Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Метод экстракции апопластов для повышения чистоты рекомбинантного белка растительного происхождения

3.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/66852

⸱

5 июля 2024 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Shandong Academy of Medical Sciences, Shandong First Medical University, 2State Key Laboratory of Plant Genomics, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, 3College of Veterinary Medicine, Shanxi Agricultural University, 4Beijing Life Science Academy

В этой статье

Краткое содержание

Очистка рекомбинантных белков из растительных систем обычно осложняется растительными белками. В данной работе представлен метод эффективного извлечения и очистки секретируемого рекомбинантного белка из апопласта Nicotiana benthamiana.

Аннотация

Растения являются недавно развивающейся эукариотической системой экспрессии, которая исследуется для производства терапевтических белков. Очистка растений от рекомбинантных белков является одним из наиболее важных этапов производственного процесса. Как правило, белки очищали от общего количества растворимых белков (TSP), и присутствие различных внутриклеточных белков и цитохромов создает проблемы для последующих этапов очистки белков. Более того, большинство терапевтических белков, таких как антигены и антитела, секретируются для получения надлежащего гликозилирования, а присутствие не полностью модифицированных белков приводит к несогласованным структурам антигенов или антител. В данной работе представлен более эффективный метод получения высокоочищенных рекомбинантных белков из апопластического пространства растений. Рекомбинантный зеленый флуоресцентный белок (GFP) секретируется в апопласт Nicotiana benthamiana , а затем экстрагируется методом инфильтрации-центрифугирования. GFP-His из экстрагированного апопласта затем очищается с помощью аффинной хроматографии никеля. В отличие от традиционных методов из TSP, при очистке от апопластов образуются высокоочищенные рекомбинантные белки. Это представляет собой важное технологическое усовершенствование для систем растениеводства.

Введение

В настоящее время изучаются различные рекомбинантные терапевтические белки растительного происхождения, включая антитела, вакцины, биоактивные белки, ферменты и малые полипептиды 1,2,3,4,5,6. Растения становятся все более используемой платформой для производства терапевтических белков благодаря их безопасности, низкой стоимости и способности быстро масштабировать производство 7,8. Экспрессия и модификация белка в растительных системах, наряду с очисткой белка, являются критическими факторами, определяющими производительность растительных биореакторов 9,10. Повышение продуктивности растений и получение целевых белков высокой чистоты являются основными задачами, стоящими перед производственными системами на растительной основе11,12.

Субклеточная локализация и модификация рекомбинантных белков зависит от специфического сигнального пептида, кодируемого на N-конце, который нацелен на белок до его конечного назначения в органелле во время экспрессии генов. Рекомбинантные белки предназначены для локализации в апопласте, эндоплазматическом ретикулуме (ЭР), хлоропласте, вакуоле или цитоплазме на основе их уникальных свойств13. В отношении антигенов и антител предпочтение отдается секретируемым белкам. Перед секрецией белки проходят через ER и Гольджи для правильного сворачивания и посттрансляционных модификаций 14,15,16.

После производства в растениях рекомбинантные белки должны быть очищены от растительных экстрактов. Как правило, белки очищаются от общих растворимых растительных экстрактов, которые содержат большое количество внутриклеточных белков, неправильно свернутых и немодифицированных продуктов, а также цитохромов17. Для удаления примесей растительные экстракты подвергаются обширному фракционированию, включающему рибулоз-1,5-бисфосфаткарбоксилазу/оксигеназу (RuBisCO)-специфическую аффинную хроматографию, осаждение фитатов, осаждение полиэтиленгликоля, а также регулировку температуры и pH18,19. Такие этапы удаления примесей трудоемки и могут ухудшить качество белка.

Компартмент растительной клетки за пределами плазматической мембраны определяется как апопласт, охватывающий клеточную стенку, межклеточные пространства и ксилему20. Водная фаза обычно называется апопластной промывочной жидкостью (AWF). AWF содержит молекулы, секретируемые клетками для регуляции многочисленных биологических процессов, таких как транспорт, метаболизм клеточной стенки и реакции на стресс21,22. В отличие от TSP, молекулярные составляющие AWF менее сложны. Экстракция рекомбинантных белков из AWF может предотвратить контаминацию внутриклеточными белками, неправильно свернутыми продуктами и цитоплазматическими остатками. Вкратце, экстракционный липид поступает в листья через устьица под отрицательным давлением, а AWF собирается путем щадящего центрифугирования23. В то время как выделение AWF широко используется для изучения биологического прогресса внутри apoplast 24,25,26,27, оно не использовалось в системах производства на растительной основе.

