В данной статье мы описываем различные методы формирования многоклеточных сфероидов для проведения последующей многопараметрической микроскопии живых клеток. С помощью флуоресцентной микроскопии с визуализацией в течение жизни (FLIM), клеточной автофлуоресценции, окрашивания красителей и наночастиц продемонстрирован подход к анализу клеточного метаболизма, гипоксии и гибели клеток в живом трехмерном (3D) раке и сфероидах, полученных из стволовых клеток.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Производство и многопараметрическая флуоресцентная флуоресцентная микроскопия живых клеток (FLIM) многоклеточных сфероидов
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Сфероиды многоклеточных опухолей являются популярной 3D-моделью микроагрегата тканей для воспроизведения микроокружения опухоли, тестирования и оптимизации медикаментозной терапии, а также использования био- и наносенсоров в 3D-контексте. Простота их производства, предсказуемый размер, рост и наблюдаемые градиенты питательных веществ и метаболитов важны для повторения 3D-нишевого клеточного микроокружения. Тем не менее, гетерогенность сфероидов и вариабельность методов их производства могут влиять на общий клеточный метаболизм, жизнеспособность и реакцию на лекарственные препараты. Это затрудняет выбор наиболее подходящей методологии с учетом требований к размеру, вариабельности, потребностям биопроизводства и использованию в качестве 3D-моделей тканей in vitro в биологии стволовых и раковых клеток. В частности, производство сфероидов может влиять на их совместимость с количественными микроскопиями в реальном времени, такими как оптическая метаболическая визуализация, флуоресцентная микроскопия в течение жизни (FLIM), мониторинг гипоксии сфероидов с помощью наносенсоров или жизнеспособность. Здесь представлен ряд традиционных протоколов формирования сфероидов, подчеркивающих их совместимость с широкоугольной, конфокальной и двухфотонной микроскопией в реальном времени. Также представлен конвейер последующей визуализации для анализа с помощью мультиплексного автофлуоресцентного FLIM и с использованием различных типов сфероидов рака и стволовых клеток.
Введение
Многоклеточные сфероиды представляют собой группу трехмерных моделей тканей, полученных путем самоагрегации клеток и имеющих сферическую форму. Они широко используются для имитации межклеточного взаимодействия и межклеточного матриксного взаимодействия in vitro и для воспроизведения 3D-контекста во множестве конструкций, полученных из раковых и стволовых клеток. Для уменьшения прикрепления клеток и стимулирования агрегации используется несколько методов. К ним относятся метод висячих капель, основанный на поверхностном натяжении1; методы отталкивания клеточных пластин, такие как пластины со сверхнизким прикреплением, микроформы и микро....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Генерация многоклеточных сфероидов
- Культура клеток
ПРИМЕЧАНИЕ: Клеточные культуры могут быть собраны из American Type Culture Collection (ATCC), Lonza, Sigma-Aldrich или других поставщиков. ATCC предоставляет всю необходимую информацию по обращению, включая предпочтительные питательные среды, процедуры субкультивирования, уровень биобезопасности, скорость роста и профили STR. Здесь 500 клеток/сфероид клеточной линии рака толстой кишки человека HCT116 используется в среде McCoy's 5A (VWR, 392-0420) с добавлением 10% FBS и 1 мМ пирувата натрия. Для долгосрочных экспериментов, которые контролируются ежедневно, в среду можно добавлять 10 м....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Выбор подходящего способа формирования сфероида
Выбранный метод формирования сфероидов может существенно влиять на размер, форму, плотность клеток, жизнеспособность и чувствительность к лекарственным препаратам (рис. 2). Ранее сравнивали влияние нескольких методов с высокой пропускной способностью (SphericalPlate 5D, лабораторные микроформы и пресс-формы MicroTissue) и с низкой пропускной способностью (96-луночные планшеты с покрытием Biofloat и липидуром) на жизнеспособн.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Многоклеточные сфероиды становятся предпочтительным методом в изучении микроокружения опухолей и стволовых клеток, открытии лекарств и разработке «тканевых строительных блоков» для биопроизводства. Гетерогенная внутренняя архитектура, градиенты питательных веществ и оксигенации сфероидов могут имитировать таковые у тканей и опухолей in vivo в относительно упрощенных и доступных условиях. В связи с необходимостью большей методологической прозрачности26,28.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Раскрывать нечего.
