Методическая статья

Выделение иммунных клеток из мозга и черепа мыши

DOI:

10.3791/66861

⸱

26 июля 2024 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Multidisciplinary Brain Protection Program (MBPP), Department of Anesthesiology, Duke University Medical Center

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для изучения иммунного ответа на расстройства мозга одним из распространенных подходов является анализ изменений в иммунных клетках. Здесь представлены два простых и эффективных протокола для выделения иммунных клеток из ткани мозга мыши и костного мозга черепа.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все больше данных указывает на то, что иммунный ответ, вызванный нарушениями работы мозга (например, ишемией мозга и аутоиммунным энцефаломиелитом), происходит не только в мозге, но и в черепе. Ключевым шагом на пути к анализу изменений в популяциях иммунных клеток как в головном мозге, так и в костном мозге черепа после повреждения головного мозга (например, инсульта) является получение достаточного количества высококачественных иммунных клеток для последующего анализа. В данном случае предлагаются два оптимизированных протокола для выделения иммунных клеток из головного мозга и костного мозга черепа. Преимущества обоих протоколов заключаются в их простоте, скорости и эффективности в получении большого количества жизнеспособных иммунных клеток. Эти клетки могут быть пригодны для ряда последующих применений, таких как сортировка клеток, проточная цитометрия и транскриптомный анализ. Чтобы продемонстрировать эффективность протоколов, были проведены эксперименты по иммунофенотипированию на головном мозге, перенесшем инсульт, и нормальном мозге, черепе, костном мозге с использованием анализа проточной цитометрии, и результаты согласуются с результатами опубликованных исследований.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мозг, центральный узел нервной системы, защищен черепом. Под черепом находятся три слоя соединительной ткани, известные как мозговые оболочки - твердая мозговая оболочка, паутинная оболочка и мягкая мозговая оболочка. Спинномозговая жидкость (ликвор) циркулирует в субарахноидальном пространстве между паутинной оболочкой и мозговой оболочкой, смягчая работу мозга и выводя отходы через глимфатическую систему 1,2. В совокупности эта уникальная архитектура обеспечивает безопасную и благоприятную среду, которая поддерживает стабильность мозга и защищает его от потенциальных травм.

Мозг долгое время считался иммунным привилегией. Тем не менее, эта идея была частично отвергнута, поскольку все больше доказательств указывают на то, что, в дополнение к резидентной микроглии в паренхиме, границы мозга, включая сосудистое сплетение и мозговые оболочки, содержат разнообразный набор иммунныхклеток. Эти клетки играют важнейшую роль в поддержании гомеостаза, наблюдении за здоровьем мозга и инициировании иммунного ответа на повреждение мозга. Примечательно, что последние результаты показывают, что череп участвует в иммунитете мозговых оболочек и может способствовать иммунному ответу в мозге после травмы. В 2018 году Herisson et al. сделали плодотворное открытие прямых сосудистых каналов, которые связывают костный мозг черепа с мозговыми оболочками, тем самым установив анатомический маршрут миграции лейкоцитов. Позже Cugurra et al. продемонстрировали, что многие миелоидные клетки (например, моноциты и нейтрофилы) и В-клетки в мозговых оболочках происходят неиз крови. Используя такие методы, как трансплантация костного лоскута и селективные схемы облучения, авторы предоставили убедительные доказательства того, что костный мозг черепа служит местным источником миелоидных клеток в мозговых оболочках, а также паренхимы ЦНС после повреждения ЦНС. Кроме того, в другом исследовании было высказано предположение, что менингеальные В-клетки постоянно снабжаются костным мозгом черепа7. Совсем недавно была идентифицирована новая структура, получившая название выход из паутинной манжеты (АПФ), как прямые ворота между твердой мозговой оболочкой и мозгомдля транспортировки иммунных клеток.

