Методическая статья

Забор, встраивание и культивирование ганглиев дорсальных корешков в многокамерных устройствах для изучения особенностей периферических нейронов

2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/66854

⸱

28 июня 2024 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Systems Engineering, University of Nebraska-Lincoln

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол обеспечивает методику сбора и культивирования эксплантированного ганглия дорсального корня (DRG) от взрослых крыс Sprague Dawley в многокамерном устройстве (MC).

Аннотация

Наиболее распространенным признаком боли со стороны периферических нейронов является пониженный порог стимуляции или гиперчувствительность терминальных нервов из ганглиев дорсального корешка (DRG). Одна из предполагаемых причин этой гиперчувствительности связана с взаимодействием между иммунными клетками в периферических тканях и нейронами. Модели in vitro предоставили фундаментальные знания о том, как эти механизмы приводят к гиперчувствительности ноцицепторов. Тем не менее, модели in vitro сталкиваются с проблемой переноса эффективности на человека. Для решения этой проблемы была разработана физиологически и анатомически значимая модель in vitro для культивирования интактных ганглиев дорсальных корешков (DRGs) в трех изолированных компартментах в 48-луночном планшете. Первичные DRG добываются у взрослых крыс Sprague Dawley после гуманной эвтаназии. Лишние нервные корешки обрезают, а ДРГ нарезают на соответствующие размеры для культивирования. Затем DRG выращиваются в натуральных гидрогелях, что обеспечивает устойчивый рост во всех областях. Эта многокомпонентная система предлагает анатомически значимую изоляцию тел клеток DRG от нейритов, физиологически значимых типов клеток и механических свойств для изучения взаимодействий между нервными и иммунными клетками. Таким образом, эта культуральная платформа предоставляет ценный инструмент для исследования стратегий изоляции лечения, что в конечном итоге приводит к улучшению подхода к скринингу для прогнозирования боли.

Введение

Хроническая боль является основной причиной инвалидности и потери работы во всем мире1. Хроническая боль затрагивает около 20% взрослого населения во всем мире и является значительным социальным и экономическим бременем2, при этом общие затраты в Соединенных Штатах оцениваются от 560 до 635 миллиардов долларов США в год3.

Основной периферической особенностью пациентов с хронической болью является пониженный порог стимуляции нервов, что приводит к тому, что нервная система становится более чувствительной к раздражителям 4,5. Пониженный порог стимуляции может привести к болезненной реакции на ранее безболезненный стимул (аллодиния) или усиленной реакции на болезненный стимул (гипералгезия)6. Современные методы лечения хронической боли имеют ограниченную эффективность, а методы лечения, которые успешно применяются на животных моделях, часто терпят неудачу в испытаниях на людях из-за механистических различийв проявлении боли. Модели in vitro, которые могут более точно имитировать механизмы периферической сенсибилизации, обладают потенциалом для увеличения трансляции новых терапевтических средств 8,9. Кроме того, моделируя ключевые аспекты сенсибилизированных нервов в культуральной системе, исследователи могут достичь более глубокого понимания механизмов, которые приводят к снижению пороговых значений, и определить новые терапевтические мишени,которые обращают их вспять.

Идеальные платформы in vitro или микрофизиологические системы должны включать физическое разделение дистальных нейритов и тела клеток ганглиев дорсальных корешков (DRG), трехмерную (3D) клеточную среду и наличие нативных поддерживающих клеток для точной имитации условий in vivo . Тем не менее, недавняя статья Caparaso et al.11 показывает, что современные платформы культуры DRG не имеют одной или нескольких из этих ключевых особенностей, что делает их недостаточными для репликации в условиях in vivo . Несмотря на то, что эти платформы просты в настройке, они не имитируют биологическую основу периферической сенсибилизации и, таким образом, могут не обеспечить эффективность in vivo . Чтобы устранить это ограничение, была разработана физиологически значимая модель in vitro для культивирования ганглиев дорсальных корешков (DRG) в гидрогелевой матрице с тремя изолированными компартментами, чтобы обеспечить временную флюидную изоляцию нейритов и тел клеток DRG11. Эта модель имеет как физиологическую, так и анатомическую значимость, что имеет потенциал для изучения периферической сенсибилизации нейронов in vitro.

Растущий интерес к использованию эксплантов DRG в 3D-культуре обусловлен их способностью способствовать устойчивому росту нейритов, что служит косвенным показателем жизнеспособности DRG12. В то время как первичные неонатальные или эмбриональные экспланты DRG преимущественно используются в современных платформах культивирования in vitro 13,14, использование эксплантов от взрослых грызунов обеспечивает лучшую модель физиологии зрелых нейронов, которая близко имитирует физиологию DRG человека по сравнению с эксплантами от неонатальных или эмбриональных грызунов15. Эксплантные DRG относятся к сохранению клеточной и молекулярной ткани нативной ткани DRG, в первую очередь путем поддержания нативных ненейрональных опорных клеток. В настоящем протоколе описана методика сбора и культивирования эксплантов DRG от взрослых крыс Sprague Dawley в многокамерном устройстве (МС) (рис. 1).

