Методическая статья

Митохондриальная трансформация у Бейкера

2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/66856

⸱

7 июня 2024 г.

 ,  , 
1Departamento de Genética Molecular, Instituto de Fisiología Celular, Universidad Nacional Autónoma de México

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

В этой работе объясняется, как трансформировать митохондрии дрожжей с помощью биолистического метода. Мы также показываем, как отбирать и очищать трансформанты и как ввести желаемую мутацию в целевую позицию в митохондриальном геноме.

Аннотация

Пекарские дрожжи Saccharomyces cerevisiae широко используются для понимания митохондриальной биологии на протяжении десятилетий. Эта модель предоставила знания об основных консервативных митохондриальных путях у эукариот, а также о грибах или дрожжевых путях. Одной из многих способностей S. cerevisiae является способность манипулировать митохондриальным геномом, что до сих пор было возможно только у S. cerevisiae и одноклеточных водорослей Chlamydomonas reinhardtii. Биолистическая трансформация митохондрий дрожжей позволяет нам вводить сайт-направленные мутации, производить перестройку генов и вводить репортеров. Эти подходы в основном используются для понимания механизмов двух высоко скоординированных процессов в митохондриях: трансляции миторибосомами и сборки дыхательных комплексов и АТФ-синтазы. Тем не менее, митохондриальная трансформация потенциально может быть использована для изучения других путей. В настоящей работе мы показываем, как трансформировать митохондрии дрожжей с помощью высокоскоростной бомбардировки микроснарядами, выбрать и очистить предполагаемый трансформант, а также ввести желаемую мутацию в митохондриальный геном.

Введение

Дрожжи Saccharomyces cerevisiae являются широко признанной моделью, используемой для изучения митохондриального биогенеза. Поскольку дрожжи являются анаэробным, факультативным организмом, можно широко изучить причины и последствия внесения мутаций, ухудшающих дыхание. Кроме того, этот организм обладает дружественными генетическими и биохимическими инструментами для изучения митохондриальных путей. Тем не менее, одним из самых мощных ресурсов для изучения механизмов сборки дыхательных комплексов и синтеза митохондриальных белков является способность трансформировать митохондрии и модифицировать геном органеллы. Ранее было полезно вводить в митохондриальную ДНК (мтДНК) точечные мутации или небольшие делеции/вставки 1,2,3,4,5, удалять гены 6,7, производить перестройку генов 7,8, добавлять эпитопы к митохондриальным белкам 9,10, перемещать гены из ядра в митохондрии11,12, и ввести репортерные гены, такие как BarStar13, GFP14,15, люциферазу16 и наиболее широко используемый ARG8m17,18. Модификации митохондриального генома позволили нам проанализировать и идентифицировать механизмы, которые в противном случае было бы трудно понять. Например, репортерный ген ARG8m, вставленный в локус ЦОГ1 в митохондриальной ДНК, имел решающее значение для понимания того, что Mss51 играет двойную роль в биогенезе ЦОГ1. Во-первых, это трансляционный активатор мРНК ЦОГ1, а во-вторых, это сборочный шаперон для недавно созданного белка ЦОГ1 7,19. В данной работе представлен подробный метод трансформации митохондрий S. cerevisiae. Несмотря на то, что протокол митохондриальной трансформации был опубликован ранее 16,20,21,22,23, визуальный подход с помощью видео необходим для полного понимания различных этапов и деталей метода. Метод состоит из различных этапов и делится на четыре основных этапа:

Схема процесса редактирования генов; Частицы вольфрама, покрытие ДНК, этапы интеграции митохондриального генома.
Рисунок 1: Обзор процедуры трансформации митохондрий с помощью высокоскоростной бомбардировки микроснарядами: 1) Частицы вольфрама стерилизуются и подготавливаются перед нанесением покрытия ДНК. 2) Две разные плазмиды выпадают в осадок на поверхности БФ. Одним из них является бактериальная плазмида, содержащая конструкцию, которая будет направлена к митохондриальному матриксу. Другой представляет собой вектор экспрессии ядерных дрожжей, несущий маркер ауксотрофии. 3) Рецепторный штамм дрожжей, лишенный митохондриальной ДНК (rho0), выращивается на ферментативном источнике углерода, таком как галактоза или рафиноза, который не оказывает никакого подавления глюкозы в экспрессии митохондриальных генов34,35. Культуру выкладывают на чашки Петри, содержащие бомбардирующую среду. 4) БФ, покрытые плазмидами, выстреливаются в штамм рецептора путем высокоскоростной бомбардировки микроснарядами. 5) Положительные синтетические колонии ро-, содержащие митохондриальную плазмиду, отбираются путем скрещивания с тестером-штаммом. 6) Митохондриальная конструкция интегрируется в митохондриальный геном в нужном локусе путем скрещивания синтетического штамма (донора) с акцепторным штаммом с помощью процесса, известного как цитодукция. 7) Положительный рецептор, гаплоидный штамм, несущий митохондриальную конструкцию, отбирается и очищается в различных средах. Сокращения: WPs = частицы вольфрама; мтДНК = митохондриальная ДНК. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Трансформация клеток с помощью ДНК-конструкции, предназначенной для интеграции в митохондриальный геном (рис. 1, шаги 1-4)
Несмотря на то, что дрожжи, содержащие полный митохондриальный геном (rho+), можно напрямую трансформировать, если в клетках отсутствует митохондриальная ДНК (rho0)24. Частицы вольфрама (ВП) покрыты двумя различными плазмидами, которые будут совместно трансформироваться. Первый из них представляет собой вектор экспрессии дрожжей 2 μ, несущий маркер ауксотрофии, такой как LEU2 или URA3 (например, YEp351 или YEp352 соответственно). Если биолистическое внедрение ДНК в дрожжевые клетки проходит успешно, трансформанты будут расти на ауксотрофной среде (т.е. в среде, лишенной лейцина или урацила). Эта плазмида полезна при первом отборе клеток, которые приобрели ядерную плазмиду; В противном случае количество образовавшихся колоний насытило бы пластину. Вторая плазмида представляет собой бактериальную плазмиду (например, pBluescript или аналогичную), содержащую митохондриальную конструкцию, предназначенную для интеграции в митохондриальный геном. Конструкция должна содержать, по меньшей мере, 100 nt 5' и 3' фланкирующих митохондриальных последовательностей для рекомбинации с митохондриальной областью, представляющей интерес. По нашему опыту, более крупные фланкирующие последовательности с большей вероятностью успешно рекомбинируются с локусом-мишенью в митохондриальном геноме.

Конкретный пример показан на рисунке 225. В этом примере цель состояла в том, чтобы удалить область митохондриального гена COX1 , кодирующую последние 15 аминокислот соответствующего белка (Cox1ΔC15) (рис. 2A). Бактериальная плазмида, несущая мутацию COX1ΔC15 , содержала 395 nt и 990 nt 5' и 3' нетранслируемых областей гена соответственно. Плазмида была получена из pBluescript (pXPM61) и вместе с 2 μ плазмидой YEp352 была соципирована на поверхности WP (рис. 2B). Затем РГ вводили путем бомбардировки микроснарядами в выбранный штамм-реципиент (рис. 2C). Этот штамм, получивший название NAB6926, представляет собой штамм MATa, rho0 , несущий аллели kar1-1 и ade2 (важность этих характеристик обсуждается ниже). Клетки наносили на бомбардирующие среды, в которых отсутствовал урацил, чтобы выбрать те, которые приобрели 2 μ плазмиды (рис. 2C). Клетки выращивали в течение 5-7 ночей при 30 °С.

