Для изучения иммунного ответа на расстройства мозга одним из распространенных подходов является анализ изменений в иммунных клетках. Здесь представлены два простых и эффективных протокола для выделения иммунных клеток из ткани мозга мыши и костного мозга черепа.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Выделение иммунных клеток из мозга и черепа мыши
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Все больше данных указывает на то, что иммунный ответ, вызванный нарушениями работы мозга (например, ишемией мозга и аутоиммунным энцефаломиелитом), происходит не только в мозге, но и в черепе. Ключевым шагом на пути к анализу изменений в популяциях иммунных клеток как в головном мозге, так и в костном мозге черепа после повреждения головного мозга (например, инсульта) является получение достаточного количества высококачественных иммунных клеток для последующего анализа. В данном случае предлагаются два оптимизированных протокола для выделения иммунных клеток из головного мозга и костного мозга черепа. Преимущества обоих протоколов заключаются в их простоте, скорости и эффективности в получении большого количества жизнеспособных иммунных клеток. Эти клетки могут быть пригодны для ряда последующих применений, таких как сортировка клеток, проточная цитометрия и транскриптомный анализ. Чтобы продемонстрировать эффективность протоколов, были проведены эксперименты по иммунофенотипированию на головном мозге, перенесшем инсульт, и нормальном мозге, черепе, костном мозге с использованием анализа проточной цитометрии, и результаты согласуются с результатами опубликованных исследований.
Введение
Мозг, центральный узел нервной системы, защищен черепом. Под черепом находятся три слоя соединительной ткани, известные как мозговые оболочки - твердая мозговая оболочка, паутинная оболочка и мягкая мозговая оболочка. Спинномозговая жидкость (ликвор) циркулирует в субарахноидальном пространстве между паутинной оболочкой и мозговой оболочкой, смягчая работу мозга и выводя отходы через глимфатическую систему 1,2. В совокупности эта уникальная архитектура обеспечивает безопасную и благоприятную среду, которая поддерживает стабильность мозга и защищает его от потенциальных травм.
Мозг долгое время считался иммунным привилегией. Тем не менее, эта идея была частично отвергнута, поскольку все больше доказательств указывают на то, что, в дополнение к резидентной микроглии в паренхиме, границы мозга, включая сосудистое сплетение и мозговые оболочки, содержат разнообразный набор иммунныхклеток. Эти клетки играют важнейшую роль в поддержании гомеостаза, наблюдении за здоровьем мозга и инициировании иммунного ответа на повреждение мозга. Примечательно, что последние результаты показывают, что череп участвует в иммунитете мозговых оболочек и может способствовать иммунному ответу в мозге после травмы. В 2018 году Herisson et al. сделали плодотворное открытие прямых сосудистых каналов, которые связывают костный мозг черепа с мозговыми оболочками, тем самым установив анатомический маршрут миграции лейкоцитов. Позже Cugurra et al. продемонстрировали, что многие миелоидные клетки (например, моноциты и нейтрофилы) и В-клетки в мозговых оболочках происходят неиз крови. Используя такие методы, как трансплантация костного лоскута и селективные схемы облучения, авторы предоставили убедительные доказательства того, что костный мозг черепа служит местным источником миелоидных клеток в мозговых оболочках, а также паренхимы ЦНС после повреждения ЦНС. Кроме того, в другом исследовании было высказано предположение, что менингеальные В-клетки постоянно снабжаются костным мозгом черепа7. Совсем недавно была идентифицирована новая структура, получившая название выход из паутинной манжеты (АПФ), как прямые ворота между твердой мозговой оболочкой и мозгомдля транспортировки иммунных клеток.
Эти захватывающие результаты имеют важное значение для происхождения инфильтрирующих иммунных клеток в поврежденный мозг (например, после ишемического инсульта). Большое количество доказательств указывает на то, что после инсульта многие иммунные клетки проникают в мозг, способствуя как острому повреждению мозга, так и его хроническому восстановлению. Общепринятое мнение заключается в том, что эти клетки являются циркулирующими лейкоцитами в крови, которые проникают в мозг, что в значительной степени облегчается повреждением гематоэнцефалического барьера, вызванным инсультом. Однако это представление было оспорено. В одном исследовании иммунные клетки в черепе и большеберцовой кости мышей были помечены по-разному, и через 6 ч после инсульта было обнаружено значительно большее снижение нейтрофилов и моноцитов в черепе по сравнению с . Большеберцовая кость и другие нейтрофилы, полученные из черепа, присутствовали в ишемизированном мозге. Эти данные свидетельствуют о том, что в фазе острого инсульта нейтрофилы в ишемизированном мозге в основном происходят из костного мозга черепа4. Интересно, что CSF может направлять эту миграцию. Действительно, два недавних исследования показали, что спинномозговая жидкость может напрямую передавать сигнальные сигналы от мозга в костный мозг черепа через каналы черепа, а также управлять миграцией клеток и кроветворением в костном мозге черепа после повреждения ЦНС.
