Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Забор, встраивание и культивирование ганглиев дорсальных корешков в многокамерных устройствах для изучения особенностей периферических нейронов

2.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/66854

⸱

28 июня 2024 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Systems Engineering, University of Nebraska-Lincoln

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол обеспечивает методику сбора и культивирования эксплантированного ганглия дорсального корня (DRG) от взрослых крыс Sprague Dawley в многокамерном устройстве (MC).

Аннотация

Наиболее распространенным признаком боли со стороны периферических нейронов является пониженный порог стимуляции или гиперчувствительность терминальных нервов из ганглиев дорсального корешка (DRG). Одна из предполагаемых причин этой гиперчувствительности связана с взаимодействием между иммунными клетками в периферических тканях и нейронами. Модели in vitro предоставили фундаментальные знания о том, как эти механизмы приводят к гиперчувствительности ноцицепторов. Тем не менее, модели in vitro сталкиваются с проблемой переноса эффективности на человека. Для решения этой проблемы была разработана физиологически и анатомически значимая модель in vitro для культивирования интактных ганглиев дорсальных корешков (DRGs) в трех изолированных компартментах в 48-луночном планшете. Первичные DRG добываются у взрослых крыс Sprague Dawley после гуманной эвтаназии. Лишние нервные корешки обрезают, а ДРГ нарезают на соответствующие размеры для культивирования. Затем DRG выращиваются в натуральных гидрогелях, что обеспечивает устойчивый рост во всех областях. Эта многокомпонентная система предлагает анатомически значимую изоляцию тел клеток DRG от нейритов, физиологически значимых типов клеток и механических свойств для изучения взаимодействий между нервными и иммунными клетками. Таким образом, эта культуральная платформа предоставляет ценный инструмент для исследования стратегий изоляции лечения, что в конечном итоге приводит к улучшению подхода к скринингу для прогнозирования боли.

Введение

Хроническая боль является основной причиной инвалидности и потери работы во всем мире1. Хроническая боль затрагивает около 20% взрослого населения во всем мире и является значительным социальным и экономическим бременем2, при этом общие затраты в Соединенных Штатах оцениваются от 560 до 635 миллиардов долларов США в год3.

Основной периферической особенностью пациентов с хронической болью является пониженный порог стимуляции нервов, что приводит к тому, что нервная система становится более чувствительной к раздражителям 4,5. Пониженный порог стимуляции может привести к болезненной реакции на ранее безболезненный стимул (аллодиния) или усиленной реакции на болезненный стимул (гипералгезия)6. Современные методы лечения хронической боли имеют ограниченную эффективность, а методы лечения, которые успешно применяются на животных моделях, часто терпят неудачу в испытаниях на людях из-за механистических различийв проявлении боли. Модели in vitro, которые могут более точно имитировать механизмы периферической сенсибилизации, обладают потенциалом для увеличения трансляции новых терапевтических средств 8,9. Кроме того, моделируя ключевые аспекты сенсибилизированных нервов в культуральной системе, исследователи могут достичь более глубокого понимания механизмов, которые приводят к снижению пороговых значений, и определить новые терапевтические мишени,которые обращают их вспять.

Идеальные платформы in vitro или микрофизиологические системы должны включать физическое разделение дистальных нейритов и тела клеток ганглиев дорсальных корешков (DRG), трехмерную (3D) клеточную среду и наличие нативных поддерживающих клеток для точной имитации условий in vivo . Тем не менее, недавняя статья Caparaso et al.11 показывает, что современные платформы культуры DRG не имеют одной или нескольких из этих ключевых особенностей, что делает их недостаточными для репликации в условиях in vivo . Несмотря на то, что эти платформы просты в настройке, они не имитируют биологическую основу периферической сенсибилизации и, таким образом, могут не обеспечить эффективность in vivo . Чтобы устранить это ограничение, была разработана физиологически значимая модель in vitro для культивирования ганглиев дорсальных корешков (DRG) в гидрогелевой матрице с тремя изолированными компартментами, чтобы обеспечить временную флюидную изоляцию нейритов и тел клеток DRG11. Эта модель имеет как физиологическую, так и анатомическую значимость, что имеет потенциал для изучения периферической сенсибилизации нейронов in vitro.