Эти захватывающие результаты имеют важное значение для происхождения инфильтрирующих иммунных клеток в поврежденный мозг (например, после ишемического инсульта). Большое количество доказательств указывает на то, что после инсульта многие иммунные клетки проникают в мозг, способствуя как острому повреждению мозга, так и его хроническому восстановлению. Общепринятое мнение заключается в том, что эти клетки являются циркулирующими лейкоцитами в крови, которые проникают в мозг, что в значительной степени облегчается повреждением гематоэнцефалического барьера, вызванным инсультом. Однако это представление было оспорено. В одном исследовании иммунные клетки в черепе и большеберцовой кости мышей были помечены по-разному, и через 6 ч после инсульта было обнаружено значительно большее снижение нейтрофилов и моноцитов в черепе по сравнению с . Большеберцовая кость и другие нейтрофилы, полученные из черепа, присутствовали в ишемизированном мозге. Эти данные свидетельствуют о том, что в фазе острого инсульта нейтрофилы в ишемизированном мозге в основном происходят из костного мозга черепа4. Интересно, что CSF может направлять эту миграцию. Действительно, два недавних исследования показали, что спинномозговая жидкость может напрямую передавать сигнальные сигналы от мозга в костный мозг черепа через каналы черепа, а также управлять миграцией клеток и кроветворением в костном мозге черепа после повреждения ЦНС.

В свете этих последних результатов стало важным анализировать изменения в иммунных клетках как в мозге, так и в костном мозге черепа при изучении иммунного ответа на нарушения в мозге. В таких исследованиях требуется достаточное количество высококачественных иммунных клеток для последующих анализов, таких как сортировка клеток, анализ проточной цитометрии и секвенирование РНК одиночных клеток (scRNA-seq). Общая цель состоит в том, чтобы представить две оптимизированные процедуры для получения суспензий одиночных клеток из ткани мозга и костного мозга черепа. Важно отметить, что кальвария (лобная кость, затылочная кость и теменные кости) черепа обычно используются для извлечения костного мозга, и этот костный мозг конкретно упоминается как костный мозг черепа на протяжении всего этого исследования.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протокол был одобрен Комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Института Дьюка. В данном исследовании использовались самцы мышей C57Bl/6 (в возрасте 3-4 месяцев; 22-28 г). Подробная информация об используемых реагентах и оборудовании приведена в Таблице материалов.

1. Суспензия одиночных клеток из мозга мыши

ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 1 представлен обзор протокола выделения клеток головного мозга.

