Производство и многопараметрическая флуоресцентная флуоресцентная микроскопия живых клеток (FLIM) многоклеточных сфероидов

Summary

В данной статье мы описываем различные методы формирования многоклеточных сфероидов для проведения последующей многопараметрической микроскопии живых клеток. С помощью флуоресцентной микроскопии с визуализацией в течение жизни (FLIM), клеточной автофлуоресценции, окрашивания красителей и наночастиц продемонстрирован подход к анализу клеточного метаболизма, гипоксии и гибели клеток в живом трехмерном (3D) раке и сфероидах, полученных из стволовых клеток.

Abstract

Сфероиды многоклеточных опухолей являются популярной 3D-моделью микроагрегата тканей для воспроизведения микроокружения опухоли, тестирования и оптимизации медикаментозной терапии, а также использования био- и наносенсоров в 3D-контексте. Простота их производства, предсказуемый размер, рост и наблюдаемые градиенты питательных веществ и метаболитов важны для повторения 3D-нишевого клеточного микроокружения. Тем не менее, гетерогенность сфероидов и вариабельность методов их производства могут влиять на общий клеточный метаболизм, жизнеспособность и реакцию на лекарственные препараты. Это затрудняет выбор наиболее подходящей методологии с учетом требований к размеру, вариабельности, потребностям биопроизводства и использованию в качестве 3D-моделей тканей in vitro в биологии стволовых и раковых клеток. В частности, производство сфероидов может влиять на их совместимость с количественными микроскопиями в реальном времени, такими как оптическая метаболическая визуализация, флуоресцентная микроскопия в течение жизни (FLIM), мониторинг гипоксии сфероидов с помощью наносенсоров или жизнеспособность. Здесь представлен ряд традиционных протоколов формирования сфероидов, подчеркивающих их совместимость с широкоугольной, конфокальной и двухфотонной микроскопией в реальном времени. Также представлен конвейер последующей визуализации для анализа с помощью мультиплексного автофлуоресцентного FLIM и с использованием различных типов сфероидов рака и стволовых клеток.

Introduction

Многоклеточные сфероиды представляют собой группу трехмерных моделей тканей, полученных путем самоагрегации клеток и имеющих сферическую форму. Они широко используются для имитации межклеточного взаимодействия и межклеточного матриксного взаимодействия in vitro и для воспроизведения 3D-контекста во множестве конструкций, полученных из раковых и стволовых клеток. Для уменьшения прикрепления клеток и стимулирования агрегации используется несколько методов. К ним относятся метод висячих капель, основанный на поверхностном натяжении¹; методы отталкивания клеточных пластин, такие как пластины со сверхнизким прикреплением, микроформы и микролунки ^2,3; подход на основе акустических волн⁴; методы проточной агрегации (колбы-спиннеры, биореакторы, микрофлюидные устройства)⁵; формирование с помощью магнитных частиц⁶ и использование стимулирующих агрегацию синтетических матриц и скаффолдов на основе ЭКМ ^7,8,9.

В исследованиях, разработке и валидации новых лекарственных препаратов для лечения рака сфероиды являются привлекательной моделью благодаря своей способности повторять ограниченные пространственной диффузией градиенты питательных веществ, продуктов жизнедеятельности и_O2, что часто приводит к образованию некротического ядра, типичного для солидных опухолей^10,11. Эти более надежные и сложные модели in vitro бросают вызов необходимости широкого использования животных моделей (Закон о модернизации Управления по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов [FDA] 2.0¹²) в соответствии с принципом 3R исследований на животных (замена, сокращение и уточнение). Помимо рака, сфероиды находят свое применение в исследованиях стволовых клеток. Например, плюрипотентные стволовые клетки обладают способностью образовывать эмбриоидные тельца (БЭ), которые могут быть использованы для дифференцировки индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) в специализированные типы клеток, которые трудно получить непосредственно от пациентов, такие как нейральные клетки-предшественники¹³ или гранулезные клетки яичников ^13,14. Кроме того, формирование БЭ часто является первым шагом в развитии более сложных органоидных моделей, например, нейронных¹⁵, сетчатки¹⁶, сердечной¹⁷, печени¹⁸, желудка¹⁹ и кишечных органоидов²⁰. При выборе подходящего метода формирования сфероидов для экспериментов следует учитывать такие факторы, как размер, воспроизводимость, производительность и последующие приложения.

Повышенная сложность 3D-культуры может привести к более высокой вариативности по сравнению с 2D-культурой. Такие факторы, как состав питательных веществ²¹, испарение среды²², вязкость²³, контроль pH²⁴, метод формирования сфероидов и даже время в культуре^25,26, могут привести к получению сфероидов различной морфологии, размеров, жизнеспособности и различной химиорезистентности^27,28. Недавние исследования показали, что сфероидальные градиенты кислорода не всегда статичны и зависят от способа формирования, размера сфероида и внеклеточной вязкости, что влияет на гетерогенность сфероида²⁹. Для улучшения воспроизводимости и доступности данных о сфероидах была разработана база знаний^MISpheroID26, определяющая клеточную линию, культуральную среду, метод формирования и размер сфероидов в качестве минимальной информации для воспроизводимого результата. В связи с этим было проведено подробное сравнение нескольких высокопроизводительных (SphericalPlate 5D, лабораторные микроформы и микротканевые формы) и методов с низким прикреплением (т.е. 96-луночных планшетов с покрытием Biofloat и липидура, как бескаркасных, так и на основе скаффолдов) (рис. 1 и табл. 1), включая размер лунки (с учетом оценки максимального размера сфероида), используемые расходные материалы, время приготовления и возможность мониторинга сфероидов без их транспортировки в микроскопические чашки. Последнее позволяет проводить долгосрочные исследования, в то время как сфероиды, полученные с помощью высокопроизводительных методов, часто приводят к экспериментам с конечными точками. Все методы, за исключением сеток 5DspheriPlate, не вносят нежелательную автофлуоресценцию, что позволяет использовать их непосредственно в микроскопии.

Рисунок 1: Объяснение методов формирования сфероидов. Высокопроизводительные методы, такие как SphericalPlate 5D, в который встроены запатентованные микролунки, в то время как в микроформах, произведенных в лаборатории, и формах MicroTissue используются штампы для изготовления нескольких микролунок в агарозе (синего цвета). Пластины с низким уровнем адгезии, такие как Lipidure (Amsbio) и Biofloat (Sarstedt), имеют неадгезивное покрытие, препятствующее адгезии к клеточной поверхности и способствующее самоагрегации клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

	5D SpheriPlate	Микроформы собственного производства	Микроткань	Низкие методы крепления
Количество сфероидов/лунка	750	1589	81	1
Диаметр лунки	90 мкм	400 мкм	800 мкм	1 мм
Объем культуры	1 мл	5 мл	1 мл	200 μл
Другие расходные материалы	/	7 мл 3% агарозы	500 мкл 2% агарозы	/ *
Время подготовки	10 мин	2 ч + 3 дня адаптация СМИ	0,5 ч + 15 мин адаптация среды	10–30 мин + 1 ч сушки
Контроль	Да	Нет**	Да	Да
Автофлуоресцентные	Да	Нет	Нет	Нет
Многоразовый	Нет	Да	Да	Нет**
Стоить	€€	€	€€€€	€€€: Покрытие и матригель
				€€: Коммерческий 96-луночный планшет
* Некоторые клеточные линии нуждаются в добавлении ВКМ (т.е. 2%–5% Матригеля) для образования компактных сфероидов.
** Покрытие можно использовать повторно до тех пор, пока оно не будет исчерпано. Однако каждая пластина будет потреблять небольшое количество среды, и со временем может накапливаться пыль. Регулярная стерилизация фильтров необходима.

Таблица 1: Сравнение методов формирования множественных сфероидов²⁹. "Мониторинг": возможность мониторинга сфероида без необходимости переноса на микроскопическую чашку. €: 0-50€, €€: 50-150€, €€: 150-500€, €€€: >500€

Флуоресцентная микроскопия позволяет осуществлять прямой мониторинг ключевых биологических аспектов сфероидов, включая гибель клеток, жизнеспособность, пролиферацию, метаболизм, вязкость и даже механические^{свойства.} Флуоресцентная микроскопия с визуализацией времени жизни (FLIM) обеспечивает дополнительное количественное измерение для изучения взаимодействий флуоресцентных зондов в их (микро)среде 31,32,33,34, позволяя разрешать перекрывающиеся спектры излучения в соответствии с различными временами жизни излучения^35,36 и зондирование клеточного метаболизма на основе внутренней клеточной аутофлуоресценции. Таким образом, такие широко распространенные клеточные автофлуоресцентные соединения, как никотинамидадениндинуклеотидфосфат (NAD(P)H), флавинмононуклеотид (FMN), флавинадениндинуклеотид (FAD), протопорфирин IX и другие, могут быть измерены с помощью одно- и двухфотонного FLIM и служить внутренними «сенсорами» катаболизма глюкозы, окислительного фосфорилирования (OxPhos) и дают общее представление о окислительно-восстановительном состоянии клеток. NAD(P)H существует в свободных цитоплазматических или в связанных с белками митохондриальных формах^37,38. Аналогичным образом, окисленная степень FAD флуоресцентна с более длительным временем жизни свободной формы. Микроскопии NAD(P)H и FAD обычно используют двухфотонное возбуждение FLIM, направленное на предотвращение фотоповреждения образца³⁹. Часто «оптическая метаболическая визуализация» FLIM может сочетаться с использованием зондов на основе красителей, генетически кодированных биосенсоров, микроскопии с визуализацией в течение жизни фосфоресценции (PLIM) и измерений, основанных на ратиометрической интенсивности, чтобы обеспечить более полную картину метаболизма сфероидов или органоидов, оксигенации, пролиферации и жизнеспособности клеток 29,30,31. Кроме того, FLIM также может быть объединен с методом резонансного переноса энергии (FRET) компании Förster для измерения изменения продолжительности жизни донорского флуорофора при тесном контакте с акцептором для исследования связывания лекарственного препарата с его целевым доменом 33,40,41.

Полученные изображения FLIM обычно анализируются для вычисления времени жизни попиксельно. В настоящее время существует, по крайней мере, 3 общие стратегии, используемые для получения времени жизни флуоресценции: полуколичественная «быстрая FLIM»⁴² (иногда называемая «тау-чувством»^43,44), аппроксимация кривой затухания с использованием одно-, двух- или трехэкспоненциальной аппроксимации и «безаппроксимирующий» подход с фазорным преобразованием и анализом векторных графиков. В зависимости от поставщика, для обработки измеренных данных FLIM может использоваться либо предоставленное (LAS X, Symphotime, SPCImage и т.д.), либо программное обеспечение с открытым исходным кодом (например, FLIMfit⁴⁵, FLIMJ⁴⁶ или другие⁴⁷). Как правило, программное обеспечение, предоставляемое поставщиками, полезно для предварительного анализа данных, в то время как решения с открытым исходным кодом могут обеспечить более точные исследования с использованием, например, векторных графиков и 3D-визуализации.

