Методическая статья

Перфузия печени крыс и выделение первичных гепатоцитов: старая процедура, имеющая решающее значение для создания передовых 3D-органоидов

3.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/66857

⸱

22 ноября 2024 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Italian Liver Foundation, 2Department of Life Sciences, University of Trieste

В этой статье

Краткое содержание

В этом протоколе представлен оптимизированный двухэтапный метод перфузии печени коллагеназой на модели крысы и показано использование выделенных гепатоцитов для долгосрочного культивирования 3D-органоидов in vitro .

Аннотация

Первичные гепатоциты являются широко используемым инструментом для исследований печени in vitro . Тем не менее, поддержание этих клеток всегда было проблемой из-за быстрой потери морфологии, жизнеспособности и функциональности в культуре. Недавний подход к долгосрочному культивированию заключается в создании трехмерных (3D) органоидов, инструмента in vitro , который может восстанавливать ткани в чашке, основываясь на удивительной способности печени к саморегенерации. Опубликованные протоколы были разработаны для получения долговременных функциональных 3D-органоидов из первичных взрослых гепатоцитов (Hep-Orgs). Передовой инструмент для 3D-органоидов требует возможности выделять клетки из тканей взрослого человека, и этот начальный шаг имеет решающее значение для получения высококачественного конечного результата. Двухступенчатая перфузия коллагеназы, введенная в 1970-х годах, до сих пор является действующей процедурой для получения одиночных гепатоцитов. Цель настоящей статьи – описать все важнейшие этапы хирургической процедуры, тем самым оптимизировав процедуру выделения первичных гепатоцитов на модели крысы. Более того, особое внимание уделяется рекомендациям PREPARE для повышения вероятности успешных процедур и обеспечения высококачественных результатов. Подробный протокол позволяет исследователям ускорить и оптимизировать последующую работу по созданию трехмерных органоидов из первичных гепатоцитов взрослых крыс. По сравнению с двумерными гепатоцитами, геп-орги все еще были жизнеспособны и находились в активной пролиферации на 15-й день, демонстрируя долгосрочный потенциал.

Введение

Первичные гепатоциты являются важным и широко используемым инструментом для исследований печени in vitro . Тем не менее, их расширение и поддержание исторически были сложными, так как они теряют морфологию и функциональность после нескольких дней в культуре1. 2D культура является лимитирующим условием, в частности, для гепатоцитов, имеющих многоугольную форму и поляризованную структуру с дифференцированными апикальными и базолатеральными мембранами. Фактически, адгезия гепатоцитов к пластине нарушает их нормальную активность, поскольку приводит к образованию плоского цитоскелета с ограниченным взаимодействием между клетками и между клетками и внеклеточным матриксом (ВКМ), снижая поляризацию и вовлеченные сигнальные пути2.

Чтобы обойти ограничения этого метода, Данн и его коллеги3 сначала использовали двойной слой коллагена. Этот метод культивирования, известный как «метод сэндвич-культуры», основан на посеве первичных гепатоцитов между двумя слоями матрицы. Этот метод имеет много преимуществ, включая долгосрочное культивирование, поддержание полигональной морфологии и транскрипционную активность, сравнимую с активностью свежевыделенных гепатоцитов4. Аналогичный метод, основанный на том же принципе, где подложка состоит из матригеля, а покрытие коллагена, свидетельствует о наличии хорошо установленной каналикулярной сети5.

Несмотря на надежность метода сэндвич-культуры для роста гепатоцитов, настоящая работа направлена на создание 3D-органоидной культуры, инструмента in vitro, используемого для рекапитуляции тканей в чашке и формирования потенциального моста к персонализированной медицине, позволяющего генерировать биологические идеи, специфичные для конкретного заболевания, идентифицировать молекулярные мишени, тестировать лекарства, создавать биобанки и открывать новые горизонты для инновационных технологий, таких как орган-на-чипе. Первичные гепатоциты были встроены в полусферические матричные капли, известные как «купола», чтобы обеспечить устойчивый рост органоидов внутри куполов и гарантировать поток растворимых факторов, включая фактор роста гепатоцитов (HGF) и эпидермальный фактор роста (EGF), из питательной среды. Эти факторы роста непосредственно активируют сигнальные пути для обеспечения выживания гепатоцитов7. Органоиды печени обычно получают из стволовых/прогениторных клеток, выделенных из эмбриональных стадий или взрослых крыс, мышей, печени человека (а также собак и кошек)8. Даже если 3D-конформация улучшает дифференцировку стволовых клеток до взрослых гепатоцитов, этому инструменту все еще не хватает зрелости исходной первичной ткани9. Чтобы преодолеть эту проблему, в 2018 году две разные группы 9,10 одновременно опубликовали протокол получения долговременной культуры 3D органоидов печени, начиная с первичных гепатоцитов взрослых мышей (называемых Hep-Orgs). Их протоколы резюмируют реакцию пролиферативного повреждения регенерации печени, выращивание гепатоцитов с высоким уровнем воспалительных цитокинов, как это происходит после частичной гепатэктомии. Действительно, вышеупомянутые исследования показывают, что гепатоциты могут переключаться в протоковое состояние после повреждения12 или когда пролиферация холангиоцитовподавляется13. Их бипотентная способность обеспечивает клеточную пластичность, что важно для сложных структур, таких как органоиды. Таким образом, эти протоколы преодолевают проблему невозможности расширения первичных гепатоцитов in vitro.