Растущий интерес к использованию эксплантов DRG в 3D-культуре обусловлен их способностью способствовать устойчивому росту нейритов, что служит косвенным показателем жизнеспособности DRG12. В то время как первичные неонатальные или эмбриональные экспланты DRG преимущественно используются в современных платформах культивирования in vitro 13,14, использование эксплантов от взрослых грызунов обеспечивает лучшую модель физиологии зрелых нейронов, которая близко имитирует физиологию DRG человека по сравнению с эксплантами от неонатальных или эмбриональных грызунов15. Эксплантные DRG относятся к сохранению клеточной и молекулярной ткани нативной ткани DRG, в первую очередь путем поддержания нативных ненейрональных опорных клеток. В настоящем протоколе описана методика сбора и культивирования эксплантов DRG от взрослых крыс Sprague Dawley в многокамерном устройстве (МС) (рис. 1).

Была показана эффективность культивирования DRG из шейного, грудного и поясничного отделов позвоночника без наблюдаемых различий в росте нейритов. Для этого применения цель состояла в том, чтобы вызвать рост нейритов во внешних отсеках устройства; поэтому в этой статье не проводилась дискриминация по уровням DRG. Однако, если это необходимо для конкретного эксперимента, уровень DRG может быть адаптирован в соответствии с потребностями экспериментаторов. В настоящее время существуют другие компартментализированные модели культур для 3D-культуры DRG16, однако эти устройства не содержат сохраненных нативных ненейрональных опорных клеток, что может ограничивать трансляцию. Сохранение нативной структуры собранных DRG важно, поскольку это обеспечивает удержание ненейрональных поддерживающих клеток, взаимодействие которых с нейронами DRG имеет важное значение для поддержания функциональных свойств этих нейронов. В нескольких исследованиях совместно культивировали диссоциированные DRG с неродными нейрональными клетками, такими как шванновские клетки, для стимулирования миелинизации нейронов 17,18,19.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Сбор DRG был проведен в соответствии с требованиями Институционального комитета по уходу за животными и их использованию (IACUC) в Университете Небраски-Линкольна. Для исследования использовались самки крыс Sprague Dawley в возрасте 12 недель (~250 г). Подробная информация о животных, реактивах и оборудовании, использованных в исследовании, приведена в Таблице материалов.

1. Изготовление и сборка многокамерного устройства

  1. Автоматизированное проектирование и 3D-печать многокамерного устройства
    ПРИМЕЧАНИЕ: Устройство MC состоит из трех отсеков для выделения тел клеток DRG и нейритов (рис. 2A). Устройство MC не имеется в продаже; тем не менее, файл STL предоставлен в настоящем документе (Дополнительный файл кодирования 1) для обеспечения 3D-печати. Печать МК занимает 1 (один) день.
  2. Загрузите файл STL MC на 3D-принтер Resin с помощью совместимого программного обеспечения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Материалом, идеально подходящим для печати, является высокотемпературная смола. Ключевым преимуществом использования высокотемпературной смолы является ее биосовместимость и ее можно автоклавировать и использовать повторно. Для печати устройства также можно использовать 3D-принтер с цифровой обработкой света (DLP) или другие 3D-принтеры.
  3. Переложите напечатанные устройства в моющий раствор на 30 минут в изопропаноле (>96%), чтобы удалить остатки смолы с поверхности напечатанного устройства МС.
  4. Последующее отверждение устройств при 80 °C в течение 120 минут с использованием имеющегося в продаже отвердителя (см. Таблицу материалов). Отвердитель улучшает механические свойства напечатанного устройства MC, подвергая его воздействию температуры и ультрафиолета.
  5. Термическое отверждение аппаратов MC в духовке при температуре 160 °C в течение 180 минут.
  6. Стерилизуйте устройства с помощью автоклава в течение 45 минут по гравитационному циклу.

2. Приготовление гидрогеля

  1. Синтезировать метакрилированную гиалуроновую кислоту (MAHA, 85%-115% метакрилация) и охарактеризовать с помощью протокола, описанного Seidlits et al.20.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для поддержки роста DRG обычно используются тройные гидрогели, состоящие из метакрилированной гиалуроновой кислоты, коллагена I типа и ламинина. Результаты показывают, что DRG обычно увеличиваются в MAHA в диапазоне от 1,25-2,5 мг/мл и коллагена от 2,0-4,5 мг/мл. Для ламинина обнаружено, что 0,75 мг/мл достаточно для обеспечения устойчивого роста DRG. Здесь подробно описаны методы создания тройного геля с 1,25 мг/мл MAHA, 4,5 мг/мл коллагена и 0,75 мг/мл ламинина. Приготовление гидрогеля следует проводить в ламинарном шкафу для обеспечения асептического рабочего пространства.