Несмотря на полезность и привлекательность FLIM в качестве метода изучения сфероидов, существует очень мало экспериментальных протоколов, и существует общая нехватка знаний о выборе наиболее подходящего метода формирования для успешных экспериментов по мультипараметрической микроскопии с использованием FLIM. В данной работе представлено подробное сравнение широко используемых протоколов формирования сфероидов на основе их морфологии, жизнеспособности и оксигенации с недавно валидированным и охарактеризованным наносенсором для зондирования кислорода (MMIR1) в дальнем красном и ближнем инфракрасном диапазонах (NIR). Катионная наночастица пропитана двумя репортерными красителями: эталонным O 2-нечувствительным aza-BODIPY (возбуждение 650 нм, излучение 675 нм) и NIR O_{2-чувствительным} металлопорфирином PtTPTBPF (возбуждение 620 нм, излучение 760 нм). MMIR1 позволяет анализировать градиенты кислорода в режиме реального времени на обычном флуоресцентном микроскопе (с использованием ратиометрического анализа) или фосфоресцентном микроскопе (PLIM) без введения клеточной токсичности и обеспечивая стабильные сигналы, долгосрочный мониторинг и мультиплексирование^25,29. В зависимости от необходимости окрашивания красителями или наносенсорами, пропускной способности сфероида или типа клетки может быть выбран наиболее подходящий протокол формирования. Поскольку исследования жизнеспособности и оксигенации сфероидов актуальны для исследований рака и сфероидов, полученных из стволовых клеток, представленные протоколы также включают примеры и ожидаемые типичные результаты NAD(P)H-FLIM и FAD-FLIM с этими моделями. Представленные конвейеры визуализации и анализа нацелены на наиболее популярные платформы микроскопии FLIM на основе подсчета одиночных фотонов с корреляцией по времени.

Protocol

1. Генерация многоклеточных сфероидов

1. Культура клеток
   ПРИМЕЧАНИЕ: Клеточные культуры могут быть собраны из American Type Culture Collection (ATCC), Lonza, Sigma-Aldrich или других поставщиков. ATCC предоставляет всю необходимую информацию по обращению, включая предпочтительные питательные среды, процедуры субкультивирования, уровень биобезопасности, скорость роста и профили STR. Здесь 500 клеток/сфероид клеточной линии рака толстой кишки человека HCT116 используется в среде McCoy's 5A (VWR, 392-0420) с добавлением 10% FBS и 1 мМ пирувата натрия. Для долгосрочных экспериментов, которые контролируются ежедневно, в среду можно добавлять 10 мМ HEPES, pH 7,2.
   1. Выращивайте клеточную культуру до 70%-90% конфлюенции.
   2. Промойте клетки предварительно подогретым (37 °C) стерильным PBS (5 мл на 25 см² или 10 мл на колбу 75 см² ).
   3. Добавить 0,05% трипсин - 1 мМ раствор ЭДТА (0,5 мл на 25 см² или 1 мл на 75 см² колбы) и инкубировать 5-10 мин при 37 °С при 5%_СО2, 95% влажности до достижения отслойки клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Управление отделением ячейки под микроскопом просвечивающего света (светлопольного). Чрезмерное воздействие на клетки диссоциирующего раствора фермента может повлиять на их жизнеспособность.
   4. Нейтрализуйте трипсин путем добавления избыточной среды для клеточных культур, содержащей 10% FBS (не менее 5 мл среды на 1 мл диссоциативного раствора).
      Примечание: Для клеток, культивируемых на питательных средах с низким содержанием FBS или без FBS, нейтрализация трипсина может быть выполнена путем добавления 0,5 мл 100% FBS в культуру клеток, обработанных трипсином, с последующим центрифугированием для переноса клеток в их исходные питательные среды.
   5. Диссоциацию клеточных агрегатов методом пипетирования с получением одноклеточной суспензии в среде.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пипетирование с помощью серологической пипетки с наконечником пипетки объемом 1000 мкл в верхней части значительно улучшает образование суспензии одиночных клеток в большом объеме культуры суспензионных клеток.
   6. Используйте счетную камеру (гемоцитометр с линейкой Нейбауэра или альтернативы) для подсчета количества клеток на 1 мл клеточной суспензии.
   7. Разбавляют клеточную суспензию до получения нужного количества клеток на миллилитр.
   8. _{Добавьте} концентрированный раствор зонда О2 (наночастиц) в клеточную суспензию в конечной концентрации 10 мкг/мл для ратиометрического анализа_О2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы обеспечить однородную клеточную суспензию (с помощью зонда), повторно суспендируйте несколько раз перед формированием сфероида. Если зонд_О2 не требуется, пропустите этот шаг и приступайте к формированию сфероидов. При работе с iPSC следует применять модифицированный протокол. Вкратце, iPSCs выращивают колониями на планшетах, покрытых Geltrex, и пассажируют с использованием ReLeSR, как описано в протоколе⁴⁸, предоставленном поставщиком. В день образования сфероидов колонии должны быть большими, компактными и иметь многослойные центры с четкими границами. Промойте клетки предварительно подогретым стерильным ПБС. Добавьте 1 мл щадящего реагента для диссоциации клеток (GCDR) и инкубируйте при 37 °C в течение 8-10 минут. С помощью наконечника объемом 1000 мкл аккуратно отделите клетки от лунки и получите одноклеточную суспензию. Перенесите суспензию одиночных клеток в стерильную коническую пробирку объемом 50 мл и добавьте 4 мл предварительно подогретой среды DMEM-F12 для нейтрализации GCDR. Промойте лунку 1 мл DMEM-F12 и перенесите его на оставшуюся клеточную суспензию. Центрифугируйте при 300 х г в течение 5 мин. Ресуспендировать в 1 мл соответствующей среды для дальнейших экспериментов. Для экспериментов, описанных в данной рукописи, использовали mTeSR + 10 мкМ Rock Inhibitor. Подсчитайте и разведите клеточную суспензию для получения нужного количества клеток на миллилитр.
2. Методы формирования сфероидов
   1. 3D чашка Петри для микроформ
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот высокопроизводительный метод используется для одновременного получения большого количества сфероидов (81 сфероид) в микропресс-форме размером 9 x 9 с диаметром 800 мкм и глубиной 800 мкм.
      1. Промойте микроформы для литья 3D чашек Петри в dH₂O и поместите в автоклавируемую емкость.
      2. Отмерьте 2 г порошка агарозы электрофорезного качества и поместите его в сухую стеклянную бутылку объемом 200 мл, пригодную для автоклава.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что флакон и агарозный порошок сухие, без жидкости и влаги.
      3. Автоклавные микроформы для литья 3D чашек Петри и бутылок с агарозным порошком в течение 30 мин на сухом цикле.
      4. Приготовьте 0,9 мас.% физиологического раствора путем добавления 0,9 г NaCl в 100 мл сверхчистой воды и стерилизуйте автоклавированием.
         ПРИМЕЧАНИЕ: NaCl рекомендован производителем. Это повышает устойчивость агарозы.
      5. Приготовьте раствор агарозы, добавив стерильный физиологический раствор в стерилизованный порошок агарозы. Закрутите крышку плотно прилегающей плотно во избежание повышения давления. Взболтайте в бутылке, чтобы смешать порошок агарозы.
      6. Вскипятите и растворите порошок агарозы, используя микроволновую печь. Выключайте микроволновую печь часто (~каждые 10 секунд). Перемешайте бутылку и повторяйте, пока агароза не растворится.
         ВНИМАНИЕ: Раствор агарозы горячий и требует осторожного обращения. Встряхивание сразу после процедуры плавления может привести к тому, что раствор вырвется из сосуда. Во избежание несчастных случаев используйте достаточно большие сосуды, заполненные не более чем на 50% вместимости, и используйте соответствующие средства индивидуальной защиты (перчатки, рукавица, средства защиты глаз и лабораторный халат).
      7. Дайте растворенному раствору агарозы остыть до 60-70 °С. Используя асептические методы и условия, пипетка впрыскивает расплавленную агарозу в микроформу (500 μл для серии 12 или 330 μл для серии 24).
         ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте образования пузырьков при смешивании или пипетировании агарозы. Удалите все мелкие пузырьки в мелких деталях микроформы с помощью пипетирования или осторожного соскабливания до того, как агароза затвердеет.
      8. Дайте агарозе застыть около 2-3 минут. После этого осторожно согните микроформу, чтобы удалить 3D чашку Петри и перенести на 12-луночный планшет для культуры тканей.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Чрезмерное изгибание микроформы может привести к образованию трещин внутри агарозной формы.
      9. Чтобы уравновесить 3D чашку Петри, добавьте 2,5 мл на лунку клеточную культуральную среду. Инкубируйте в течение 15 минут или дольше. Удалите питательную среду и замените ее свежей средой. Повторите еще раз, чтобы уравновесить 3D-чашку Петри с питательной средой.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь протокол может быть прерван до посева клеток. Для длительного хранения (до 2 недель при 4 °С) используйте раствор PBS вместо среднего.
      10. Полностью снимите 3D-чашку Петри, окружающую питательную среду (или PBS), и аккуратно удалите среду внутри 3D-чашки Петри, наклонив планшет для культуры тканей.
      11. Осторожно засейте 190 мкл клеточной суспензии, содержащей 40 500 клеток, по каплям в камеру посева клеток (см. шаг 1.1).
          ПРИМЕЧАНИЕ: Количество микролунок в агарозных марках определяет количество сфероидов, производимых на одном штампе. В этом случае эта агарозная плесень содержит 81 микролунку (81 x 500 клеток/сфероид). Изменение концентрации клеток в суспензии, добавленной в макролунку, позволяет изменять количество клеток на сфероиде, тем самым контролируя размер сфероида.
      12. Подождите ~10 минут, чтобы ячейки обосновались в функциях 3D Petri dsh. Затем добавьте 2 мл среды на внешнюю сторону 3D-чашки Петри.
      13. Поместите планшет для культуры тканей в инкубатор для клеточных культур и при необходимости замените среду, окружающую 3D-чашку Петри.
   2. Низкая крепежная пластина
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод используется для создания одного сфероида на лунку. Пластины с покрытием (Lipidure или Biofloat) имеются в продаже (пропустите шаги 1.2.2.1-1.2.2.4). В качестве альтернативы покрытие можно приобрести отдельно и использовать для покрытия необработанных многолуночных пластин. Скважины по краям 96-луночных пластин рекомендуется заполнять стерильной водой или ПБС из-за более быстрого испарения в этих лунках, тем самым ограничивая количество лунок для сфероидов до 60. В случае, если сфероидов нужно меньше, заполните окружающие пустые колодцы водой или PBS. Используйте беспыльные наконечники для работы с жидкостью, чтобы избежать попадания мелких частиц в лунки, так как они мешают образованию сфероида.
      1. Приготовьте 0,5 мас.% раствора для покрытия, растворив 0,25 г полимерного порошка в 50 мл этанола в стеклянной бутылке. Отфильтруйте и простерилизуйте покрытие.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Стерилизация фильтра и все последующие шаги должны проводиться в стерильных условиях под ламинарным потоком.
      2. Добавьте 200 мкл раствора для нанесения покрытия в каждую лунку культуральной пластины с U-образным дном 96.
      3. Выдержать 1 минуту и снять излишки покрытия.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Решение для нанесения покрытия можно использовать несколько раз. Хранить в стеклянной таре при комнатной температуре (RT). Пластиковые контейнеры не рекомендуются, так как пластик может частично раствориться и стать частью раствора. Если присутствует пыль, простерилизуйте фильтр с помощью полиэфирсульфонового (PES) или нейлонового шприцевого фильтра 0,22 мкм.
      4. Дайте 96-луночной пластине высохнуть на воздухе в течение примерно 1 часа.
         Примечание: Если клеткам необходим внеклеточный матрикс, перейдите к шагу 1.2.3. Пластины с покрытием могут храниться в RT в завернутом в алюминий до 1 месяца. При посеве меньшего количества клеток/лунок, центрифугирование планшета в течение 5 минут при 300 g может помочь вытащить ячейки.
   3. Протокол формирования внеклеточного матрикса
      Примечание: Некоторые клеточные линии сами не производят достаточное количество внеклеточного матрикса (ВКМ) и нуждаются в добавлении ВКМ, таких как Matrigel, Cultrex или Geltrex, для образования компактных сфероидов 49,50,51. Для таких типов клеток, как рак молочной железы MDA-MB-231, дермальный сосок человека, клетки рака предстательной железы и другие, возможно использование шага 1.2.2 со следующими модификациями⁵², требующими добавления ВКМ. Желательно использовать беспыльные наконечники для работы с жидкостью, чтобы избежать попадания пыли в сфероидальную форму. Этапы 1 и 4-7 должны выполняться в шкафу биологической безопасности (класс II).
      1. Выполните шаги 1.2.2.1-1.2.2.4 (пластины с низким уровнем крепления) для обработки поверхности.
      2. Предварительно охладите 96-луночную тарелку при температуре 4 °C в холодильнике.
      3. Подготовьте центрифугу с помощью подходящего адаптера для 96-луночного планшета и предварительно охладите ее до 4 °C.
      4. Приготовьте 5% раствор матрицы базальной мембраны (BMM) в предварительно охлажденной (4 °C) среде для клеточных культур.
         ПРИМЕЧАНИЕ: BMM быстро слинковывает на RT. При работе держите запасы и растворы на льду.
      5. Приготовьте клеточную суспензию (см. шаг 1.1).
      6. Добавьте по 50 мкл раствора BMM в каждую лунку.
      7. Аккуратно добавьте 50 мкл клеточной суспензии в каждую лунку поверх раствора BMM (25 000 клеток на лунку).
         ПРИМЕЧАНИЕ: Не выбрасывайте этот объем в колодец, иначе ячейки будут распространяться вверх по бокам колодцев и не будут собираться на дне. Меньшее количество ячеек на лунку может быть получено путем соответствующей регулировки плотности ячеек. Не все клетки образуют сфероиды при любой плотности посева; Оптимизация должна быть выполнена по типу ячейки и желаемым размерам. При предоставленных объемах конечная концентрация BMM составляет 2,5%. Если требуется другая концентрация, исходный раствор должен быть приготовлен при более низкой/высокой концентрации.
      8. Центрифугируйте 96-луночный планшет в течение 5 минут при 300 x g и 4 °C.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Без этого шага ячейки не могут должным образом агрегироваться на дне скважины, что приводит к образованию множества более мелких агрегатов. На этом этапе центрифугу необходимо охлаждать, чтобы избежать сшивки.
      9. Поместите планшет в инкубатор для клеточных культур. Агрегаты считаются зрелыми на 4 день после посева.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Дополнительные протоколы по формированию сфероидов см. в Дополнительном файле 1.