Была показана эффективность культивирования DRG из шейного, грудного и поясничного отделов позвоночника без наблюдаемых различий в росте нейритов. Для этого применения цель состояла в том, чтобы вызвать рост нейритов во внешних отсеках устройства; поэтому в этой статье не проводилась дискриминация по уровням DRG. Однако, если это необходимо для конкретного эксперимента, уровень DRG может быть адаптирован в соответствии с потребностями экспериментаторов. В настоящее время существуют другие компартментализированные модели культур для 3D-культуры DRG16, однако эти устройства не содержат сохраненных нативных ненейрональных опорных клеток, что может ограничивать трансляцию. Сохранение нативной структуры собранных DRG важно, поскольку это обеспечивает удержание ненейрональных поддерживающих клеток, взаимодействие которых с нейронами DRG имеет важное значение для поддержания функциональных свойств этих нейронов. В нескольких исследованиях совместно культивировали диссоциированные DRG с неродными нейрональными клетками, такими как шванновские клетки, для стимулирования миелинизации нейронов 17,18,19.

Протокол

Сбор DRG был проведен в соответствии с требованиями Институционального комитета по уходу за животными и их использованию (IACUC) в Университете Небраски-Линкольна. Для исследования использовались самки крыс Sprague Dawley в возрасте 12 недель (~250 г). Подробная информация о животных, реактивах и оборудовании, использованных в исследовании, приведена в Таблице материалов.

1. Изготовление и сборка многокамерного устройства

  1. Автоматизированное проектирование и 3D-печать многокамерного устройства
    ПРИМЕЧАНИЕ: Устройство MC состоит из трех отсеков для выделения тел клеток DRG и нейритов (рис. 2A). Устройство MC не имеется в продаже; тем не менее, файл STL предоставлен в настоящем документе (Дополнительный файл кодирования 1) для обеспечения 3D-печати. Печать МК занимает 1 (один) день.
  2. Загрузите файл STL MC на 3D-принтер Resin с помощью совместимого программного обеспечения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Материалом, идеально подходящим для печати, является высокотемпературная смола. Ключевым преимуществом использования высокотемпературной смолы является ее биосовместимость и ее можно автоклавировать и использовать повторно. Для печати устройства также можно использовать 3D-принтер с цифровой обработкой света (DLP) или другие 3D-принтеры.
  3. Переложите напечатанные устройства в моющий раствор на 30 минут в изопропаноле (>96%), чтобы удалить остатки смолы с поверхности напечатанного устройства МС.
  4. Последующее отверждение устройств при 80 °C в течение 120 минут с использованием имеющегося в продаже отвердителя (см. Таблицу материалов). Отвердитель улучшает механические свойства напечатанного устройства MC, подвергая его воздействию температуры и ультрафиолета.
  5. Термическое отверждение аппаратов MC в духовке при температуре 160 °C в течение 180 минут.
  6. Стерилизуйте устройства с помощью автоклава в течение 45 минут по гравитационному циклу.

2. Приготовление гидрогеля

  1. Синтезировать метакрилированную гиалуроновую кислоту (MAHA, 85%-115% метакрилация) и охарактеризовать с помощью протокола, описанного Seidlits et al.20.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для поддержки роста DRG обычно используются тройные гидрогели, состоящие из метакрилированной гиалуроновой кислоты, коллагена I типа и ламинина. Результаты показывают, что DRG обычно увеличиваются в MAHA в диапазоне от 1,25-2,5 мг/мл и коллагена от 2,0-4,5 мг/мл. Для ламинина обнаружено, что 0,75 мг/мл достаточно для обеспечения устойчивого роста DRG. Здесь подробно описаны методы создания тройного геля с 1,25 мг/мл MAHA, 4,5 мг/мл коллагена и 0,75 мг/мл ламинина. Приготовление гидрогеля следует проводить в ламинарном шкафу для обеспечения асептического рабочего пространства.

3. Приготовление раствора фотоинициатора

ПРИМЕЧАНИЕ: Фотоинициатор необходим для сшивания MAHA под воздействием ультрафиолетового излучения. Обычно используется в процентах от 0,3% до 0,6%.

  1. Приготовьте раствор фотоинициатора за 3 дня до сбора урожая DRG.
  2. Перед приготовлением раствора фотоинициатора предварительно нагрейте ультразвуковую водяную баню до 37 °C.
  3. Работая стерильным методом в проточном колпаке, приготовьте раствор бикарбоната натрия (NaHCO3) в дозе 23,125 мг/мл, растворив NaHCO3 в 5-кратном растворе модифицированной орлиной среды (DMEM)-HEPES от Dulbecco.
  4. В стеклянном флаконе смешайте 0,6% вес/объем (w/v) фотоинициатора с 20% об/об. 1x стерильного фосфат-буферного раствора (PBS) и 80% об./об. 5x раствора DMEM/HEPES.
  5. Для защиты от света оберните стеклянный флакон алюминиевой фольгой. Тем не менее, обязательно снимите алюминиевую фольгу перед тем, как поместить флакон на водяную баню для ультразвуковой обработки, нагретую до 37 °C с ультразвуком в течение 30-40 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор фотоинициатора должен быть защищен от света, так как он может распадаться на радикалы и запускать процесс полимеризации при воздействии света21.
  6. Стерильно отфильтровать раствор с помощью шприцевого фильтра 0,22 мкм в новый стерильный стеклянный флакон.