3. Приготовление раствора фотоинициатора

ПРИМЕЧАНИЕ: Фотоинициатор необходим для сшивания MAHA под воздействием ультрафиолетового излучения. Обычно используется в процентах от 0,3% до 0,6%.

  1. Приготовьте раствор фотоинициатора за 3 дня до сбора урожая DRG.
  2. Перед приготовлением раствора фотоинициатора предварительно нагрейте ультразвуковую водяную баню до 37 °C.
  3. Работая стерильным методом в проточном колпаке, приготовьте раствор бикарбоната натрия (NaHCO3) в дозе 23,125 мг/мл, растворив NaHCO3 в 5-кратном растворе модифицированной орлиной среды (DMEM)-HEPES от Dulbecco.
  4. В стеклянном флаконе смешайте 0,6% вес/объем (w/v) фотоинициатора с 20% об/об. 1x стерильного фосфат-буферного раствора (PBS) и 80% об./об. 5x раствора DMEM/HEPES.
  5. Для защиты от света оберните стеклянный флакон алюминиевой фольгой. Тем не менее, обязательно снимите алюминиевую фольгу перед тем, как поместить флакон на водяную баню для ультразвуковой обработки, нагретую до 37 °C с ультразвуком в течение 30-40 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор фотоинициатора должен быть защищен от света, так как он может распадаться на радикалы и запускать процесс полимеризации при воздействии света21.
  6. Стерильно отфильтровать раствор с помощью шприцевого фильтра 0,22 мкм в новый стерильный стеклянный флакон.

4. Растворение метакрилированной гиалуроновой кислоты

  1. Растворите метакрилированную гиалуроновую кислоту (приготовленную на шаге 2) в тот же день, когда готовится раствор фотоинициатора (шаг 3).
  2. Поместите замороженную лиофилизированную MAHA в эксикатор на 15 минут, чтобы она нагрелась до комнатной температуры.
  3. Работая в ламинарном проточном колпаке и используя метод стерильного взвешивания, взвесьте лиофилизированный МАХА в стеклянном флаконе.
  4. Добавьте в МАХА необходимый объем отфильтрованного фотоинициирующего раствора, чтобы прийти к нужной концентрации МАХА. Обычная конечная концентрация геля составляет 1,25 мг/мл MAHA и 4,5 мг/мл коллагена.
  5. Запечатайте крышку лабораторной герметизирующей пленкой, оберните стеклянный флакон алюминиевой фольгой и поместите его на орбитальную шейкер при комнатной температуре до полного растворения (обычно 3 суток). Время от времени используйте вихревой раствор для разрушения больших комков MAHA, чтобы обеспечить равномерное растворение MAHA.

5. Сборка устройства

  1. Поместите устройство MC в 48-луночный планшет за день до сбора урожая DRG.
  2. Нанесите тонкую линию силиконового геля в канавку под устройством MC (рисунок 2B) с помощью шприца объемом 3 мл. Это поможет устройству надежно закрепиться на пластине колодца.
  3. С помощью щипцов #3 аккуратно поместите устройство MC в лунку 48-луночного планшета, как показано на рисунке 2C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Размер устройства может быть изменен в соответствии с предполагаемым применением, а при желании можно использовать пластину другого размера. Устройства можно использовать повторно. Для повторного использования гидрогель необходимо аккуратно вымыть из всех туннелей, а загрузочный паз под устройством должен быть использован с 70% этанолом при бережном перемешивании. После этого устройства можно повторно стерилизовать в автоклаве для стерилизации перед использованием.