Повышение продуктивности растений и получение целевых белков высокой чистоты являются центральными задачами для систем растениеводства28. Как правило, белки очищают от общих растворимых растительных экстрактов, содержащих большое количество внутриклеточных белков, неправильно свернутых и немодифицированных продуктов, а также цитохромов29, которые требуют больших затрат на последующую очистку30. Использование методов экстракции белка AWF для экстракции экзогенных рекомбинантных белков, секретируемых в апопласт, позволяет эффективно улучшить гомогенность рекомбинантных белков и снизить затраты на очистку белков. В данной работе мы используем сигнальный пептид PR1a для обеспечения секреции экзогенного белка в апопластное пространство и представляем подробный метод очистки рекомбинантного белка из AWF N. benthamiana.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Подготовка растений N. benthamiana

  1. Поместите рассадные блоки в лоток, добавьте 1 л воды и замочите примерно на 2 часа до полного насыщения.
  2. Равномерно рассыпьте по рассадным блокам семена N. benthamiana дикого типа, накройте крышкой, и проращивайте в течение 1 недели. Выращивайте N. benthamiana в теплице с 18-часовым фотопериодом, 24 °C и относительной влажностью 45% и удобряйте каждые 2 недели.
  3. Как только семена прорастут, аккуратно извлеките саженец с помощью пинцета, стараясь не повредить его корни. Выкопайте в центре нового лотка небольшую ямку, поместите в нее саженец, а корни слегка присыпьте почвой. Накрываем крышкой и продолжаем расти.
  4. Выращивайте до тех пор, пока у рассады не появится три листочка, с закрытой крышкой. Снимите крышку, когда появится4-й настоящий лист.
  5. Дайте растениям продолжить рост еще две недели до агроинфильтрации.

2. Построение рекомбинантного GFP-HIS

  1. Провести оптимизацию кодонов N. benthamiana и синтез GFP и PR1a (MGFVLFSQLPSFLLVSTLLLFLVISHSCRAG) на основе последовательностей генов.
  2. Проведите двойное разложение вектора pCAMBIA1300 с использованием ферментов Xba I и Sac I (см. таблицу материалов).
  3. Выполнение амплификации PR1a с использованием восходящих праймеров (TTGGAGAGAGAACGGGGGACTCTAGAATGGGATT
    TGTTCTCTTTTC) и последующими праймерами (TCCTCG
    CCCTTGCTCACCATGTCGACCCCGGCACGGCAAGA
    GTGGG), амплификация GFP с использованием восходящих праймеров (CCCACTCTTGCCGTGCCGGGGGGGACATGGTGAG
    CAAGGGCGAGGA) и последующими праймерами (GGGGAAATTCGAGCTCAGTGGTGATGGTGGTG
    GTGAGATCTTCCGGACTTGT).
  4. Использование гомологичной рекомбинации, клонирования PR1a и GFP в вектор экспрессии растений pCAMBIA1300. После переноса в E. coli выберите отдельные клоны и отправьте их в компанию для секвенирования. Сравнение результатов секвенирования и правильной плазмиды представляет собой рекомбинантную плазмиду pCAMBIA1300-PR1a-GFP-His, обозначаемую как p35s-PR1a-GFP-His.

3. Производство GFP-His в N. benthamiana

  1. Добавьте 1 мкл плазмиды GFP в 50 мкл рецепторных клеток агробактерий GV3101, аккуратно перемешайте и добавьте в электродную чашку, снимите после поражения электрическим током на электрошокере.
  2. Распределите трансформированные Agrobacterium tumefaciens на твердой средней пластине LB, содержащей 50 мкг/мл канамицина (Kan) и 50 мкг/мл рифампицина (Rif). Инкубировать в перевернутом состоянии при 28 °C в течение 48 ч. Вектор pCAMBIA1300 устойчив к кану, а Agrobacterium устойчив к рифам; только правильная Агробактерия может расти на пластинах с каном и рифом. Моноклональные клоны представляли собой позитивные трансформанты, получившие название A. tumefaciens GV3101-p35s-PR1a-GFP-His (AtGPG).
  3. Используйте стерилизованную зубочистку, чтобы собрать нужное количество AtGPG и ввести его в 4 мл жидкого LB с Kan и Rif. Культивировать при 28 °C, 220-300 об/мин в течение 24 ч.
  4. Субкультурируют бактерии 1:50 в свежие LB (50 мкг/мл Kan, 10 мМ 2-(N-Morpholino) этансульфоновую кислоту (MES), 20 мкМ ацетосирингон (AS)) и инкубируют при 28 °C, 220-300 об/мин в течение 10-12 ч.
  5. Соберите бактерии центрифугированием при 1500 x g в течение 10 мин и повторно суспендируйте гранулу 1 мл MMA (10 мМ MgCl2, 10 мМ MES pH 5,6, 100 мкМ AS).
  6. Измерьте и отрегулируйте оптическую плотность (OD) AtGPG до OD600 = 0,8 с помощью MMA. Инкубируйте бактерии еще 2-4 часа при комнатной температуре. Наберите бактериальный раствор с помощью безыгольного шприца, слегка прижмите его к тыльной стороне листьев и дайте давление для проникновения раствора в листья. Впрыскивайте только средние 3-4 листа на одно растение.
  7. Продолжайте выращивать N. benthamiana в теплице за 3-4 дня до уборки листьев для извлечения белка.