4. Растворение метакрилированной гиалуроновой кислоты

  1. Растворите метакрилированную гиалуроновую кислоту (приготовленную на шаге 2) в тот же день, когда готовится раствор фотоинициатора (шаг 3).
  2. Поместите замороженную лиофилизированную MAHA в эксикатор на 15 минут, чтобы она нагрелась до комнатной температуры.
  3. Работая в ламинарном проточном колпаке и используя метод стерильного взвешивания, взвесьте лиофилизированный МАХА в стеклянном флаконе.
  4. Добавьте в МАХА необходимый объем отфильтрованного фотоинициирующего раствора, чтобы прийти к нужной концентрации МАХА. Обычная конечная концентрация геля составляет 1,25 мг/мл MAHA и 4,5 мг/мл коллагена.
  5. Запечатайте крышку лабораторной герметизирующей пленкой, оберните стеклянный флакон алюминиевой фольгой и поместите его на орбитальную шейкер при комнатной температуре до полного растворения (обычно 3 суток). Время от времени используйте вихревой раствор для разрушения больших комков MAHA, чтобы обеспечить равномерное растворение MAHA.

5. Сборка устройства

  1. Поместите устройство MC в 48-луночный планшет за день до сбора урожая DRG.
  2. Нанесите тонкую линию силиконового геля в канавку под устройством MC (рисунок 2B) с помощью шприца объемом 3 мл. Это поможет устройству надежно закрепиться на пластине колодца.
  3. С помощью щипцов #3 аккуратно поместите устройство MC в лунку 48-луночного планшета, как показано на рисунке 2C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Размер устройства может быть изменен в соответствии с предполагаемым применением, а при желании можно использовать пластину другого размера. Устройства можно использовать повторно. Для повторного использования гидрогель необходимо аккуратно вымыть из всех туннелей, а загрузочный паз под устройством должен быть использован с 70% этанолом при бережном перемешивании. После этого устройства можно повторно стерилизовать в автоклаве для стерилизации перед использованием.

6. Подготовка животных

  1. Автоклавируйте все необходимые инструменты для вскрытия до начала сбора урожая.
  2. Приобретите взрослого самца или самку крысы Спрэг Доули в возрасте 12-20 недель. Пол крысы не влияет на рост DRG.
  3. Усыпить крысу в соответствии с утвержденным протоколом IACUC с использованием передозировки CO2 в качестве основного метода эвтаназии и двусторонней пункции пневмоторакса в качестве вторичного метода эвтаназии в соответствии с Рекомендациями Американской ветеринарной медицинской ассоциации22.
  4. Поместите крысу на стерильную пеленку на препарирующем столе брюшной стороной вниз. Сбрызните мех 70% этанолом.

7. Забор ганглиев дорсальных корешков (DRG)

  1. Приготовьте тримминговую среду, содержащую 86% нейробазала А, 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 1% пенициллин-стрептомицин (PS), 1% глутамина и 2% B27 плюс 50x, и перенесите в 24-луночный планшет. Этот фильтрующий материал и колодезная пластина будут использоваться для временного хранения собранных DRG перед их заделкой в гидрогель.
  2. Наденьте лабораторный халат, хирургическую маску, чепчик, защитные очки и перчатки.
  3. С помощью больших ножниц для тупого носа разрежьте кожу у основания шейного отдела позвоночника, а затем вниз по длине позвоночника.
  4. Чтобы еще больше отвести кровь от спинномозгового канала, разрежьте под лопатками и вниз через мышцу, чтобы разорвать крупные кровеносные сосуды.
  5. Используйте большие ножницы с острым носом, чтобы отрезать мышцу от позвоночника. Очистите как можно больше мышц, чтобы визуализировать позвоночник.
  6. Удалите спинной и боковой сегменты позвонков. С помощью прямого ронжера и ножниц с острым носом удалите остистые и поперечные отростки позвонков, начиная с шейного конца и двигаясь к поясничному концу.
  7. Удалите спинной мозг. С помощью небольших ножниц с острым носом аккуратно прорежьте нервные корешки, соединенные с DRG по обе стороны спинного мозга. Разрежьте шейный конец спинного мозга и осторожно поднимайте его из спинномозгового канала постепенно, разрезая все оставшиеся нервные корешки, соединенные с DRG.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мелкая моторика необходима для того, чтобы тело DRG не было разорвано в процессе.
  8. Чтобы обнажить DRG, используйте изогнутый Rongeur, чтобы удалить больше боковых частей позвонков. Потяните наружу от средней линии, чередуя стороны. Будьте осторожны, чтобы не разрезать тело DRG, так как это может привести к повреждению тел клеток и аксонов.
  9. С помощью щипцов #3 и пружинных ножниц с прямым краем удалите DRG между каждым уровнем позвонков. Захватите корешки спинномозгового нерва из ДРГ, осторожно вытащите их из кармана, а другой конец перережьте спинномозговой нерв. Будьте осторожны, чтобы не захватить корпус ДРГ напрямую.
  10. Поместите DRG в лунки 24-луночной пластины (содержащей обрезной материал, шаг 7.1) на льду.
  11. После сбора всех DRG очистите рабочее место, поместите тушу в автоклавный мешок и храните/утилизируйте ее надлежащим образом в соответствии с протоколом IACUC.