6. Подготовка животных

  1. Автоклавируйте все необходимые инструменты для вскрытия до начала сбора урожая.
  2. Приобретите взрослого самца или самку крысы Спрэг Доули в возрасте 12-20 недель. Пол крысы не влияет на рост DRG.
  3. Усыпить крысу в соответствии с утвержденным протоколом IACUC с использованием передозировки CO2 в качестве основного метода эвтаназии и двусторонней пункции пневмоторакса в качестве вторичного метода эвтаназии в соответствии с Рекомендациями Американской ветеринарной медицинской ассоциации22.
  4. Поместите крысу на стерильную пеленку на препарирующем столе брюшной стороной вниз. Сбрызните мех 70% этанолом.

7. Забор ганглиев дорсальных корешков (DRG)

  1. Приготовьте тримминговую среду, содержащую 86% нейробазала А, 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 1% пенициллин-стрептомицин (PS), 1% глутамина и 2% B27 плюс 50x, и перенесите в 24-луночный планшет. Этот фильтрующий материал и колодезная пластина будут использоваться для временного хранения собранных DRG перед их заделкой в гидрогель.
  2. Наденьте лабораторный халат, хирургическую маску, чепчик, защитные очки и перчатки.
  3. С помощью больших ножниц для тупого носа разрежьте кожу у основания шейного отдела позвоночника, а затем вниз по длине позвоночника.
  4. Чтобы еще больше отвести кровь от спинномозгового канала, разрежьте под лопатками и вниз через мышцу, чтобы разорвать крупные кровеносные сосуды.
  5. Используйте большие ножницы с острым носом, чтобы отрезать мышцу от позвоночника. Очистите как можно больше мышц, чтобы визуализировать позвоночник.
  6. Удалите спинной и боковой сегменты позвонков. С помощью прямого ронжера и ножниц с острым носом удалите остистые и поперечные отростки позвонков, начиная с шейного конца и двигаясь к поясничному концу.
  7. Удалите спинной мозг. С помощью небольших ножниц с острым носом аккуратно прорежьте нервные корешки, соединенные с DRG по обе стороны спинного мозга. Разрежьте шейный конец спинного мозга и осторожно поднимайте его из спинномозгового канала постепенно, разрезая все оставшиеся нервные корешки, соединенные с DRG.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мелкая моторика необходима для того, чтобы тело DRG не было разорвано в процессе.
  8. Чтобы обнажить DRG, используйте изогнутый Rongeur, чтобы удалить больше боковых частей позвонков. Потяните наружу от средней линии, чередуя стороны. Будьте осторожны, чтобы не разрезать тело DRG, так как это может привести к повреждению тел клеток и аксонов.
  9. С помощью щипцов #3 и пружинных ножниц с прямым краем удалите DRG между каждым уровнем позвонков. Захватите корешки спинномозгового нерва из ДРГ, осторожно вытащите их из кармана, а другой конец перережьте спинномозговой нерв. Будьте осторожны, чтобы не захватить корпус ДРГ напрямую.
  10. Поместите DRG в лунки 24-луночной пластины (содержащей обрезной материал, шаг 7.1) на льду.
  11. После сбора всех DRG очистите рабочее место, поместите тушу в автоклавный мешок и храните/утилизируйте ее надлежащим образом в соответствии с протоколом IACUC.

8. Обрезка и резка DRG

  1. Заполните чашку Петри диаметром 60 мм на чистом скамейке обрезным материалом (шаг 7.1). Установите эндоскоп для препарирования и стерилизатор стеклянных шариков и поместите автоклавный ящик для инструментов с инструментами для обрезки (щипцы #3 и пружинные ножницы с прямым краем) рядом с эндоскопом.
  2. Под эндоскопом для вскрытия удалите лишнюю ткань вокруг DRG и обрежьте нервные корешки, расположенные близко к телу DRG (обычно немного темнее, чем окружающие нервы).
  3. Заполните вторую чашку Петри на 60 мм свежей средой. Под областью рассекания обрежьте обрезанные ДРГ примерно до 0,5 мм (или от 0,5 мм до 0,8 мм). Во время резки под чашку Петри помещается линейка, чтобы иметь правильный расчетный размер разрезаемых DRG.
  4. Переложите вырезанные DRG в свежую 24-луночную пластину с носителем на льду.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обрезка, резка и встраивание DRG должны выполняться в шкафу с ламинарным потоком, чтобы обеспечить асептическое рабочее пространство. При отсутствии ламинарного шкафа необходимо соблюдать асептические методы, рекомендуя минимально подходящие средства индивидуальной защиты (СИЗ) (лабораторный халат, маски, очки и перчатки) и стерилизуя все инструменты на протяжении всего процесса для снижения потенциального загрязнения.