В свете этих последних результатов стало важным анализировать изменения в иммунных клетках как в мозге, так и в костном мозге черепа при изучении иммунного ответа на нарушения в мозге. В таких исследованиях требуется достаточное количество высококачественных иммунных клеток для последующих анализов, таких как сортировка клеток, анализ проточной цитометрии и секвенирование РНК одиночных клеток (scRNA-seq). Общая цель состоит в том, чтобы представить две оптимизированные процедуры для получения суспензий одиночных клеток из ткани мозга и костного мозга черепа. Важно отметить, что кальвария (лобная кость, затылочная кость и теменные кости) черепа обычно используются для извлечения костного мозга, и этот костный мозг конкретно упоминается как костный мозг черепа на протяжении всего этого исследования.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Протокол был одобрен Комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Института Дьюка. В данном исследовании использовались самцы мышей C57Bl/6 (в возрасте 3-4 месяцев; 22-28 г). Подробная информация об используемых реагентах и оборудовании приведена в Таблице материалов.
1. Суспензия одиночных клеток из мозга мыши
ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 1 представлен обзор протокола выделения клеток головного мозга.
- Обезболите, интубируйте и закрепите мышь, как было показано ранее11.
- Сделайте верхний надрез брюшной полости через кожу и нижележащие мышечные слои и осторожно прорежьте диафрагму и ребра, чтобы создать отверстие в грудную полость.
- Наполните шприц объемом 30 мл холодной PBS и прикрепите его к тупой перфузионной игле с помощью силиконовой трубки. Осторожно введите перфузионную иглу в левый желудочек.
- Сделайте небольшой надрез в правом предсердии, чтобы обеспечить отток крови, а затем перфузируйтемышь со скоростью потока ~ 10 мл/мин в течение 3-4 минут.
Примечание: Для улучшения выведения крови из крови в мозге можно рассмотреть увеличение объема перфузионного раствора и добавление гепарина. - Обезглавите мышь и сделайте разрез по средней линии кожи на макушке головы, чтобы обнажить череп.
- Аккуратно соскребите любую соединительную ткань, лежащую над черепом, с помощью тупых щипцов.
- С помощью острых ножниц для рассечения аккуратно прорежьте череп швами по средней линии и с обеих сторон, создавая лоскут.
- Аккуратно поднимите лоскут черепа, чтобы обнажить мозг, и с помощью тупых щипцов осторожно удалите мозг из полости черепа.
- Погрузите мозг в чашку Петри, содержащую ледяной PBS, и удалите все оставшиеся ткани мозговой оболочки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для лучшего сохранения жизнеспособности клеток рекомендуется выполнять все следующие действия на льду или при температуре 4 °C. - Поместите мозг в предварительно охлажденный стеклянный гомогенизатор Dounce объемом 15 мл, содержащий 20 мл (весь мозг) или 12 мл (половина мозга) ледяного буфера HBSS.
- Используйте рассыпчатый пестик Dounce, чтобы мягко и медленно диссоциировать мозговую ткань примерно 100-120 ударами по льду.
Примечание: Этот шаг имеет решающее значение для получения большого количества здоровых клеток мозга. Этот шаг занимает примерно 10 минут. Прекратите гомогенизацию, когда в суспензии не видно существенных фрагментов мозговой ткани. В этот момент пестик может легко сдвинуться вниз без какого-либо усилия. - Полученную суспензию мозговой ткани отфильтровать через клеточный фильтр 70 мкм в центрифужной пробирке объемом 50 мл.
- Промойте пробирку Dounce 5 мл HBSS и продолжайте фильтрацию, чтобы максимально увеличить сбор клеток.
- Центрифугируйте отфильтрованную тканевую суспензию при давлении 550 х г в течение 6 мин при 4 °С.