2. Живая микроскопия сфероидов

1. Подготовка сфероидов к анализу изображений в реальном времени
   ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от плана эксперимента (например, долгосрочный мониторинг или анализ конечных точек, настройка микроскопа или спектральные свойства измеряемой флуоресценции) или из-за несовместимости метода производства сфероидов с микроскопией (например, толщина образца, автофлуоресценция материала, плавающее количество сфероидов во время визуализации) прямой мониторинг сфероидов в пластине, где они были получены, может оказаться невозможным. Протокол объясняет подготовку сфероидов к визуализации, которые подходят для большинства инвертированных широкопольных и конфокальных микроскопов.
   1. Подготовьте и подогрейте (37 °C) среды для визуализации: DMEM с добавлением HEPES-Na, pH 7,2 (10 мМ), пирувата натрия (1 мМ), L-глутамина (2 мМ) и глюкозы (5 мМ), без фенола красного.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Можно использовать бикарбонат натрия отдельно или в комбинации с HEPES-Na, если во время визуализации²⁴ обеспечивается контроль CO₂. Некоторые типы клеточных культур не переносят присутствие HEPES. В зависимости от плана эксперимента содержание пирувата, глутамина и глюкозы может быть изменено.
   2. Приготовьте стерильные микроскопические чашки (коммерчески доступные или изготовленные в лаборатории) с покрытием (для сильной адгезии сфероида) или без покрытия (низкая адгезия сфероида) покровными стеклянными поверхностями (толщина #1,5).
      Примечание: Необходимость и тип покрытия зависят от типа клеток, адгезионных свойств сфероидов и скорости их миграции клеток из 3D в 2D интерфейс культуры. Это важно учитывать, так как покрытие может способствовать потере 3D-организации, изменению формы микроградиентов у сфероидов и, как следствие, поведения клеток. Для некоторых экспериментов (например, при визуализации анализировалась реакция на стимуляцию лекарственными препаратами) требуется сильное прилегание сфероида к поверхности, и предпочтительно покрытие желатином, BMM, коллагеном, коллагеном/поли-D-лизином или поли-D-лизином.
   3. Аккуратно промойте сфероиды, окрашенные зондом_О-2 , из микролунок микроузорчатого агарозного или 96-луночного планшета и переложите еще плавающие сфероиды во флакон объемом 2 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для обеспечения сбора всех сфероидов методом высокой пропускной способности необходимо 1-3 раза промыть форму с дополнительным объемом питательных сред, объединив все сфероидные суспензии в одном флаконе. Для сфероидов в низком прикрепляющем планшете собирайте сфероиды по одному из отдельных лунок в флакон или непосредственно в чашку для микроскопии, если для эксперимента достаточно небольшого количества сфероидов. При переносе больших сфероидов обрежьте конец кончика пипетки, чтобы не повредить его во время пипетирования.
   4. Оставьте флакон в вертикальном положении на срок до 5 минут, чтобы сфероиды осядли на дне флакона, образуя видимую гранулу.
   5. Извлеките среду из пробирки, оставив сфероиды нетронутыми, и аккуратно повторно суспендируйте их в достаточном количестве свежей культуры.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для удобства работы со сфероидами перенос сфероидов на носители изображения также может быть выполнен на этом этапе небольшими партиями; Смотрите шаги 2.1.7 и 2.1.8. К сфероидам из разных экспериментальных групп следует относиться одинаково, так как состав среды и время предварительного кондиционирования среды могут влиять на их метаболизм.
   6. Пока сфероиды находятся в плавании, переносите равный объем сфероидальной суспензии на лунку микроскопической чашки.
   7. Инкубируйте сфероиды в течение 1-2 ч при 37 °C в инкубаторе с_СО2 , чтобы обеспечить их прикрепление к поверхности микроскопической чашки/лунки. Для визуализации перейдите к шагу 2.1.9. Для окрашивания сфероидов дополнительными зондами приступают к шагу 2.1.8.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Скорость миграции клеток от 3D-сфероида к интерфейсу 2D-поверхности является функцией времени. Чтобы избежать потери 3D-организации, время инкубации должно быть оптимизировано с учетом типа клеток, типа покрытия поверхности и плана эксперимента. Например, HCT116, в зависимости от размера сфероида, требуется не менее 2 часов для правильного прикрепления сфероида к поверхности, покрытой коллагеном IV/поли-D-лизином, в то время как прикрепление hDPSC и миграция в 2D-интерфейс происходит чрезвычайно быстро, что приводит к потере 3D-организации за 1-2 часа. Чтобы избежать визуализации «2D-сфероидов» из-за чрезмерного растекания, используются стеклянные поверхности без покрытия с уменьшенным временем инкубации.
   8. Добавьте флуоресцентный зонд (зонды) в рекомендуемых или эмпирически оптимизированных концентрациях к известному объему сфероидной суспензии. Перед визуализацией инкубатор инкубировать в течение 1 ч при 37 °C_CO2 .
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для анализа живых/мертвых веществ используйте йодид пропидия и кальцеин Грин-АМ в стандартной конечной концентрации 1 г/мл. Чтобы избежать токсического эффекта окрашивания йодидом пропидида на эмбриоидные тельца iPSC, конечная концентрация йодида пропидиума составляла 0,5 мкг/мл. Время загрузки зонда может быть увеличено, если диффузия щупа неэффективна из-за большого размера сфероида. Время загрузки всегда следует рассматривать как часть общего времени инкубации, необходимого для крепления сфероида к поверхности. Если для крепления сфероида требуется более длительное время, то процедуру окрашивания следует устраивать в конце этого срока. Имейте в виду, что более длительное время инкубации может привести к потере 3D-организации.
   9. Удалите среды для клеточных культур или среды, содержащие флуоресцентные зонды, и замените их на необходимый объем среды для визуализации. Чтобы убедиться в отсутствии фона флуоресценции среды на пути получения сфероидальной визуализации, повторите этап замены (промывки) среды до 5 раз.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать удаления сфероида во время замены среды, рекомендуется осторожно отсасывать среду пипеткой объемом 200 мкл от краев микроскопических чашек и выполнять добавление медиа у стены или сбоку в микроскопической чашке.
   10. Немедленно перейдите к шагу 2.2.1 протокола визуализации.
       Примечание: Слишком долгий перерыв между подготовкой к визуализации и фактическим получением изображений может повлиять на клеточный метаболизм (например, через изменение состава среды), жизнеспособность (некоторые флуоресцентные зонды, используемые для анализа конечных точек, обладают токсическими эффектами, которые могут стимулировать гибель клеток после длительного инкубационного периода), а также привести к потере 3D-организации. Если необходимо сравнить несколько групп сфероидов или экспериментальных условий, то план эксперимента должен быть разработан таким образом, чтобы время проведения процедур, предварительного кондиционирования и визуализации между анализируемыми группами было как можно более равномерным.
2. Получение изображений
   ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол описывает многопараметрическую визуализацию живых сфероидов с помощью конфокального микроскопа Stellaris 8 Falcon (Leica) и программного обеспечения Leica Application Suite X (LAS X) версии 4.7. Однако для выполнения такого анализа на альтернативных платформах микроскопии потребуются лишь незначительные модификации.
   1. Включите термоклимат-контроль за 30-60 минут до начала съемки. Установите необходимую скорость проветривания и температуру (35-37 °С).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если в дополнение к контролю температуры необходимо контролировать концентрацию газов (например, CO₂ или O₂) во время визуализации, соответствующие устройства также должны быть запущены заранее, чтобы достичь необходимых условий до получения изображения.
   2. Включите микроскоп и подключенные к нему устройства (например, лазер WLL, компьютер, водяной насос для объектива погружения в воду и другие работающие электронные блоки). Запустите программное обеспечение для управления микроскопом (например, LAS X Machine Mode или Machine Mode with Environmental Control), поставляемое с точной настройкой микроскопа, и инициализируйте калибровку предметного столика.
   3. Выберите нужную цель в программном обеспечении и при необходимости нанесите иммерсионную жидкость.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для живой микроскопии рекомендуется использовать либо водные, либо глицериновые иммерсионные объективы с достаточным («длинным») рабочим расстоянием, например, HC Fluotar L 25x/0,95 W VIS IR (рабочее расстояние 2,4 мм), HC PL Apo 40x/1,25 GLYC (рабочее расстояние 0,35 мм) или не менее NA = 0,4 или выше для воздушных объективов. Выбор увеличения и рабочего расстояния зависит от характера и размера визуализируемого образца и измеряемых сигналов флуоресценции (яркость, квантовый выход, эффективность окрашивания, см., например, обсуждение красителей и наночастиц⁵³). Большие объекты (сфероиды или органоиды размером >500 мкм), «биореакторы» или микрофлюидные чипы требуют объективов с большим рабочим расстоянием и меньшим увеличением, в то время как анализ отдельных клеток или клеточных органелл требует большого увеличения, часто достигаемого с помощью «мозаичной» визуализации.
   4. Установите на сцене чашку для микроскопии со сфероидами. Отрегулируйте фокус и найдите объект/область интереса (ROI).
      Примечание: Если необходимо найти небольшие, слабофлуоресцентные, малоконтрастные или редкие объекты, а нахождение фокуса затруднено, рекомендуется предварительно сфокусироваться на стенках микроскопической чашки и «экранировать» поверхность для интересующего объекта серпантином, начиная с одного из углов лунки.
   5. Выберите окно « Открыть проект» и нажмите на соответствующий значок « Создать новый проект». Присвойте файлу исследовательского проекта стандартное имя (например, начиная с «YY-MM-DD+ description»). Во время создания изображений все созданные изображения будут автоматически сохранены в созданный файл проекта .lif .