9. Нейтрализация коллагена

  1. Нейтрализуйте коллаген в тот же день, что и сбор урожая DRG, после обрезки и обрезки DRG.
  2. Работая на льду, нанесите в стеклянный флакон ~8,16% ультрачистой воды, ~1,84% 1 М гидроксида натрия (NaOH), ~10% 10x PBS и ~80% коллагена от общего объема раствора.
  3. Медленно перемешайте с помощью стерильного наконечника пипетки с низким уровнем удержания, чтобы добавить коллаген (обычно добавляемый последним) в смесь. Убедитесь, что наконечник пипетки находится в растворе во время смешивания, чтобы избежать образования пузырьков. Проверьте pH нейтрализованного коллагена с помощью pH-полосок, чтобы убедиться, что он составляет ~7.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Нейтрализованный коллаген можно держать на льду в течение 2-3 часов без гелеобразования; Таким образом, производство гидрогеля должно быть выполнено как можно скорее после нейтрализации коллагена.

10. Изготовление гидрогеля

  1. Работая на льду, пипетку ламинин (до конечной концентрации 0,75 мг/мл) и 1x PBS в стеклянный флакон.
  2. Используя стерильные наконечники пипеток с низким удержанием, пипетка нейтрализует коллаген и раствор MAHA в смесь для достижения желаемой концентрации.
  3. Медленно перемешиваем и проверяем pH полученного гидрогеля (должен быть ~7).

11. Встраивание DRG

  1. Выполнение встраивания в несколько отсеков.
    1. Пипетка 65,1 мкл и 52,8 мкл предварительно смешанного гидрогеля в компартменты сомы и нейрита, соответственно.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это предполагает использование устройств MC в 48-луночном планшете. Эти объемы можно изменять в зависимости от размера используемого устройства MC.
    2. Аккуратно вставьте вырезанные DRG в отсек сомы (Рисунок 2A), следя за тем, чтобы они не поцарапали дно пластины лунки. Поместите DRG посередине, чтобы невриты могли прорасти в соседние отсеки через туннели.
    3. Термическое сшивание гидрогеля в инкубаторе при температуре 37 °C в течение 30 мин. Пока это происходит, включите УФ-лампу для прогревания.
    4. После термической сшивки ультрафиолетовое сшивание гидрогеля в течение 90 с.
    5. Добавьте питательную среду DRG к гидрогелю и DRG и выполните полную смену среды через час, чтобы устранить непрореагировавшие или оставшиеся следы фотоинициатора, которые сохраняются в среде.
    6. Выполняйте половинную смену среды каждые 3 дня и следите за ростом ДРГ путем просмотра под микроскопом.
    7. Через ~4 недели, когда нейриты DRG начнут расти (Рисунок 3A), сделайте снимки с помощью флуоресцентного пластинчатого тепловизора и количественно определите длину нейритов с помощью FIJI (ImageJ).

12. Управление встраиванием DRG

  1. Пипетка 250 мкл гидрогеля в 48-луночном планшете (без МС).
  2. Аккуратно поместите отрезанный DRG в середину лунки и наполовину в гидрогель, следя за тем, чтобы он не поцарапал дно пластины лунки.
  3. Термическое сшивание гидрогеля в инкубаторе при температуре 37 °C в течение 30 мин.
  4. УФ-сшивание гидрогеля в течение 90 с.
  5. Добавьте питательную среду DRG к гидрогелю и DRG и выполните полную смену среды через час.
  6. Выполняйте половинную смену среды каждые 3 дня и следите за ростом DRG, рассматривая ее под микроскопом.
  7. Через ~4 недели, когда нейриты DRG начнут расти (Рисунок 3B), сделайте снимки с помощью флуоресцентного пластинчатого тепловизора.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для визуализации подойдет любой светлопольный микроскоп. Автоматизированный планшетный микроскоп ускоряет этот процесс. Контрольное встраивание в простые гели без прибора производится для сравнения роста нейритов DRG в многокамерных камерах. Как только пользователи убедятся, что DRG растут одинаково в MC и контрольных гелях, им, возможно, не придется повторять контрольные гели каждый раз.