8. Обрезка и резка DRG

  1. Заполните чашку Петри диаметром 60 мм на чистом скамейке обрезным материалом (шаг 7.1). Установите эндоскоп для препарирования и стерилизатор стеклянных шариков и поместите автоклавный ящик для инструментов с инструментами для обрезки (щипцы #3 и пружинные ножницы с прямым краем) рядом с эндоскопом.
  2. Под эндоскопом для вскрытия удалите лишнюю ткань вокруг DRG и обрежьте нервные корешки, расположенные близко к телу DRG (обычно немного темнее, чем окружающие нервы).
  3. Заполните вторую чашку Петри на 60 мм свежей средой. Под областью рассекания обрежьте обрезанные ДРГ примерно до 0,5 мм (или от 0,5 мм до 0,8 мм). Во время резки под чашку Петри помещается линейка, чтобы иметь правильный расчетный размер разрезаемых DRG.
  4. Переложите вырезанные DRG в свежую 24-луночную пластину с носителем на льду.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обрезка, резка и встраивание DRG должны выполняться в шкафу с ламинарным потоком, чтобы обеспечить асептическое рабочее пространство. При отсутствии ламинарного шкафа необходимо соблюдать асептические методы, рекомендуя минимально подходящие средства индивидуальной защиты (СИЗ) (лабораторный халат, маски, очки и перчатки) и стерилизуя все инструменты на протяжении всего процесса для снижения потенциального загрязнения.

9. Нейтрализация коллагена

  1. Нейтрализуйте коллаген в тот же день, что и сбор урожая DRG, после обрезки и обрезки DRG.
  2. Работая на льду, нанесите в стеклянный флакон ~8,16% ультрачистой воды, ~1,84% 1 М гидроксида натрия (NaOH), ~10% 10x PBS и ~80% коллагена от общего объема раствора.
  3. Медленно перемешайте с помощью стерильного наконечника пипетки с низким уровнем удержания, чтобы добавить коллаген (обычно добавляемый последним) в смесь. Убедитесь, что наконечник пипетки находится в растворе во время смешивания, чтобы избежать образования пузырьков. Проверьте pH нейтрализованного коллагена с помощью pH-полосок, чтобы убедиться, что он составляет ~7.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Нейтрализованный коллаген можно держать на льду в течение 2-3 часов без гелеобразования; Таким образом, производство гидрогеля должно быть выполнено как можно скорее после нейтрализации коллагена.

10. Изготовление гидрогеля

  1. Работая на льду, пипетку ламинин (до конечной концентрации 0,75 мг/мл) и 1x PBS в стеклянный флакон.
  2. Используя стерильные наконечники пипеток с низким удержанием, пипетка нейтрализует коллаген и раствор MAHA в смесь для достижения желаемой концентрации.
  3. Медленно перемешиваем и проверяем pH полученного гидрогеля (должен быть ~7).

11. Встраивание DRG

  1. Выполнение встраивания в несколько отсеков.
    1. Пипетка 65,1 мкл и 52,8 мкл предварительно смешанного гидрогеля в компартменты сомы и нейрита, соответственно.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это предполагает использование устройств MC в 48-луночном планшете. Эти объемы можно изменять в зависимости от размера используемого устройства MC.
    2. Аккуратно вставьте вырезанные DRG в отсек сомы (Рисунок 2A), следя за тем, чтобы они не поцарапали дно пластины лунки. Поместите DRG посередине, чтобы невриты могли прорасти в соседние отсеки через туннели.
    3. Термическое сшивание гидрогеля в инкубаторе при температуре 37 °C в течение 30 мин. Пока это происходит, включите УФ-лампу для прогревания.
    4. После термической сшивки ультрафиолетовое сшивание гидрогеля в течение 90 с.
    5. Добавьте питательную среду DRG к гидрогелю и DRG и выполните полную смену среды через час, чтобы устранить непрореагировавшие или оставшиеся следы фотоинициатора, которые сохраняются в среде.
    6. Выполняйте половинную смену среды каждые 3 дня и следите за ростом ДРГ путем просмотра под микроскопом.
    7. Через ~4 недели, когда нейриты DRG начнут расти (Рисунок 3A), сделайте снимки с помощью флуоресцентного пластинчатого тепловизора и количественно определите длину нейритов с помощью FIJI (ImageJ).

12. Управление встраиванием DRG

  1. Пипетка 250 мкл гидрогеля в 48-луночном планшете (без МС).
  2. Аккуратно поместите отрезанный DRG в середину лунки и наполовину в гидрогель, следя за тем, чтобы он не поцарапал дно пластины лунки.
  3. Термическое сшивание гидрогеля в инкубаторе при температуре 37 °C в течение 30 мин.
  4. УФ-сшивание гидрогеля в течение 90 с.
  5. Добавьте питательную среду DRG к гидрогелю и DRG и выполните полную смену среды через час.
  6. Выполняйте половинную смену среды каждые 3 дня и следите за ростом DRG, рассматривая ее под микроскопом.
  7. Через ~4 недели, когда нейриты DRG начнут расти (Рисунок 3B), сделайте снимки с помощью флуоресцентного пластинчатого тепловизора.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для визуализации подойдет любой светлопольный микроскоп. Автоматизированный планшетный микроскоп ускоряет этот процесс. Контрольное встраивание в простые гели без прибора производится для сравнения роста нейритов DRG в многокамерных камерах. Как только пользователи убедятся, что DRG растут одинаково в MC и контрольных гелях, им, возможно, не придется повторять контрольные гели каждый раз.