   6. Откройте окно Приобретение . Установите длину волны возбуждения лазера белого света (WLL) и требуемый диапазон гибридных или резонансных сканирующих детекторов (типа HyD S, HyD X или HyD R) на основе известных спектральных свойств измеряемой флуоресценции (спектров возбуждения/поглощения и излучения). Выберите тип сканирования «Линия» или «Кадр ».
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для большинства коммерчески доступных флуоресцентных красителей спектральные свойства можно найти (или добавить) в пакете LAS X Dye Assistant. Выберите детектор с подходящим диапазоном спектральной чувствительности, совместимым со спектральными свойствами зонда и, в случае FLIM, совместимым с подсчетом фотонов (т. е. HyD X или HyD R). Для многопараметрической визуализации установка WLL в нескольких положениях возбуждения (например, для одновременной визуализации FAD/флавинов и двух флуоресцентных каналов ратиометрического зонда MMIR1 O₂ - опорного и чувствительного, настройки возбуждения/излучения могут составлять 460 нм/510-590 нм HyD X1 и 614 нм/631-690 HyD X3 и 724-800 нм HyD R соответственно в одной или двух последовательных последовательностях сканирования). Важно назначить соответствующий детектор для сбора излучения, так как детекторы могут иметь различную спектральную чувствительность⁵⁴.
   7. (Опционально для FLIM) В окне Сбор данных выберите режим FLIM для выполнения визуализации в сочетании с подсчетом фотонов (сбором распада). Сразу же будет открыт дополнительный модуль «FLIM в программном обеспечении LAS X» для навигации и анализа данных FLIM.
   8. (Опционально для FLIM) Выберите частоту следования импульсов WLL в зависимости от ожидаемого среднего срока службы флуорофора.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Частота лазерного импульса должна быть отрегулирована для сбора полного затухания флуоресценции. Это можно сделать с помощью функции Pulse Picker , установленной на микроскопе. Наложение затухания флуоресценции на лазерный импульс приведет к сокращению расчетного времени жизни флуоресценции. Рекомендуется иметь интервалы импульсов в 4-5 раз больше ожидаемого среднего времени жизни флуоресценции (например, 25 нс/40 МГц для времен жизни до 5 нс). Многие импульсные лазеры имеют фиксированную частоту следования 80 МГц (идеально подходит только для диапазона до 2-3 нс). Это важно для выбора правильных флуорофоров для эксперимента.
   9. Запустите предварительный просмотр изображения в режиме FAST LIVE и отрегулируйте точную фокусировку объекта изображения на интересующем участке.
      ВНИМАНИЕ: Строго соблюдайте правила безопасности лазера. Всегда учитывайте правила безопасности лазера и дождитесь остановки изображения, прежде чем включать просвечивающий свет, смотреть в окуляр или на образец.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В режиме FAST LIVE к изображению автоматически применяется высокоскоростное сканирование с частотой 600 Гц (соответствует максимальной частоте кадров 4,43/с при использовании двунаправленного режима сканирования X) и разрешением 256 x 256 пикселей, чтобы защитить флуоресценцию от фотообесцвечивания. Откройте отверстие (например, на 3-4 а.е.) и/или увеличьте интенсивность лазера, если сигнал флуоресценции слишком слаб для фокусировки на объекте. Избегайте неполного сбора кариеса.
   10. (Опционально для FLIM) Глядя на гистограмму интенсивности пикселей, появляющуюся во время визуализации в окне модуля FLIM (режим реального времени), отрегулируйте соответствующую интенсивность/размер и разрешение лазерного отверстия, чтобы достичь предела скорости подсчета ~1 фотон/лазерный импульс (красная линия). Избегайте значительно выше 1, чтобы исключить риск эффекта накопления. При необходимости отрегулируйте частоту следования импульсов WLL таким образом, чтобы в окне затухания отображалась полная коллекция затухания (во избежание неполной коллекции затухания см. шаг 2.2.8).
       ПРИМЕЧАНИЕ: Если количество фотонов (интенсивность) недостаточно для восстановления надежного затухания для анализа подгонки или облака векторных графиков, примените несколько повторов сканирования (кадров или линий, или настройте время сканирования), увеличьте интенсивность лазера и/или пожертвуйте разрешением (размером ROI сканирования). Имейте в виду, что для уменьшения частоты лазерного следования требуется собрать больше фотонов для надежной реконструкции распада, и может потребоваться дополнительная коррекция параметров изображения. Помните о потенциальном влиянии интенсивного света и длительного непрерывного освещения на жизнеспособность клеток и метаболизм⁵⁵. Негативное влияние на жизнеспособность и метаболизм может быть различным в каждом отдельном случае, в зависимости от интенсивности, продолжительности и длины волны возбуждающего света, а также от модальности визуализации (например, однофотонная конфокальная или многофотонная визуализация). Соответствующим образом отрегулируйте параметры визуализации и, при необходимости, контролируйте жизнеспособность/гибель клеток с помощью Calcein Green-AM или интенсивность йодида пропидиума в пилотных экспериментах⁵⁶. По возможности следует рассмотреть возможность дальнейшей оптимизации протокола окрашивания флуоресцентным зондом для достижения адекватного флуоресцентного сигнала во время микроскопии в реальном времени.
   11. (Опционально для 3D z-стека) В режиме Fast Live задайте координаты, направление сканирования и присвойте им значения «Начало » и «Конец » в окне Z-стека (режим сканирования XYZ). Выберите размер Z-шага или количество ступеней.
       ПРИМЕЧАНИЕ: В то время как программное обеспечение автоматически рассчитывает «оптимальное» количество шагов на основе используемого разрешения и параметров сканирования, 3D-реконструкция в реальном времени обычно может потребовать меньшего количества шагов для достижения быстрого сбора, например, размер шага 1-2 мкм, размер стека 50-100 мкм, двунаправленное сканирование, требующее 2-3 минуты от общего времени сканирования. Имейте в виду, что субклеточные органеллы, клетки и 3D-модель клетки также могут перемещаться во время измерений. Кроме того, из-за глубины проникновения света и пределов рассеяния обычно можно достичь только 50-100 мкм глубины сканирования на конфокальном FLIM.
   12. Когда все необходимые настройки применены, приступайте к созданию образа.
   13. Присвойте изображению подходящее имя.
   14. Найдите следующий объект изображения в режиме пропускающего света и повторите процедуру визуализации с предварительно оптимизированными настройками изображения (шаги 2.2.8-2.2.12).
       ПРИМЕЧАНИЕ: Для сравнения на основе интенсивности или анализа отношения интенсивностей (например, анализа оксигенации на основе зонда MMIR_O2) всегда сохраняйте одни и те же настройки изображения для всех анализируемых объектов (увеличение и тип линзы объектива, интенсивность лазера, мощность и частота импульсов, длина волны возбуждения, дальность детектора, точечное отверстие, скорость сканирования, время задержки пикселей и разрешение). Однако, поскольку время жизни флуоресценции не зависит от интенсивности флуоресценции и требует сбора соответствующего количества фотонов для надежного расчета, параметры визуализации FLIM могут быть скорректированы в ходе эксперимента, чтобы сохранить количество собранных фотонов сопоставимым при различных методах обработки или экспериментальных условиях. Таким образом, для многопараметрического анализа, где требуется как анализ на основе интенсивности, так и анализ на основе времени жизни флуоресценции, для всех объектов в сравниваемых экспериментальных группах необходимо применять оптимизированные универсальные настройки визуализации. Для сравнения "только FLIM" можно сравнивать изображения, полученные с немного отличающимися настройками изображения, поскольку программное обеспечение LAS X обеспечивает расчет IRF для отдельного измерения изображения⁴². Однако для анализа FLIM-fitting вне LAS X (например, FLIMfit⁴⁵) функция отклика инструмента (IRF) должна измеряться для каждого отдельного условия визуализации, поскольку она не может быть экспортирована из программного обеспечения для визуализации. Таким образом, для простоты планирования эксперимента и рабочей нагрузки рекомендуется применять одни и те же настройки визуализации для всех изображений в наборе данных. Затем соответствующие измерения IRF могут быть выполнены с использованием гашеных или быстрых флуоресцентных флуорофоров со временем жизни (в диапазоне ps) с эмиссионными свойствами измеряемого спектрального канала 57,58,59, люминесценцией наночастиц золота ⁶⁰ или сигналом генерации второй гармоники для мультифотона FLIM⁶¹. В программном обеспечении LAS X ранее оптимизированные параметры изображения можно загрузить для нового проекта, щелкнув правой кнопкой мыши на интересующем файле и выбрав «Применить настройки изображения».
   15. Когда сеанс обработки изображений будет завершен, сохраните проект изображения. Чтобы завершить сеанс визуализации, извлеките образец из микроскопического этапа и очистите объектив от иммерсионной жидкости (если она используется) в соответствии со стандартной процедурой, реализованной в центре визуализации. Закройте проект и программное обеспечение. Выключите микроскоп, лазеры и все подключенные устройства.
   16. Перейдите к анализу данных визуализации (шаг 2.3).
3. Векторная обработка изображений NAD(P)H/FAD-FLIM с модулем LAS X FLIM и FIJI
   ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол описывает флуоресцентный анализ времени жизни визуализированных сфероидов для получения данных в частотной области на примерах автофлуоресценции NAD(P)H и FAD/Flavins FLIM. Измерение автофлуоресценции NAD(P)H стало золотым стандартом метаболического анализа, где короткие и более длительные компоненты автофлуоресценции NAD(P)H связаны с гликолизом или окислительным фосфорилированием (OxPhos) соответственно. Это можно проанализировать по сдвигу на векторном графике вдоль метаболической траектории в сторону измеренных стандартов свободного NAD(P)H или связанного с белком NAD(P)H^31,62. Для анализа траектории метаболического сдвига, а также для сравнения положения векторных облаков (см. ПРИМЕЧАНИЕ ниже шаг 2.3.6) на графике между экспериментальными группами был реализован упрощенный анализ векторных координат, основанный на расчете геометрического центра (центроида) векторного облака²⁹. Описанный протокол демонстрирует вычисление координат центроида в FIJI и измерение расстояния между двумя точками на векторном графике с использованием координат (например, расстояние от центроида сфероида автофлуоресцентного векторного облака NAD(P)H до теоретической точки «свободного NAD(P)H»). Аналогичным образом можно анализировать FAD и другие сигналы автофлуоресценции. Набор данных 1 с .lif (требуется программное обеспечение LAS X) или .ptu Форматы файлов для обучения этой процедуре предоставлены (Дополнительное дело 2, Дополнительное дело 3, Дополнительное дело 4, Дополнительное дело 5, Дополнительное дело 6, Дополнительное дело 7, Дополнительное дело 8, Дополнительное дело 9, и Дополнительный файл 10).
   1. Откройте модуль FLIM в LAS X, выберите «Открыть проект» и загрузите файл изображения сфероида (.lif) для автофлуоресцентного анализа NAD(P)H/FAD.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В связи с возможными ошибками и промежуточными потерями данных в модуле FLIM, используйте копию исходного файла изображения сфероида (.lif) для анализа NAD(P)H/FAD, сохраняя необработанный файл без изменений.
   2. Выберите одно изображение и перейдите к интерфейсу анализа FLIM. Нажмите кнопку Вектор, чтобы получить доступ к векторному графику и активировать режим векторного анализа. Примените фильтр (Медиана или Вейвлет) и установите Порог для минимизации шума и улучшения видимости данных для всех векторных анализов. Выберите гармоники. Для анализа метаболического сдвига на основе данных NAD(P)H перейдите к шагам 2.3.3-2.3.5. Для общего сравнения векторных графиков исходим из пункта 2.3.6.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Применяйте настройки анализа (тип фильтра, гармоники, пороговые значения, группирование и ROI векторов) одинаково ко всем изображениям в сравниваемом наборе данных.
   3. (Опционально для анализа NAD(P)H) Выберите любое изображение, относящееся к набору данных, и используйте опцию «Нарисовать курсор для двух компонентов », чтобы точно определить положение 0,45 нс на универсальной окружности стандартного пространства векторных графиков. Это положение будет присвоено среднему времени жизни флуоресценции чистого однородного раствора свободного NAD(P)H, которое в норме близко к моноэкспоненциальному распаду⁶².
      ПРИМЕЧАНИЕ: Free-NADH и free-NAD(P)H имеют схожие спектральные свойства и схожие значения времени жизни флуоресценции в водном растворе, с двумя короткими компонентами жизни, 0,3 нс и 0,7^нс63. Таким образом, для простоты векторного анализа и из-за небольшой разницы между временными компонентами их затухание флуоресценции принято считать моноэкспоненциальным, что позволяет распределить векторное облако по универсальной окружности. Эталонное среднее время жизни формы со свободным NAD(P)H также может быть измерено и построено на графике в векторном пространстве для аналогичного анализа. Референтный срок жизни был выбран на основе литературы⁶²; Обратите внимание, что в других источниках можно найти несколько иное значение свободного NAD(P)H в растворе (0,4 нс⁶⁴).
   4. (Опционально для анализа NAD(P)H) Экспортируйте векторный график с выделенным временем жизни free-NAD(P)H (см. шаг 2.3.3), щелкнув правой кнопкой мыши на графике и выбрав «Экспорт данных». Экспортируйте векторную диаграмму в виде файла в формате .tiff в указанную папку для хранения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Исходный размер пикселя экспортированного векторного изображения из модуля LAS X FLIM всегда составляет 1024 x 600 пикселей. Если для экспорта и предварительного анализа данных используется другое программное обеспечение, убедитесь, что все изображения векторных графиков экспортируются с одинаковым размером и разрешением.
   5. Чтобы экспортировать шароидное облако, связанное с сфероидами, используйте инструмент Нарисовать курсор в модуле LAS X FLIM, чтобы выбрать ROI сфероида на изображении. Экспортируйте сгенерированный векторный график, как описано в шаге 2.3.4.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Соответствующие координаты g и s (аналогично x и y) векторного пространства будут присвоены каждому пикселю выбранного ROI в соответствии с их временем жизни, преобразованные в набор данных в частотной области^64,65. Кластер пикселей с одинаковыми значениями t_f (время жизни фазы) и t_m (время жизни модуляции) образует на графике облачный узор (фазорное облако), где цветовое кодирование (с диапазоном от глубокого синего до красного) будет отражать обилие значений времени жизни. По положению облака на универсальном круге или внутри можно различать моно- или мультиэкспоненциальные распады. Некоторые измерительные среды проявляют сильную (авто)флуоресценцию, что приводит к появлению соответствующего облака на векторном графике, которое не может быть просто удалено с помощью средств порога интенсивности. Этот шаблон влияет на вычисление координат центроида и должен быть исключен из экспортируемого векторного графика. Работа со сфероидом ROI позволяет исключить несвязанные пиксели из дальнейшего векторного анализа.
   6. Повторите процедуру экспорта векторных графиков для всех сфероидов ROI в наборе данных (см. шаги 2.3.4 и 2.3.6). Кроме того, проверьте экспортированный набор .tiff изображений, чтобы гарантировать полный набор данных для дальнейшего сравнительного анализа и убедиться, что все экспортируемые изображения имеют одинаковый размер пикселя (см. ПРИМЕЧАНИЕ в шаге 2.3.4).
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе протокола набор изображений должен включать вектор с местоположением свободного NAD(P)H (на основе литературы или эмпирически полученных данных) и все сфероидные ROI (или альтернативные шаблоны ROI, если это необходимо для конкретного анализа). После этого шага будет проведен дальнейший анализ на Фиджи, а затем в электронной таблице. Используя окно инструмента Анализ , выберите опцию Установить масштаб в FIJI и убедитесь, что все изображения векторных графиков откалиброваны с одним и тем же типом единиц измерения, например, только в пикселях. Если нет, задайте единицу длины в окне «Задать масштаб » для выбранной единицы (например, для масштаба на основе пикселей поставьте 1 в поле «Расстояние в пикселях » и установите единицу длины в пикселях). Для дальнейшего сравнения измерьте все экспортируемые данные, используя один и тот же тип единиц измерения.
   7. (Опционально для анализа NAD(P)H) Определите положение точки пикселя со средним временем жизни флуоресценции в свободном NAD(P)H на соответствующем экспортируемом векторном изображении (см. шаг 2.3.3): Откройте векторное изображение с помощью FIJI, увеличьте изображение, чтобы четко визуализировать с пиксельным разрешением пересечение между универсальным полукругом и линией Ratio Cursor for Two Components ; используйте инструмент Rectangle ROI для выбора перекрестка.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что прямоугольное выделение представляет собой небольшую область вокруг точки пересечения для точного определения ее координат на следующем шаге (шаг 2.3.9).
   8. (Опционально для анализа NAD(P)H) Откройте инструмент Анализ , выберите окно Задать измерения и выберите Центроид в качестве параметра измерения. Нажмите кнопку Измерить в окне инструмента Анализ, чтобы определить координаты центроида точки отсчета свободного NAD(P)H. Экспортируйте эти координаты в таблицу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Координаты Free-NAD(P)H будут использоваться в качестве точки отсчета для сравнения расстояний от этой точки до положения сфероидного векторного облака в наборе данных (способ характеристики метаболического сдвига между гликолизом и OxPhos в автофлуоресцентном анализе NAD(P)H FLIM)
   9. С помощью FIJI откройте изображение сфероидального векторного облака. Откройте окно «Изображение », выберите «Настройка» и выберите «Порог цвета » на панели инструментов. Выберите выбранный метод порогового значения (например, Otsu) и установите значения оттенка и яркости , чтобы сузить параметры для выбора части векторного облака с наиболее распространенными пиксельными координатами. Нажмите кнопку Выбрать, чтобы определить область кластера.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сохраняйте одинаковые пороговые параметры для всех изображений векторных графиков, которые должны быть проанализированы. Для представленных данных NAD(P)H-FLIM был выбран метод порогового значения Otsu с установленными значениями Hue Value 9 и Brightness Value 160, который был применен ко всем векторным изображениям. Кроме того, выбранную область можно скопировать в Менеджер ROI (следуйте по пути Edit > Selection > Add to Manager) для создания библиотеки векторных ROI для дальнейшего анализа.
   10. Сохраняя выделение, рассчитаем координаты центроида выделенной области, следуя процедуре, описанной в шаге 2.3.9. Экспортируйте эти координаты в файл таблицы.
   11. Повторите шаги 2.3.9 и 2.3.10 для определения координат центроида для всех векторных изображений ROI для создания набора данных в электронной таблице.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Использование библиотеки ROI Manager помогает упростить и организовать анализ ROI (см. шаг 2.3.10)
   12. (Опционально для анализа NAD(P)H) Откройте таблицу с экспортированными координатами свободного NAD(P)H и сфероида ROI из разных групп сравнения. Вычислите расстояние между каждым отдельным центроидом вектора сфероида до опорного положения свободного NAD(P)H, используя определенные координаты и следующее уравнение:
       