4. Наблюдение за субклеточной локализацией GFP

  1. После 48 часов агроинфильтрации выберите плоский лист и с помощью дырокола диаметром 6 мм зажмите лезвие для пробивки.
  2. Капните 30% раствор сахарозы на предметное стекло, положите образец листа обратной стороной вверх и накройте покровным стеклом.
  3. Установите длину волны возбуждения на 488 нм и определите зеленую флуоресценцию на длине волны 490-550 нм после увеличения 400x. Сделайте первую фотографию после того, как слайд будет готов, а еще одну через 10 минут.

5. Извлечение GFP из растения

  1. Экстракция AWF
    1. Соберите неповрежденные свежие листья N. benthamiana, экспрессирующие рекомбинантный GFP, через 3 дня после агроинфильтрации. Обращайтесь с листом бережно и поддерживайте его целостность, чтобы избежать внутриклеточного оттока белка. Собранные листья используйте для следующего шага сразу, чтобы избежать деградации белка.
    2. Промойте листовую пластинку предварительно охлажденным ддН2О для удаления мусора.
    3. Взвесьте свежие листья и погрузите 20 г листьев (абаксиальной стороной вниз) в 100 мл предварительно охлажденного 100 мМ фосфатного буфера (PB 100 mM Na2, HPO4 и 100 мМ2PO4 были сконфигурированы отдельно и перемешаны в соотношении 2,2:1 pH 7,0) в стакан объемом 200 мл с широким горлышком. Накройте листья нейлоновой мелкоячеистой нитью 100 меш (см. Таблицу материалов) и пластиковой тарелкой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Предварительное охлаждение предотвращает расщепление белка. Объемы буфера можно регулировать в зависимости от экспериментального масштаба. Убедитесь, что все листья погружены в воду.
    4. Поместите стакан в вакуумный насос. Подайте вакуум 0,8 МПа на 1 мин, затем быстро восстановите до атмосферного давления.
    5. Извлеките листья из буфера и аккуратно промокните насухо впитывающей бумагой. Сверните листья, оберните сетчатой пряжей и поместите по 5 г листьев в каждую центрифугу объемом 50 мл. Чтобы собрать AWF, расположите свернутые листья кончиком вверх в трубках с сетчатой нитью, скрепленной колпачками трубок.
    6. Центрифуга при 4 °C, 500 x g в течение 5 минут. Удалите листья и соберите AWF на дно пробирки с помощью пипетки. Из каждой пробирки можно получить около 5 мл AWF.
      Примечание: Чтобы свести к минимуму интерференцию от внутриклеточных белков и извлечь максимальное количество белков AWF, экстракцию можно повторить 2-3 раза, но не более 3 раз.
  2. Экстракция общего растворимого белка
    1. 20 г листьев измельчить в мелкий порошок в жидком азоте. Добавьте экстракционный буфер (50 мМ Tris-HCl pH 7,4, 150 мМ NaCl, 10% глицерин, 1% Triton X-100, 0,034% β-меркаптоэтанол (см. Таблицу материалов)) в соотношении 1:2.
    2. Встряхните гомогенат в вертикальном миксере в течение 30 минут при температуре 4 °C. Центрифуга гомогенирует при давлении 13 000 x g в течение 15 мин при 4 °C.
    3. Перенесите надосадочную жидкость в новую пробирку и повторите центрифугирование в течение 15 минут. Переложите очищенную надосадочную жидкость в другую трубку.
    4. Отфильтруйте надосадочную жидкость через фильтр 0,22 мкм (см. Таблицу материалов) для получения общего растворимого белкового экстракта.