13. Визуализация DRG

  1. Захватывайте светлопольные изображения с 4-кратным увеличением с помощью флуоресцентного тепловизора в диапазоне фокусных расстояний для визуализации всего устройства DRG и MC.
  2. Отрегулируйте яркость и контрастность изображения, чтобы было удобнее просматривать невриты.
  3. Сохраните изображение в виде файла .tiff.

14. Количественное определение нейритов DRG

  1. Загрузите и установите FIJI (ImageJ).
  2. Откройте ImageJ. Откройте файл изображения и убедитесь, что он монохромный.
  3. Увеличьте контраст так, чтобы были видны мельчайшие нейриты. Для этого откройте опцию яркости и контрастности с помощью сочетания клавиш Ctrl+Shift+C.
  4. Отрегулируйте ползунки контроллера по мере необходимости, чтобы визуализировать нейриты, и нажмите « Применить » для желаемой яркости и контрастности.
  5. Откройте трассировщик нейритов, открыв меню «Плагины », выбрав «Сегментация» и нажав на «Простой нейритовый трассировщик».
  6. Начните новую трассировку, щелкнув по одному концу нейрита прямо напротив корпуса DRG.
  7. Щелкните еще одну точку вдоль нейрита, чтобы добавить трассировку до тех пор, пока нейрит не будет прослежен встык. Нажмите на Finish Path после трассировки нейрита.
  8. Преобразуйте трассированную длину в реальные единицы измерения и сохраните результаты, скопировав и вставив их в Excel.
  9. Используйте инструмент «Прямая линия» в FIJI, чтобы нарисовать линию той же длины, что и масштабная линейка (не пропуская конец линии), и посмотрите на значение длины, видимое под панелью инструментов. Значение length используется для преобразования.
  10. Измерьте длину шести длинных нейритов, идущих с обеих сторон DRG (рисунок 3C, D), и рассчитайте среднюю длину этих нейритов, чтобы получить репрезентативную среднюю длину DRG, как показано на рисунке 4.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Иммуноокрашивание было протестировано на эксплантах DRG в простых гелях, чтобы показать наличие ненейрональных опорных клеток7. DRG фиксируют в 4% параформальдегиде (PFA) при комнатной температуре, трижды промывают 1x PBS в течение 15 минут и хранят в 1x PBS при 4 °C до иммуноокрашивания.
  11. Для эксплантов в устройствах MC извлеките устройство MC и выполните тот же процесс, который описан выше7.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

В настоящем протоколе описан метод сбора и культивирования DRG у взрослых крыс Sprague Dawley в многокамерном (MC) устройстве. Как показано на рисунке 1, DRG, собранный у взрослых крыс, был обрезан и разрезан на ~0,5 мм. Затем обрезанные и разрезанные DRG были помещены в гидрогель в области сомы устройства MC (рис. 2) и культивировались в течение 27 дней до количественного определения нейритов. DRG культивировали в простом геле в качестве контро...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В этом протоколе описан метод сбора взрослых DRG Sprague Dawley и их культивирования в 3D-натуральных гидрогелях. В отличие от этого метода, другие подходы к забору DRG у мышей и крыс предполагают изоляцию позвоночного столба. Иссеченный позвоночный столб разрезается вдвое, а спинной мозг удаляется, чтобы обнажить DRG 23,24,25. Повреждение спинного мозга ограничивает кровоснабжение, что влияет на ДРГ и внутренние нейроны