Передовой инструмент для 3D-органоидов требует возможности выделять клетки из тканей взрослого человека, и этот начальный шаг имеет решающее значение для получения высококачественного конечного результата. В то время как 3D-органоидный препарат можно считать недавним и развивающимся методом (потому что определение органоида было придумано Ланкастером-14 и Хуч-15 всего десять лет назад), двухступенчатая коллагеназная перфузия является старой процедурой, введенной Сегленом в 1970-х годах. Сосредоточившись на самых последних публикациях в этой области, протоколы Ng17 и Shen18 можно считать золотым стандартом для выполнения процедуры на крысах, в то время как протоколы Кабрал19 и Чарни-Натан20 для мышей. Нет ничего необычного в том, что исследователи сосредотачиваются на выборе лучшего внеклеточного матрикса (ВКМ) и факторов роста для разработки трехмерных органоидов, но при этом сталкиваются с такими неудачами, как неправильная хирургическая процедура, низкая жизнеспособность и выход гепатоцитов или высокий уровень бактериального загрязнения. Эти проблемы удлиняют последующие эксперименты и увеличивают количество животных, необходимых для последующих экспериментов. И наоборот, если хирургические и изоляционные процедуры хорошо организованы, большое количество полученных жизнеспособных гепатоцитов позволяет получить огромное количество органоидов, тем самым ограничивая использование животных. Настоящий протокол в основном решает эти проблемы с помощью коммерческих решений и оптимизации точной канюляции воротной вены, которая обеспечивает оптимальные этапы перфузии и пищеварения с печенью in situ.

Чтобы повысить качество, воспроизводимость и переводимость наших исследований на животных, мы тщательно изучили рекомендации PREPARE: Планирование исследований и экспериментальных процедур на животных: Рекомендации по совершенствованию21. Эти руководящие принципы отчетности направлены на повышение вероятности успеха за счет планирования и представляют собой важный шаг в реализации 3R Рассела и Берча (замена, сокращение и уточнение). Руководящие принципы PREPARE охватывают 15 основных тем, которые должны быть рассмотрены в соответствии с каждым отдельным исследовательским проектом. Мы опишем темы, на которые мы ориентировались во время планирования и подготовки проекта.

Цель настоящей работы состоит в том, чтобы описать в исчерпывающем, подробном и последовательном протоколе важнейшие этапы операции на модели крысы, чтобы позволить исследователям ускорить и оптимизировать последующую работу. Когда мы впервые обратились к этим протоколам, мы столкнулись с проблемами бактериального загрязнения, низкой эффективности переваривания печени, низкого выхода первичных гепатоцитов и низкой жизнеспособности гепатоцитов, которые могут легко повлиять на успех метода. Демонстрируя, как решать критические проблемы, этот протокол оптимизировал процедуру первичной изоляции гепатоцитов крыс. Перфузия печени крысы и последующая первичная выделение взрослых гепатоцитов являются основными подготовительными этапами для различных применений. В частности, этот протокол подходит для всех процедур, требующих хорошего выхода высококачественных и высокожизнеспособных взрослых гепатоцитов. Результаты протокола пригодны для создания моделей in vitro для изучения физиологии и патологии печени.

Протокол

Все процедуры и содержание животных проводились в соответствии с руководящими принципами итальянского законодательства и директивой Европейского Сообщества. Протокол эксперимента был одобрен местным Комитетом по уходу за животными и Министерством здравоохранения Италии (разрешение No 321/2022-PR) в соответствии со ст. 31 постановления 26/2014.

1. Подготовка к процедуре с животными

ПРИМЕЧАНИЕ: Пожалуйста, обратитесь к Таблице 1 для получения информации о составе среды и буфера и к Таблице материалов для получения коммерческих деталей.

  1. Нагрейте водяную баню до 42 °C, а затем поместите перфузионный буфер и 1x PBS в водяную баню примерно на 20 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за чувствительности ферментов буфер для пищеварения нагревается только после успешного начала процедуры перфузии. Во время процедуры перфузии выдерживайте растворы на водяной бане.
  2. Поместите на лед William's complete medium и PBS + 3% P/S.
  3. Подготовьте перистальтический насос и подсоедините трубку к стеклянной бутылке и пузырьковой ловушке, заполненным перфузионным буфером.
  4. Во время заливки насоса заполните трубку теплым буфером для перфузии, чтобы удалить воздух и смыть остатки этанола (низкая скорость насоса). На этом этапе также важно проверить правильность работы насоса и возможную утечку трубки.

2. Подготовка к выделению гепатоцитов

  1. Во время процедуры на животных подвергайте воздействию ультрафиолетового света следующие инструменты: чашка Петри 100 мм, ячеистое ситечко 100 мкм, скребок размера М, большой пинцет, стакан для льда, поднос для льда.