       Где, X,_c и Y,_c — координаты центроида, X_f и Y_f — координаты привязки.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Применение параметра центроида для определения сдвига в сторону опорного времени целесообразно только в том случае, если все центроиды из набора данных лежат на одной и той же линейной траектории к точке отсчета. Чтобы проверить это, все точки центроида из набора данных должны быть построены вместе с опорной точкой в том же пространстве координат, а также должно быть выполнено линейное выравнивание тренда. Если коэффициент R² линейной линии тренда, проведенной через все точки, близок к 1 (например, R² равен 0,8-0,99), то предполагается, что анализ расстояний является целесообразным.
   13. Организуйте все данные соответствующим образом для сравнения и выполните статистический анализ с использованием любого соответствующего программного обеспечения (например, Origin, MatLab). Выберите подходящий статистический тест в соответствии с характеристиками набора данных (нормальность распределения, количество статистических единиц и т.д.).
       ПРИМЕЧАНИЕ: Для анализа NAD(P)H сравните значения расстояний, чтобы охарактеризовать метаболический сдвиг в зависимости от условий эксперимента. Для сравнения любых векторных графиков между экспериментальными группами выполните сравнение координат центроидов векторного облака ROI.

Results

Выбор подходящего способа формирования сфероида
Выбранный метод формирования сфероидов может существенно влиять на размер, форму, плотность клеток, жизнеспособность и чувствительность к лекарственным препаратам (рис. 2). Ранее сравнивали влияние нескольких методов с высокой пропускной способностью (SphericalPlate 5D, лабораторные микроформы и пресс-формы MicroTissue) и с низкой пропускной способностью (96-луночные планшеты с покрытием Biofloat и липидуром) на жизнеспособность сфероидов и оксигенацию²⁹.

Здесь различные методы формирования приводят к образованию сфероидов разных размеров, даже с одинаковой начальной концентрацией 500 клеток/сфероид. Сфероиды HCT116, образованные в 96-луночных планшетах с низким прикреплением, были значительно больше по сравнению с высокопроизводительными методами после 5 дней формирования (Рисунок 2 и Таблица 2). Кроме того, методы с низким уровнем прикрепления привели к очевидному развитию некротического ядра, обнаруженного при окрашивании йодидом пропидия (красным цветом), в то время как сфероиды, полученные другими методами (MicroTissue, лабораторные формы и Sphericalplate 5D), продемонстрировали диффузное распределение мертвых клеток по корпусу сфероида (рис. 2A). Эта разница в жизнеспособности клеток по объему сфероида также может влиять на диффузию кислорода через среду, на которую, в свою очередь, могут влиять парциальное давление_О2, скорость потребления, температура и растворимость_О2. Кроме того, при высокопроизводительных методах питательные вещества истощаются, а продукты жизнедеятельности накапливаются быстрее, так как большее количество сфероидов находится в пределах одного объема и, следовательно, требует более частой замены среды (рис. 2A).

Общая оксигенация сфероида была измерена с помощью недавно охарактеризованного и валидированного зонда MMIR1²⁹, при этом ранее сообщалось о подробном протоколе²⁵. Оксигенацию можно сравнивать только между методами с высокой пропускной способностью и методом с низким уровнем прикрепления по отдельности (рис. 2B), так как отношение сигнал/шум различается во всех сравниваемых методах формирования сфероидов. Сферические 5D-сфероиды показали более низкую общую оксигенацию по сравнению с микротканью (P-значение = 0,0697) и лабораторными микроформами (P-значение = 0,0005) (Рисунок 2C). Сфероиды, полученные с помощью сферической пластины 5D, выращиваются на большем расстоянии от поверхности воздушного интерфейса среды по сравнению с методами агарозной формы, что приводит к более медленной доставке_O2 в статическую культуру. Эта гипотеза справедлива, поскольку значения оксигенации между обоими пластинами с низким уровнем прикрепления и, кроме того, между обоими методами агарозной формы статистически схожи (рисунок 2D).

Рисунок 2: Методы формирования сфероидов влияют на морфологию, размер, жизнеспособность и оксигенацию. (A) Сфероиды HCT116 (начальная плотность посева 500 клеток) выращивали в течение 5 дней перед окрашиванием в течение 1 часа Propidium Iodide (некроз клеток, красный, 1 мкг/мл) и Calcein Green-AM (жизнеспособные клетки, зеленый, 1 мкг/мл). Методы формирования с низким уровнем прикрепления дают более крупные сфероиды, содержащие некротическое ядро (красный). Масштабная линейка составляет 100 мкм. (B) Оксигенация в сфероидах HCT116 (начальное посев 500 клеток с добавлением 20 мкг/мл MMIR1 во время формирования сфероида, 6 дней), полученная различными методами, показала больше насыщенных кислородом сфероидов с помощью MicroTissue и лабораторных микроформ, чем с помощью SphericalPlate 5D. (C) Общая оксигенация сфероидов рассчитана по измерениям соотношения. (D) Размер сфероидов в квадрате через 5 дней. Результаты показывают, что средняя ± SEM составляет 6-16 сфероидов. 5D = SphericalPlate 5D, MM = метод Micromold, MT = метод MicroTissue. P-значение < 0,001 и ****P-значение <0,0001 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Способ формирования	Количество сфероидов в лунке	Общее количество засеянных ячеек на лунку	Площадь квадрата (м²)
Микроткань	81	40 500 ячеек/190 мкл	112 558 ± 15 702
Лабораторные микролунки	1859	794 500 ячеек/мл	53 460 ± 8 332
Сферическая пластина 5D	750	375 000 ячеек/мл	44 048 ± 7 259
Липидур	1	500 / 200 μл	257 148 ± 28 132
Биопоплавок	1	500 / 200 μл	254 475 ± 21365

Таблица 2: Различные методы формирования сфероидов приводят к различиям в размерах сфероидов, измеряемых квадратом площади.

При выборе конкретного метода формирования сфероида для экспериментов необходимо учитывать, что добавление наночастиц может влиять на форму сфероида. При использовании покрытия на основе липидов с круглыми донными микролунками может произойти выпадение зонда в осадок, приводящее к образованию «спутниковых сфероидов» или некруглых сфероидов (рис. 3). Добавление зонда O₂ к коммерческой пластине Biofloat приводит к образованию некомпактной периферии сфероида, что предполагает потенциальную интерференцию наночастиц с покрытием микропластины. На морфологию сфероидов также может влиять пыль, прикрепленная к наконечникам пипеток. Клетки во взвешенном состоянии могут прилипать к пыли, тем самым влияя на форму. Поэтому рекомендуется использовать многоразовые наконечники для пипеток, уже поставляемые в штативе.

Рисунок 3: Изображения микроскопии просвечивающего света с примерами формирования неидеальных сфероидов. Неправильное хранение наночастиц может привести к выпадению зонда в осадок, препятствуя образованию сфероидов. Примеры интерференции зонда и пыли. Масштабная линейка составляет 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Очевидно, что методы формирования сфероидов влияют на размер, морфологию и жизнеспособность сфероидов и приводят к различиям в их насыщении кислородом. Метод с высокой пропускной способностью с агарозными формами (например, коммерчески доступными, такими как MicroTissue mold) совместим с большинством экспериментов. Он обеспечивает более воспроизводимую форму, не вызывает осаждения наночастиц, является многоразовым и может быть совместим с прямой последующей микроскопией. Однако для крупных сфероидов (>800 мкм) и длительного культивирования рекомендуется метод с низким прикреплением, поскольку методы с высокой пропускной способностью потребуют частой замены среды. В таком случае проблемы осаждения наночастиц и их влияния на формирование сфероидов можно избежать путем предварительного окрашивания двухмерной монослойной культуры в течение ночи перед формированием сфероидов (рис. 4).

Рисунок 4: Предлагаемый алгоритм выбора метода формирования сфероидов для флуоресцентной микроскопии в реальном времени. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

  

Визуализация многопараметрического FLIM сфероидов NAD(P)H с помощью двухфотонной FLIM-микроскопии выявляет метаболическую гетерогенность сфероидов HCT116
Являясь заметным маркером автофлуоресценции в безметочной метаболической визуализации, NAD(P)H показывает более короткое время жизни для гликолиза и более длительное время жизни для OxPhos, что позволяет расшифровать пространственное распределение метаболической активности в таких 3D-моделях, как сфероиды и органоиды³¹. Для удобного анализа распределения NAD(P)H в сфероидах HCT116 был использован основанный на фазоре количественный метод автофлуоресцентного анализа NAD(P)H, который выявил связанные с гликолизом и окислительным фосфорилированием (OxPhos) состояния. В то время как изображения интенсивности флуоресценции сфероидов HCT116 не выявили существенных различий между сфероидами, быстрая FLIM-визуализация NAD(P)H выявила явную разницу в оптических срезах сфероидов. На быстрых FLIM-изображениях сфероиды с внутренней областью, демонстрирующей более короткое время жизни флуоресценции, были помечены белым кругом, идентифицирующим его как гликолитическое ядро (рис. 5A). Следовательно, сфероиды были разделены на две группы: группу гликолитического ядра и группу негликолитического ядра, в зависимости от наличия или отсутствия гликолитического ядра. Векторный анализ на основе центроидов был использован для статистического анализа различий между двумя различными группами и измерения расстояния от центроида кластера пикселей до свободной точки NAD(P)H. Как показано на рисунке 5B, на векторном графике наблюдалась очевидная разница в кластерах пикселей между гликолитической и негликолитической группами. Для точного измерения расстояния свободная точка NAD(P)H на векторном графике была точно отмечена с помощью модуля FLIM в программном обеспечении LAS X, а затем экспортирована в программное обеспечение FIJI для определения точных координат. Впоследствии, в соответствии с протоколом 2.3, координаты центроида были измерены на векторном графике каждой группы с помощью программного обеспечения FIJI. Расстояние (D) от центроида до свободной точки NAD(P)H, используя теорему Пифагора, было рассчитано таким образом, что облегчает анализ профилей NAD(P)H для различения сфероидов OxPhos и сфероидов с гликолитическим ядром. Результаты, показанные на диаграмме, показывают значительную разницу в расстояниях между сфероидами гликолитического ядра и группой негликолитических ядер (***P-значение < 0,001) (рисунок 5C). Этот результат согласуется с быстрой визуализацией FLIM, демонстрируя, что этот метод векторного анализа подходит для количественного анализа дивергенции NAD(P)H сфероидальных популяций. Кроме того, чтобы проверить, применим ли этот подход для сравнения расстояния между двумя группами сфероидов, был проведен линейный регрессионный анализ центроидов из обеих групп и свободной точки NAD(P)H (рис. 5D). Результат показал, что центроиды выровнены со свободным NAD(P)H с высоким коэффициентом корреляции (R² = 0,997), что подтверждает возможность сравнения расстояния для вывода о разнице NAD(P)H между сфероидальными группами.