  

6. Очистка GFP-His с помощью никель(Ni)-аффинной хроматографии

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте все шаги при температуре 4 °C.

  1. Добавьте смолу Ni sepharose excel (см. Таблицу материалов) в пробирку в соотношении 1:1000 относительно объема экстракта белка из шага 5.1.6. Объем смолы равен 1/1000-йчасти объема белкового экстракта.
  2. Промойте никелевую смолу 3x с 10-кратным объемом смолы ddH,2O и PB (pH 7,0) отдельно по очереди и удалите надосадочную жидкость.
  3. Инкубируйте белковый экстракт со смолой Ni в течение 2 часов, чтобы обеспечить полное связывание. Центрифугируйте при 500 х г в течение 5 мин для удаления несвязанных белков в надосадочной жидкости. Постирайте 3 раза с 20-кратным объемом смолы PB. Центрифугируйте при давлении 500 х г в течение 5 минут и удалите надосадочную жидкость.
  4. Выведите GFP-His путем добавления 250 мМ имидазола в 10-кратном объеме смолы (50 мМ Tris-HCl pH 7,4, 150 мМ NaCl, 10% глицерина, 250 мМ имидазола) и соберите надосадочную жидкость.

7. Кумасси синий окрашивание белков

  1. Добавьте 10 μL загрузочного буфера 5x SDS к 40 μL образцов белка, кипятите в течение 10 минут, затем запустите на 15% SDS-PAGE при 110 В в течение 60 минут.
  2. Окрашивать протеиновые гели раствором синего Кумасси (0,1% R-250, 25% изопропанол, 10% ледяная уксусная кислота) в течение 2 ч.
  3. Слейте раствор и простирайте обесцвечивающим раствором в течение 2 ч. Понаблюдайте за гелем; Белки на геле будут окрашены в синий цвет.

8. Вестерн-блоттинг белков

  1. Добавьте 10 μL загрузочного буфера 5x SDS к 40 μL образцов белка, кипятите в течение 10 минут, затем запустите на 15% SDS-PAGE при 110 В в течение 60 минут.
  2. Перенос белков на мембрану из нитроцеллюлозы размером 0,45 мкм при давлении 280 мА. Закройте мембрану 5% обезжиренным молоком на 1 час.
  3. Разбавьте антитела против His-tag в дозе 1:5000 и инкубируйте мембрану с антителами в течение 1 ч. Используйте трис-буферный физиологический раствор и подросток 20 (TBST) для промывания мембраны 4 раза в течение 5 минут.
  4. Разведите антитела против мышей в соотношении 1:10000 и инкубируйте мембрану с антителами в течение 1 ч. Используйте TBST для промывки мембраны 4 раза в течение 5 минут.
  5. Смешайте проявитель (см. Таблицу материалов) в соотношении 1:1. Добавьте 400 μл в мембрану и дайте вступить в реакцию в течение 1 минуты. Делайте фотографии через 1 минуту выдержки с помощью документ-камеры.

9. Определение концентрации белка

  1. Добавьте 5 мкл белка в 1 мл красителя Bradford 1x и вступайте в реакцию в течение 5 минут.
  2. Определите значение OD595 после обнуления и рассчитайте концентрацию белка по стандартной кривой.

10. Количественное определение белка 31

  1. Проведите вестерн-блоттинг белковых проб вместе со стандартами.
  2. Выполняйте количественную оценку GFP по отношению к стандартам с помощью анализа оттенков серого ImageJ 1.5.0.

  