- Удалите надосадочную жидкость с помощью вакуумного аспиратора и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 1 мл 30% изотонического раствора градиента плотности.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы приготовить 15 мл 30% раствора изотонического градиента плотности, смешайте 4,5 мл 100% среды с градиентом плотности, 1,5 мл 10× PBS и 9 мл ddH2O. - Перенесите клеточную суспензию в центрифужную пробирку объемом 15 мл и добавьте 9 мл (весь мозг) или 6 мл (половина мозга) 30% раствора градиента плотности.
- Аккуратно переверните трубку, чтобы обеспечить тщательное перемешивание.
- Немедленно центрифугируйте трубку при давлении 845 x g с ускорением и тормозом, установленным на уровне 3, в течение 20 минут при 4 °C.
- Аккуратно извлеките пробирку из центрифуги, не встряхивая, и осторожно отсасывайте верхний слой миелина с помощью наконечника объемом 1 мл, подключенного к вакууму.
ПРИМЕЧАНИЕ: Крайне важно не потревожить этот слой. Любой оставшийся миелин может негативно повлиять на здоровье клеток и поставить под угрозу последующие анализы. - Аспирируйте надосадочную жидкость, оставляя 1-2 мл после нее, и повторно суспендируйте клеточную гранулу минимум 10 мл холодного HBSS.
- Центрифугируйте при 550 x g в течение 6 мин при 4 °C.
- Промойте еще один раз минимум 7 мл холодного HBSS.
- Удалите как можно больше надосадочной жидкости и повторно суспендируйте клетки для анализа проточной цитометрии, используя 100-200 мкл буфера для проточной цитометрии.
ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер FACS для проточной цитометрии, используемый в этом исследовании, содержит 0,5% БСА и 2 мМ ЭДТА в 1× PBS. Для минимизации потерь клеток на этапах промывки рекомендуется использовать 96-луночную пластину с V-образным дном для окрашивания клеток. - Выполнение анализа проточной цитометрии с использованием стандартного протокола, установленного в отдельных лабораториях13.
- Кратко смешайте 80 мкл клеточной суспензии с 20 мкл смеси антител в 96-луночном V-образном планшете и инкубируйте в течение 25 мин при 4 °С.
- Промойте 200 мкл буфера FACS, а затем повторно суспендируйте клетки 100 мкл HBSS плюс реагент для окрашивания жизнеспособности клеток.
- После 15-минутной инкубации при 4 °C промыть с помощью буфера FACS и повторно суспендировать клетки в 200 мкл буфера FACS для анализа проточной цитометрии.
2. Приготовление одноклеточной суспензии костного мозга из кальварии мышей
ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 2 представлен обзор процедуры выделения костного мозга черепа.
- Выполните конфузию мыши, как описано в шаге 1.4.
- Обезглавите мышь и сделайте разрез кожи по средней линии на волосистой части головы, чтобы обнажить череп.
- Разрежьте череп насквозь, начиная от большого затылочного отверстия и двигаясь вперед по боковым сторонам кальварии с помощью острых ножниц. Затем поднимите и снимите кальварию.
Примечание: Мозг может быть собран у той же мыши и обработан с использованием шага 1, что позволяет анализировать иммунные клетки как из мозга, так и из костного мозга черепа. - Осторожно отклейте твердую мозговую оболочку от черепа под препарирующим микроскопом с помощью тупых щипцов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Легче начинать с краев затылочной кости, медленно отделяться и неуклонно продвигаться к лобной области, двигаясь внутрь. - Поместите кальварию в посуду на лед и с помощью пипетки объемом 1 мл промойте кальварию, обеспечив удаление остатков крови с ее поверхности.
- Переложите кальварию в новое блюдо со свежей, холодной PBS, достаточной для погружения кальварии.
- С помощью стерильных ножниц разрежьте кальварию на фрагменты размером примерно 3 мм х 3 мм в холодном PBS.
ПРИМЕЧАНИЕ: Методы обрезки могут повлиять на эффективность экстракции костного мозга из кальварии. Рекомендуется использовать один и тот же метод обрезки, чтобы свести к минимуму изменчивость. Также важно разрезать швы. На рисунке 2B показан один из подходов. - Проделайте отверстие в дне микроцентрифужной пробирки объемом 500 мкл с помощью иглы 18 G.
- Вставьте эту пробирку в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл, содержащую 20 мкл холодной PBS.
- Перенесите фрагменты кальварии в пробирку объемом 500 μл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Костные фрагменты должны быть неплотно упакованы для повышения эффективности экстракции. - Центрифуга при давлении 10 000 x g в течение 30 с при 4 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы максимизировать восстановление клеток, используйте иглу 18 G, чтобы аккуратно перемешать фрагменты кальварии, и повторите этот шаг еще 1-2 раза. - Ресуспендируйте собранные клетки костного мозга кальварии в 500 мкл буфера для лизиса эритроцитов и инкубируйте при комнатной температуре в течение 30 с.