Рисунок 5: Векторный анализ сфероидов HCT116, выполненный с использованием пластин с низким уровнем прикрепления: сравнение гликолитических и негликолитических ядер распределения NAD(P)H с помощью двухфотонного FLIM. Параметры захвата: интенсивность лазера: 15%, разрешение: 512 x 512 пикселей, например, 741 нм/эм. 411-491 нм. (A) Интенсивность флуоресценции и быстрые изображения FLIM отображают распределение NAD(P)H в сфероидах HCT116, отличая сфероиды с гликолитическим ядром (слева) от сфероидов без него (справа). Белый круг на быстром FLIM-изображении отображал более короткую область жизни, определяющую гликолитическое ядро. Начальная плотность посева: 50 клеток (слева) и 500 (справа), время инкубации: 6 дней, масштабная линейка: 50 мкм. (B) Методика измерения расстояния от центроида сфероидов HCT116 до свободной точки NAD(P)H на векторных графиках с использованием модуля LAS X FLIM и программного обеспечения FIJI для двух различных сфероидальных групп (D: расстояние). Для сфероидов HCT116 для векторного графика использовали вейвлет-фильтр и пороговое значение 10. (C) Диаграмма разницы в расстоянии от центроида до свободной точки NAD(P)H, сравнивающая группы гликолитических и негликолитических ядер (***P < 0,001). (D) Линейная подгонка центроидов векторных графиков из гликолитического ядра, негликолитических групп ядер и свободных теоретических координат NAD(P)H продемонстрировала точное линейное выравнивание с R² = 0,997, что позволило напрямую сравнить разницу расстояний между сфероидами гликолитического и негликолитического ядра. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Мультиплексный анализ аутофлуоресценции и гипоксии FAD в сфероидах стволовых клеток пульпы зуба человека (DPSC)
Сфероиды стволовых клеток пульпы зуба являются привлекательным экспериментальным инструментом для биопроизводства различных тканей, в том числе остеобластов 25,66,67. Однако их жизнеспособность и метаболизм изучены редко. Эти сфероиды, полученные из стволовых клеток, демонстрируют довольно малые размеры (<200 мкм), ярко-зеленую автофлуоресценцию от FAD/Flavins (позже названных FAD) (например, 460 нм, em. 550 нм) и наличие «прямых» и «инвертированных» гипоксических градиентов²⁹. На рисунке 6 представлены результаты комбинированной конфокальной ратиометрической визуализации оксигенации сфероидов (с_{помощью} О2-чувствительных наночастиц MMIR) и автофлуоресцентной FLIM FAD. «Классический» градиент прямого оксигенации наблюдался у сфероидов диаметром 69 мм, в то время как более крупный (141 мкм) сфероид показал «инвертированный» градиент. Добавление FAD-FLIM к этим измерениям помогает подтвердить различия в окислительном метаболизме, как показывают быстрые FLIM и векторные графики: малые сфероиды демонстрировали более заметную долю более длительного времени жизни FAD, что потенциально указывает на более высокую гликолитическую активность в сфероидах меньшего размера.

Рисунок 6: Пример многопараметрической визуализации автофлуоресценции флавина (например, 460 нм/эм. 510-590 нм) и оксигенации (анализ отношения интенсивностей с помощью чувствительных наночастиц MMIR O₂: например, 614 нм/эталонная эм. 631-690 нм / чувствительная эм. 724-800 нм) в сфероидах hDPSC различного размера (маленькие: 188 клеток/сфероид, большие: 820 клеток/сфероид), полученные методом высокопроизводительных агарозных микроформ собственного производства (конфокальный FLIM). (А, B) Репрезентативный пример отношения интенсивности оксигенации и визуализации времени жизни флавин-автофлуоресценции в больших (A, "B Sphs") и малых (B, "S Sphs") сфероидах hDPSC. (К,Г) Сравнительный анализ времени жизни флавин-автофлуоресценции с использованием анализа векторных графических облаков, основанного на сравнении геометрических центров векторных облаков. (E) Центроиды пикселей (геометрические центры) координат автофлуоресценции флавина от большого сфероида hDPSC (B Sphs) и малого сфероида hDPSC (S Sphs) на векторном графике. Для разных подходов к FLIM-анализу применены два разных цветовых кода, где цветовое кодирование с помощью τ показывает распределение среднего времени прихода фотонов (изображений FAST-FLIM), в то время как цветовое кодирование с помощью τ φ - тау-фазы соответствует фазорно-FLIM-анализу времени жизни флуоресценции в тех же сфероидах. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Мультиплексный анализ аутофлуоресценции FAD и клеточной гибели в сфероидах iPSC человека
Индуцированные плюрипотентными стволовыми клетками человека (ИПСК) сфероиды часто используются в качестве первого шага во время индукции тканеспецифической дифференцировки и производства органоидов, например, в случае культуры нейронных органоидов. В зависимости от обращения с ними и конкретного протокола генерации, жизнеспособность и последующая воспроизводимость органоидов могут серьезно пострадать. Неразрушающее исследование органоидов и сфероидов, содержащих нервные клетки-предшественники, имеет решающее значение для структурной оценки, мониторинга и прогнозирования качества растущих и собранных нервных тканей в процессе их развития ^68,69. На рисунке 7А показано, что неразрушающий FLIM автофлуоресцентных молекул флавина/FAD может дать нам информацию о жизнеспособности сфероидов iPSC. Визуализация проводилась через 4 дня после посева 9 000 iPSC в коммерческие скважины со сверхнизким прикреплением пластин (Corning). Перед визуализацией сфероиды окрашивали в течение 1 ч 0,5 мкг/мл йодида пропидиума (PI) для визуализации мертвых клеток. В этих сфероидах iPSC с плотностью посева 9000 клеток через 4 дня не наблюдалось некротических ядер. На соответствующем векторном графике автофлуоресценции флавина/FAD (Рисунок 7В слева) можно выделить три основные закономерности: картина автофлуоресценции среды (пурпурный цвет), картина (со средним значением τ φ - тау-фаза, ~2,6 нс), соответствующая областям без PI (ROI1) и картина (со средним τ φ ~3,1 нс) областей, коррелирующих с маркером клеточной смерти - окрашиванием (ROI2). Дополнительное сравнение обработанных и необработанных 2D-культур ИПК показало отсутствие влияния ПИ на появление длительных фазорных структур флавинов/FAD (рис. 7C), что указывает на то, что это увеличение времени жизни флавинов / FAD может быть независимым маркером нарушенной жизнеспособности ИПСК и их производных клеток. Несмотря на то, что это наблюдение согласуется с недавним отчетом о визуализации на основе интенсивности⁷⁰, мы не можем полностью исключить наличие интенсивности йодида пропидида в канале излучения FAD (506-582 нм). Необходимы дальнейшие исследования, чтобы доказать связь между изменениями флавина / FAD в течение жизни и потенциальными событиями гибели клеток. Простой многопараметрический векторный анализ областей ROI демонстрирует элегантный способ быстрого скрининга и анализа данных.

Рисунок 7: Флавин аутофлуоресцентное конфокальное окрашивание FLIM и йодидом пропидиума в сфероидах iPSC для оценки жизнеспособности клеток. (A) Автофлуоресценция флавина (слева) и йодид пропидиума - PI (справа) FLIM сфероида iPSC через 4 дня после посева 9000 клеток в планшет со сверхнизким уровнем прикрепления (Corning) и окрашивание PI (0,5 мкг/мл, 1 ч) до визуализации. (B) Векторный анализ автофлуоресцентных изображений флавина (слева) и йодида пропидия (справа) и соответствующих ROI (ROI1 - зеленый и ROI2 - красный, автофлуоресценция среды - пурпурный). ROI выбирали на основе наличия мечения йодидом пропидия. (C) fast-FLIM и векторный анализ автофлуоресценции флавинов в 2D-культуре iPSC, обработанных и не обработанных PI (0,5 мкг/мл, 1 ч). Не было обнаружено влияния окрашивания PI на внешний вид длительного времени жизни флуоресценции флавинов (соответствует векторному рисунку внутри розового круга) при сборе возбуждения флавинов в диапазоне 469-542 нм. Этот диапазон детектора не перекрывается со спектром возбуждения PI (550-720 нм). При сборе более широкого диапазона возбуждения для FAD (469-590 нм) можно заметить влияние PI. Цветовое кодирование изображения соответствует средним значениям времени прихода фотонов (fast-FLIM). Параметры визуализации: T = 35 °C, 25X/0,95 водно-иммерсионный объектив (A-B), 40X/1,25 глицериновый объектив (C). Flavins: ex. 460 nm, em. 506-582 нм (А-В), отверстие 4 а.е. PI: ex. 535 nm, em. 584-667 нм, точечное отверстие 1 а.е. Каналы: Интенсивность и Тау. Частота повторения 40 МГц для сбора полного затухания автофлуоресценции флавина. Настройки векторного анализа; Гармоника 1, порог 1 (А-В), 47 (С), Медианный фильтр 17 (А-В), 11 (С). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Дополнительный файл 1: Дополнительные протоколы по формированию сфероидов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 2: Данные FLIM гликолитического ядра и негликолитического ядра.lif. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 3: Данные FLIM гликолитического ядра.ptu. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 4: Данные FLIM негликолитического core.ptu. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 5: Гликолитическое ядро быстрое FLIM.tif Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный файл 6: Негликолитическое ядро быстрое FLIM.tif Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный файл 7: NAD(P)H без гликолитического ядра point.tif Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 8: Фазор гликолитического ядра plot.tif Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный файл 9: Негликолитический NAD(P)H point.tif Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный файл 10: Негликолитический вектор ядра plot.tif Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Discussion

Многоклеточные сфероиды становятся предпочтительным методом в изучении микроокружения опухолей и стволовых клеток, открытии лекарств и разработке «тканевых строительных блоков» для биопроизводства. Гетерогенная внутренняя архитектура, градиенты питательных веществ и оксигенации сфероидов могут имитировать таковые у тканей и опухолей in vivo в относительно упрощенных и доступных условиях. В связи с необходимостью большей методологической прозрачности^26,28 и стандартизации⁷¹, ожидается, что эти протоколы помогут исследователям выбрать наилучший метод формирования сфероидов для экспериментов по микроскопии с визуализацией времени жизни живой количественной флуоресценции. Представленные методы используют преимущества сенсоров наночастиц для окрашивания клеток и собственной клеточной автофлуоресценции, которые можно легко сочетать с окрашиванием клеточной смерти.

Наиболее важными этапами являются протокол формирования сфероидов; Таким образом, для высокопроизводительного метода на основе агарозы важно в достаточной степени сбалансировать агарозные формы для питательных сред. Недостаточное время уравновешивания приведет к разбавлению питательных веществ в оставшихся PBS и внесет дополнительные факторы на сфероидальную неоднородность 21,26,72,73. Свежеизготовленная агарозная форма также должна быть визуально проверена на наличие пузырьков воздуха, микротрещин и других дефектов.

Несмотря на свою эффективность для визуализации, суспензия наночастиц может проявлять самоагрегацию и вызывать образование сфероидов неправильной формы при методах формирования с низким уровнем прикрепления. Это часто можно смягчить путем добавления сыворотки в питательную среду или путем предварительного окрашивания монослойной клеточной культуры перед формированием сфероидов. Часто, во время компактизации сфероидов, добавление небольшого количества наночастиц (например, 10% от начальной концентрации окрашивания) также может способствовать окрашиванию зоны пролиферации сфероидов. Наконец, важно использовать «беспыльные» стерильные наконечники для пипеток при всех методах формирования.

