиной, что затрудняет количественный анализ. Этого можно избежать, используя специализированное оборудование для секционирования свежего растительного материала (например, вибратом или криостат). Более толстые срезы от ручного среза могут привести к образованию нескольких слоев клеток друг над другом, размывая клетки и, таким образом, анатомию. Если цель среза чисто качественная, то срезы от руки дают преимущество химической обработки растительных тканей (т.е. гистохимии)31. Это позволяет качественно указать на присутствие тех или иных соединений в растительных клетках. И наоборот, полутонкие срезы почти всегда приводят к равномерно толстым срезам. Однако эти процессы более длительные, тонкие и, следовательно, подвержены ошибкам. О проблемах, которые могут возникнуть, а также о способах их избежать, пойдет речь далее.

Закрепление
Свежий материал необходимо использовать как для свободных, так и для полутонких срезов, т.е. листьев растений, которые достаточно увлажнены. Срезы из увядших листьев не обладают структурной целостностью, так как клетки имеют пониженное тургорное давление. При получении полутонких профилей из материала, залитого смолой, очень важно убедиться, что створки закреплены под вакуумом, чтобы заменить воздух внутри листа. Это обеспечивает структурную целостность и осмос в процессе инфильтрации. Если этот шаг не выполнен правильно, клетки, скорее всего, разрушатся, что приведет к сечениям, которые не точно отображают реальную структуру листа и, следовательно, к неправильным анатомическимизмерениям.

И наоборот, высокое вакуумное давление может повредить листья с мягкими тканями (например, семядолями), что приведет к уменьшению клеток или разрушению образцов. Этого можно избежать, используя соответствующую настройку вакуумного насоса или вообще пропустив ее и просто замочив образцы в фиксирующем растворе. Если предпочтение отдается последнему, образцы могут быть разрезаны со всех сторон, чтобы облегчить инфильтрацию фиксатора в ткани.

Предварительное проникновение
Толщина клеточной стенки и ткань склереидов являются наиболее важными анатомическими признаками для проникновения растворов, которые обеспечивают оптимальную фиксацию и инфильтрацию образца. Целью склереид в тканях растений является механическая поддержка и защита, которые могут повлиять на процесс инфильтрации33. Поскольку эти ткани имеют сильно утолщенные одревесневшие клеточные стенки, проникновение растворов может быть затруднено. Образцы, которые имеют проблемы с инфильтрацией, приводят к полутонким срезам с поврежденными клетками и разрывами смолы (Рисунок 5C, D). Продольное сечение приводит к деформации клеток, что приводит к систематической ошибке в анатомических анализах и измерении признаков листьев, таких как размер и плотность клеток (рис. 5F-H).

Инфильтрация смолы
Качественное срезирование имеет жизненно важное значение для наблюдения за анатомическими тканями, на которые непосредственно влияет среда, в которую внедрен образец. Наиболее распространенными закладочными средами, используемыми в гистологии растений, являются парафин, эпоксидные и акриловые смолы 34,35. Запечатывание воска требует подготовки образцов с помощью химического фиксатора и инфильтрации жидким воском, который затвердевает при комнатной температуре. Эти разрезы обычно приводят к получению участков толщиной 5-10 мкм, что, как показано здесь, может быть достигнуто с таким же успехом вручную (Рисунок 2) и требует только незакрепленной свежей ткани. В этом случае расположение ячеек вокруг оболочки пучка имеет жизненно важное значение для различения растений C3 и C4, что требует использования более прочной и жесткой среды для встраивания. Эпоксидная смола (смола Spurr's36) и акриловая смола (LR White) были протестированы как на твердость, долговечность, инфильтрацию проб, так и на долговечность среза в этом исследовании. Эпоксидная смола используется для встраивания биологического материала на протяжении десятилетий37. Акриловые смолы являются относительно новыми и первоначально рассматривались для встраивания растительных образцов из-за их устойчивости с течением времени, поскольку, в отличие от эпоксидных смол, они не обесцвечиваются в результате воздействия ультрафиолета и менее подверженыусадке. Акриловая смола LR White (твердая марка) была выбрана из-за ее нетоксичной и устойчивой к ультрафиолетовому излучению формуле. Акриловые смолы, как правило, имеют значительно меньшую вязкость, чем эпоксидные смолы, что обеспечивает более быструю инфильтрацию образцов, а твердость материала позволяет проводить более чистую резку с помощью микротома39. На рисунке 5C,D показаны результаты применения эпоксидной смолы в образцах листьев с большим количеством структурной ткани, где разрывы неизбежны из-за мягкости эпоксидной смолы, по сравнению с акриловой смолой (рис. 3).