  1. Обезболите, интубируйте и закрепите мышь, как было показано ранее11.
  2. Сделайте верхний надрез брюшной полости через кожу и нижележащие мышечные слои и осторожно прорежьте диафрагму и ребра, чтобы создать отверстие в грудную полость.
  3. Наполните шприц объемом 30 мл холодной PBS и прикрепите его к тупой перфузионной игле с помощью силиконовой трубки. Осторожно введите перфузионную иглу в левый желудочек.
  4. Сделайте небольшой надрез в правом предсердии, чтобы обеспечить отток крови, а затем перфузируйтемышь со скоростью потока ~ 10 мл/мин в течение 3-4 минут.
    Примечание: Для улучшения выведения крови из крови в мозге можно рассмотреть увеличение объема перфузионного раствора и добавление гепарина.
  5. Обезглавите мышь и сделайте разрез по средней линии кожи на макушке головы, чтобы обнажить череп.
  6. Аккуратно соскребите любую соединительную ткань, лежащую над черепом, с помощью тупых щипцов.
  7. С помощью острых ножниц для рассечения аккуратно прорежьте череп швами по средней линии и с обеих сторон, создавая лоскут.
  8. Аккуратно поднимите лоскут черепа, чтобы обнажить мозг, и с помощью тупых щипцов осторожно удалите мозг из полости черепа.
  9. Погрузите мозг в чашку Петри, содержащую ледяной PBS, и удалите все оставшиеся ткани мозговой оболочки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для лучшего сохранения жизнеспособности клеток рекомендуется выполнять все следующие действия на льду или при температуре 4 °C.
  10. Поместите мозг в предварительно охлажденный стеклянный гомогенизатор Dounce объемом 15 мл, содержащий 20 мл (весь мозг) или 12 мл (половина мозга) ледяного буфера HBSS.
  11. Используйте рассыпчатый пестик Dounce, чтобы мягко и медленно диссоциировать мозговую ткань примерно 100-120 ударами по льду.
    Примечание: Этот шаг имеет решающее значение для получения большого количества здоровых клеток мозга. Этот шаг занимает примерно 10 минут. Прекратите гомогенизацию, когда в суспензии не видно существенных фрагментов мозговой ткани. В этот момент пестик может легко сдвинуться вниз без какого-либо усилия.
  12. Полученную суспензию мозговой ткани отфильтровать через клеточный фильтр 70 мкм в центрифужной пробирке объемом 50 мл.
  13. Промойте пробирку Dounce 5 мл HBSS и продолжайте фильтрацию, чтобы максимально увеличить сбор клеток.
  14. Центрифугируйте отфильтрованную тканевую суспензию при давлении 550 х г в течение 6 мин при 4 °С.
  15. Удалите надосадочную жидкость с помощью вакуумного аспиратора и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 1 мл 30% изотонического раствора градиента плотности.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы приготовить 15 мл 30% раствора изотонического градиента плотности, смешайте 4,5 мл 100% среды с градиентом плотности, 1,5 мл 10× PBS и 9 мл ddH2O.
  16. Перенесите клеточную суспензию в центрифужную пробирку объемом 15 мл и добавьте 9 мл (весь мозг) или 6 мл (половина мозга) 30% раствора градиента плотности.
  17. Аккуратно переверните трубку, чтобы обеспечить тщательное перемешивание.
  18. Немедленно центрифугируйте трубку при давлении 845 x g с ускорением и тормозом, установленным на уровне 3, в течение 20 минут при 4 °C.
  19. Аккуратно извлеките пробирку из центрифуги, не встряхивая, и осторожно отсасывайте верхний слой миелина с помощью наконечника объемом 1 мл, подключенного к вакууму.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Крайне важно не потревожить этот слой. Любой оставшийся миелин может негативно повлиять на здоровье клеток и поставить под угрозу последующие анализы.
  20. Аспирируйте надосадочную жидкость, оставляя 1-2 мл после нее, и повторно суспендируйте клеточную гранулу минимум 10 мл холодного HBSS.
  21. Центрифугируйте при 550 x g в течение 6 мин при 4 °C.
  22. Промойте еще один раз минимум 7 мл холодного HBSS.
  23. Удалите как можно больше надосадочной жидкости и повторно суспендируйте клетки для анализа проточной цитометрии, используя 100-200 мкл буфера для проточной цитометрии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер FACS для проточной цитометрии, используемый в этом исследовании, содержит 0,5% БСА и 2 мМ ЭДТА в 1× PBS. Для минимизации потерь клеток на этапах промывки рекомендуется использовать 96-луночную пластину с V-образным дном для окрашивания клеток.
  24. Выполнение анализа проточной цитометрии с использованием стандартного протокола, установленного в отдельных лабораториях13.
    1. Кратко смешайте 80 мкл клеточной суспензии с 20 мкл смеси антител в 96-луночном V-образном планшете и инкубируйте в течение 25 мин при 4 °С.
    2. Промойте 200 мкл буфера FACS, а затем повторно суспендируйте клетки 100 мкл HBSS плюс реагент для окрашивания жизнеспособности клеток.
    3. После 15-минутной инкубации при 4 °C промыть с помощью буфера FACS и повторно суспендировать клетки в 200 мкл буфера FACS для анализа проточной цитометрии.

2. Приготовление одноклеточной суспензии костного мозга из кальварии мышей

ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 2 представлен обзор процедуры выделения костного мозга черепа.