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы данного исследования заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантом NSF (2152065) и премией NSF CAREER Award (1846857). Авторы хотели бы поблагодарить всех нынешних и бывших членов лаборатории Вакса за вклад в этот протокол. Диаграммы на рисунке 1 были сделаны в Biorender.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Щипцы #5Fine Science Tools11252-00Для обрезки и резки DRG
10x DMEMMilliporeSigmaD2429
1x PBS (автоклавный)Приготовлен в лаборатории7,3 - 7,5 pH
24 луночные пластиныVWR82050-892Для временного хранения собранных и нарезанных DRG
3 мл Шприц стерильный, одноразовыйBD309657
48-луночные пластиныGreiner Bio-One677180
60 мм чашка ПетриFisher ScientificFB0875713AДля удержания сред для обрезки и резки
Алюминиевая фольгаFisherbrand01-213-104
B27 Plus 50xThermoFisher17504044Для DRG среды
Коллаген тип IIbidi50205
Изогнутый чашка Friedman Pearson RongeurFine Science Tools16221-14Для вскрытия
Дюмон #3 щипцыFine Science Tools11293-00Для вскрытия
Фетальная бычья сыворотка (FBS)ThermoFisher16000044Для DRG media
Form cureForm Labsотвердитель
Form WashForm LabsДля смывания излишков смол с MC
Стерилизатор стеклянных шариковFisher ScientificNC9531961
Стеклянные флаконы (8 мл)DWK Life Sciences (Wheaton)224724
GlutaMaxThermoFisher35050-061Для медиа DRG
HEPES (1M)Millipore SigmaH0887
Высокотемпературная смола V2FormLabsFLHTAM02
гиалуроновой кислотой Натриевая сольMilliporeSigma53747Используется для изготовления MAHA
IrgacureMilliporeSigma410896
LamininR& D Systems344600501
Большие тупые ножницыMilitexEG5-26Для диссекции
Большие щипцы (зазубренные наконечники)Militex9538797Для диссекции
Большие остроносые ножницыFine Science Tools14010-15Для диссекции
Наконечники пипеток с низким удержанием FisherScientific02-707-017Для пипетирования коллагена и MAHA
Метакрилированная гиалуроновая кислота (MAHA)Получено в лабораторииN/A85 - 115 % метакрилационный
фактор роста нервов (NGF)R& D Systems556-NG-100Для DRG media
Neurobasal A MediaThermoFisher10888022Для DRG media
ParafilmBemisPM996
ParafilmBemisPM996
Penicillin/Streptomycin (PS)EMD Millipore516106для DRG media
тест-полоскиVWR InternationalBDH35309.606
Наконечники для пипеток (1000 &; L)США Scientific1111-2021
Преформа 3.23.1 программное обеспечениеFormslabДля загрузки файла STL
RatCharles River
Resin 3D-принтерForm LabsForm 3L 3Dпечать MC устройство
Маленькие остроносые ножницыFine Science Tools14094-11Для вскрытия
БикарбонатнатрияMilliporeSigmaS6014
Прямая чашка rongeurFine Science Tools16004-16Для диссекции
Пружинные ножницы с прямым краемFine Science Tools15024-10Для диссекции
Хирургическое лезвие шлепеля (No 10)Fisher Scientific22-079-690
Фильтры для шприцев, PES (0.22 µ m)Celltreat229747
Крошечные пружинные ножницыWorld Precision Instruments14003Для обрезки и резки DRG
UV лампаAnalytik Jena USДля фотосшивки гидрогеля (15 - 18 мВт/см2)
pH