- Перенесите суспензию в центрифужную пробирку объемом 15 мл, содержащую 4 мл холодного PBS.
- Центрифугируйте при 400 x g в течение 6 мин при 4 °C.
- Умойтесь еще раз 5 мл холодной PBS.
- Повторно суспендируйте клеточную гранулу в соответствующем буфере. Для проточной цитометрии мы обычно используем 500 мкл буфера FACS.
- Для анализа проточной цитометрии выполните подсчет клеток и используйте примерно 1 x 106 клеток для окрашивания антителами.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обязательно включите этап блокировки Fc перед окрашиванием антител13.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Для получения иммунных клеток из ткани мозга мыши протокол обычно дает клетки с высокой жизнеспособностью (84,1% ± 2,3% [среднее ± SD]). Примерно 70-80% этих клеток являются CD45-положительными. В нормальном мозге мышей почти все клетки CD45+ представляют собой микроглию (CD45LowCD11b+), как и ожидалось. Этот протокол использовался в лаборатории для различных приложений, включая анализ проточной цитометрии, сортировку флуоресцентно-активируемых клеток (FACS) и анализ scRNA-seq. В качестве...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Здесь представлены два простых, но эффективных протокола для выделения иммунных клеток из мозга и костного мозга черепа. Эти протоколы могут надежно получать большое количество жизнеспособных иммунных клеток, которые могут быть пригодны для различных последующих применений, в частности, для проточной цитометрии.
Для изучения нейровоспаления при различных заболеваниях мозга было разработано множество протоколов подготовки иммунных клеток из мозга, которые используются в различных лабораториях 1...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Благодарности
Мы благодарим Кэти Гейдж за ее замечательный редакторский вклад. Иллюстративные рисунки были созданы с помощью BioRender.com. Это исследование было поддержано средствами отделения анестезиологии (Медицинский центр Университета Дьюка) и грантами NIH NS099590, HL157354 и NS127163.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
```html
```
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 0.5 мл микроцентрифужные пробирки | VWR | 76332-066 | |
| 1.5 мл микроцентрифужные пробирки | VWR | 76332-068 | |
| 15 мл конические пробирки | Thermo Fisher Scientific | 339651 | |
| 18 G x 1 дюйм BD PrecisionGlide игла | BD Biosciences | 305195 | |
| 1x HBSS | Gibco | 14175-095 | |
| 50 мл конические пробирки | Thermo Fisher Scientific | 339653 | |
| 96-лунковые пластинки с V-образным дном | SARSTEDT | 82.1583 | |
| Флоу-цитометр AURORA | Cytek bioscience | ||
| БСА | Fisher | BP9706-100 | |
| CD11b-AF594 | BioLegend | 101254 | 1:500 разбавление |
| CD19-BV785 | BioLegend | 115543 | 1:500 разбавление |
| CD19-FITC | BioLegend | 115506 | 1:500 разбавление |
| CD3-APC | BioLegend | 100312 | 1:500 разбавление |
| CD3-PE | BioLegend | 100206 | 1:500 разбавление |
| CD45-Alex 700 | BioLegend | 103128 | 1:500 разбавление |
| CD45-BV421 | Biolegend | 103133 | 1:500 разбавление |
| Клеточный фильтр 70 мкм | Avantor | 732-2758 | |
| Пинцет для перевязки | V. Mueller | NL1410 | |
| ЭДТА | Invitrogen | 15575-038 | |
| Fc Block | Biolegend | 101320 | 1:100 разбавление |
| Пинцет | Roboz | RS-5047 | |
| Набор для окрашивания клеток LIVE/DEAD Fixable Blue | Thermo Fisher Scientific | N7167 | 1:500 разбавление |
| Ly6G-BV421 | BioLegend | 127628 | 1:500 разбавление |
| Ly6G-PerCp-cy5.5 | BioLegend | 127615 | 1:500 разбавление |
| NK1.1-APC-cy7 | BioLegend | 108723 | 1:500 разбавление |
| Percoll (грануляционная среда) | Cytiva | 17089101 | |
| Фосфатный буферный раствор (10x) | Gibco | 70011-044 | |
| Буфер лизиса эритроцитов (10x) | BioLegend | 420302 | |
| Ножницы | SKLAR | 64-1250 | |
| WHEATON Dounce тканевая ступка, размер 15 мл | DWK Life Sciences | 357544 |
Ссылки
- Bohr, T., et al. The glymphatic system: Current understanding and modeling. iScience. 25 (9), 104987(2022).