  1. Выполните конфузию мыши, как описано в шаге 1.4.
  2. Обезглавите мышь и сделайте разрез кожи по средней линии на волосистой части головы, чтобы обнажить череп.
  3. Разрежьте череп насквозь, начиная от большого затылочного отверстия и двигаясь вперед по боковым сторонам кальварии с помощью острых ножниц. Затем поднимите и снимите кальварию.
    Примечание: Мозг может быть собран у той же мыши и обработан с использованием шага 1, что позволяет анализировать иммунные клетки как из мозга, так и из костного мозга черепа.
  4. Осторожно отклейте твердую мозговую оболочку от черепа под препарирующим микроскопом с помощью тупых щипцов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Легче начинать с краев затылочной кости, медленно отделяться и неуклонно продвигаться к лобной области, двигаясь внутрь.
  5. Поместите кальварию в посуду на лед и с помощью пипетки объемом 1 мл промойте кальварию, обеспечив удаление остатков крови с ее поверхности.
  6. Переложите кальварию в новое блюдо со свежей, холодной PBS, достаточной для погружения кальварии.
  7. С помощью стерильных ножниц разрежьте кальварию на фрагменты размером примерно 3 мм х 3 мм в холодном PBS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Методы обрезки могут повлиять на эффективность экстракции костного мозга из кальварии. Рекомендуется использовать один и тот же метод обрезки, чтобы свести к минимуму изменчивость. Также важно разрезать швы. На рисунке 2B показан один из подходов.
  8. Проделайте отверстие в дне микроцентрифужной пробирки объемом 500 мкл с помощью иглы 18 G.
  9. Вставьте эту пробирку в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл, содержащую 20 мкл холодной PBS.
  10. Перенесите фрагменты кальварии в пробирку объемом 500 μл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Костные фрагменты должны быть неплотно упакованы для повышения эффективности экстракции.
  11. Центрифуга при давлении 10 000 x g в течение 30 с при 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы максимизировать восстановление клеток, используйте иглу 18 G, чтобы аккуратно перемешать фрагменты кальварии, и повторите этот шаг еще 1-2 раза.
  12. Ресуспендируйте собранные клетки костного мозга кальварии в 500 мкл буфера для лизиса эритроцитов и инкубируйте при комнатной температуре в течение 30 с.
  13. Перенесите суспензию в центрифужную пробирку объемом 15 мл, содержащую 4 мл холодного PBS.
  14. Центрифугируйте при 400 x g в течение 6 мин при 4 °C.
  15. Умойтесь еще раз 5 мл холодной PBS.
  16. Повторно суспендируйте клеточную гранулу в соответствующем буфере. Для проточной цитометрии мы обычно используем 500 мкл буфера FACS.
  17. Для анализа проточной цитометрии выполните подсчет клеток и используйте примерно 1 x 106 клеток для окрашивания антителами.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обязательно включите этап блокировки Fc перед окрашиванием антител13.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для получения иммунных клеток из ткани мозга мыши протокол обычно дает клетки с высокой жизнеспособностью (84,1% ± 2,3% [среднее ± SD]). Примерно 70-80% этих клеток являются CD45-положительными. В нормальном мозге мышей почти все клетки CD45+ представляют собой микроглию (CD45LowCD11b+), как и ожидалось. Этот протокол использовался в лаборатории для различных приложений, включая анализ проточной цитометрии, сортировку флуоресцентно-активируемых клеток (FACS) и анализ scRNA-seq. В качестве примера был проведен анализ проточной цитометрии на модели инсульта (рис. 3). Мышам проводили модель транзиторного инсульта с окклюзией средней мозговой артерии через 30 мин (MCAO)14. На 3-й день после инсульта клетки были получены из мозга мышей и окрашены общими маркерами поверхности иммунных клеток. Стратегия стробирования изображена на рисунке 3А. В соответствии с предыдущими исследованиями13,15, наблюдалось заметное увеличение клетокс высоким уровнем CD45 в ипсилатеральном полушарии (рис. 3B,C), что указывает на инфильтрацию иммунных клеток в мозг.

Для протокола костного мозга черепа был достигнут значительный выход клеток костного мозга черепа (около 2 x 10-6 клеток) с отличной жизнеспособностью (93,8% ± 1,8% [среднее ± SD]). Как и ожидалось, большинство этих клеток являются CD45-положительными. Чтобы проиллюстрировать полезность этого протокола, было проведено сравнительное исследование для характеристики состава иммунных клеток как в бедренном, так и в костном мозге черепа наивных мышей (рис. 4). Как показано на репрезентативных графиках, состав иммунных клеток был схожим между бедренной костью и костным мозгом черепа (рис. 4A, B). Интересно, что частота нейтрофилов, по-видимому, выше в бедренной кости, чем в кости черепа (Рисунок 4C). Тем не менее, этот вывод требует дальнейшей проверки, так как размер выборки для этого пилотного исследования был небольшим.