Ссылки

  1. Vos, T., et al. Global, regional, and national incidence, prevalence, and years lived with disability for 310 diseases and injuries, 1990-2015: A systematic analysis for the global burden of disease study 2015. Lancet. 388 (10053), 1545-1602 (2016).
  2. Goldberg, D. S., Mcgee, S. J. Pain as a global public health priority. BMC Public Health. 11 (1), 770(2011).
  3. Gaskin, D. J., Richard, P. The economic costs of pain in the United States. J Pain. 13 (8), 715-724 (2012).
  4. Kim, Y. S., et al. Coupled activation of primary sensory neurons contributes to chronic pain. Neuron. 91 (5), 1085-1096 (2016).
  5. Im, H. J., et al. Alteration of sensory neurons and spinal response to an experimental osteoarthritis pain model. Arthritis Rheum. 62 (10), 2995-3005 (2010).
  6. Jensen, T. S., Finnerup, N. B. Allodynia and hyperalgesia in neuropathic pain: Clinical manifestations and mechanisms. Lancet Neurol. 13 (9), 924-935 (2014).
  7. Berge, O. G. Predictive validity of behavioral animal models for chronic pain. Br J Pharmacol. 164 (4), 1195-1206 (2011).
  8. Anderson, W. A., Willenberg, A. R., Bosak, A. J., Willenberg, B. J., Lambert, S. Use of a capillary alginate gel (capgel™) to study the three-dimensional development of sensory nerves reveals the formation of a rudimentary perineurium. J Neurosci Methods. 305, 46-53 (2018).
  9. Mohammed Izham, N. A., et al. Exploring the possibilities of using in vitro model for neuropathic pain studies. Neurosci Res Notes. 5, 144(2022).
  10. Park, S. E., et al. A three-dimensional in vitro model of the peripheral nervous system. NPG Asia Mater. 13 (1), 2(2021).
  11. Caparaso, S. M., Redwine, A. L., Wachs, R. A. Engineering a multi-compartment in vitro model for dorsal root ganglia phenotypic assessment. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 111 (11), 1903-1920 (2023).
  12. Krug, A. K., et al. Evaluation of a human neurite growth assay as specific screen for developmental neurotoxicants. Arch Toxicol. 87 (12), 2215-2231 (2013).
  13. F, M., et al. Extracellular matrix stiffness negatively affects axon elongation, growth cone area and F-actin levels in a collagen type I 3D culture. J Tissue Eng Regen Med. 16 (2), 151-162 (2021).
  14. Spearman, B. S., et al. Tunable methacrylated hyaluronic acid-based hydrogels as scaffolds for soft tissue engineering applications. J Biomed Mater Res A. 108 (2), 279-291 (2020).
  15. Zhu, W., Oxford, G. S. Differential gene expression of neonatal and adult DRG neurons correlates with the differential sensitization of TRPV1 responses to nerve growth factor. Neurosci Lett. 500 (3), 192-196 (2011).
  16. Van De Wijdeven, R., et al. Structuring a multi-nodal neural network in vitro within a novel design microfluidic chip. Biomed Microdevices. 20, 1-8 (2018).
  17. Chan, J. R., et al. NGF controls axonal receptivity to myelination by Schwann cells or oligodendrocytes. Neuron. 43 (2), 183-191 (2004).
  18. Ng, B. K., Chen, L., Mandemakers, W., Cosgaya, J. M., Chan, J. R. Anterograde transport and secretion of brain-derived neurotrophic factor along sensory axons promote Schwann cell myelination. J Neurosci. 27 (28), 7597-7603 (2007).
  19. Xiao, J., et al. BDNF exerts contrasting effects on peripheral myelination of NGF-dependent and BDNF-dependent drg neurons. J Neurosci. 29 (13), 4016-4022 (2009).
  20. Seidlits, S. K., et al. The effects of hyaluronic acid hydrogels with tunable mechanical properties on neural progenitor cell differentiation. Biomaterials. 31 (14), 3930-3940 (2010).
  21. Tomal, W., Ortyl, J. Water-soluble photoinitiators in biomedical applications. Polymers. 12 (5), 1073(2020).
  22. Leary, S., et al. Avma guidelines for the euthanasia of animals: 2013 edition. Veterinary Medical Association. , Schaumburg, Illinois. (2013).
  23. Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia. BMC Res Notes. 9 (1), 82(2016).
  24. Naveed, M., et al. Simple methods of dissection protocols for the rapid isolation of rat dorsal root ganglia under the non-microscopic condition. Neuroscience Research Notes. 6 (2), 212(2023).
  25. Perner, C., Sokol, C. L. Protocol for dissection and culture of murine dorsal root ganglia neurons to study neuropeptide release. STAR Protocols. 2 (1), 100333(2021).
  26. Bai, X., et al. A high-resolution anatomical rat atlas. J Anatomy. 209 (5), 707-708 (2006).
  27. Bian, L., et al. The influence of hyaluronic acid hydrogel crosslinking density and macromolecular diffusivity on human MSC chondrogenesis and hypertrophy. Biomaterials. 34 (2), 413-421 (2013).
  28. Haberberger, R. V., Barry, C., Dominguez, N., Matusica, D. Human dorsal root ganglia. Front Cell Neurosci. 13, 271(2019).
  29. Schwaid, A. G., Krasowka-Zoladek, A., Chi, A., Cornella-Taracido, I. Comparison of the rat and human dorsal root ganglion proteome. Scientific Rep. 8 (1), 13469(2018).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Многокамерное устройстворост нейритовмодель хронической боликультура ГКНпериферические нейроныиммобилизация в гидрогелегиперчувствительность ноцицепторованализ в ImageJтрассировка нейритов
Забор, встраивание и культивирование ганглиев дорсальных корешков в многокамерных устройствах для изучения особенностей периферических нейронов
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.