Отбор клеток, которые приобрели бактериальную плазмиду, содержащую митохондриальную конструкцию, и ядерную плазмиду 2 μ, несущую маркер ауксотрофии (рис. 1, шаг 5)
Положительные колонии сохраняют много копий бактериальной плазмиды в своих митохондриях22. Поскольку трансформированные клетки изначально являются rho0, никакие митохондриальные последовательности не поддерживают трансляцию митохондриальной конструкции, присутствующей в плазмиде; Следовательно, трансформированный митохондриальный ген не будет экспрессироваться. Необходимо сопрягать трансформанты со штаммом тестера, чтобы обнаружить колонии дрожжей, которые приобрели митохондриальную плазмиду. Митохондриальный геном тестерного штамма содержит нефункциональную мутировавшую версию интересующего гена. После спаривания митохондрии сливаются, и митохондриальная последовательность, включенная в трансформированную плазмиду, рекомбинируется с мутировавшим митохондриальным геном из тестерового штамма; следовательно, восстановление гена WT восстановит функцию. Полученный диплоид будет иметь обнаруживаемый положительный фенотип (обычно способность к росту в дыхательной среде или в среде, в которой отсутствует аргинин). Положительные клетки, несущие бактериальную плазмиду в митохондриях, называются «синтетическими ро-клетками». В конкретном примере на рисунке 2D синтетические ро-клетки, несущие конструкцию COX1ΔC15 (названную XPM199), были реплицированы на среде, в которой отсутствует урацил (это основная пластина, из которой были очищены положительные колонии). Они также были реплицированы на тестовом штамме L4527 Газон, который содержит нефункциональную мутацию cox1D369N. После спаривания в течение двух ночей митохондриальный геном L45 и XPM199 рекомбинировался, в результате чего образовался функциональный ген COX1; Таким образом, диплоиды восстановили способность к росту на дыхательных средах. С эталонной пластины мы отобрали положительные колонии. Они были нанесены на пластины, в которых отсутствовал урацил, и селективные тесты были повторены для получения чистых синтетических ро-клеток (рис. 2E). Важно отметить, что тестовая пластина предназначена только для идентификации синтетических колоний, и мутанты не могут быть извлечены из этих пластин.

Интеграция конструкта в митохондриальный геном предполагаемого штамма
Этот этап достигается с помощью процесса, называемого цитодукцией28,29 (рис. 1, стадия 6). При таком подходе синтетический штамм rho- (донорский штамм) сопрягают с предполагаемым акцепторным штаммом противоположного типа сопряжения. Существенным требованием является то, что по крайней мере один из двух брачных штаммов несет мутацию kar1-1, препятствующую ядерному синтезу30. Следовательно, в результате скрещивания двух клеток образуется двуядерная зигота (рис. 3). Митохондриальная сеть родительских клеток (донорской и акцепторной) сливается, и молекулы митохондриальной ДНК рекомбинируют. Двуядерные зиготы инкубируются/восстанавливаются, чтобы обеспечить почкование, которое приведет к образованию гаплоидных клеток. Эти гаплоиды несут ядерный фон одной из родительских клеток. Точно так же гаплоиды могут переносить митохондриальную ДНК либо из родительской клетки, либо из рекомбинированной митохондриальной ДНК, представляющей интерес. Тем не менее, мутация kar1-1 не эффективна на 100%, и некоторые истинные диплоиды будут образовываться во время спаривания 28,29. Синтетический штамм rho- (донор, XPM199) нес аллель kar1-1 в этом примере. В качестве селективного маркера он обладал аллелем ade2, что делало его ауксотрофом для аденина (рис. 4). Акцепторным штаммом был XPM10, штамм rho+, несущий конструкцию cox1Δ::ARG8m, где репортерный ARG8m заменил кодоны COX1 в митохондриальном геноме7. Смесь обеих клеточных культур добавляли в планшет YPD в качестве капли для обеспечения спаривания. Через 3-5 ч клетки наблюдали под световым микроскопом, чтобы обнаружить образование shmoos (рис. 3B), клеточной формы, связанной со спариванием. По истечении периода инкубации/восстановления биядерные зиготы помещали на среду, в которой отсутствовал аденин, чтобы предотвратить рост донорских клеток.

Выбор гаплоидного штамма, несущего интересующий митохондриальный геном (рис. 1, шаг 7)
После цитодукции присутствует смесь донорных, акцепторных и диплоидных клеток. Таким образом, после инкубации/восстановления двуядерных зигот клетки должны быть выращены в различных селективных средах для идентификации и очистки интересующих гаплоидов. Селективная среда зависит от генотипов донора, акцепторных штаммов и предполагаемой митохондриальной конструкции. Однако, в целом, обоснование выбора селективных сред заключается в следующем: i) после инкубации/восстановления цитодукционная смесь выращивается на селективной среде, где родительский штамм-донор не может расти. В конкретном примере на рисунках 4А, В донор (синтетический штамм ро-штамма ) несет нефункциональный аллель ade2 . Таким образом, цитодукционную смесь необходимо инкубировать на средней тарелке, лишенной аденина. Это мастер-плита. ii) По мере того, как колонии вырастают, эталонная пластина снова реплицируется на среде, лишенной аденина (для создания новой эталонной пластины, из которой будут очищаться положительные колонии, представляющие интерес), а затем на среде, где могут расти только диплоиды. Это необходимо для того, чтобы избежать дальнейшей непреднамеренной очистки диплоидных колоний. В примере с рисунка 4C только диплоиды могут расти на средах, лишенных лейцина. iii) Мастер-пластина также реплицируется на средах, где будут расти только те акцепторные гаплоиды, которые включают в себя интересующую митохондриальную ДНК. В примере на рисунке 4C гаплоиды растут на дыхательных средах, содержащих этанол/глицерин в качестве источника углерода, поскольку белокCox1 Δ C15является функциональным. Полученный штамм rho+ , несущий представляющую интерес мтДНК, был назван XPM20925. Деформации, используемые на рисунках 2 и 4 , перечислены в таблице 1.