3. Первичная процедура на животных и анестезия

  1. Обезболивание взрослой крысы (250-350 г массы тела; возраст 10-12 недель) путем внутрибрюшинного введения смеси анестетиков (конечная концентрация для ксилазина: 22,5 мг/кг; для кетамина: 112,5 мг/кг; приблизительный конечный объем: 0,8-1,0 мл).
  2. Контролируйте глубину анестезии, щипая пальцы ног до тех пор, пока крыса не перестанет реагировать на вредные раздражители. Обычно это занимает 5 минут. Анестетическая доза обеспечивает глубокую хирургическую анестезию, которая сводит к минимуму риск страданий или стресса во время процедуры
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обескровливание является вторичным методом эвтаназии крыс, используемым в этом эксперименте, и он гарантирует, что животное было эффективно усыплено.
  3. Побрейте брюшную полость и очистите ее с помощью 70% этанола, чтобы уменьшить бактериальное загрязнение во время операции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это операция, не требующая выживания, поэтому полная асептика не поддерживается.
  4. Поместите крысу в середину лотка для вскрытия и закрепите конечности с помощью игл.
  5. Сделайте U-образный разрез через кожу и мышцу от центра нижней части живота к грудной клетке, зажмите кожу, и сложите ее до головы, обнажив кишечник.
  6. Осторожно переместите кишечник в левую сторону животного, из брюшной полости, и обнажите воротную вену печени и полую вену.
  7. С помощью плоскогубцев пропустите хлопчатобумажную нить под воротную жилу и подготовьте 2 узла, на расстоянии 1 см друг от друга, которые окружают саму жилу.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Черную нить легче визуализировать.
  8. Введите 100-150 МЕ гепарина, растворенного в 1x PBS (общий объем 300 мкл) в полую вену для предотвращения свертывания крови.

4. Канюляция и перфузия печени

  1. Включите насос на низких оборотах (расход менее 1 мл/мин).
  2. Введите ангиокатет 18 G в воротную вену на уровне нити под плоским углом относительно вены.
  3. Вручную удалите внутреннюю иглу, чтобы оставить канюлю в вене. Кровь будет течь внутри него, заполняя пробку и предотвращая попадание пузырьков воздуха на следующем этапе.
  4. Пока буфер перфузии течет по трубке, подсоедините канюлю, нажав кнопку C на выходном конце с помощью разъема с замком Люэра.
  5. На этом этапе завяжите узлы, один вокруг катетера внутри вены, а другой вокруг катетера, прежде чем войти в вену, чтобы стабилизировать трубку в правильном положении.
  6. Разрежьте полую вену, чтобы кровь вышла. Следите за тем, чтобы печень начала быстро (за секунды) набухать и отбеливаться через 2-3 с. Это подтверждает, что перфузионный буфер правильно протекает через печень.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если некоторые доли остаются красными, ангиокатетер устанавливается слишком глубоко. Если есть только красные пятна, легкое постукивание по печени может помочь перфузии в определенных точках. Налейте немного 1x PBS на открытую брюшную полость, чтобы помочь удалить кровь и проверить наличие подтеканий.
  7. Медленно увеличьте расход насоса до 10 мл/мин и поддерживайте его не менее 10 минут, чтобы обеспечить очищение печени от крови.
  8. Во время перфузии надавливайте на полую вену ватной палочкой с интервалом в 10 с: Убедитесь, что печень набухает при пережатии и расслабляется при освобождении. Периодически повторяйте надавливание (5-10 раз) и проверяйте наличие отека печени и расслабления.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап служит важной контрольной точкой для видимой валидации перфузии. Это сыграло важную роль в обеспечении высокой жизнеспособности гепатоцитов и максимизации конечного выхода. При активной проверке этого процесса буфер может эффективно достигать всех частей сосудистой сети печени, чего не удалось бы достичь только с помощью пассивного очищения крови.

5. Пищеварение печени

  1. После перфузии переключитесь на предварительно подогретый буфер для разложения, не прерывая поток и не допуская образования пузырьков воздуха в трубке.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Временное уменьшение потока может помочь выполнению этого отрывка. В состав буфера для разложения входит феноловый красный, что облегчает визуализацию переключения с буфера для перфузии на буфер для разложения.
  2. Увеличьте скорость помпы до 20 мл/мин и периодически надавливайте тампоном для отека печени и расслабления.
  3. После этого шага (длящийся около 15 минут) следите за тем, чтобы печень становилась все более мягкой. В этот момент иглу можно снять, а насос остановиться.
  4. Так как капсула печени после пищеварения хрупкая, аккуратно и осторожно рассеките печень: захватите щипцами центральную соединительную ткань между долями. Перережьте все соединения с другими органами и приподнимите печень.
  5. Промойте печень, погрузив ее на несколько секунд в предварительно охлажденный раствор PBS + 3% P/S. Затем поместите его в предварительно охлажденную пробирку William's Complete, содержащую среду.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обескровливание и смерть обеспечивают перфузию через полую вену. Подтверждением смерти животного является пневмоторакс, вызванный в момент эксплантации печени и полного рассечения диафрагмы, и при осмотре дыхание и сердцебиение больше не функционируют.