Ультрамикротомия
Обрезка излишков смолы может привести к образованию трещин в смоле, которые проникнут внутрь образца. Чтобы избежать этого, жизненно важно учитывать плотность и хрупкость смолы, выбранной для заделки. Более глубокая резка в разрезе должна избегать каких-либо артефактов, вызванных ручной или грубой обрезкой ножом. Образец должен быть выровнен перпендикулярно держателю образца и проверен путем увеличения увеличения через окуляр, а также просмотра неподвижного и окрашенного участка. Растительные клетки, не разрезанные под идеально прямым углом, выглядят как конические клетки, в которых один конец больше другого40.

Последующее окрашивание
Толуидиновый синий (1% в водном растворе) использовали для окрашивания полутонких участков, разрезанных на ультрамикротоме. Если оставить пятно сохнуть на участке слишком долго, это приведет к переувлажнению, что приведет к перенасыщению участка при изображении (Рисунок 5A). Когда пятно плохо фильтруется, это приводит к высыханию нерастворенных частиц на участке, что затрудняет визуализацию анатомических структур (Рисунок 5B). Этой проблемы можно избежать, используя тонкий фильтр при приготовлении раствора толуидина синего, а также ограничив воздействие пятна на участок. Образцы сушат на горячей пластине при 60°С перед окрашиванием, чтобы убедиться, что срез прилипает к предметному стеклу стеклянного микроскопа, но не должны подвергаться воздействию толуидинового синего в течение более 10 с перед промыванием и повторной сушкой41.

Соображения по анатомическим измерениям
Измерения, показанные в этой статье, являются лишь примером многих анатомических признаков, которые могут быть количественно оценены с помощью полутонких срезов, включая долю межклеточного воздушного пространства, среднюю толщину мезофилла (без сосудистой ткани) и площадь поверхности мезофилла, подверженную воздействию межклеточных воздушных пространств, на единицу площади листа42. Однако, в то время как размер клеток оболочки пучка является важным показателем для дифференциации метаболизмаС3 иС4, толщина клеточной стенки оболочки пучка является еще одним важным признаком, который не может быть рассмотрен только с помощью световой микроскопии, поскольку он определяет степень негерметичности клеток оболочки пучка, т.е. количество обратного диффундированияCO2 в клетки мезофилла42. 43. Высокая герметичность снижает эффективность фотосинтеза, так как теряется большая часть энергии, используемой для фиксации CO2 карбоксилазой ПЭП 44,45,46. Для такого ультраструктурного анализа требуется просвечивающая электронная микроскопия и анализ изображений. Несмотря на то, что для настоящего исследования рассматривалась только световая микроскопия, протокол включает обработку тетраоксидом осмия, контрастирующим и фиксирующим агентом, который является краеугольным камнем микроскопии ПЭМ. Таким образом, полимеризованные образцы могут быть использованы для анализа ПЭМ в любое время, даже если это не было учтено во время подготовки.

В то время как анатомическая диагностика может легко обнаружить структуры, подобные Кранцу, присутствиеС4 может быть диагностировано с помощью измерений газообмена, которые могут показать типичную физиологиюС4, т.е. низкую точку компенсации CO2,ограниченное ингибирование фотосинтеза О2 и различный состав изотопов углерода 2,4,47.