Потенциальное влияние освещения на жизнеспособность клеток всегда должно учитываться во время экспериментов по визуализации. Таким образом, важно знать факторы риска, негативно влияющие на каждый эксперимент с визуализацией в реальном времени. В целом, фотоповреждение включает в себя несколько механизмов: (1) высокое локальное повышение температуры, (2) механическое напряжение и (3) фотохимическое напряжение (окислительная реакция и реакция свободных радикалов)⁷⁴. В зависимости от модальности визуализации (например, однофотонная конфокальная или многофотонная визуализация, режимы непрерывного и импульсного освещения, чувствительности детекторов и мощности источника света на различных длинах волн, если возможна настройка возбуждения), типа клетки и ткани (например, накопление эффективно поглощающих свет пигментов или других молекул автофлуоресценции, зависящее от типа ткани, 3D или 2D организация, рост и состав среды визуализации), происхождение флуоресцентного зонда (например, фотосенсибилизирующие свойства), различные комбинации факторов риска могут спровоцировать фототоксичность во время визуализации. Кроме того, даже если после освещения не наблюдается увеличения смертности клеток, зависящие от мощности света более ранние предсмертные воздействия на митохондрии и метаболизм потенциально могут помешать анализу^{и интерпретации} экспериментов.

Чтобы исключить фототоксическое воздействие на экспериментальные результаты, исследователь должен провести общий мониторинг жизнеспособности клеток и изменений в морфологии клеток по сравнению с интактным контролем или с использованием зондов клеточной гибели для оценки увеличения смертности клеток после освещения. Если метаболические эксперименты проводятся, то в пилотных экспериментах должна быть проведена соответствующая оптимизация параметров визуализации для оценки и минимизации влияния визуализации на измеряемые метаболические параметры. В случае кислород-чувствительных зондов передозировка света может быть легко отслежена по внезапному увеличению времени жизни и интенсивности фосфоресценции О2-чувствительного красителя (соответствующие изменения в соотношении интенсивности по отношению к_{О2-чувствительному} красителю) из-за так называемого эффекта «фотоиндуцированного потребления_О2»^53,75. Это можно легко сделать путем анализа кинетических кривых в покадровых экспериментах с различными параметрами мощности света с использованием, например, следующего опубликованного протокола²⁵. В «защиту» импульсного освещения (например, используемого в микроскопии TCSPC-F(P)LIM) недавние исследования показали его минимальное влияние на производство АФК и фотообесцвечивание зондов по сравнению с измерениями стационарного освещения^76,77, что указывает на дополнительное преимущество TCSPC-FLIM по сравнению с традиционным подходом к визуализации, основанным на интенсивности.

Основным ограничением представленных методов формирования сфероидов является прямое и долгосрочное применение в мониторинге. Для агарозных форм требуется объектив с большим рабочим расстоянием (или дополнительный вертикальный микроскоп или флуоресцентный стереомикроскоп) из-за толстого слоя агарозы, а материал 5D сфериplate может мешать измерениям в красных флуоресцентных каналах (зонд O₂ ). Размер сфероида, полученного методами с высокой пропускной способностью, ограничен диаметром микролунки и требует частой замены среды во избежание истощения и закисления среды. Учитывая все эти ограничения, мы рекомендуем 3D-чашки Петри (MicroTissue) для экспериментов, требующих высокой производительности (например, для приложений 3D-биопечати) и методов с низким уровнем прикрепления для базовых исследований со «средней пропускной способностью», а также для более низкого количества клеток.

Ратиометрический мониторинг оксигенации и обычные эксперименты на основе флуоресцентной микроскопии живых клеток доступны на широко доступных инвертированных микроскопах, если они оснащены камерой, чувствительной к ближнему инфракрасному диапазону (NIR), возбуждением на основе светоизлучающих диодов (LED) и соответствующим объективом²⁵. Для более подходящего оптического среза и FLIM рекомендуется использовать готовые коммерческие конфокальные микроскопы (такие как описанные здесь). Хотя мы также описываем метод детектирования автофлуоресценции NAD(P)H, требующий более дорогостоящего двухфотонного микроскопа FLIM, существует множество различных подходов, совместимых и полезных для конфокальных систем FLIM, идеально оснащенных лазером белого света и гибридными или SPAD детекторами. К ним относятся оценка клеточного метаболизма, биосенсорных белков FRET-FLIM, визуализация клеточной и тканевой механики, автофлуоресценция конкретных типов клеток и тканей, а также рецепторно-лекарственные взаимодействия, визуализируемые с помощью FLIM-FRET³¹.

Программное обеспечение для сбора и анализа FLIM, предоставленное поставщиком, может повлиять на успех эксперимента, поскольку не всегда возможно экспортировать IRF или изображения в формате, совместимом с последующим анализом из открытых источников. Постобработка является важной частью рабочего процесса анализа FLIM, и она до сих пор не является универсально стандартизированной или принятой. Аппроксимация кривой требует большего количества фотонов и большей вычислительной мощности по сравнению с векторным подходом. FLIMfit⁴⁵ (глобальная и попиксельная аппроксимация) и Flimview⁷⁸ относятся к числу открытых программ, используемых для анализа аппроксимации кривых, в то время как PAM⁷⁹, FLUTE⁶⁴ и AlliGator⁸⁰ используются для векторного анализа. FLIMJ⁴⁶ - это полезный плагин ImageJ, который работает с обоими подходами. В совокупности эти опции помогают улучшить процедуру постобработки и сделать ее более быстрой, универсальной и удобной для пользователя.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,05% Трипсин-ЭДТА	Gibco	25300-054	Также доступен от Sigma
10 мл серологических пипеток	VWR	612-3700	Аналогичные продукты также доступны от Sarstedt, Corning, VWR и других компаний
12 лунок клеточные культуральные планшеты, стерильные	Greiner bio-one	665-180	Аналогичные продукты также доступны от Sarstedt, Corning и других компаний.
Предметное стекло камеры на 12 лунок, съемное	Ibidi	81201	Также доступно от Grace Bio-Labs, ThermoFisher Scientific и других
Центрифужные пробирки 15 мл	Nerbe plus	02-502-3001	Аналогичные продукты также доступны от Sarstedt, Corning, VWR и других компаний
3D чашка Петри микроформы	Microtissue	Z764000-6EA
6 луночных планшетов для клеточных культур, стерильные	Greiner bio-one	657160	Аналогичные продукты также доступны от Sarstedt, Corning, VWR и других компаний
70% этанол	ChemLab	CL02.0537.5000
Biofloat	Sarstedt	83.3925.400	В продаже доступна 96-луночная пластина с покрытием для формирования сфероидов
Кальцеин Green-AM	Tebubio	AS-89201	Применение в разведении 1:1000
Программное обеспечение CellSens Dimension	Olympus	версия 3
Коллаген из плаценты человека, тип IV	Sigma	C5533	Для приготовления 0,07 мг/мл коллагена и 0,03 мг/мл покрытых поли-D-лизином микроскопических чашек
Confocal FLIM Микроскоп	Leica Microsystems	N/A	Stellaris 8 Falcon инвертированный микроскоп с лазером белого света, детекторы HyD X, камера управления климатом/T (OkoLab), объектив 25x/0,95 Вт D
(+)-глюкоза	Merck	8342	Приготовить 1 М стоковый раствор, 1:100 для приготовления среды визуализации (конечная концентрация 10 мМ)
Модифицированная среда Дульбекко Eagle's (DMEM), фенол красный, глюкозо-, пируват- и глутамин без фенола, глюкозы, пирувата и глутамина	Sigma-Aldrich	D5030-10X1L	Для приготовления среды визуализации
Фетальная сыворотка крупного рогатого скота ( FBS)	Gibco	10270-098	Также доступен от Sigma. Перед использованием необходимо обезвредить от нагрева.
HEPES (1M)	Gibco	15630-080	Разведение 1/100 для получения среды визуализации (конечная концентрация 10 мМ)
Клетки рака толстой кишки человека HCT116	ATCC
ImageJ	NIH	версия 1.54f
Leica Application Suite X (LAS X)	Leica Microsystems	версия 4.6.1.27508
L-глутамин	Gibco	25030	Также выпускается от Sigma. Применять в разведении 1:100.
Lipidure-CM5206	Amsbio	AMS.52000034GB1G
McCoy's 5A, требуется добавление 1 мМ пирувата натрия и 10 мМ HEPES	VWR	392-0420	Стандартная питательная среда для клеток HCT116
микроструктурированные 3D-печатные штампы PDMS	Н/Д	/Д	Предоставлено Центром микросистемных технологий, профессором д-ром Яном Ванфлетереном, Гентский университет
NaCl	Chemlab	CL00.1429.100
Камера Нойбауэра	Зонды Fisher Scientific	15980396
O2: MMIR1	N/A	N/A	Полную характеристику, валидацию и некоторые приложения можно найти по адресу: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2023.12.11.571110 v1
PBS	Fisher scientific	Gibco18912014	Растворите таблетку PBS в 500 мл дистиллированной воды.
Pen Strepline :P энициллин (10 000 ЕД/мл) / стрептомицин (10 000 ЕД; г/мл) 100x раствор	Gibco	15140-122	Также доступен от Sigma. Применять в разведении 1:100.
Поли-D-лизин	Sigma	P6407-5 мг	Для приготовления 0,07 мг/мл коллагена и 0,03 мг/мл поли-D-лизина покрытых микроскопических блюд
Пропидия йодид	Сигма-Олдрич	25535-16-4	Окрашивание клеточной смертью, используйте 1 & микро; г/мл при 1 ч инкубации
шприца PVDF шприц фильтр 0,22 & микро; m	Novolab	A35149	Аналогичные продукты также доступны от Sarstedt, Corning, VWR и других компаний
Пируват натрия (100 мМ)	Gibco	11360-070	Разведение 1/100 для приготовления среды визуализации (конечная концентрация 1мМ)
SphericalPlate 5D 24-луночный	Kugelmeiers	SP5D-24W
стерильный петридиш	Greiner bio-one	633181	Аналогичная продукция также доступна от Sarstedt, Corning, VWR и других компаний
Tissue culture flask (25 cm² )	VWR	734-2311	Аналогичная продукция также доступна от Sarstedt, Corning, VWR и других компаний
Колба для культуры тканей (75 см²)	VWR	734-2313	Аналогичная продукция также доступна от Sarstedt, Corning, VWR и других компаний
U-bottom 96-well plate	VWR	10062-900	Аналогичная продукция также доступна от Sarstedt, Corning, Greiner Bio-one и других компаний
Ultrapure Agarose	Invitrogen (Life Technologies)	16500-500	Другие типы агарозы, такие как Агароза с низкой температурой плавления (A-9414, Sigma), Агароза для повседневного использования (A-9539, Sigma)
Широкопольный флуоресцентный инвертированный микроскоп	Olympus	N/A	Инвертированный флуоресцентный микроскоп IX81, с моторизованным управлением по оси Z, CoolLED pE4000 (16 каналов, 365-770 нм), ORCA-Flash4.0LT (Hamamatsu) cMOS камера, стеклянная нагревательная пластина Okolab, программное обеспечение CellSens Dimension v.3 и воздушные объективы 4x/0.13 UPlanFLN и 40x/0.6 LUCPlanFLN. (Опционально, для визуализации с высоким разрешением) 60x/1.0 LUMPLFLN вода