13. Визуализация DRG

  1. Захватывайте светлопольные изображения с 4-кратным увеличением с помощью флуоресцентного тепловизора в диапазоне фокусных расстояний для визуализации всего устройства DRG и MC.
  2. Отрегулируйте яркость и контрастность изображения, чтобы было удобнее просматривать невриты.
  3. Сохраните изображение в виде файла .tiff.

14. Количественное определение нейритов DRG

  1. Загрузите и установите FIJI (ImageJ).
  2. Откройте ImageJ. Откройте файл изображения и убедитесь, что он монохромный.
  3. Увеличьте контраст так, чтобы были видны мельчайшие нейриты. Для этого откройте опцию яркости и контрастности с помощью сочетания клавиш Ctrl+Shift+C.
  4. Отрегулируйте ползунки контроллера по мере необходимости, чтобы визуализировать нейриты, и нажмите « Применить » для желаемой яркости и контрастности.
  5. Откройте трассировщик нейритов, открыв меню «Плагины », выбрав «Сегментация» и нажав на «Простой нейритовый трассировщик».
  6. Начните новую трассировку, щелкнув по одному концу нейрита прямо напротив корпуса DRG.
  7. Щелкните еще одну точку вдоль нейрита, чтобы добавить трассировку до тех пор, пока нейрит не будет прослежен встык. Нажмите на Finish Path после трассировки нейрита.
  8. Преобразуйте трассированную длину в реальные единицы измерения и сохраните результаты, скопировав и вставив их в Excel.
  9. Используйте инструмент «Прямая линия» в FIJI, чтобы нарисовать линию той же длины, что и масштабная линейка (не пропуская конец линии), и посмотрите на значение длины, видимое под панелью инструментов. Значение length используется для преобразования.
  10. Измерьте длину шести длинных нейритов, идущих с обеих сторон DRG (рисунок 3C, D), и рассчитайте среднюю длину этих нейритов, чтобы получить репрезентативную среднюю длину DRG, как показано на рисунке 4.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Иммуноокрашивание было протестировано на эксплантах DRG в простых гелях, чтобы показать наличие ненейрональных опорных клеток7. DRG фиксируют в 4% параформальдегиде (PFA) при комнатной температуре, трижды промывают 1x PBS в течение 15 минут и хранят в 1x PBS при 4 °C до иммуноокрашивания.
  11. Для эксплантов в устройствах MC извлеките устройство MC и выполните тот же процесс, который описан выше7.

Результаты

В настоящем протоколе описан метод сбора и культивирования DRG у взрослых крыс Sprague Dawley в многокамерном (MC) устройстве. Как показано на рисунке 1, DRG, собранный у взрослых крыс, был обрезан и разрезан на ~0,5 мм. Затем обрезанные и разрезанные DRG были помещены в гидрогель в области сомы устройства MC (рис. 2) и культивировались в течение 27 дней до количественного определения нейритов. DRG культивировали в простом геле в качестве контроля. Концентрация гидрогелевого состава, используемого для этого эксперимента, составляла 4,5/1,25 мг/мл коллагена: MAHA. На 27-й и 21-й сутки для многокамерных и простых гелей соответственно наблюдался устойчивый рост нейритов (рис. 3). Средняя длина нейритов в MC (894,22 мкм ± 308,75 мкм) была сопоставима с длиной нейритов в контрольных простых гелях (864,26 мкм ± 362,84 мкм) (рис. 4). Это демонстрирует способность устройства MC поддерживать культуру DRG и рост нейритов. Длины нейритов были количественно определены с помощью программного обеспечения ImageJ.

figure-results-1
Рисунок 1: Принципиальная схема, показывающая экспериментальную процедуру. (A) Забор ганглиев дорсальных корешков (DRG) у взрослых крыс Sprague Dawley. (Б) Обрезка и рубка заготовленных ДРГ. (C) Состав гидрогеля, встраивание DRG и культура в гидрогеле в MC, помещенном в 48-луночный планшет. (D) Рост нейритов DRG после 21-30 дней культивирования. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2: Напечатанный многокамерный с тремя изолированными отсеками может использоваться в 48-луночной пластине. (A) Репрезентативное изображение, показывающее вид сверху напечатанного устройства MC, показывает отсеки DRG и нейрита (красные линии) и область встраивания DRG (зеленые). (B) Вид MC сбоку. (C) Изображение MC, помещенное в 48-луночный планшет. Масштабная линейка = 10 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-3
Рисунок 3: Рост нейритов в многокамерном (MC) устройстве и контрольных простых гелях. (A) Репрезентативное изображение, показывающее прослеженный рост нейритов в многокамерном (МС) устройстве в светлом поле. (Ниже) Невриты, выросшие через тоннели МС, обозначены стрелками. (B) Изображение роста нейритов в контрольных простых гелях (без MC). (C) Репрезентативное изображение, показывающее нейритную трассировку двенадцати длинных нейритов в контрольных простых гелях (фиолетовые линии). Шесть длинных нейритов по обе стороны от DRG были количественно определены, чтобы получить среднюю длину нейритов. Изображения были получены с помощью флуоресцентного пластинчатого тепловизора с 4-кратным увеличением, а нейриты были количественно определены с помощью метода FIJI (ImageJ). Масштабные линейки = 1000 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-4
Рисунок 4: Длина нейрита в многокамерном корпусе (MC) по сравнению с длиной простого геля (PG). Точечная диаграмма, показывающая отдельные длины нейритов со средними и стандартными отклонениями, представленными полосами погрешностей. Средняя длина нейритов в MC составила 1204,40 μм ± 690,43 μм (среднее значение ± SD) по сравнению с 864,26 μм ± 362,84 μм (среднее значение ± SD) в простом геле, что указывает на рост невритов поддержки MC. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Файл дополнительного кодирования 1: STL-файл многокамерного устройства (MC), созданный с использованием программного обеспечения для автоматизированного проектирования. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Обсуждение