- Jiang-Xie, L. F., et al. Neuronal dynamics direct cerebrospinal fluid perfusion and brain clearance. Nature. 627 (8002), 157-164 (2024).
- Goertz, J. E., Garcia-Bonilla, L., Iadecola, C., Anrather, J. Immune compartments at the brain's borders in health and neurovascular diseases. Semin Immunopathol. 45 (3), 437-449 (2023).
- Herisson, F., et al. Direct vascular channels connect skull bone marrow and the brain surface enabling myeloid cell migration. Nat Neurosci. 21 (9), 1209-1217 (2018).
- Mazzitelli, J. A., et al. Skull bone marrow channels as immune gateways to the central nervous system. Nat Neurosci. 26 (12), 2052-2062 (2023).
- Cugurra, A., et al. Skull and vertebral bone marrow are myeloid cell reservoirs for the meninges and CNS parenchyma. Science. 373 (6553), 7844(2021).
- Brioschi, S., et al. Heterogeneity of meningeal b cells reveals a lymphopoietic niche at the CNS borders. Science. 373 (6553), 9277(2021).
- Smyth, L. C. D., et al. Identification of direct connections between the dura and the brain. Nature. 627, 165-173 (2024).
- Mazzitelli, J. A., et al. Cerebrospinal fluid regulates skull bone marrow niches via direct access through dural channels. Nat Neurosci. 25 (5), 555-560 (2022).
- Pulous, F. E., et al. Cerebrospinal fluid can exit into the skull bone marrow and instruct cranial hematopoiesis in mice with bacterial meningitis. Nat Neurosci. 25 (5), 567-576 (2022).
- Li, R., et al. Mouse cardiac arrest model for brain imaging and brain physiology monitoring during ischemia and resuscitation. J Vis Exp. (194), e65340(2023).
- Wang, W., et al. Development and evaluation of a novel mouse model of asphyxial cardiac arrest revealed severely impaired lymphopoiesis after resuscitation. J Am Heart Assoc. 10 (11), e019142(2021).
- Li, X., et al. Single-cell transcriptomic analysis of the immune cell landscape in the aged mouse brain after ischemic stroke. J Neuroinflammation. 19 (1), 83(2022).
- Wang, Y. C., et al. Perk (protein kinase RNA-like er kinase) branch of the unfolded protein response confers neuroprotection in ischemic stroke by suppressing protein synthesis. Stroke. 51 (5), 1570-1577 (2020).
- Posel, C., Moller, K., Boltze, J., Wagner, D. C., Weise, G. Isolation and flow cytometric analysis of immune cells from the ischemic mouse brain. J Vis Exp. (108), e53658(2016).
- Srakocic, S., et al. Proposed practical protocol for flow cytometry analysis of microglia from the healthy adult mouse brain: Systematic review and isolation methods' evaluation. Front Cell Neurosci. 16, 1017976(2022).
- Disano, K. D., et al. Isolating central nervous system tissues and associated meninges for the downstream analysis of immune cells. J Vis Exp. (159), e61166(2020).
- Mattei, D., et al. Enzymatic dissociation induces transcriptional and proteotype bias in brain cell populations. Int J Mol Sci. 21 (21), (2020).
- Mcgill, C. J., Lu, R. J., Benayoun, B. A. Protocol for analysis of mouse neutrophil netosis by flow cytometry. STAR Protoc. 2 (4), 100948(2021).
- Su, Y., et al. Meningeal immunity and neurological diseases: New approaches, new insights. J Neuroinflammation. 20 (1), 125(2023).
- Niu, C., et al. Mechanical isolation of neonatal and adult mouse dura leukocytes for flow cytometry analysis. STAR Protoc. 4 (2), 102272(2023).
- Roussel-Queval, A., Rebejac, J., Eme-Scolan, E., Paroutaud, L. A., Rua, R. Flow cytometry and immunohistochemistry of the mouse dural meninges for immunological and virological assessments. STAR Protoc. 4 (1), 102119(2023).
- Louveau, A., Filiano, A. J., Kipnis, J. Meningeal whole mount preparation and characterization of neural cells by flow cytometry. Curr Protoc Immunol. 121 (1), e50(2018).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