6. Очищение гепатоцитов

  1. Под биологический колпак переложите печень в чашку Петри на 100 мм с 15 мл холодной полной среды Вильямса над лотком, полным льда.
  2. Энергично надавите на орган скребком, чтобы освободить клетки в среде.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если фаза пищеварения выполнена правильно, высвобождение клеток должно быть легким и не требовать большого давления на печень. Не режьте печень на кусочки; Оставьте его в целости и сохранности. Погружение печени в среду улучшает высвобождение клеток.
  3. Соберите клетки, содержащие среду, и отфильтруйте их с помощью фильтра 100 мкм, переложив в стерильную коническую пробирку. Фильтрация позволяет удалить соединительные ткани и непереваренные фрагменты тканей.
  4. Вылейте около 15 мл холодной среды William's Complete на раздавленную печень в чашке Петри, чтобы помочь высвободить больше клеток. Повторите шаги 6.2 и 6.3.
  5. Повторите пункт 6.4 по крайней мере один раз, пока не высвободятся все клетки. При необходимости разделите среду на более конические пробирки и используйте несколько фильтров по 100 мкм.
    Примечание: После высвобождения гепатоцитов и до фильтрации среда должна выглядеть непрозрачной из-за присутствия гепатоцитов. Оставшаяся печень должна выглядеть волокнистой и будет отброшена.
  6. Отфильтрованную среду, содержащую клетки печени, центрифугируют при давлении 50 x g в течение 3 мин при 4 °C с помощью тормоза на низких оборотах.
    Примечание: Гепатоциты плотнее, чем другие клетки печени. Из-за низкой силы центрифугирования в грануле будут находиться только гепатоциты, в то время как другие клетки останутся в надосадочной жидкости.
  7. Выбросьте надосадочную жидкость, не нарушая клеточную гранулу. Осторожно добавьте в пробирку около 40 мл ледяной среды William's Complete и медленно пипетируйте вверх и вниз 2–3 раза, чтобы ресуспендировать клеточную гранулу.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Гранулу клетки необходимо осторожно ресуспендировать, чтобы не повредить клетки.
  8. Центрифугируйте при 50 x g в течение 3 мин при 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для первых попыток подсчитайте жизнеспособные клетки с помощью анализа трипанового синего в соотношении 1:10 после второго центрифугирования, прежде чем переходить к следующим этапам. Это позволяет избежать потери среды и времени, если все клетки мертвы.
  9. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 25 мл ледяной полной среды William's.
  10. Добавьте в пробирку 25 мл 90% раствора градиента плотности и аккуратно перемешайте.
    Примечание: Раствор градиента плотности отделяет жизнеспособные гепатоциты от мертвых гепатоцитов и клеточного мусора в зависимости от их плотности.
  11. Центрифугируйте при 200 x g в течение 10 минут при 4 °C. На дне пробирки должна быть получена видимая гранула, соответствующая жизнеспособным гепатоцитам, и прозрачный слой сверху градиента, состоящий из мертвых гепатоцитов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если гранулы нет вообще, попробуйте снова перемешать раствор, взболтав, и повторите центрифугирование.
  12. Отсадите слой мертвых клеток от верхней части градиента и оставьте 1-2 мл среды вместе с гранулой.
  13. Суспендируйте гранулу в 30-40 мл полной среды William's.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для всей процедуры используйте только 25 мл серологических пипеток. Пипетки меньшего диаметра могут снизить жизнеспособность гепатоцитов. Все этапы следует проводить на льду для поддержания +4°C.
  14. Центрифугируйте при 200 x g в течение 10 минут при 4°C, затем отаскайте надосадочную жидкость.

7. Культура гепатоцитов и сбор РНК

  1. Добавьте соответствующее количество среды для подсчета клеток. Подсчитайте жизнеспособность клеток с помощью трипанового синего 1:10.
  2. 2D посев гепатоцитов
    1. Пластинчатые клетки в концентрации 500 000 клеток/лунку 6-луночной чашки на клеточной пластине, покрытой коллагеном, с предварительно нагретой полной средой Уильяма.
    2. Поместите клеточную культуру во увлажненный инкубатор с 95% воздуха, 5%CO2 при 37 °C.
    3. Через 4 ч смените среду на новую предварительно подогретую среду William's complete.
    4. Держите клетки в инкубаторе. Меняйте среду ежедневно.
    5. Соберите первичные гепатоциты в реагент для экстракции РНК перед осаждением (день 0) и на 1-3 день посева.
    6. Извлечь РНК в соответствии с протоколом производителя и провести обратную транскрибацию ее в кДНК для оценки генов-маркеров печени методом ОТ-кПЦР. Праймерный список представлен в таблице 2.
  3. Для 3D долгосрочного посева гепатоцитов:
    1. Ресуспендировать клетки в холодной чистой матрице в концентрации 1000-10000 клеток в 20 мкл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Старайтесь избегать создания матричных пузырей.
    2. С помощью предварительно охлажденных наконечников для пипеток капли, содержащие матрикс планшета, помещают их в предварительно нагретый планшет для клеточной культуры.
    3. Переверните тарелку вверх дном и оставьте в инкубаторе для клеточных культур на 20-30 минут.
    4. Включите его и добавьте предварительно нагретую 3D среду для долговременного хранения гепатоцитов и специальную культуральную среду в соответствии с работойПэна 22. Держите клетки в инкубаторе.
    5. Меняйте среду 3D гепатоцитов длительного действия каждые 2-3 дня.
    6. По крайней мере, после 14 дней культивирования Hep-Orgs отделяют от матрицы, а жизнеспособные Hep-Orgs оценивают с помощью анализа Trypan blue и EdU и пропускают в соответствии с работой Пэна.

Результаты

В конце процедур настройки (шаг 6.13) мы получили выход клеток до 1 x 108 клеток на выделение из печени около 300 г крысы. Жизнеспособность клеток в диапазоне от 78% до 97% была установлена с помощью подсчета трипанового синего цвета.