В этом протоколе описан метод сбора взрослых DRG Sprague Dawley и их культивирования в 3D-натуральных гидрогелях. В отличие от этого метода, другие подходы к забору DRG у мышей и крыс предполагают изоляцию позвоночного столба. Иссеченный позвоночный столб разрезается вдвое, а спинной мозг удаляется, чтобы обнажить DRG 23,24,25. Повреждение спинного мозга ограничивает кровоснабжение, что влияет на ДРГ и внутренние нейроны26. Это снижает активность ДРГ, делая хирургические подходы более целесообразными. Кроме того, был описан метод 3D-печати надежного устройства MC, которое позволяет создавать физиологически релевантную культуру DRG.

В этом протоколе описывается метод культивирования DRG in vitro, особое внимание уделяется изучению периферической сенсибилизации нейронов в анатомически и физиологически значимой модели. Этот метод культивирования позволяет установить физическое разделение дистальных нейритов и тела клетки DRG в 3D-среде. Устройство MC имитирует среду in vivo , поскольку эксплантации DRG с клетками сохраняются и могут быть совместно культивированы с нативными глиальными клетками. Эксплант DRG содержит ненативные нейрональные клетки, которые могут быть культивированы совместно с другими клетками для имитации физиологических условий. Эта физиологическая значимость способствует изучению того, как ненейрональные клетки регулируют активность нейритов, и помогает в понимании основных механизмов, участвующих в ноцицепции. Включение этих ненейрональных взаимодействий должно дать более точные прогнозы результатов клеточной сигнализации по сравнению с упрощенными моделями культур с диссоциированными DRG. Наличие двух нейритовых компартментов максимизирует физиологическую значимость, поскольку отдельные DRG иннервируют различные ткани in vivo. Такая конструкция позволяет обрабатывать один нейритовый отсек, в то время как другой служит в качестве контрольного. Контрольные и лечебные отсеки, подключенные к одной соме, могут быть использованы для изучения эффектов перекрестных компартментов, имитируя in vivo условия, когда нейриты выходят из одной сомы и испытывают различные стимулы по мере того, как они иннервируют различные ткани, обеспечивая понимание перекрестных взаимодействий между нейритами. Если между нейритами в соседних отсеках возникают перекрестные помехи, то необработанные ДРГ могут служить настоящим контролем.

Это устройство может быть использовано для изоляции лечения или для изучения взаимодействия между нейронами и DRG в контексте боли. Поскольку дистальные невриты можно селективно лечить отдельно от DRG soma и проксимальных нейритов, эта система может быть использована для периферического лечения, такого как таргетная терапия суставов, при которой непосредственно лечится терминальный конец периферических сенсорных нейронов.

Ключевым преимуществом устройства MC является проведение высокопроизводительных экспериментов на нескольких лунках одной и той же пластины, так как устройство MC предназначено для установки в 48-луночную пластину. Дополнительным преимуществом платформы in vitro является способность изменять жесткость гидрогеля в МК путем настройки концентраций коллагена и MAHA для имитации свойств различных тканевых микроокружений. Одним из потенциальных ограничений этого протокола является то, что флюидная изоляция между нейритом и компартментом DRG soma не является идеальной для культур продолжительностью более 72 ч без смены среды. Предыдущее исследование подтвердило, что изоляция жидкости сохраняется в отсеках до 72 ч без смены среды11. Предыдущие исследования показали, что увеличение концентрации гиалуроновой кислоты значительно увеличивает плотность сшивки коллагена, тем самым ограничивая диффузию макромолекул через гидрогелевую матрицу27. Таким образом, для улучшения жидкостной изоляции для культур после 72 ч концентрация MAHA может быть увеличена, как показано в исследовании Caparaso et al.7, где увеличение MAHA привело к улучшению жидкостной изоляции. Контрольное встраивание выполнено для обеспечения сопоставимого роста нейритов DRG в МЦ и простом геле. Это необходимо для того, чтобы MC не оказывал влияния на рост DRG. Не рекомендуется повторять контрольное встраивание в каждый эксперимент после того, как будет подтвержден рост DRG в MC.

Авторы признают, что человеческие DRG больше, содержат больше клеток и имеют различные пропорции подтипа нейронов по сравнению с крысиными DRG28. Использование DRG для грызунов является ограничением данного исследования с точки зрения трансляции в клинику; Тем не менее, эта система может быть ценной в качестве платформы для скрининга для выявления соединений, влияющих на возбудимость нейронов. Несмотря на различия в составе между DRG грызунов и человека, существует также большое перекрытие внутри протеома между DRG крысы и человека29. Это перекрытие в протеоме - и наличие одних и тех же подтипов нейронов - предполагает, что DRG крысы может быть использована для скрининга терапевтических препаратов на высоком уровне, и дальнейшие испытания могут быть проведены для того, чтобы выяснить, механически ли изменения в DRG крысы трансформируются в DRG человека.