Следует также отметить, что анатомия Кранца не является необходимой для развития фотосинтезаС4, о чем свидетельствует открытие одноклеточных растенийС4 48,49,50. Поэтому одного только анатомического анализа может быть недостаточно для обнаружения физиологииС4 у менее изученных таксонов. Сочетание анатомических характеристик с физиологическим анализом предлагает мощные инструменты для исследования признаков листьев и их структурно-функциональной взаимосвязи как у сельскохозяйственных культур, так и у дикорастущих растений.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Авторы выражают признательность Программе Европейского Союза H2020 (проект GAIN4CROPS, ГА No 862087). Центр передового опыта «Агроэкология AgroCropFuture и новые культуры в климате будущего» финансируется Министерством образования и науки Эстонии. Мы хотели бы поблагодарить профессора Эвелин Лойт-Харро за предоставление семян T. aestivum и Z. mays, Паулу Палмет и Вайко Вайнолу за помощь в подготовке срезов листьев, а также Жуана Паулу де Силва Соузу за помощь в анализе. Все изображения были получены в микроскопическом подразделении Эстонского университета естественных наук в рамках различных проектов.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Дигидрат гидрофосфата натрия (Na2HPO42H2O) чистыйPENTA, CZ10028-24-7
Закладная пленка, толщина 7,8 мил, 8 x 12,5, (203 x 318 мм)ACLAR, US10501-10
Этанол, абс. 100% а.р.Chem-Lab NV, BECL00.0505.1000Опасность: Легковоспламеняющаяся жидкость и пары.
Система визуализации EVOS Invitrogen FL Auto 2Thermo Fisher Scientific, США
Плоская встраиваемая форма из ПТФЭ с металлическим каркасом, 16 полостейPELCO, US10501
Стеклянный флакон 2 млVWR Life Science, US548-0045
Глутаральдегид 50% растворVWR Life Science, US23H2856331Опасность: Смертельный исход при вдыхании. Токсичен при проглатывании. Вызывает сильные ожоги кожи и повреждение глаз. Может вызвать раздражение дыхательных путей. Надевайте защитные перчатки, защитную одежду, средства защиты глаз и лица.
Алмазный нож HistoDiatome, US
LEICA EM UC7Leica Vienna, AT
LR Белая смола твердого сортаЭлектронная микроскопия Sciences, US14383Опасность: Вызывает раздражение кожи. Вызывает сильное раздражение глаз Может вызвать раздражение дыхательных путей. Может вызвать сонливость или головокружение Надевайте защитные перчатки, защитную одежду, средства защиты глаз и лица.
Предметные стекла микроскопаNormax, PT5470308A
Nikon Eclipse E600 и Nikon DS0Fi1 5 МПNikon Corporation, JP
Тетраоксид осмия (OsO4)Agar Scientific Ltd, GBR1019Опасность: Смертельно опасен при проглатывании, контакте с кожей или при вдыхании. Вызывает сильные ожоги кожи и повреждение глаз Носите двойные защитные перчатки, защитную одежду, средства защиты глаз и лица.
Пипетки и наконечники для пипетокThermo Scientific, FIKJ16047
Дигидрат дигидрофосфата натрия (2PO4 . 2H2O) чистыйPENTA, CZ13472-35-0
Шприц 10 млEcoject, DE20010
Толуидин синий, общего назначения классаFisher Scientific, GB2045836