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

GFP-His предназначен для секреции в апопластическое пространство N. benthamiana
GFP клонировали в плазмиду pCAMBIA1300 с N-концевым сигнальным пептидом PR1a для секреции и C-концевой His-меткой для очистки, генерируя p35s-PR1a-GFP-His (рис. 1A). Рекомбинантный белок был временно экспрессирован в N. benthamiana, и полоса в 30 кДа была обнаружена с помощью вестерн-блоттинга с использованием антител против His через 3 дня после агроинфильтр...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Использование растений для производства терапевтических белков в последние годы быстро расширилось 1,2,3,4,5,6. Гены, кодирующие белки, клонируются в векторы экспрессии и доставляются в ткани растений с помощью агроинфильтрации. После производства растительными клетками белки очищаются для последующего применения. Как правило...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Эта работа поддерживается Ассоциацией содействия инновациям молодежи CAS (2021084) и Фондом поддержки ключевых проектов развертывания Трехлетнего плана действий Института микробиологии Китайской академии наук.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
100 меш нейлоновая мелкоячеистая пряжаGuangzhou Huayu Trading limited companyhy-230724-2Для экстракции белка AWF
50 мл центрифужные пробиркиVazymeTCF00150Для центрифуги
ClonExpress II одношаговый набор для клонированияVazymeC112-02Для клона
FastDigest Sac1NEBR3156SДля клона
FastDigest XbaINEBFD0685Для клонирования
ImageJ 1.5.0//Дляанализа оттенков серого
Большой фильтрThermo FisherNESTДля фильтрации Лазерная
сканирующая конфокальная микроскопияLeica SP8Для субклеточной локализации
Ni sepharose excelCytiva10339806Для очистки белка
Сборный белок плюс гельYEASEN36246ES10Для SDS-PAGE
Малый фильтрNalgene1660045Для фильтрации
SuperSignal West Femto Substrate Trial KitThermo Fisher34076Для вестерн-блоттинга
Triton X-100SCR30188928Для настройки буфера экстракции
типа ротариванг вакуумныйнасос Zhejiang taizhouqiujing vacuum pump limited company2XZ-2Для вакуумной инфильтрации
Вертикальный смесительHaimen Qilinbel Instrument Manufacturing ОООBE-1200Для смешивания
β-меркаптоэтанолаSIGMABCBK8223VДля настройки экстракционного буфера