Эта платформа позволяет проводить целенаправленную фармакологическую стимуляцию и исследование нейронов или клеточных тел с временным контролем. Изменения в возбудимости нейронов и передаче сигнала могут быть легко измерены с помощью манипулирования нейритами или DRG. Продемонстрирована возможность оценки возбудимости нейронов с помощью визуализации кальция в простых контрольных гидрогелях с эксплантами DRG7. Аналогичные методы могут быть использованы в устройстве MC для оценки возбудимости нейронов.

Этот метод может быть использован для изучения различных болевых состояний, в которых стимуляция периферических первичных сенсорных нейронов является движущим фактором, таких как боль в пояснице, связанная с диском. Скрининг гиперчувствительности ноцицепторов может быть многообещающим инструментом для открытия новых препаратов для снижения гипервозбудимости. Снижение гипервозбудимости может клинически привести к уменьшению боли. Эта платформа может проводить скрининг высокопроизводительных препаратов для выявления наиболее эффективных кандидатов для валидации in vivo с использованием анализа болевого поведения.

Раскрытие информации

Авторы данного исследования заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантом NSF (2152065) и премией NSF CAREER Award (1846857). Авторы хотели бы поблагодарить всех нынешних и бывших членов лаборатории Вакса за вклад в этот протокол. Диаграммы на рисунке 1 были сделаны в Biorender.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Щипцы #5Fine Science Tools11252-00Для обрезки и резки DRG
10x DMEMMilliporeSigmaD2429
1x PBS (автоклавный)Приготовлен в лаборатории7,3 - 7,5 pH
24 луночные пластиныVWR82050-892Для временного хранения собранных и нарезанных DRG
3 мл Шприц стерильный, одноразовыйBD309657
48-луночные пластиныGreiner Bio-One677180
60 мм чашка ПетриFisher ScientificFB0875713AДля удержания сред для обрезки и резки
Алюминиевая фольгаFisherbrand01-213-104
B27 Plus 50xThermoFisher17504044Для DRG среды
Коллаген тип IIbidi50205
Изогнутый чашка Friedman Pearson RongeurFine Science Tools16221-14Для вскрытия
Дюмон #3 щипцыFine Science Tools11293-00Для вскрытия
Фетальная бычья сыворотка (FBS)ThermoFisher16000044Для DRG media
Form cureForm Labsотвердитель
Form WashForm LabsДля смывания излишков смол с MC
Стерилизатор стеклянных шариковFisher ScientificNC9531961
Стеклянные флаконы (8 мл)DWK Life Sciences (Wheaton)224724
GlutaMaxThermoFisher35050-061Для медиа DRG
HEPES (1M)Millipore SigmaH0887
Высокотемпературная смола V2FormLabsFLHTAM02
гиалуроновой кислотой Натриевая сольMilliporeSigma53747Используется для изготовления MAHA
IrgacureMilliporeSigma410896
LamininR& D Systems344600501
Большие тупые ножницыMilitexEG5-26Для диссекции
Большие щипцы (зазубренные наконечники)Militex9538797Для диссекции
Большие остроносые ножницыFine Science Tools14010-15Для диссекции
Наконечники пипеток с низким удержанием FisherScientific02-707-017Для пипетирования коллагена и MAHA
Метакрилированная гиалуроновая кислота (MAHA)Получено в лабораторииN/A85 - 115 % метакрилационный
фактор роста нервов (NGF)R& D Systems556-NG-100Для DRG media
Neurobasal A MediaThermoFisher10888022Для DRG media
ParafilmBemisPM996
ParafilmBemisPM996
Penicillin/Streptomycin (PS)EMD Millipore516106для DRG media
тест-полоскиVWR InternationalBDH35309.606
Наконечники для пипеток (1000 &; L)США Scientific1111-2021
Преформа 3.23.1 программное обеспечениеFormslabДля загрузки файла STL
RatCharles River
Resin 3D-принтерForm LabsForm 3L 3Dпечать MC устройство
Маленькие остроносые ножницыFine Science Tools14094-11Для вскрытия
БикарбонатнатрияMilliporeSigmaS6014
Прямая чашка rongeurFine Science Tools16004-16Для диссекции
Пружинные ножницы с прямым краемFine Science Tools15024-10Для диссекции
Хирургическое лезвие шлепеля (No 10)Fisher Scientific22-079-690
Фильтры для шприцев, PES (0.22 µ m)Celltreat229747
Крошечные пружинные ножницыWorld Precision Instruments14003Для обрезки и резки DRG
UV лампаAnalytik Jena USДля фотосшивки гидрогеля (15 - 18 мВт/см2)
pH