Ссылки

  1. Erb, T. J., Zarzycki, J. A short history of RubisCO: the rise and fall (?) of Nature's predominant CO2 fixing enzyme. Curr Opinion Biotechnol. 49, 100-107 (2018).
  2. Smith, E. N., et al. Improving photosynthetic efficiency toward food security: Strategies, advances, and perspectives. Mol Plant. 16 (10), 1547-1563 (2023).
  3. Nisbet, E. G., et al. The age of Rubisco: the evolution of oxygenic photosynthesis. Geobiology. 5 (4), 311-335 (2007).
  4. Boretti, A., Florentine, S. Atmospheric CO2 concentration and other limiting factors in the growth of C3 and C4 plants. Plants. 8 (4), 92(2019).
  5. Elferjani, R., et al. A meta-analysis of mesophyll conductance to CO2 in relation to major abiotic stresses in poplar species. J Exp Botany. 72 (12), 4384-4400 (2021).
  6. Knauer, J., et al. Contrasting anatomical and biochemical controls on mesophyll conductance across plant functional types. New Phytol. 236 (2), 357-368 (2022).
  7. Tosens, T., Niinemets, Ü, Westoby, M., Wright, I. J. Anatomical basis of variation in mesophyll resistance in eastern Australian sclerophylls: news of a long and winding path. J Exp Botany. 63 (14), 5105-5119 (2012).
  8. Ehleringer, J. R., Monson, R. K. Evolutionary and ecological aspects of photosynthetic pathway variation. Ann Rev Ecol Syst. 24 (1), 411-439 (1993).
  9. Niinemets, Ü, Díaz-Espejo, A., Flexas, J., Galmés, J., Warren, C. R. Role of mesophyll diffusion conductance in constraining potential photosynthetic productivity in the field. J Exp Botany. 60 (8), 2249-2270 (2009).
  10. Flexas, J., et al. Mesophyll diffusion conductance to CO2: An unappreciated central player in photosynthesis. Plant Sci. 193 - 194, 70-84 (2012).
  11. Walker, B. J., VanLoocke, A., Bernacchi, C. J., Ort, D. R. The costs of photorespiration to food production now and in the future. Ann Rev Plant Biol. 67 (1), 107-129 (2016).
  12. Kanai, R., Edwards, G. E. The biochemistry of C 4 photosynthesis. C4 Plant Biol. , 49-87 (1999).
  13. Sage, R. F., Sage, T. L., Kocacinar, F. Photorespiration and the evolution of C4 photosynthesis. Ann Rev Plant Biol. 63 (1), 19-47 (2012).
  14. Lundgren, M. R., Osborne, C. P., Christin, P. A. Deconstructing Kranz anatomy to understand C4 evolution. J Exp Botany. 65 (13), 3357-3369 (2014).
  15. Furbank, R., Kelly, S., Von Caemmerer, S. Photosynthesis and food security: the evolving story of C4 rice. Photosyn Res. 158 (2), 121-130 (2023).
  16. Dengler, N. G., Nelson, T. Leaf structure and development in C4 plants. C4 Plant Biol. , 133-172 (1999).
  17. Leegood, R. C. Roles of the bundle sheath cells in leaves of C3 plants. J Exp Botany. 59 (7), 1663-1673 (2007).
  18. Mallmann, J., et al. The role of photorespiration during the evolution of C4 photosynthesis in the genus Flaveria. eLife. 3, e02478(2014).
  19. Edwards, E. J., et al. The origins of C4 grasslands: Integrating evolutionary and ecosystem science. Science. 328 (5978), 587-591 (2010).
  20. Sage, R. F. The evolution of C 4 photosynthesis. New Phytol. 161 (2), 341-370 (2004).
  21. Ludwig, M., Busch, F. A., Khoshravesh, R., Covshoff, S. Editorial: Understanding C4 evolution and function. Fron Plant Sci. 12, 774818(2021).
  22. Stata, M., Sage, T. L., Sage, R. F. Mind the gap: the evolutionary engagement of the C4 metabolic cycle in support of net carbon assimilation. Curr Opinion Plant Biol. 49, 27-34 (2019).
  23. Sage, R. F., Khoshravesh, R., Sage, T. L. From proto-Kranz to C4 Kranz: building the bridge to C4 photosynthesis. J Exp Botany. 65 (13), 3341-3356 (2014).
  24. Lyu, M. J. A., et al. The coordination of major events in C4 photosynthesis evolution in the genus Flaveria. Sci Rep. 11 (1), 15618(2021).
  25. Lundgren, M. R. C2 photosynthesis: a promising route towards crop improvement. New Phytol. 228 (6), 1734-1740 (2020).
  26. Ermakova, M., Danila, F. R., Furbank, R. T., Von Caemmerer, S. On the road to C4 rice: advances and perspectives. Plant J. 101 (4), 940-950 (2020).
  27. Yadav, S., Mishra, A. Ectopic expression of C4 photosynthetic pathway genes improves carbon assimilation and alleviate stress tolerance for future climate change. Physiol Mol Biol Plants. 26 (2), 195-209 (2020).
  28. Schuler, M. L., Mantegazza, O., Weber, A. P. M. Engineering C4 photosynthesis into C3 chassis in the synthetic biology age. Plant J. 87 (1), 51-65 (2016).
  29. Simpson, C. J. C., Singh, P., Sogbohossou, D. E. O., Eric Schranz, M., Hibberd, J. M. A rapid method to quantify vein density in C4 plants using starch staining. Plant, Cell Environ. 46 (9), 2928-2938 (2023).