Процесс редактирования генов дрожжей, схема с мтДНК и COX1ΔC15, плазмидой URA3, синтетическим штаммом rho⁻.
Рисунок 2: Диаграмма, описывающая конкретный пример митохондриальной трансформации и отбора положительных ро-клеток. (А) Предполагаемой модификацией митохондриального генома была делеция участка, кодирующего последние 15 аминокислот субъединицы Cox1 (Cox1ΔC15). (В) БФ были покрыты двумя плазмидами для трансформации дрожжевых клеток. Одним из них была 2 μ плазмида Yep352, которая была направлена и экспрессировалась в ядре. Другой была плазмида pXPM61, которая содержит аллель COX1ΔC15 плюс 395 nt и 990 nt 5' и 3'-UTRs COX1 соответственно. (C) БФ были введены в клетки из штамма NAB69, в котором отсутствует митохондриальная ДНК (штамм rho0). Колонии трансформантов, полученные из бомбардировочных пластин, реплицировались на среде, в которой отсутствует урацил, ауксотрофный маркер ядерной плазмиды YEp352. (D) Для отбора положительных ро-колоний пластину -URA реплицировали на среде, в которой отсутствует урацил. Это была эталонная пластина, с которой отбирались и изолировались положительные колонии. Он также был воспроизведен на пластинах с богатой средой (YPD) и газоне из тестера штамма. Во время скрещивания синтетическая ро-митохондриальная ДНК была рекомбинирована с митохондриальной ДНК из тестерного штамма L4527, который несет мутацию в гене COX1 (D369N). Диплоиды, выросшие на дыхательных средах, содержали трансформированную ДНК. Соответствующие колонии были отобраны с эталонной пластины для восстановления и очистки. Чтобы помочь идентифицировать положительные колонии на эталонной пластине на протяжении всей копии покрытия, по краям пластин были сделаны метки постоянным маркером (зеленые линии). (E) Отобранные положительные колонии были восстановлены на среде, в которой отсутствовал урацил. Это была новая эталонная пластина. Как и в случае с D, было проведено еще два раунда испытаний для очистки синтетических колоний. Сокращения: WPs = частицы вольфрама; мтДНК = митохондриальная ДНК; -URA/Sorb = отсутствует урацил/, содержащий сорбит; WT = дикий тип. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Процесс слияния дрожжевых клеток; диаграмма и изображение с микроскопа; трансфер RHO+; стадии спаривания; клеточная биология.
Рисунок 3: Схема, описывающая процедуру цитодукции. (А) Общий обзор того, как клетки спариваются во время цитодукции. Во время цитодукции митохондрии донорского и акцепторного штаммов сливаются, поэтому митохондриальная ДНК обоих штаммов рекомбинирует. Поскольку ядерный синтез снижается из-за мутации kar1-1 30, образуются биядерные зиготы. После некоторого времени инкубации/восстановления отбираются зачатки бинуклеарных зигот и гаплоидные акцепторы, содержащие предполагаемую митохондриальную мутацию. (Б) Спаривание синтетического штамма rho- (донора) и акцепторного штамма посредством цитодукции позволяет образовывать шмоос (красные стрелки), характерную форму спаривающихся дрожжей. Изображение было получено под световым микроскопом со 100-кратным объективом. Масштабная линейка = 10 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Диаграмма генетического скрещивания дрожжей, показывающая донора XPM199 и акцептор XPM10, подчеркивающая мастер-плакинг ADE и процесс рекомбинантного роста для интеграции ДНК.
Рисунок 4: Диаграмма, описывающая конкретный пример цитодукции для интеграции мутации COX1ΔC15 в митохондриальный геном. (A) Жидкие культуры синтетического штамма rho- (донор, XPM199) и представляющего интерес штамма (акцептор, XPM10) были смешаны для спаривания. После образования шму смесь восстанавливали в жидкой культуре в течение 2-4 ч. Затем цитодукционную смесь наносили на планшет со средой, в которой отсутствовал аденин для предотвращения роста донорских клеток. (B) Схематическое изображение событий рекомбинации митохондриальной ДНК от донора (XPM199) и акцептора (XPM10) во время цитодкции. (C) Мастер-пластину реплицировали на различных селективных средах для идентификации и очистки тех гаплоидов, которые интегрировали предполагаемый митохондриальный ген в ДНК органеллы (XPM209)25. Сокращения: -ADE = отсутствует аденин; -LEU = недостаток лейцина. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Протокол

Примечание: Мы рекомендуем проводить шесть трансформаций для каждого конструкта, так как эффективность митохондриального превращения обычно низкая. Состав различных питательных сред представлен в таблице 2.

1. Подготовка вольфрамовых частиц

  1. Масса 30 мг 0,7 мкм частиц вольфрама (ВД, микроносителей) в микропробирке. Добавьте 1,5 мл 70% этанола (EtOH) для стерилизации. Сделайте вихревые насосы и дайте им отдохнуть в течение 10 минут при комнатной температуре.
  2. Центрифуга при 13 200 x g в течение 15 минут при комнатной температуре. Промойте БФ, добавив к частицам 1,5 мл стерильной воды, сделав их вихревыми и центрифугируя при 13 200 × г в течение 15 минут при комнатной температуре. Выбросьте надосадочную жидкость.
  3. Добавьте 500 μL стерильного 50% глицерина (конечная концентрация 60 μг WPs/μL).
    ПРИМЕЧАНИЕ: БФ можно хранить при температуре -20 °C не менее 6 месяцев. Из этого запаса возьмите необходимое количество для шести превращений (100 μл).

2. Покрытие ДНК WPs

  1. Добавьте 5 г плазмиды 2 μ и 15 г бактериальной плазмиды, содержащей митохондриальную последовательность, в микротрубку на льду.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Конечный объем не должен превышать 50 μл, чтобы избежать дальнейшего разбавления реагентов, необходимых для покрытия ДНК.
  2. Добавьте 100 мкл суспензии и вихря WP в течение 5 с (6 мг WPs).
  3. Добавьте 4 мкл 1 М спермидина. Кратко вихрь.
  4. Добавьте 100 μЛ ледяного 2,5 М CaCl2, кратковременно вортессируйте. Инкубировать на льду в течение 10 минут; Кратковременно перемешивайте смесь каждые 3 минуты.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор CaCl2 стерилизован фильтром и не должен подвергаться автоклавированию.
  5. Центрифугируйте ДФ в течение 30 с при 13 200 × g при 4 °C и выбросьте надосадочную жидкость. Промойте частицы, аккуратно взвесив их в 200 мкл 100% EtOH при -20 °C.
  6. Центрифугируйте ДФ в течение 30 с при давлении 13 200 × г при 4 °C и выбросьте надосадочную жидкость. Повторите стирку.
  7. Ресуспендируйте БФ в 60-70 мкл комнатной температуры 100% EtOH с помощью наконечника для пипетки; Не делайте вихрей.
    Примечание: Чтобы обеспечить качество плазмид, покрытие ДНК должно быть выполнено в тот же день, что и биолистическая трансформация.

3. Биолистическая подготовка материала

  1. Перед бомбардировкой стерилизуйте шесть держателей макроносителей (рис. 5) в автоклаве и тщательно высушите их. В качестве альтернативы замочите их в EtOH и простерилизуйте с помощью пламени с помощью щипцов. Поместите их на стерильную стеклянную тарелку.
  2. Во время осаждения ДНК (10 мин инкубации на льду на шаге 2.4) вставьте шесть макроносителей (или летающих дисков) в каждый из шести держателей макроносителей с помощью стерильных щипцов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не стерилизуйте макроносители.
  3. Смешайте WP, покрытые ДНК, с пипеткой. Добавьте 10 μL WP на каждую поверхность макроносителя и распределите по всей поверхности с помощью наконечника для дозатора. При необходимости добавьте несколько дополнительных микролитров 100% EtOH на поверхность макроносителя, чтобы обеспечить равномерное распределение ВП. Дайте суспензии высохнуть при комнатной температуре в течение ~20 минут.

4. Подготовка дрожжевых клеток и бомбардировочных пластин

  1. Инокулируют штамм рецептора rho0 в 2 мл среды YPR (табл. 2). Выращивайте в течение одной ночи при температуре 30 °C во вращающемся колесе.
  2. Разведите 300 мкл культуры в 30 мл свежей среды YPR. Выращивайте при температуре 30 °C и 200 об/мин на ротационном встряхивателе в течение двух ночей, пока культура не насытится.
  3. Центрифугируйте дрожжевые клетки при 600 × г в течение 5 мин при комнатной температуре. Выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте дрожжевые клетки в 600 мкл среды YPD (табл. 2).
  4. С помощью стерильной стеклянной ручки распределите 100 мкл суспензии дрожжевых клеток на твердую бомбардирующую среднюю пластину.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В среде бомбардировки должен отсутствовать маркер выбора 2 μ плазмиды, которые будут использоваться для трансформации.
  5. Повторите шаг 4.4 для остальных пяти пластин.
  6. Перед бомбардировкой инкубируйте в течение 1–3 часов при комнатной температуре, чтобы убедиться, что жидкая среда полностью впиталась на поверхности планшета.

5. Получение синтетического штамма ро- методом биолистической трансформации

ПРИМЕЧАНИЕ: Прежде чем начать, обязательно прочтите руководство по эксплуатации биолистического оборудования. Опишем протокол работы указанного оборудования (Таблица материалов и Рисунок 5).