Ссылки

  1. Vos, T., et al. Global, regional, and national incidence, prevalence, and years lived with disability for 310 diseases and injuries, 1990-2015: A systematic analysis for the global burden of disease study 2015. Lancet. 388 (10053), 1545-1602 (2016).
  2. Goldberg, D. S., Mcgee, S. J. Pain as a global public health priority. BMC Public Health. 11 (1), 770(2011).
  3. Gaskin, D. J., Richard, P. The economic costs of pain in the United States. J Pain. 13 (8), 715-724 (2012).
  4. Kim, Y. S., et al. Coupled activation of primary sensory neurons contributes to chronic pain. Neuron. 91 (5), 1085-1096 (2016).
  5. Im, H. J., et al. Alteration of sensory neurons and spinal response to an experimental osteoarthritis pain model. Arthritis Rheum. 62 (10), 2995-3005 (2010).
  6. Jensen, T. S., Finnerup, N. B. Allodynia and hyperalgesia in neuropathic pain: Clinical manifestations and mechanisms. Lancet Neurol. 13 (9), 924-935 (2014).
  7. Berge, O. G. Predictive validity of behavioral animal models for chronic pain. Br J Pharmacol. 164 (4), 1195-1206 (2011).
  8. Anderson, W. A., Willenberg, A. R., Bosak, A. J., Willenberg, B. J., Lambert, S. Use of a capillary alginate gel (capgel™) to study the three-dimensional development of sensory nerves reveals the formation of a rudimentary perineurium. J Neurosci Methods. 305, 46-53 (2018).
  9. Mohammed Izham, N. A., et al. Exploring the possibilities of using in vitro model for neuropathic pain studies. Neurosci Res Notes. 5, 144(2022).
  10. Park, S. E., et al. A three-dimensional in vitro model of the peripheral nervous system. NPG Asia Mater. 13 (1), 2(2021).
  11. Caparaso, S. M., Redwine, A. L., Wachs, R. A. Engineering a multi-compartment in vitro model for dorsal root ganglia phenotypic assessment. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 111 (11), 1903-1920 (2023).
  12. Krug, A. K., et al. Evaluation of a human neurite growth assay as specific screen for developmental neurotoxicants. Arch Toxicol. 87 (12), 2215-2231 (2013).
  13. F, M., et al. Extracellular matrix stiffness negatively affects axon elongation, growth cone area and F-actin levels in a collagen type I 3D culture. J Tissue Eng Regen Med. 16 (2), 151-162 (2021).
  14. Spearman, B. S., et al. Tunable methacrylated hyaluronic acid-based hydrogels as scaffolds for soft tissue engineering applications. J Biomed Mater Res A. 108 (2), 279-291 (2020).
  15. Zhu, W., Oxford, G. S. Differential gene expression of neonatal and adult DRG neurons correlates with the differential sensitization of TRPV1 responses to nerve growth factor. Neurosci Lett. 500 (3), 192-196 (2011).
  16. Van De Wijdeven, R., et al. Structuring a multi-nodal neural network in vitro within a novel design microfluidic chip. Biomed Microdevices. 20, 1-8 (2018).
  17. Chan, J. R., et al. NGF controls axonal receptivity to myelination by Schwann cells or oligodendrocytes. Neuron. 43 (2), 183-191 (2004).
  18. Ng, B. K., Chen, L., Mandemakers, W., Cosgaya, J. M., Chan, J. R. Anterograde transport and secretion of brain-derived neurotrophic factor along sensory axons promote Schwann cell myelination. J Neurosci. 27 (28), 7597-7603 (2007).
  19. Xiao, J., et al. BDNF exerts contrasting effects on peripheral myelination of NGF-dependent and BDNF-dependent drg neurons. J Neurosci. 29 (13), 4016-4022 (2009).
  20. Seidlits, S. K., et al. The effects of hyaluronic acid hydrogels with tunable mechanical properties on neural progenitor cell differentiation. Biomaterials. 31 (14), 3930-3940 (2010).
  21. Tomal, W., Ortyl, J. Water-soluble photoinitiators in biomedical applications. Polymers. 12 (5), 1073(2020).
  22. Leary, S., et al. Avma guidelines for the euthanasia of animals: 2013 edition. Veterinary Medical Association. , Schaumburg, Illinois. (2013).
  23. Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia. BMC Res Notes. 9 (1), 82(2016).
  24. Naveed, M., et al. Simple methods of dissection protocols for the rapid isolation of rat dorsal root ganglia under the non-microscopic condition. Neuroscience Research Notes. 6 (2), 212(2023).
  25. Perner, C., Sokol, C. L. Protocol for dissection and culture of murine dorsal root ganglia neurons to study neuropeptide release. STAR Protocols. 2 (1), 100333(2021).
  26. Bai, X., et al. A high-resolution anatomical rat atlas. J Anatomy. 209 (5), 707-708 (2006).
  27. Bian, L., et al. The influence of hyaluronic acid hydrogel crosslinking density and macromolecular diffusivity on human MSC chondrogenesis and hypertrophy. Biomaterials. 34 (2), 413-421 (2013).
  28. Haberberger, R. V., Barry, C., Dominguez, N., Matusica, D. Human dorsal root ganglia. Front Cell Neurosci. 13, 271(2019).
  29. Schwaid, A. G., Krasowka-Zoladek, A., Chi, A., Cornella-Taracido, I. Comparison of the rat and human dorsal root ganglion proteome. Scientific Rep. 8 (1), 13469(2018).

Перепечатки и разрешения

Теги

ImageJ
Забор, встраивание и культивирование ганглиев дорсальных корешков в многокамерных устройствах для изучения особенностей периферических нейронов
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.