  30. Upadhyay, P., Agrawal, N., Yadav, P. K., Patel, R. The evolutionary path from C3 to C4 photosynthesis: A review. Int J Curr Microbiol Appl Sci. 9 (1), 748-762 (2020).
  31. Hewitson, T. D., Wigg, B., Becker, G. J. Tissue preparation for histochemistry: Fixation, embedding, and antigen retrieval for light microscopy. Histol Prot. 611, 3-18 (2010).
  32. Kalve, S., Saini, K., Vissenberg, K., Beeckman, T., Beemster, G. Transverse sectioning of Arabidopsis thaliana leaves using resin embedding. Bio Prot. 5 (18), 1592(2015).
  33. Whitehill, J. G. A., et al. Histology and cell wall biochemistry of stone cells in the physical defence of conifers against insects. Plant, Cell Environ. 39 (8), 1646-1661 (2016).
  34. Yeung, E. C. The use of histology in the study of plant tissue culture systems-Some practical comments. In Vitro Cell Dev Biol- Plant. 35 (2), 137-143 (1999).
  35. Lee, K. J. D., Knox, J. P. Resin embedding, sectioning, and immunocytochemical analyses of plant cell walls in hard tissues. Plant Cell Morpho. 1080, 41-52 (2014).
  36. Spurr, A. R. A low-viscosity epoxy resin embedding medium for electron microscopy. J Ultrastr Res. 26 (1-2), 31-43 (1969).
  37. Coste, R., et al. Unveiling the impact of embedding resins on the physicochemical traits of wood cell walls with subcellular functional probing. Compos Sci Technol. 201, 108485(2021).
  38. De Smet, I., et al. An easy and versatile embedding method for transverse sections. J Microsc. 213 (1), 76-80 (2004).
  39. Khoshravesh, R., Lundsgaard-Nielsen, V., Sultmanis, S., Sage, T. L. Light microscopy, transmission electron microscopy, and immunohistochemistry protocols for studying photorespiration. Photorespiration. 1653, 243-270 (2017).
  40. Verhertbruggen, Y., Walker, J. L., Guillon, F., Scheller, H. V. A comparative study of sample preparation for staining and immunodetection of plant cell walls by light microscopy. Front Plant Sci. 8, 1505(2017).
  41. Rodríguez, J. R., Turégano-López, M., DeFelipe, J., Merchán-Pérez, A. Neuroanatomy from mesoscopic to nanoscopic scales: An improved method for the observation of semithin sections by high-resolution scanning electron microscopy. Front in Neuroanat. 12, 14(2018).
  42. Veromann-Jürgenson, L. L., Brodribb, T. J., Niinemets, Ü, Tosens, T. Variability in the chloroplast area lining the intercellular airspace and cell walls drives mesophyll conductance in gymnosperms. J Exp Botany. 71 (16), 4958-4971 (2020).
  43. Sonawane, B. V., Koteyeva, N. K., Johnson, D. M., Cousins, A. B. Differences in leaf anatomy determines temperature response of leaf hydraulic and mesophyll CO2 conductance in phylogenetically related C4 and C3 grass species. New Phytol. 230 (5), 1802-1814 (2021).
  44. Hatch, M. D., Agostino, A., Jenkins, C. Measurement of the leakage of CO2 from bundle-sheath cells of leaves during C4 photosynthesis. Plant Physiol. 108 (1), 173-181 (1995).
  45. Kromdijk, J., Ubierna, N., Cousins, A. B., Griffiths, H. Bundle-sheath leakiness in C4 photosynthesis: a careful balancing act between CO2 concentration and assimilation. J Exp Botany. 65 (13), 3443-3457 (2014).
  46. Wang, Y., et al. Increased bundle-sheath leakiness of CO2 during photosynthetic induction shows a lack of coordination between the C4 and C3 cycles. New Phytol. 236 (5), 1661-1675 (2022).
  47. Johnson, J. E., Field, C. B., Berry, J. A. The limiting factors and regulatory processes that control the environmental responses of C3, C3-C4 intermediate, and C4 photosynthesis. Oecologia. 197 (4), 841-866 (2021).
  48. Sage, R. F. C4 photosynthesis in terrestrial plants does not require Kranz anatomy. Trend Plant Sci. 7 (7), 283-285 (2002).
  49. Voznesenskaya, E. V., et al. Proof of C4 photosynthesis without Kranz anatomy in Bienertia cycloptera (Chenopodiaceae). Plant J. 31 (5), 649-662 (2002).
  50. Koteyeva, N. K., Voznesenskaya, E. V., Berry, J. O., Cousins, A. B., Edwards, G. E. The unique structural and biochemical development of single cell C4 photosynthesis along longitudinal leaf gradients in Bienertia sinuspersici and Suaeda aralocaspica (Chenopodiaceae). J Exp Botany. 67 (9), 2587-2601 (2016).

Перепечатки и разрешения

Теги

C3C4ImageJ
Оценка структурных признаков Triticum aestivum и Zea mays для фотосинтетической дифференциации C3 и C4 с использованием свободных и полутонких срезов
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.