  1. Очистите камеру системы подачи биолистических частиц 70% этанолом, чтобы предотвратить загрязнение, и дайте ей постоять не менее 10 минут. Непосредственно перед бомбардировкой протрите поверхность чистым бумажным полотенцем.
  2. Откройте клапаны гелиевого бака до положения около 2 000 фунтов на квадратный дюйм.
  3. Включите оборудование и включите источник вакуума.
  4. С помощью щипцов поместите макроноситель лицевой стороной вниз на держатель макроносителя.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте сетку остановки, которая идет в комплекте с оборудованием.
  5. Закрутите крышку макроносителя поверх макроносителя. Все части вместе составляют систему запуска микроносителя (рис. 5).
  6. Разместите систему запуска микроносителя внутри вакуумной камеры на пятом уровне снизу.
  7. Поместите одну из тарелок с газоном сорта rho0 на второй уровень снизу камеры. Убедитесь, что тарелка обращена вверх и не имеет крышки.
  8. С помощью стерильных щипцов наложите один разрывной диск на удерживающий колпачок. Накрутите стопорный колпачок на трубку ускорения; Убедитесь, что стопорный колпачок плотно прилегает.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не обрабатывайте разорванные диски изопропанолом, как рекомендовано в руководстве, поскольку мы заметили, что эффективность трансформации снижается.
  9. Закройте дверцу вакуумной камеры.
  10. Установите переключатель VAC/VENT/HOLD в положение VAC . При достижении вакуума 25–28 дюймов ртутного столба переведите переключатель VAC/VENT/HOLD в положение HOLD .
    ПРИМЕЧАНИЕ: Имейте в виду, что достижимый вакуум может варьироваться в зависимости от уровня моря. Мы добились успеха, достигнув 25 дюймов ртутного столба.
  11. Нажмите переключатель FIRE , чтобы выстрелить WP. Подождите, пока давление в трубе ускорения не достигнет 1 300 фунтов на квадратный дюйм, когда разрывная мембрана сломается, издавая хлопок.
  12. Сразу после обрыва разрывной мембраны выключатель FIRE и вакуум разблокируются путем перевода переключателя VAC/VENT/HOLD в положение VENT .
  13. Осторожно, с помощью стерильных щипцов, удалите все остатки разрывного диска, присутствующие на поверхности пластины, и накройте пластину своей крышкой.
  14. Повторите процедуру с оставшимися пятью пластинами, помещая в каждый круг новую разрывную мембрану и макроноситель.
  15. В конце закройте главный клапан гелиевого бака.
  16. Закройте камеру и создайте вакуум, установив переключатель VAC/VENT/HOLD в положение VAC . Освободите систему от любого давления гелия, нажав и отпустив переключатель FIRE несколько раз. Повторите с открытой дверцей.
  17. Выключите вакуумный насос и оборудование для бомбардировки.
  18. Очистите систему подачи 70% EtOH. Промойте опоры макроносителя 0,1% раствором SDS; промыть стерильной дистиллированной водой и 100% EtOH.

6. Селекция синтетической колонии

  1. Инкубируйте планшеты для бомбардировки в течение 5-7 ночей при температуре 30 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Важно ежедневно проверять пластины на наличие загрязнений. При необходимости загрязненный участок можно вырезать стерильным шпателем, чтобы избежать дальнейшего загрязнения.
  2. Инокулируйте штамм тестера противоположного типа сопряжения в 2 мл среды YPD на ночь (см. конкретный пример на рисунке 2D, E).
  3. Инокулируйте 150 мкл культуры штамма тестера на планшет YPD. С помощью ручки из стерильного стекла равномерно распределите тестер по поверхности пластины. Дайте тарелке высохнуть не менее 5 минут.
  4. Сделайте реплики бомбардировочных пластин с помощью бархатных копировальных подушечек и штампа репликатора.
    1. Реплицируются на выпадающей средней пластине, соответствующей трансформированному маркеру ауксотрофии плазмиды 2 μ. Для роста требуется одна ночная инкубация при 30 °C. После этого хранить при температуре 4 °C до дальнейшего использования. Эта пластина является эталонной пластиной.
    2. Повторите на табличке YPD, содержащей газон испытателя, начиная с шага 6.3. Выдерживать при температуре 30 °C в течение двух ночей. После этого реплицируйте эту пластину на селективной среде, чтобы обнаружить присутствие митохондриального гена, представляющего интерес, например, в дыхательной среде или среде, в которой отсутствует аргинин, и инкубируйте в течение ночи при 30 °C. Только клетки, которые содержали синтетическую бактериальную плазмиду в митохондриях, будут расти на селективной среде после скрещивания со штаммом тестера.
  5. Определите на эталонной пластине (шаг 6.4.1) соответствующие колонии, которые выросли на шаге 6.4.2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку бомбардирующая пластина (и, следовательно, мастер-пластина) переполнена колониями трансформантов, может быть трудно идентифицировать те положительные колонии, которые наблюдаются на сопрягаемой пластине тестера. По этой причине настоятельно рекомендуется нарисовать перманентным маркером пару небольших линий с каждой стороны всех табличек. Нарисуйте аналогичные линии на кольце тиражирующейся марки. Эти линии будут полезны для ориентации и определения местоположения положительных колоний на эталонной пластине (см. пример на рисунке 2D).
  6. Очистите положительные колонии, протянув их от эталонной пластины ко второй селективной пластине для выпадения, как в шаге 6.4.1. Выдерживать в течение двух ночей при температуре 30 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Важно, чтобы полосы позволяли росту отдельных колоний для обеспечения чистого штамма.
  7. Повторите процесс отбора (шаги 6.2-6.5), чтобы подтвердить наличие бактериальной плазмиды в митохондриях.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно этот процесс можно повторить еще два раза для выбора стабильных синтетических штаммов ро-штаммов.
  8. После того как синтетический штамм rho- стабильно поддерживает плазмидную ДНК в митохондриях, выберите 3-5 различных положительных колоний и инокулируйте их в 2 мл YPD. Используйте эту культуру для приготовления криовиального сырья (путем смешивания 600 мкл культуры и 600 мкл 50% глицерина для хранения при -70 °C) и для вставки плазмидной последовательности в представляющую интерес мтДНК путем цитодукции (шаг 6.7).
    Примечание: Поскольку не существует селективного давления для поддержания трансформированной плазмиды в митохондриях из синтетического штамма rho- , плазмида может быть легко потеряна. Поэтому мы рекомендуем проводить цитодукцию как можно скорее.

7. Интеграция конструкции, присутствующей в синтетическом штамме rho- , в целевой участок митохондриального генома путем цитодукции

  1. Инокулируйте две пробирки 3 мл среды YPD, одну с донорскими клетками (синтетическими ро-клетками ) и одну с акцепторными клетками (дрожжевые клетки, где ожидается окончательная конструкция). Выдерживать в течение ночи при 30 °C.
  2. Смешайте 750 мкл донорского штамма и 250 мкл рецепторного штамма в стерильной микропробирке (соотношение 3:1).
  3. Центрифугируйте смесь в течение 1 мин при 13 200 × г; Выбросьте надосадочную жидкость. С помощью наконечника для пипетки объемом 1 мл со срезанным концом возьмите одну каплю клеточной гранулы и поместите ее на пластину YPD. Выдерживать при 30 °C в течение 2-4 часов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Во избежание перекрестного загрязнения не помещайте более двух клеточных суспензий в одну пластину (см. пример на рисунке 4A).
  4. Возьмите небольшое количество клеточной смеси, повторно суспендируйте ее в 15 мкл стерильной воды на предметное стекло и накройте крышкой. Проверить под световым микроскопом на наличие шмур с объективом 40х или 100х; эта характерная форма проявляется, когда присутствуют два типа сопряжения (рисунок 3B).
  5. Если шмуры присутствуют, ресуспендируйте небольшое количество (~0,5мм3) клеточной массы в 2 мл среды YPD. Инкубировать в течение 2 ч при 30 °C во вращающемся колесе, чтобы дать возможность двуядерным зиготам восстановиться.
  6. Перемешайте смесь и разведите 10 мкл клеточной суспензии в 990 мкл стерильной воды (разведение 1:100). Используйте стеклянные шарики или стерильную стеклянную ручку, чтобы распределить 100 мкл клеточного разведения на выпадающей среде, где растут только акцепторные штаммы (и спорадические диплоиды). Выдерживать 2-3 ночи при температуре 30 °C.
  7. Воспроизведите полученные колонии на необходимых селективных средах, как описано во введении (стадия 4; конкретный пример см. на рисунке 4C ).
  8. После идентификации положительных колоний восстановите их на той же селективной среде, чтобы очистить гаплоидный штамм, несущий интересующую мтДНК.
  9. Выберите не менее двух положительных колоний и выращивайте их на 2 мл среды YPD при 30 °C в течение ночи. Сделайте криогенную резервную копию, смешав 600 мкл 50% глицерина с 600 мкл насыщенной культуры YPD. Хранить при температуре -70 °C.
  10. Изолировать ДНК полученных штаммов31,32. Амплифицируйте желаемый участок с помощью ПЦР и секвенирования для подтверждения наличия митохондриальной мутации.
    Примечание: Каждая положительная колония является технической репликацией, которая должна быть подтверждена независимо друг от друга, чтобы обеспечить правильную последовательность в митохондриальном геноме.