figure-results-1
Рисунок 1: Обзор протокола выделения клеток головного мозга. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-2
Рисунок 2: Протокол выделения клеток костного мозга черепа. (А) Обзор процедуры. (Б) Рекомендуемая схема для резки черепа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-3
Рисунок 3: Репрезентативный анализ проточной цитометрии иммунных клеток в головном мозге после инсульта. (A) Пример стратегии гейтирования. На графиках изображены следующие популяции иммунных клеток: микроглия (CD45LowCD11b+), NK-клетки (CD45HighNK1.1+), нейтрофилы (CD45HighLy6G+), Т-клетки (CD45HighCD11b-CD3+) и В-клетки (CD45HighCD11b-CD19+). Этот пример представляет собой анализ иммунных клеток мозга в ипсилатеральном полушарии на 3-й день после инсульта. (В,В) Инфильтрация иммунных клеток в мозг после инсульта. Молодые самцы мышей подвергались транзиторной окклюзии средней мозговой артерии (MCAO). На 3-е сутки мозг был собран и разделен на левое (контралатеральное) и правое (ипсилатеральное) полушария. Клетки мозга препарировали по описанному протоколу, а затем подвергали анализу проточной цитометрии. Репрезентативные графики иллюстрируют повышенное проникновение иммунных клеток в ипсилатеральное полушарие (клетки с высоким уровнем CD45; Б). Количественные данные представлены на гистограммах (В). Количество клеток рассчитывали на основе количества и объема клеток, записанных в данных проточной цитометрии. Данные представлены в виде среднего ± SEM. *p < 0,05. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-4
Рисунок 4: Репрезентативный анализ клеток костного мозга черепа методом проточной цитометрии. Для сравнения был включен анализ клеток костного мозга бедренной кости. На графиках изображены следующие популяции иммунных клеток: NK-клетки (CD45+NK1.1+), нейтрофилы (CD45+CD11b+Ly6G+), Т-клетки (CD45+CD11b-CD3+) и В-клетки (CD45+CD11b-CD19+). (A) Репрезентативные участки для бедренного костного мозга. (B) Репрезентативные участки для костного мозга черепа. (C) Сравнение состава иммунных клеток бедренной кости и костного мозга черепа. Данные представлены в виде среднего значения ± SEM. *p < 0,05. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь представлены два простых, но эффективных протокола для выделения иммунных клеток из мозга и костного мозга черепа. Эти протоколы могут надежно получать большое количество жизнеспособных иммунных клеток, которые могут быть пригодны для различных последующих применений, в частности, для проточной цитометрии.

Для изучения нейровоспаления при различных заболеваниях мозга было разработано множество протоколов подготовки иммунных клеток из мозга, которые используются в различных лабораториях 15,16,17. Общие подходы включают в себя диссоциацию клеток на основе ферментов с последующим градиентным разделением. Как правило, в этих протоколах мозговую ткань измельчают, а затем инкубируют в ферментном растворе для расщепления, содержащем коллагеназу и ДНКазу, в течение 30-60 минут при 37 °C с легким встряхиванием. После расщепления клетки подвергаются дальнейшей диссоциации с помощью механического метода, такого как пипетирование или гомогенизация по методу Даунса. После прохождения через клеточный фильтр (например, 70 мкм фильтр) клетки затем подвергают градиентному центрифугированию (часто 30%/70% раствор градиента плотности) для удаления миелина, эритроцитов и мусора, а также для обогащения лейкоцитов. Однако этот подход требует длительной ферментативной инкубации при 37 °C, что может существенно изменить транскриптом и протеом иммунных клеток мозга. Действительно, систематическое исследование показало, что ферментативный подход вносит глубокие изменения в транскриптом и протеотип специфическихклеток мозга. Это может привести к артефактам в последующих транскриптомных анализах, таких как scRNA-seq. В отличие от этого, в протоколе, описанном здесь, используется подход механической диссоциации при низких температурах на протяжении всей процедуры, тем самым подавляя клеточный метаболизм. Это обеспечивает лучшее сохранение транскрипционного и протеомного состояния, сводя к минимуму потенциальные артефакты. Во время разработки протокола мы заметили, что использование большого гомогенизатора Dounce для гомогенизации мозговой ткани имеет решающее значение для достижения более высокого количества клеток с более низкой гибелью клеток. Вполне вероятно, что при гомогенизации Dounce массивное присутствие внеклеточных матриц, клеточного мусора и цитоплазматических компонентов токсично для клеток. Использование чрезмерного количества буфера помогает разбавить эти токсичные вещества и, таким образом, смягчает их вредное воздействие, что приводит к улучшению жизнеспособности клеток. Данные проточной цитометрии подтвердили примерно 85% жизнеспособность иммунных клеток, полученных по этому протоколу. Кроме того, следует отметить, что центрифугирование с использованием всего 30% градиентного раствора эффективно обогащает иммунные клетки мозга и удаляет миелин. Это также может снизить затраты на подготовку клеток.