Как уже было описано в предыдущих исследованиях 1,18,19, первичные гепатоциты в культуре теряют свою морфологию, специфичные для печени функции и погибают в течение нескольких дней.

В литературе23,24 хорошо известно, что первичные взрослые гепатоциты быстро теряют кубовидно-гексагональную морфологию, в течение нескольких дней приобретают «фибробластоподобную» форму и погибают. На рисунке 1 изображены различные фазы: через 4 ч после нанесения на пластину, покрытую коллагеном, гепатоциты прилипают к поверхности, распределяясь типичным монослоем, демонстрирующим кубовидную морфологию, края клеток определяются, соединения между клетками линейны, а поверхность клеток выглядит гладкой (рис. 1А). В 1-й день первичные гепатоциты приобретают свою типичную гексагональную форму, и становятся видны липидные капли (рис. 1В). На 2-3 день количество липидных капель увеличивается (Рисунок 1C-1D), в то время как на 4-5 день клетки накапливают стрессовые волокна актина (Рисунок 1E-F). Мы также оценили процент жизнеспособных клеток в первичной 2D-культуре с 1-го по 5-й день и сравнили его с жизнеспособностью до осаждения на 0-й день (рис. 2). Уже в первые дни культивирования можно наблюдать резкое снижение жизнеспособности, достигающее 49,5% (стандартное отклонение 12,7) в 1-й день, которое снижается до 45,2% (стандартное отклонение 18,2) во второй день и 33,5% (стандартное отклонение 0,77) в 3-й день. Процент жизнеспособных клеток на 4-й день составляет уже 16,9% (SD 5,4), в то время как на 5-й день достигает 9,1% (SD 0,38). Таким образом, очевидно, что потеря морфологии сопровождается быстрой прогрессирующей гибелью взрослых гепатоцитов в 2D-культуре.

Выделенные гепатоциты до платирования (день 0) показали высокую экспрессию мРНК генов маркеров печени (ABCD3, ALB, KRT18, PCK1, SERPIN, TDO2), оцененных с помощью ОТ-кПЦР (рис. 3). Все анализируемые гены демонстрируют зависящее от культуры во времени снижение экспрессии уже на 1-е сутки в культуре. Уровни экспрессии мРНК указывают на потерю функциональности и жизнеспособности первичных гепатоцитов в течение этого времени.

Изолированные гепатоциты были покрыты 3D-матричными каплями и трехмерными органоидными клеточными структурами с течением времени. На 1-й день посева одиночные гепатоциты суспендируются в матричных каплях (рис. 4А). Концентрация клеток намеренно поддерживается на низком уровне, чтобы обеспечить гепатоцитам достаточное пространство для роста. Кроме того, это позволяет нам визуально следить за ростом органоидов. Первичные гепатоциты показали клеточное деление в первые несколько дней культивирования (рисунок 4C). Более того, в то время как в День 0 Геп-Орги измерялись на 30 мкм, на День 2 Геп-Орги почти удвоили свои размеры, подчеркивая рост размеров, который сохранялся до 15-го дня (33,08 мкм в 1-й день; 64,86 мкм во 2-й день; 45,06 мкм в 5-й день; 55,19 мкм в 7-й день; 51,93 мкм в 10-й день; 62,90 мкм 15-го дня). Что касается формы Hep-Orgs, то в то время как в первый день они были круглой формы, в последующие дни они достигали «формы грозди винограда» (типичной для печеночных органоидов).

Гепатоциты, пластинированные в 3D-матрицу, остаются живыми в культуре в течение нескольких недель, демонстрируя жизнеспособность 23% ±10% через 15 дней при использовании анализа трипанового синего (рис. 4B, первый ряд). Чтобы подтвердить пролиферацию Hep-организаций крыс, на 15-й день был проведен тест EdU (рисунок 4D). Тем не менее, окрашивание по методу Хёхста показало высокое количество одиночных клеток, а не Hep-Orgs, присутствовала пролиферативная активность гепатоцитов (зеленых клеток), даже если включение EdU было низким (9% ± 7%) (рис. 4B, второй ряд).