Результаты

В этом разделе представлены некоторые репрезентативные результаты различных стадий трансформации митохондрий. На рисунке 6 показана процедура бомбардировки. Синтетические ро-клетки несли бактериальную плазмиду с репортерным геном ARG8m, который заменит кодирующую последовательность митохондриального гена (рис. 6А). После бомбардировки пластина была воспроизведена на носителе, в котором отсутствовал урацил (-URA); это эталонная пластина (рис. 6B). Растущие колонии имеют вектор экспрессии дрожжей с маркером ауксотрофии URA3 . В соответствии с разделом 6 протокола, бомбардировочная пластина также была воспроизведена на среде YPD, содержащей газон тестера штамма. В этом случае тестер содержал дефектный аллель гена ARG8m в митохондриальном геноме (ARG8m-1)1. После 2 ночей инкубации лужайка из тестера и трансформирующие клетки спарились, и митохондрии слились. Эта пластина была воспроизведена на среде с недостаточным содержанием аргинина. Только те диплоиды, которые содержали митохондриальную плазмиду, могли расти в этой селективной среде, потому что ген ARG8m, присутствующий в синтетическом штамме rho- , заменил дефектный ARG8m-1 из митохондриального генома тестерового штамма.

Количество положительных колоний обычно колеблется от нуля до 20 на пластину. В настоящем примере были получены четыре положительные синтетические роколонии , которые были очищены путем нанесения на них среды, лишенной урацила. В первом раунде очищения было получено много отрицательных колоний вместе с положительными. Однако после двух или трех раундов очистки можно получить чистый положительный синтетический штамм ро. На рисунке 6C мы показали пару положительных синтетических колоний после трех раундов очистки и тестирования. Большинство колоний с мастер-пластины -URA положительны для щупа тестера. Интересно, что не все клетки положительной колонии содержат митохондриальную плазмиду, что указывает на то, что трансформированная плазмида была потеряна в популяции колонии. Этот результат ожидаем, поскольку отсутствует селективное давление для удержания митохондриальной плазмиды, что делает ее нестабильной. Тем не менее, синтетический штамм rho, подобный показанным на рисунке 6C , может быть перенесен на следующий этап, цитодукцию (раздел 7 протокола), и использован для подготовки исходного материала для хранения при -70 °C. На рисунке 6D также показан третий раунд очистки синтетического штамма rho. Однако в этом случае, поскольку трансформанты были практически не в состоянии поддерживать митохондриальную плазмиду, от них отказались.

Мы описали одну общую стратегию отбора положительных синтетических колоний, которая представлена на рисунке 7А. В этом случае митохондриальная конструкция, присутствующая в синтетических ро-клетках, имеет несколько сотен нуклеотидов для рекомбинации с митохондриальной ДНК из тестерового штамма (например, конструкция COX1ΔC15 в синтетическом ро-штамме рекомбинирует с мутировавшим геном cox1D369N на митохондриальной ДНК тестера (рис. 2D); или конструкция cox1Δ::ARG8m в синтетическом ро-штамме с мутировавшим геном ARG8m-1 в митохондриальной ДНК тестера (рис. 6A). Однако, если нет тестирующего штамма для отбора положительных синтетических роклеток, представляющих интерес, существует косвенный подходк их отбору. В этом случае бактериальная плазмида также должна содержать фрагмент митохондриального гена, например, ЦОГ2 или ЦОГ3. Тестер содержит нефункциональную копию митохондриального гена cox2 или cox3. В приведенном примере последовательность фрагмента ЦОГ3, присутствующего в бактериальной плазмиде, может дополнять последовательность ЦОГ3, присутствующую в митохондриях тестера, и после рекомбинации обеспечивать функциональный ген ЦОГ3. После скрещивания синтетических ро-клеток с тестером диплоиды могут дышать только в том случае, если синтетические ро-клетки содержат бактериальную плазмиду внутри митохондрий (рис. 7В).

На рисунке 8 показан пример процесса цитодукции. Донорский и акцепторный штаммы содержат лейцин и аденин ауксотрофию соответственно. Следовательно, после цитодукции смесь помещали на среду, в которой отсутствовал лейцин, предотвращая рост донорских клеток. Это мастер-плита. К этому моменту будут расти только гаплоиды с ядерным фоном акцепторного штамма и спорадические диплоиды. Чтобы исключить диплоиды, эталонная пластина была реплицирована на средах, лишенных аденина, где могут расти только диплоиды. В этом примере полученная митохондриальная ДНК после цитодукции мутирует, и предполагаемые гаплоиды не могут расти на дыхательной среде этанола/глицерина. Поэтому эталонную пластину нужно тиражировать на пластинах YPD с газоном испытательного штамма. Положение диплоидов положительного дыхания указывает, какие колонии нужно очищать от мастер-пластины. Два раунда очистки необходимы для получения окончательного, чистого штамма. Митохондриальная интеграция обычно подтверждается ПЦР-амплификацией окружающего участка и секвенированием.

Наконец, гены могут быть вставлены в определенный локус в митохондриальном геноме. Например, репортерные гены могут быть вставлены на 3'-конец кодирующей последовательности митохондриального гена или заменить кодирующую область митохондриального гена, среди прочих вариантов (рисунок 9A). Тем не менее, гены также могут быть вставлены в эктопические участки в некодирующих областях митохондриального генома. Обычно используемый сайт находится на расстоянии 295 нт выше стартового кодона гена ЦОГ2 . Изменение в этой некодирующей области безобидно13. Чтобы успешно экспрессировать ген в эктопическом сайте, он должен быть окружен митохондриальным промотором и терминатором. Фланкирующие последовательности ЦОГ2 являются наиболее оптимальными, поскольку ЦОГ2 является геном митохондрий с самыми короткими 5' и 3' нетранслируемыми последовательностями (73 нт из 5' UTR и 119 нт из 3' UTR) (рис. 9B). Для этой конструкции бактериальная плазмида имеет следующие характеристики: матрица представляет собой плазмиду, содержащую кодирующую область COX2 с 1120 nt ниже стоп-кодона и 670 nt выше стартового кодона AUG , называемую pXPM5025. Ген, представляющий интерес, спроектирован таким образом, чтобы быть фланкированным 73 нт COX2 5'-UTR и 119 нт COX2 3'-UTR. После этого он был вставлен, как указывалось ранее, на расстоянии 295 нт вверх по течению от стартового кодона COX2 AUG, который является некодирующей областью (рисунок 9B). Обратите внимание, что эта плазмида и, следовательно, в полученном митохондриальном геноме ЦОГ2 5' и 3' УТР дублируются. После бомбардировки этой плазмиды синтетические ро-клетки скрещиваются для цитодукции с рецепторным штаммом, который имеет обширную делецию области ЦОГ2 (аллель ЦОГ2-62 )1. Во время цитодукции митохондриальная плазмида синтетического штамма рекомбинирует с митохондриальной ДНК акцептора. Полученный митохондриальный геном имеет эктопическую конструкцию и ген WT COX2 . Таким образом, положительные колонии смогут расти в дыхательной среде (рисунок 9B).