Благодарности
Эта работа была поддержана грантами Специального исследовательского фонда (BOF) Гентского университета (BOF/STA/202009/003; BOF/IOP/2022/058), Исследовательский фонд Фландрии (FWO, I001922N) и Европейский Союз, fliMAGIN3D-DN Horizon Europe-MSCA-DN No 101073507.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 0,05% Трипсин-ЭДТА | Gibco | 25300-054 | Также доступен от Sigma |
| 10 мл серологических пипеток | VWR | 612-3700 | Аналогичные продукты также доступны от Sarstedt, Corning, VWR и других компаний |
| 12 лунок клеточные культуральные планшеты, стерильные | Greiner bio-one | 665-180 | Аналогичные продукты также доступны от Sarstedt, Corning и других компаний. |
| Предметное стекло камеры на 12 лунок, съемное | Ibidi | 81201 | Также доступно от Grace Bio-Labs, ThermoFisher Scientific и других |
| Центрифужные пробирки 15 мл | Nerbe plus | 02-502-3001 | Аналогичные продукты также доступны от Sarstedt, Corning, VWR и других компаний |
| 3D чашка Петри микроформы | Microtissue | Z764000-6EA | |
| 6 луночных планшетов для клеточных культур, стерильные | Greiner bio-one | 657160 | Аналогичные продукты также доступны от Sarstedt, Corning, VWR и других компаний |
| 70% этанол | ChemLab | CL02.0537.5000 | |
| Biofloat | Sarstedt | 83.3925.400 | В продаже доступна 96-луночная пластина с покрытием для формирования сфероидов |
| Кальцеин Green-AM | Tebubio | AS-89201 | Применение в разведении 1:1000 |
| Программное обеспечение CellSens Dimension | Olympus | версия 3 | |
| Коллаген из плаценты человека, тип IV | Sigma | C5533 | Для приготовления 0,07 мг/мл коллагена и 0,03 мг/мл покрытых поли-D-лизином микроскопических чашек |
| Confocal FLIM Микроскоп | Leica Microsystems | N/A | Stellaris 8 Falcon инвертированный микроскоп с лазером белого света, детекторы HyD X, камера управления климатом/T (OkoLab), объектив 25x/0,95 Вт D |
| (+)-глюкоза | Merck | 8342 | Приготовить 1 М стоковый раствор, 1:100 для приготовления среды визуализации (конечная концентрация 10 мМ) |
| Модифицированная среда Дульбекко Eagle's (DMEM), фенол красный, глюкозо-, пируват- и глутамин без фенола, глюкозы, пирувата и глутамина | Sigma-Aldrich | D5030-10X1L | Для приготовления среды визуализации |
| Фетальная сыворотка крупного рогатого скота ( FBS) | Gibco | 10270-098 | Также доступен от Sigma. Перед использованием необходимо обезвредить от нагрева. |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | Разведение 1/100 для получения среды визуализации (конечная концентрация 10 мМ) |
| Клетки рака толстой кишки человека HCT116 | ATCC | ||
| ImageJ | NIH | версия 1.54f | |
| Leica Application Suite X (LAS X) | Leica Microsystems | версия 4.6.1.27508 | |
| L-глутамин | Gibco | 25030 | Также выпускается от Sigma. Применять в разведении 1:100. |
| Lipidure-CM5206 | Amsbio | AMS.52000034GB1G | |
| McCoy's 5A, требуется добавление 1 мМ пирувата натрия и 10 мМ HEPES | VWR | 392-0420 | Стандартная питательная среда для клеток HCT116 |
| микроструктурированные 3D-печатные штампы PDMS | Н/Д | /Д | Предоставлено Центром микросистемных технологий, профессором д-ром Яном Ванфлетереном, Гентский университет |
| NaCl | Chemlab | CL00.1429.100 | |
| Камера Нойбауэра | Зонды Fisher Scientific | 15980396 | |
| O2: MMIR1 | N/A | N/A | Полную характеристику, валидацию и некоторые приложения можно найти по адресу: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2023.12.11.571110 v1 |
| PBS | Fisher scientific | Gibco18912014 | Растворите таблетку PBS в 500 мл дистиллированной воды. |
| Pen Strepline :P энициллин (10 000 ЕД/мл) / стрептомицин (10 000 ЕД; г/мл) 100x раствор | Gibco | 15140-122 | Также доступен от Sigma. Применять в разведении 1:100. |
| Поли-D-лизин | Sigma | P6407-5 мг | Для приготовления 0,07 мг/мл коллагена и 0,03 мг/мл поли-D-лизина покрытых микроскопических блюд |
| Пропидия йодид | Сигма-Олдрич | 25535-16-4 | Окрашивание клеточной смертью, используйте 1 & микро; г/мл при 1 ч инкубации |
| шприца PVDF шприц фильтр 0,22 & микро; m | Novolab | A35149 | Аналогичные продукты также доступны от Sarstedt, Corning, VWR и других компаний |
| Пируват натрия (100 мМ) | Gibco | 11360-070 | Разведение 1/100 для приготовления среды визуализации (конечная концентрация 1мМ) |
| SphericalPlate 5D 24-луночный | Kugelmeiers | SP5D-24W | |
| стерильный петридиш | Greiner bio-one | 633181 | Аналогичная продукция также доступна от Sarstedt, Corning, VWR и других компаний |
| Tissue culture flask (25 cm² ) | VWR | 734-2311 | Аналогичная продукция также доступна от Sarstedt, Corning, VWR и других компаний |
| Колба для культуры тканей (75 см²) | VWR | 734-2313 | Аналогичная продукция также доступна от Sarstedt, Corning, VWR и других компаний |
| U-bottom 96-well plate | VWR | 10062-900 | Аналогичная продукция также доступна от Sarstedt, Corning, Greiner Bio-one и других компаний |
| Ultrapure Agarose | Invitrogen (Life Technologies) | 16500-500 | Другие типы агарозы, такие как Агароза с низкой температурой плавления (A-9414, Sigma), Агароза для повседневного использования (A-9539, Sigma) |
| Широкопольный флуоресцентный инвертированный микроскоп | Olympus | N/A | Инвертированный флуоресцентный микроскоп IX81, с моторизованным управлением по оси Z, CoolLED pE4000 (16 каналов, 365-770 нм), ORCA-Flash4.0LT (Hamamatsu) cMOS камера, стеклянная нагревательная пластина Okolab, программное обеспечение CellSens Dimension v.3 и воздушные объективы 4x/0.13 UPlanFLN и 40x/0.6 LUCPlanFLN. (Опционально, для визуализации с высоким разрешением) 60x/1.0 LUMPLFLN вода |
Ссылки
- Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3d spheroids. J Vis Exp. (51), e2720(2011).
- Moskovits, N., et al. Establishing 3-dimensional spheroids from patient-derived tumor samples and evaluating their sensitivity t....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