figure-results-1
Рисунок 1: Первичные гепатоциты 2D культивируются на пластинах, покрытых коллагеном, с течением времени. Изображения были получены при 20-кратном увеличении с помощью (А) фазово-контрастной микроскопии через 4 часа после нанесения покрытия, (В) в 1-й день, в 2-й день, в 3-й день, в 3-й день, в 4-й день, в 5-й день. На каждом снимке отображается масштабная линейка, соответствующая 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2: Жизнеспособные первичные клетки в 2D-культуре на пластинах, покрытых коллагеном. На графике показано процентное соотношение жизнеспособных клеток с 1-го по 5-й день по сравнению с жизнеспособными клетками, покрытыми в 0-й день, составляющим 100%. Результаты представлены в виде единичных повторений, среднего значения и SD 3 различных экспериментов (* p-значение ≤ 0,05; ** p-значение ≤ 0,005). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-3
Рисунок 3: экспрессия мРНК печеночных маркеров, измеренная методом ОТ-кПЦР в первичных гепатоцитах. Результаты были нормализованы по β-актину и/или GAPDH (генам хозяйственного хозяйства) и экспрессированы по отношению к первичным гепатоцитам, собранным перед посевом в день 0, рассматриваемые как 1. Результаты представлены в виде среднего SD ±, по крайней мере, 3 различных экспериментов (**+ p-значение ≤ 0,001). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-4
Рисунок 4: Культивирование 3D гепатоцитов в матричных каплях с течением времени. (А) Изолированные гепатоциты, покрытые матриксными каплями для долговременных Hep-Orgs: на рисунке матричные капли видны на поверхности лунки (красный круг = одна капля). (B) Процент жизнеспособных клеток трипановым синим и пролиферативных клеток EdU на 15-й день до пассажа. Количественное определение положительных клеток EdU проводилось с помощью программного обеспечения ImageJ2. Результаты представлены в процентах как среднее±SD, по крайней мере, 3 различных экспериментов. (C) Фазово-контрастные изображения 3D-культуры крыс Hep-Orgs в разные дни роста в 3D-культуре: день 1, 2, 5, 7, 10, 15. Увеличение изображения 20Х. На каждом снимке отображается масштабная линейка, соответствующая 50 мкм. (D) Инкорпорирующий анализ EdU крысиных Hep-Orgs на 15-й день. Увеличение изображения 20X. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Таблица 1: Буферы и состав среды. В таблице указано название и компоненты (с их конечной концентрацией) всех буферов и клеточных сред, используемых в протоколе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 2: Список грунтовок для крыс. В таблице приведен список праймеров, используемых для экспериментов с ОТ-кПЦР. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Обсуждение

3D-органоиды являются рубежом для персонализированной медицины и позволяют проводить долгосрочное культивирование гепатоцитов. Качество этой инновационной методики требует хорошего выхода жизнеспособных первичных гепатоцитов и хорошо выполненной перфузии печени и выделения гепатоцитов. Эта старая процедура до сих пор широко используется; Тем не менее, он включает в себя различные этапы, которые могут быть сложными. Подходя к процедуре, мы столкнулись с такими серьезными проблемами, как бактериальное загрязнение, низкая эффективность переваривания печени, низкий выход первичных гепатоцитов и низкая жизнеспособность гепатоцитов, которые могут легко повлиять на успех метода. Начиная с протоколов золотого стандарта 17,18, здесь мы расскажем, как преодолеть распространенные проблемы, проясним наиболее важные шаги в выделении первичных гепатоцитов крысы и обобщим разрозненные советы, которые могут легко повлиять на успех метода в модели крыс. Несмотря на то, что процедура перфузии печени является довольно сложной и требует от оператора точных знаний, она гарантирует высококачественные результаты с точки зрения выхода, целостности, жизнеспособности и функциональности первичных гепатоцитов. Эти особенности имеют важное значение для последующих этапов.

При планировании проекта мы тщательно учитывали контрольный список рекомендацийPREPARE 21. Особое внимание уделялось литературе прошлых лет, сравнивая различные предыдущие работы и вступая в контакт с некоторыми авторами (контрольный список рекомендаций PREPARE _topic А1). Органоидный инструмент сам по себе является важным способом сокращения численности животных, поскольку клетки могут размножаться в культуре до 7 месяцев (контрольный список рекомендаций PREPARE _topic А3). В ходе диалога с персоналом ветеринарного учреждения мы выбрали опытного техника, который оказал помощь в проведении процедуры и способствовал предотвращению использования излишков экспериментальных животных (контрольный список рекомендаций PREPARE _topic B5). Был получен соответствующий перистальтический насос, необходимый для проведения перфузии печени (контрольный список рекомендаций PREPARE _topic B6).

Публикации Ng17 и Shen18 являются самыми последними публикациями, описывающими эту процедуру на крысах. Основные вопросы, рассматриваемые в настоящем протоколе, не рассмотренные в предыдущих, касаются использования коммерческих решений и оптимизации точной канюляции воротной вены, которая обеспечивает оптимальные этапы перфузии и пищеварения, сохраняя печень на месте. В то время как в протоколах Shen18 и Ng17 использовались домашние растворы, наш протокол основан на коммерческих растворах для перфузии и сбраживания для снижения вариабельности в приготовлении буфера. Избыток концентрации фермента пищеварения может быть агрессивным по отношению к гепатоцитам и влиять на качество и жизнеспособность клеток25. Использование коммерческих решений имеет решающее значение для улучшения воспроизводимости протокола, гарантируя стандартизацию. Кроме того, протокол, выполняемый Ng17 , может быть сложным из-за необходимости удаления печени до фазы пищеварения. Наш протокол основан на перфузии и переваривании печени без ее удаления до тех пор, пока не будут выполнены обе фазы, это упрощает процедуру. С точки зрения выхода и жизнеспособности клеток результаты нашего протокола сопоставимы с предыдущими работами.

Очистка и дезинфекция перфузионных трубок до и после процедуры, а также дезинфекция кожи перед началом операции очень важны для ограничения бактериального загрязнения. Кроме того, полное высыхание трубки после очистки этанолом и последующей промывки средой имеет решающее значение для повышения жизнеспособности клеток. На самом деле, даже один укол этанола, введенный в печень, вызовет гибель клеток во время процедуры.

Важна температура вводимого раствора, но также необходимо учитывать чувствительность фермента коллагеназы к температуре. По этой причине мы предварительно разогрели перфузионный буфер до 42 °C перед началом хирургической процедуры, в то время как буфер для пищеварения мы поместили в согревающую ванну только на этапе перфузии. Добавление ловушки для пузырьков к трубке перед катетером предотвращает попадание вырвавшихся пузырьков в катетер, а также попадание воздуха в печень, когда раствор для перфузиизаканчивается.