Схема системы запуска микроносителей, настройка давления гелия, планшет для образца, разгонная трубка.
Рисунок 5: Схематическое изображение высокоскоростного оборудования для бомбардировки микроснарядами. В нашей лаборатории используется система доставки частиц Biolistic-PDS-1000/He (Таблица материалов). Сокращение: WPs = частицы вольфрама. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Диаграмма трансформации дрожжей и результаты чашки Петри, показывающие функциональность гена ARG в синтетической мтДНК.
Рисунок 6: Пример высокоскоростной преобразующей микроснарядной пластины. (A,B) После бомбардировки пластины инкубировали в течение 5-7 ночей при 30 °C. Если растет загрязнение (обозначено синей стрелкой), его можно вырезать стерильным шпателем. После репликации пластин на селективной маркерной среде (в данном случае -URA) мастер-пластину также проверяли на наличие митохондриальной плазмиды путем спаривания с тестером. В этом случае штамм тестера имеет нефункциональный аллель ARG8m-1 1. После спаривания в течение 2 ночей и репликации пластины на среде с недостаточным содержанием аргинина (-ARG) возникло четыре положительные колонии (обозначены красными стрелками). (В) Положительные синтетические колонии очистили путем их рестрикации на среде -URA, и провели тестирование реплики, как описано ранее. Эти пластины представляют собой третий раунд очищения. (D) Некоторые синтетические колонии утратили митохондриальную конструкцию. Сокращения: мтДНК = митохондриальная ДНК; -URA = отсутствует урацил; -ARG = недостаток аргинина. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Схема процесса интеграции бактериальных плазмид; перенос генов в мтДНК; концепция генной инженерии.
Рисунок 7: Диаграмма, показывающая, как отбирать положительные синтетические колонии после бомбардировки. (А) Бактериальная плазмида содержит нефункциональную мутировавшую версию митохондриального гена. Для обнаружения синтетические роколонии скрещивают с тестером, содержащим другую нефункциональную мутацию того же гена в митохондриальной ДНК. После скрещивания мутантные мтДНК рекомбинируют, и функциональный ген может быть восстановлен путем комплементации. Здесь диплоид произрастает на селективной среде, где ни синтетический штамм ро-, ни тестер не могут расти. (B) В этом случае плазмида содержит дополнительную последовательность митохондриального гена (т.е. фрагмент ЦОГ3). После трансформации синтетический штамм rho- отбирают по его способности комплементировать мутацию ЦОГ3 в тестерном штамме, поэтому только диплоиды могут расти на селективной среде (т.е. в дыхательной среде). Этот метод удобен, если тестер штамма для интересующего гена недоступен. Обнаружение положительных синтетических колоний в этом случае является косвенным. Сокращение: мтДНК = митохондриальная ДНК. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

эксперимент с чашкой Петри; процесс цитодукции; наблюдение за ростом дрожжей; оценка генетического переноса.
Рисунок 8: Пример цитодукции для интеграции конструкции в целевой локус в митохондриальной ДНК. После спаривания и восстановления смешанные клетки и биядерные зиготы помещались на среду, в которой отсутствовал лейцин. В этом случае, поскольку донорский штамм имеет аллель leu2,3-112, эта среда препятствует росту донора. Эта пластина была воспроизведена на той же среде (мастер-пластине), в среде, где могут расти только диплоиды (-ADE) и в среде, где может расти акцептор с предполагаемой мутацией (красные стрелки). При этом ни донорская, ни рецепторная клетки не могут расти на дыхательных средах. Только образовавшийся диплоид после сопряжения с газоном сорта тестер может расти на дыхательной среде. Эти дышащие диплоидные колонии являются руководством по отбору и очистке положительных колоний от эталонной пластины. Сокращения: -LEU = отсутствует лейцин; -ADE = отсутствует аденин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Диаграмма переноса митохондриальных генов с синтетическим родонором в процесс акцептора мтДНК.
Рисунок 9: Диаграмма, показывающая, как интегрировать мутировавшую митохондриальную конструкцию (присутствующую в синтетическом штамме rho) в акцепторный штамм. (A) В этом примере акцепторный штамм несет репортерный ген ARG8m, который заменяет кодоны из интересующего гена. Синтетическая ро-ДНК содержит мутировавшую версию этого гена. Плазмида и митохондриальная ДНК рекомбинируют через 5' и 3' фланговые области, и репортер ARG8m заменяется мутировавшей последовательностью интересующего гена. (B) Чужеродные гены могут быть эктопически вставлены в определенные области митохондриального генома 7,13,36. В этом примере ген может быть введен в положение на 295 nt выше гена COX2. Это некодирующая область мтДНК. Представляющий интерес чужеродный ген фланкирован 73 nt и 119 nt 5' UTR и 3' UTR COX2 соответственно. Эта конструкция вставляется в плазмиду, содержащую ген ЦОГ2 плюс 670 нт и 1120 нт 5' и 3' областей UTR. Синтетический штамм (донор) переносит эту конструкцию в митохондриях. В этом случае акцепторный штамм (XPM13)7 имеет значительную делецию гена cox2 (аллель cox2-62)1. После цитодукции митохондриальная ДНК донора и акцептора рекомбинируют. Ген ЦОГ2 восстанавливается, и представляющий интерес ген вставляется в эктопический участок (на 295 нт выше гена ЦОГ2). Сокращения: мтДНК = митохондриальная ДНК; nt = нуклеотиды. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Штамм дрожжейГенотипССЫЛКА
НАБ69Mata,ade2-101, arg8-delta::hisG, ura3-52, kar1-1 (rho0)1
НБ71Matα, ade2-101, ura3-52, leu2-delta, arg8-delta::URA3, kar1-1, (cox3Δ:ARG8m-1)1
XPM10bMatα, lys2, leu2-3,112, arg8::hisG, ura3-52 (rho+ , cox1∆::ARG8m)7
ХПМ209Matα, lys2, arg8::hisG, ura3-52, leu2-3, 112, (rho+, ΔΣai, COX1ΔC15)26
ХПМ199Mata,ade2-101, arg8-delta::hisG, ura3-52, kar1-1 (rho-, pXPM61)26
ХПМ13Matα, lys2, leu2-3,112, arg8::hisG,ura3-52, his3-deltaHindIII (rho+,cox2-62, cox1∆::ARG8m)7
Л45Matα, ade1, op1 (rho+, cox1-D369N)28

Таблица 1: Примеры штаммов дрожжей, используемых в биолистической трансформации и цитодукции.

Питательные средыКомпоненты
YPD2% глюкозы, 2% бактопептона, 1% экстракта дрожжей
YPR2% рафиноза, 2% бактопептон, 1% экстракт дрожжей
YPEG*3% глицерин, 3% этанол*1, 2% бактопептон, 1% экстракт дрожжей
Выпадающие носители информации2% глюкозы, 6,8% дрожжевого азотного основания с (NH4)2SO4, смесь аминокислот*2
Бомбардировочные СМИ5% глюкозы, 6,8% дрожжевого азота с (NH4)2SO4, 1 М сорбит, смесь выпадающих аминокислот*2,3.
*1 Добавляйте этанол после автоклавирования, когда фильтрующий материал нагрелся.
*2 Количество смеси аминокислот может варьироваться в зависимости от имеющихся запасов или количества, указанного производителем.
*3 Для бомбардировочной среды добавляйте аминокислоты и азотные основания по мере необходимости в зависимости от штамма дрожжей. Убедитесь, что состав специфичен для ауксотрофии на плазмиде объемом 2μл, используемой для выбора.