Ссылки

  1. Zahmanova, G., et al. Green biologics: Harnessing the power of plants to produce pharmaceuticals. Int J Mol Sci. 24 (24), 1757(2023).
  2. PREVAIL II Writing Group. A randomized, controlled trial of ZMapp for Ebola virus infection. N Engl J Med. 375 (15), 1448-1456 (2016).
  3. Ma, J. K. C., et al. Regulatory approval and a first-in-human phase I clinical trial of a monoclonal antibody produced in transgenic tobacco plants. Plant Biotechnol J. 13 (8), 1106-1120 (2015).
  4. Shanmugaraj, B., Rattanapisit, K., Manopwisedjaroen, S., Thitithanyanont, A., Phoolcharoen, W. Monoclonal antibodies B38 and H4 produced in Nicotiana benthamiana neutralize SARS-CoV-2 in vitro. Front Plant Sci. 11, 589995(2020).
  5. Takeyama, N., Kiyono, H., Yuki, Y. Plant-based vaccines for animals and humans: Recent advances in technology and clinical trials. Ther Adv Vaccines. 3 (5-6), 139-154 (2015).
  6. Ward, B. J., Séguin, A., Couillard, J., Trépanier, S., Landry, N. Phase III: Randomized observer-blind trial to evaluate lot-to-lot consistency of a new plant-derived quadrivalent virus like particle influenza vaccine in adults 18-49 years of age. Vaccine. 39 (10), 1528-1533 (2021).
  7. Siriwattananon, K., et al. Plant-produced receptor-binding domain of SARS-CoV-2 elicits potent neutralizing responses in mice and non-human primates. Front Plant Sci. 12, 682953(2021).
  8. Leblanc, Z., Waterhouse, P., Bally, J. Plant-based vaccines: The way ahead. Viruses. 13 (1), 5(2020).
  9. Sethi, L., Kumari, K., Dey, N. Engineering of plants for efficient production of therapeutics. Mol Biotechnol. 63 (12), 1125-1137 (2021).
  10. Webster, D. E., Thomas, M. C. Post-translational modification of plant-made foreign proteins; glycosylation and beyond. Biotechnol Adv. 30 (2), 410-418 (2012).
  11. Streatfield, S. J. Approaches to achieve high-level heterologous protein production in plants. Plant Biotechnol J. 5 (1), 2-15 (2007).
  12. Nandi, S., et al. Process development and economic evaluation of recombinant human lactoferrin expressed in rice grain. Transgenic Res. 14 (3), 237-249 (2005).
  13. Ullrich, K. K., Hiss, M., Rensing, S. A. Means to optimize protein expression in transgenic plants. Curr Opin Biotechnol. 32, 61-67 (2015).
  14. Su, H., et al. Plant-made vaccines against viral diseases in humans and farm animals. Front Plant Sci. 14, 1170815(2023).
  15. Agrawal, G. K., Jwa, N. S., Lebrun, M. H., Job, D., Rakwal, R. Plant secretome: Unlocking secrets of the secreted proteins. Proteomics. 10 (4), 799-827 (2010).
  16. Kim, T., Gondré-Lewis, M. C., Arnaoutova, I., Loh, Y. P. Dense-core secretory granule biogenesis. Physiology. 21, 124-133 (2006).
  17. Menkhaus, T. J., Bai, Y., Zhang, C., Nikolov, Z. L., Glatz, C. E. Considerations for the recovery of recombinant proteins from plants. Biotechnol Prog. 20 (4), 1001-1014 (2004).
  18. Kim, S. T., Cho, K. S., Jang, Y. S., Kang, K. Y. Two-dimensional electrophoretic analysis of rice proteins by polyethylene glycol fractionation for protein arrays. Electrophoresis. 22 (10), 2103-2109 (2001).
  19. Xi, J., et al. Polyethylene glycol fractionation improved detection of low-abundant proteins by two-dimensional electrophoresis analysis of plant proteome. Phytochemistry. 67 (21), 2341-2348 (2006).
  20. Dani, V., Simon, W. J., Duranti, M., Croy, R. R. D. Changes in the tobacco leaf apoplast proteome in response to salt stress. Proteomics. 5 (3), 737-745 (2005).
  21. Delaunois, B., et al. Uncovering plant-pathogen crosstalk through apoplastic proteomic studies. Front Plant Sci. 5, 249(2014).
  22. Andreasson, E., Abreha, K. B., Resjö, S. Isolation of apoplast. Methods Mol. Biol. 1511, 233-240 (2017).
  23. Lohaus, G., Pennewiss, K., Sattelmacher, B., Hussmann, M., Hermann, M. K. Is the infiltration-centrifugation technique appropriate for the isolation of apoplastic fluid? A critical evaluation with different plant species. Physiol Plant. 111 (4), 457-465 (2001).
  24. Nouchi, I., et al. Overcoming the difficulties in collecting apoplastic fluid from rice leaves by the infiltration-centrifugation method. Plant Cell Physiol. 53 (9), 1659-1668 (2012).
  25. Rumyantseva, N. I., Valieva, A. I., Kostyukova, Y. A., Ageeva, M. V. The effect of leaf plasticity on the isolation of apoplastic fluid from leaves of tartary buckwheat plants grown in vivo and in vitro. Plants. 12 (23), 4048(2023).
  26. Ekanayake, G., Gohmann, R., Mackey, D. A method for quantitation of apoplast hydration in Arabidopsis leaves reveals water-soaking activity of effectors of Pseudomonas syringae during biotrophy. Sci Rep. 12 (1), 18363(2022).
  27. Preston, G. M., Fones, H. N., Mccraw, S., Rico, A., O'leary, B. M. The infiltration-centrifugation technique for extraction of apoplastic fluid from plant leaves using phaseolus vulgaris as an example. J Vis Exp. (94), e52113(2014).
  28. Nandi, S., et al. Process development and economic evaluation of recombinant human lactoferrin expressed in rice grain. Transgenic Res. 14 (3), 237-249 (2005).
  29. Menkhaus, T., et al. Considerations for the recovery of recombinant proteins from plants. Biotechnol Prog. 20 (4), 1001-1014 (2004).
  30. Streatfield, S. Approaches to achieve high-level heterologous protein production in plants. Plant Biotechnol J. 5 (1), 2-15 (2007).
  31. Yamamoto, T., et al. Improvement of the transient expression system for production of recombinant proteins in plants. Sci Rep. 8 (1), 4755(2018).
  32. Zhao, J., et al. Wheat Apoplast-localized lipid transfer protein TaLTP3 enhances defense responses against Puccinia triticina. Front Plant Sci. 12, 771806(2021).
  33. Venkataraman, S., et al. Recent advances in expression and purification strategies for plant made vaccines. Front Plant Sci. 14, 1273958(2023).
  34. Witzel, K., Shahzad, M., Matros, A., Mock, H. P., Mühling, K. H. Comparative evaluation of extraction methods for apoplastic proteins from maize leaves. Plant Meth. 7, 48(2011).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Очистка рекомбинантного белкасистема экспрессии в растенияхNicotiana benthamianaвакуумная инфильтрацияаффинная хроматографиязеленый флуоресцентный белокжидкость для промывки апопластасекреция белкавестерн-блоттинг
Метод экстракции апопластов для повышения чистоты рекомбинантного белка растительного происхождения
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.