Состав буфера, давление перфузии и скорость потока должны находиться в соответствующем диапазоне17. Мы обнаружили, что низкое давление и низкая скорость потока приводят к низкому выходу и отрицательно влияют на жизнеспособность клеток, поскольку буфер не может достичь мелких сосудов. С другой стороны, скорость потока не должна быть слишком высокой, чтобы сохранить капсулу Глиссона в целости. Поскольку для целостности клеточной адгезии требуется Ca2 + 18, перфузионный буфер представляет собой раствор без Ca2+, содержащий ЭДТА для атаки на кальцийсодержащие мостики между клетками, поэтому он необходим для удаления кальция и вымывания крови из печени. Время перфузии 8-15 мин при скорости потока 10 мл/мин имеет решающее значение для того, чтобы все клетки были охвачены раствором ЭДТА, без Ca2+. Недостаточная перфузия может привести к снижению пищеварения. 

Буфер для расщепления содержит Ca2+, так как коллагеназа, которая переваривает коллагеновый матрикс, зависит от Ca2+ . Скорость потока буфера для расщепления должна поддерживаться на уровне не менее 20 мл/мин, а время зависит от емкости коллагеназы. В случае специфического буфера для разложения, который мы используем, нам необходимо провести перфузию 15 минут для конечного объема раствора 300 мл. Если пищеварение неполное, межклеточные соединения сохраняются, и последовательное механическое давление повреждает клетки, снижая их жизнеспособность. Медленное увеличение скорости потока способствует снижению стрессового воздействия перфузии на клетки. Во время операции мы сосредоточились на преходящем пережатии нижней полой вены и последующем отеке печени: этот проход значительно улучшил как эффективность пищеварения, так и восстановление клеток. В конце пищеварения печень должна выглядеть светло-коричневой и мягкой. После завершения резекции печени промывка изолированной печени при PBS +3% P/S снижает бактериальный титул и помогает избежать загрязнения на следующей части процедуры.

На этапах выделения гепатоцитов под биологическим колпаком использование серологических пипеток объемом 25 мл позволяет избежать снижения жизнеспособности гепатоцитов при использовании пипеток меньшего диаметра. Мы добавили необязательный этап для увеличения выхода первичного гепатоцита, который заключается в выливании полной среды Уильяма на разбитую печень для повторения этапа выскабливания под капюшоном. Этот этап выполняется после фильтрации высвобождаемой клетками среды из изолированной печени, и это помогает очистить Петри и восстановить больше клеток из печеночной капсулы. Если необходимо приложить высокое давление для перемещения гепатоцитов через фильтры, жизнеспособность клеток будет низкой19.

Неспособность гепатоцитов культивироваться в 2D в течение более 2 дней привела нас к поиску альтернативной долгосрочной модели культивирования. Подходящей моделью для культивирования гепатоцитов в течение более длительного времени является взрослый Hep-Org. По сравнению с двумерными гепатоцитами, Hep-Orgs оказались все еще жизнеспособными и активно пролиферировали на 15-й день, демонстрируя долгосрочный потенциал.

Перфузия печени крысы и последующая первичная выделение взрослых гепатоцитов являются основными подготовительными этапами для различных применений. Несмотря на то, что воспроизводимость может быть ограничением метода, поскольку процедура включает в себя множество этапов и переменных, внимание к визуальному описанию процедуры помогает воспроизвести метод с высоким процентом успеха. Указывая на критические стадии и показывая, как их решать, этот протокол оптимизирует процедуру выделения первичных гепатоцитов крыс и результаты, подходящие для создания моделей in vitro , таких как поколение Hep-Orgs, с целью изучения физиологии и патологии печени.

Раскрытие информации

Все авторы раскрыли все конфликты интересов.

Благодарности

Мы благодарим доктора Давиде Селвестрель и профессора Джованни Соррентино из SorrentinoLab Университета Триеста за помощь в проведении анализа пролиферации EdU. Работа была поддержана специальным грантом Banca d'Italia и внутренними грантами FIF.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
A83-01- Ингибитор ALK5 IVTwin Helix  T3031
B27Thermofisher Scientific0080085SA
CFX Connect Система обнаружения ПЦР в реальном времени   Bio-Rad
CHIR99021Twin HelixT2310
Click EdU Alexa 488 imaging kitThermofisher ScientificC10499
Collagen, Type I, раствор из крысиного хвостаMerckC3867-1VL
Dexamethasone MerckD4902
ЭФРMerck  E9644
Фетальная бычья сыворотка (FBS)EurocloneECS0180L
GELTREX LDEV FREE RGF BMEThermofisher ScientificA1413202
гепарин натрия 25000 МЕ/5 млB. Braun Melsungen AGB01AB01
HGFPeprotech  100-39H 
Инсулин-Трансферрин-Селен раствор 100x Thermofisher Scientific41400045
раствор L-глютаминаEurocloneECB3000D
Liver Digest Medium Thermofisher Scientific  17703-034
Перфузия печени MediumThermofisher Scientific17701038
добавка N2Thermofisher Scientific17502048
N-ацетилцистеинMerckA9165
НикотинамидMerck  N-0636
Заменимые аминокислотыMerckM7145
НормоцинАурогенant-nr-1
PBS буфер 1XPanReac AppliChemA0964,9050
Пенициллин-стрептомицин раствор 100xEurocloneECB3001D
PercollSanta Cruzsc-296039A
Перистальтический насосIsmatec™  MS-4/12 Цифровой насос
ТНФаПепротех  300-01A
Реагент TRIMerckT9424
Трубка Ismatec™    ID.2,79mm
Williams' E Medium, без глютаминаThermofisher Scientific31415029
Y27632Twin HelixT1725