Таблица 2: Дрожжевые среды для выращивания, используемые в этом протоколе.

Обсуждение

В настоящей работе описано, как успешно трансформировать митохондрии из дрожжей S. cerevisiae . Процесс, начиная с высокоскоростной бомбардировки микроснарядами и заканчивая очисткой предполагаемого штамма дрожжей, занимает ~8-12 недель, в зависимости от того, сколько раундов очистки синтетического штамма необходимо. Некоторые из важнейших этапов метода заключаются в следующем. Во-первых, чем больше фланкирующие области, добавленные вокруг сайта мутации в митохондриальной генной конструкции, тем выше вероятность успешной интеграции целевой мутации. Минимальный размер фланкирующих областей составляет ~100 nt; Тем не менее, настоятельно рекомендуется использовать более 500 NT с каждой стороны мутации. Во-вторых, при отборе синтетических роколоний после трансформации рекомендуется проводить не более 3-4 раундов очистки; В противном случае существует высокий риск того, что в конечном итоге митохондриальная конструкция будет утрачена, так как нет селективного давления для удержания плазмиды в митохондриях. В-третьих, чтобы не навредить пользователю или оборудованию, вы должны внимательно прочитать инструкцию к машине для бомбардировки перед началом процедуры. Это оборудование является деликатным и использует высокое давление и вакуум.

Одним из ограничений этой процедуры является то, что до сих пор только дрожжи и зеленые водоросли C. reinhardtii являются кандидатами на трансформацию митохондрий с помощью этого метода. Было бы уместно, если бы мы могли вводить сайт-направленные мутации в митохондриальный геном от других организмов. Еще одно ограничение заключается в том, что сложно преобразовать множество различных конструкций в одном сеансе. Для каждой конструкции рекомендуется сделать шесть преобразований, каждое из которых необходимо протестировать, отобрать и очистить. Это приводит к получению более 50 пластин среды только для получения чистых роколоний с одной митохондриальной мутацией.

Несмотря на эти ограничения, возможность манипулировать митохондриальным геномом дрожжей внесла значительный вклад в понимание многих путей биогенеза дыхательных комплексов. Этот подход может быть использован для введения репортерных генов для мониторинга и количественной оценки митохондриальной трансляции 1,7,36,37, прерывания митохондриальных генов 38, идентификации шаперонов сборки дыхательных комплексов39, лучшего понимания механизмов сопряженной митохондриальной трансляции и сборки 7,11,12,36, и искать супрессоры при отслеживании экспрессии мутировавшего митохондриального гена40. До сих пор, несмотря на то, что ранеесообщалось о некоторых подходах к манипулированию митохондриальным геномом млекопитающих, для этих организмов не существует широко распространенного метода трансформации митохондриальной ДНК.

Раскрытие информации

Авторы не имеют никаких конфликтов интересов, которые можно было бы раскрыть.

Благодарности

Эта публикация была поддержана Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica (PAPIIT), UNAM [IN223623 к XP-M]. UPD является членом CONAHCYT (CVU:883299). Мы хотим поблагодарить доктора Арианн Мендоса-Мартинес за техническую помощь в получении изображений с помощью светового микроскопа. Лицензии Biorender: DU26OMVLUU (Рисунок 2); BK26TH9GXH (Рисунок 3); GD26TH80R5 (Рисунок 4); PU26THARYD (Рисунок 7); ML26THAIFG (Рисунок 9).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1 мл наконечники для пипетокAxygenT-1000-B
1,5 мл микропробиркиAxygenMCT-150-C
10 мл; L наконечники для пипетокAxygenT-10-C
15 мл коническая нижняя трубка AxygenSCT-25ML-25-S
200 μ L наконечники для пипетокAxygenT-200-Y
50 мл коническое дно  трубкаAxygenSCT-50ML-25-S
AfiIINew England BioLabsR0520S
AgaroseSeaKem50004
Аналитические весыOHAUSARA520
АвтоклавTOMYES-315
Bacto agarBD214010
Bacto peptoneBD211677
Biolisitic BIO-RAD1652322
горелка БунзенаVWR89038-528
Хлорид кальцияFisher ScientificC79-500
CSM -ADEFormediumDCS0049
CSM -ARGFormediumDCS0059
CSM -LEUFormediumDCS0099
CSM -URAFormedium
Стеклянная колба для культурKIMAX KIMBLE25615
Стеклянная тубадля культур Pyrex9820
ДекстрозаBD215520
ЭтанолJT Baker 9000
ЩипцыМиллипоры620006
Стеклянные бусиныSigmaZ265926
Стеклянная ручкаSigmaS4647
ГлицеринJT BAKER2136-01
Гелиевый бак класс 5 (99.99 %)--
HSTaq  НаборPCR BIO
МикроцентрифугаEppendorf022620100
NdeINew England BioLabsR0111L
Орбитальный шейкерНью-Брансуик ScientificNB-G25
ПЦР пробиркиAxygenPCR-02-C
PDS-1000/He TM Система доставки биолистических частицBIO-RAD165-2257
Чашки Петри (100X10)BD252777
QIAprep Spin MiniprepQiagen27106
RaffinoseFormediumRAF03
Реплика платераSciencewareZ363391
разрывные диски 1350 фунтов на квадратный дюймBIO-RAD1652330
сорбитSigmaS7547
СпермидинSigmaS0266
T4 ДНК-лигазаThermo ScientificEL0011
Ротатор для культуры тканейThermo Scientific88882015
Вольфрамовые микроносители M10BIO-RAD1652266
Вакуумный насос производительностью 100 л/мин-
Бархатные прокладкиBel-ArtH37848-0002
Вихрь Scientifc IndustriesSI-0236
Палочка для апликатора по деревуPROMA1820060
Экстракт дрожжейBD212750
Дрожжевая азотная основа без аминокислотBD291920
Держатель макроносителей DCS0169