Ссылки

  1. Heslop, J. A., et al. Mechanistic evaluation of primary human hepatocyte culture using global proteomic analysis reveals a selective dedifferentiation profile. Arch Toxicol. 91 (1), 439-452 (2017).
  2. Ietto, G., et al. Multicellular liver organoids: Generation and importance of diverse specialized cellular components. Cells. 12 (10), 1429(2023).
  3. Dunn, J. C., Tompkins, R. G., Yarmush, M. L. Hepatocytes in collagen sandwich: evidence for transcriptional and translational regulation. J Cell Biol. 116 (4), 1043-1053 (1992).
  4. Keemink, J., Oorts, M., Annaert, P. Primary Hepatocytes in sandwich culture. Methods in Mol Biol (Clifton, N.J). 1250, 175-188 (2015).
  5. Kaur, I., et al. Primary hepatocyte isolation and cultures: Technical aspects, challenges and advancements. Bioengineering (Basel, Switzerland). 10 (2), 131(2023).
  6. Thompson, W. L., Takebe, T. Human liver model systems in a dish. Dev Growth Differ. 63 (1), 47-58 (2021).
  7. Takebe, T., Wells, J. M. Organoids by design. Science (New York, N.Y.). 364 (6444), 956-959 (2019).
  8. Nantasanti, S., de Bruin, A., Rothuizen, J., Penning, L. C., Schotanus, B. A. Concise review: organoids are a powerful tool for the study of liver disease and personalized treatment design in humans and animals. Stem Cells Transl Med. 5 (3), 325-330 (2016).
  9. Raju, R., et al. In vitro pluripotent stem cell differentiation to hepatocyte ceases further maturation at an equivalent stage of e15 in mouse embryonic liver development. Stem Cells Dev. 27 (13), 910-921 (2018).
  10. Peng, W. C., et al. Inflammatory cytokine TNFalpha promotes the long-term expansion of primary hepatocytes in 3D culture. Cell. 175 (6), 1607-1619.e15 (2018).
  11. Hu, H., et al. Long-term expansion of functional mouse and human hepatocytes as 3d organoids. Cell. 175 (6), 1591-1606.e19 (2018).
  12. Michalopoulos, G. K., Bowen, W. C., Mulè, K., Lopez-Talavera, J. C., Mars, W. Hepatocytes undergo phenotypic transformation to biliary epithelium in organoid cultures. Hepatology (Baltimore, Md). 36 (2), 278-283 (2002).
  13. Schaub, J. R., et al. De novo formation of the biliary system by TGFβ-mediated hepatocyte transdifferentiation. Nature. 557 (7704), 247-251 (2018).
  14. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies. Science (New York, N.Y.). 345 (6194), 1247125(2014).
  15. Huch, M., Koo, B. -K. Modeling mouse and human development using organoid cultures. Development (Cambridge, England). 142 (18), 3113-3125 (2015).
  16. Seglen, P. O. Preparation of isolated rat liver cells. Methods in Cell Biol. 13, 29-83 (1976).
  17. Ng, I. C., et al. Isolation of primary rat hepatocytes with multiparameter perfusion control. J Vis Exp. (170), e62289(2021).
  18. Shen, L., Hillebrand, A., Wang, D. Q. -H., Liu, M. Isolation and primary culture of rat hepatic cells. J Vis Exp. (64), e3917(2012).
  19. Cabral, F., et al. Purification of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from mouse liver perfusion. J Vis Exp. (132), e56993(2018).
  20. Charni-Natan, M., Goldstein, I. Protocol for primary mouse hepatocyte isolation. STAR protoc. 1 (2), 100086(2020).
  21. Smith, A. J., Clutton, R. E., Lilley, E., Hansen, K. E. A., Brattelid, T. PREPARE: Guidelines for planning animal research and testing. Lab Anim. 52 (2), 135-141 (2018).
  22. Kluiver, T. A., Kraaier, L. J., Peng, W. C. Long-term expansion of murine primary hepatocyte organoids. Methods in Molecular Biol (Clifton, N.J). 2544, 1-13 (2022).
  23. Shulman, M., Nahmias, Y. Long-term culture and coculture of primary rat and human hepatocytes. Methods in Molecular Biol (Clifton, N.J). 945, 287-302 (2013).
  24. Knobeloch, D., et al. Human hepatocytes: isolation, culture, and quality procedures. Methods in Molecular Biol (Clifton, N.J). 806, 99-120 (2012).
  25. Queral, A. E., DeAngelo, A. B., Garrett, C. T. Effect of different collagenases on the isolation of viable hepatocytes from rat liver. Anal Biochem. 138 (1), 235-237 (1984).

Перепечатки и разрешения

Теги

3DPercoll
Перфузия печени крыс и выделение первичных гепатоцитов: старая процедура, имеющая решающее значение для создания передовых 3D-органоидов
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.