Ссылки

  1. Bonnefoy, N., Fox, T. D. In vivo analysis of mutated initiation codons in the mitochondrial COX2 gene of Saccharomyces cerevisiae fused to the reporter gene ARG8m reveals lack of downstream reinitiation. Mol Gen Genet. 262 (6), 1036-1046 (2000).
  2. Franco, L. V. R., Su, C. H., McStay, G. P., Yu, G. J., Tzagoloff, A. Cox2p of yeast cytochrome oxidase assembles as a stand-alone subunit with the Cox1p and Cox3p modules. J Biol Chem. 293 (43), 16899-16911 (2018).
  3. Flores-Mireles, D., et al. The cytochrome b carboxyl terminal region is necessary for mitochondrial complex III assembly. Life Sci Alliance. 6 (7), (2023).
  4. Rubalcava-Gracia, D., Vázquez-Acevedo, M., Funes, S., Pérez-Martínez, X., González-Halphen, D. Mitochondrial versus nuclear gene expression and membrane protein assembly: the case of subunit 2 of yeast cytochrome. Mol Biol Cell. 29 (7), 820-833 (2018).
  5. García-Villegas, R., et al. The Cox1 C-terminal domain is a central regulator of cytochrome c oxidase biogenesis in yeast mitochondria. J Biol Chem. 292 (26), 10912-10925 (2017).
  6. Rak, M., et al. Yeast cells lacking the mitochondrial gene encoding the ATP synthase subunit 6 exhibit a selective loss of complex IV and unusual mitochondrial morphology. J Biol Chem. 282 (15), 10853-10864 (2007).
  7. Perez-Martinez, X., Broadley, S. A., Fox, T. D. Mss51p promotes mitochondrial Cox1p synthesis and interacts with newly synthesized Cox1p. EMBO J. 22 (21), 5951-5961 (2003).
  8. Sanchirico, M. E., Fox, T. D., Mason, T. L. Accumulation of mitochondrially synthesized Saccharomyces cerevisiae Cox2p and Cox3p depends on targeting information in untranslated portions of their mRNAs. EMBO J. 17 (19), 5796-5804 (1998).
  9. Saracco, S. A., Fox, T. D. Cox18p is required for export of the mitochondrially encoded Saccharomyces cerevisiae Cox2p C-tail and interacts with Pnt1p and Mss2p in the inner membrane. Mol Biol Cell. 13 (4), 1122-1131 (2002).
  10. McStay, G. P., Su, C. H., Thomas, S. M., Xu, J. T., Tzagoloff, A. Characterization of assembly intermediates containing subunit 1 of yeast cytochrome oxidase. J Biol Chem. 288 (37), 26546-26556 (2013).
  11. Golik, P., Bonnefoy, N., Szczepanek, T., Saint-Georges, Y., Lazowska, J. The Rieske FeS protein encoded and synthesized within mitochondria complements a deficiency in the nuclear gene. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (15), 8844-8849 (2003).
  12. Franco, L. V. R., et al. Allotopic expression of COX6 elucidates Atco-driven co-assembly of cytochrome oxidase and ATP synthase. Life Sci Alliance. 6 (11), e202301965(2023).
  13. Mireau, H., Arnal, N., Fox, T. D. Expression of Barstar as a selectable marker in yeast mitochondria. Mol Genet Genomics. 270 (1), 1-8 (2003).
  14. Cohen, J. S., Fox, T. D. Expression of green fluorescent protein from a recoded gene inserted into Saccharomyces cerevisiae mitochondrial DNA. Mitochondrion. 1 (2), 181-189 (2001).
  15. Suhm, T., et al. A novel system to monitor mitochondrial translation in yeast. Microb Cell. 5 (3), 158-164 (2018).
  16. Rzepka, M., Suhm, T., Ott, M. Incorporation of reporter genes into mitochondrial DNA in budding yeast. STAR Protoc. 3 (2), 101359(2022).
  17. Steele, D. F., Butler, C. A., Fox, T. D. Expression of a recoded nuclear gene inserted into yeast mitochondrial DNA is limited by mRNA-specific translational activation. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (11), 5253-5257 (1996).
  18. Flores-Mireles, D., Camacho-Villasana, Y., Pérez-Martínez, X. The ARG8m reporter for the study of yeast mitochondrial translation. Methods Mol Biol. 2661, 281-301 (2023).
  19. Perez-Martinez, X., Butler, C. A., Shingu-Vazquez, M., Fox, T. D. Dual functions of Mss51 couple synthesis of Cox1 to assembly of cytochrome c oxidase in Saccharomyces cerevisiae mitochondria. Mol Biol Cell. 20 (20), 4371-4380 (2009).
  20. Bonnefoy, N., Remacle, C., Fox, T. D. Genetic transformation of Saccharomyces cerevisiae and Chlamydomonas reinhardtii mitochondria. Methods Cell Biol. 80, 525-548 (2007).
  21. Veloso Ribeiro Franco, L., Barros, M. H. Biolistic transformation of the yeast Saccharomyces cerevisiae mitochondrial DNA. IUBMB Life. 75 (12), 972-982 (2023).
  22. Bonnefoy, N., Fox, T. D. Directed alteration of Saccharomyces cerevisiae mitochondrial DNA by biolistic transformation and homologous recombination. Methods Mol Biol. 372, 153-166 (2007).
  23. Butow, R. A., Henke, R. M., Moran, J. V., Belcher, S. M., Perlman, P. S. Transformation of Saccharomyces cerevisiae mitochondria using the biolistic gun. Methods Enzymol. 264, 265-278 (1996).
  24. Bonnefoy, N., Fox, T. D. Genetic transformation of Saccharomyces cerevisiae mitochondria. Methods Cell Biol. 65, 381-396 (2001).
  25. Shingú-Vázquez, M., et al. The carboxyl-terminal end of Cox1 is required for feedback assembly regulation of Cox1 synthesis in Saccharomyces cerevisiae mitochondria. J Biol Chem. 285 (45), 34382-34389 (2010).
  26. Bonnefoy, N., Bsat, N., Fox, T. D. Mitochondrial translation of Saccharomyces cerevisiae COX2 mRNA is controlled by the nucleotide sequence specifying the pre-Cox2p leader peptide. Mol Cell Biol. 21 (7), 2359-2372 (2001).
  27. Meunier, B., Lemarre, P., Colson, A. M. Genetic screening in Saccharomyces cerevisiae for large numbers of mitochondrial point mutations which affect structure and function of catalytic subunits of cytochrome-c oxidase. Eur J Biochem. 213 (1), 129-135 (1993).
  28. Dorweiler, J. E., Manogaran, A. L. Cytoduction and plasmiduction in yeast. Bio Protoc. 11 (17), 4146(2021).
  29. Zakharov, I. A., Yarovoy, B. P. Cytoduction as a new tool in studying the cytoplasmic heredity in yeast. Mol Cell Biochem. 14 (1-3), 15-18 (1977).
  30. Conde, J., Fink, G. R. A mutant of Saccharomyces cerevisiae defective for nuclear fusion. Proc Natl Acad Sci U S A. 73 (10), 3651-3655 (1976).
  31. Burke, D., Dawson, D., Stearns, T. Cold Spring Harbor Laboratory. Methods in yeast genetics : a Cold Spring Harbor Laboratory manual. 2000 ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
  32. Dunham, M. J., Gartenberg, M. R., Brown, G. W. : a. Methods in yeast genetics and genomics : a Cold Spring Harbor Laboratory course manual. 2015 edition. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2015).
  33. Ding, M. G., et al. Chapter 27 An improved method for introducing point mutations into the mitochondrial cytochrome B gene to facilitate studying the role of cytochrome B in the formation of reactive oxygen species. Methods Enzymol. 456, 491-506 (2009).
  34. Klein, C. J. L., Olsson, L., Nielsen, J. Glucose control in Saccharomyces cerevisiae: the role of Mig1 in metabolic functions. Microbiology (Reading). 144, Pt 1 13-24 (1998).
  35. Rolland, F., Winderickx, J., Thevelein, J. M. Glucose-sensing and -signalling mechanisms in yeast. FEMS Yeast Res. 2 (2), 183-201 (2002).
  36. Gruschke, S., et al. The Cbp3-Cbp6 complex coordinates cytochrome b synthesis with bc(1) complex assembly in yeast mitochondria. J Cell Biol. 199 (1), 137-150 (2012).
  37. Seshadri, S. R., Banarjee, C., Barros, M. H., Fontanesi, F. The translational activator Sov1 coordinates mitochondrial gene expression with mitoribosome biogenesis. Nucleic Acids Res. 48 (12), 6759-6774 (2020).
  38. Rak, M., Tzagoloff, A. F1-dependent translation of mitochondrially encoded Atp6p and Atp8p subunits of yeast ATP synthase. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (44), 18509-18514 (2009).
  39. He, S., Fox, T. D. Mutations affecting a yeast mitochondrial inner membrane protein, pnt1p, block export of a mitochondrially synthesized fusion protein from the matrix. Mol Cell Biol. 19 (10), 6598-6607 (1999).
  40. Rak, M., et al. Regulation of mitochondrial translation of the ATP8/ATP6 mRNA by Smt1p. Mol Biol Cell. 27 (6), 919-929 (2016).
  41. Barrera-Paez, J. D., Moraes, C. T. Mitochondrial genome engineering coming-of-age. Trends Genet. 38 (8), 869-880 (2022).

Перепечатки и разрешения

Теги

Saccharomyces cerevisiae
Митохондриальная трансформация у Бейкера
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.