Исследования иммунных клеток в костном мозге черепа все еще ограничены. Метод, обычно используемый для выделения клеток из черепа мыши, включает в себя разрезание черепа на мелкие кусочки, а затем механическое дробление кусочков пестиком. В действующем протоколе используется кратковременное центрифугирование. Этот метод адаптирован из опубликованного протокола препарирования костного мозга из бедренных и большеберцовых костей19. Для этих длинных костей нужно только отрезать один конец кости, чтобы собрать костный мозг с помощью центрифугирования. Для черепа этот шаг видоизменяется путем разрезания его на несколько небольших кусочков, чтобы открыть полость костного мозга. Рекомендуется использовать последовательную схему для резки черепа, чтобы получить воспроизводимое количество клеток. Более того, для максимального восстановления клеток костного мозга кусочки черепа могут быть подвергнуты 2-3 раундам центрифугирования с перемешиванием между каждым центрифугированием.

Оба протокола имеют ограничения. Во-первых, использование центрифугирования с градиентом плотности 30% может не эффективно удалять оставшиеся эритроциты в мозге, что может произойти из-за неполной перфузии. Более того, если структура миелина модулируется при определенных условиях, то 30% градиентный раствор плотности может не быть оптимальной концентрацией для их удаления. В этом случае необходимо установить другую рабочую концентрацию раствора градиента плотности. Во-вторых, хотя анализ проточной цитометрии указывает на хорошую жизнеспособность иммунных клеток мозга с использованием описанного протокола, его все еще необходимо оценить для других применений, таких как транскриптомный анализ, в котором может быть использован актиномицин D. В-третьих, кальвария используется для приготовления черепа, костного мозга. Однако следует отметить, что иммунные клетки существуют во многих других частях черепа. Наконец, мозговые оболочки, особенно твердая мозговая оболочка, содержат различные иммунные клетки и играют роль в гомеостазе и дисфункциимозга. Для иммунологического анализа мозговых оболочек может быть принят протокол, опубликованный в других документах 17,21,22,23.

Таким образом, описаны два надежных протокола для выделения иммунных клеток из мозга и черепа мыши. Ожидается, что эти протоколы будут полезны для получения большого количества высококачественных элементов, пригодных для различных последующих применений.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим Кэти Гейдж за ее замечательный редакторский вклад. Иллюстративные рисунки были созданы с помощью BioRender.com. Это исследование было поддержано средствами отделения анестезиологии (Медицинский центр Университета Дьюка) и грантами NIH NS099590, HL157354 и NS127163.

Материалы

```html

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0.5 мл микроцентрифужные пробиркиVWR76332-066
1.5 мл микроцентрифужные пробиркиVWR76332-068
15 мл конические пробиркиThermo Fisher Scientific339651
18 G x 1 дюйм BD PrecisionGlide иглаBD Biosciences305195
1x HBSSGibco14175-095
50 мл конические пробиркиThermo Fisher Scientific339653
96-лунковые пластинки с V-образным дномSARSTEDT82.1583
Флоу-цитометр AURORACytek bioscience
БСАFisherBP9706-100
CD11b-AF594BioLegend1012541:500 разбавление
CD19-BV785BioLegend1155431:500 разбавление
CD19-FITCBioLegend1155061:500 разбавление
CD3-APCBioLegend1003121:500 разбавление
CD3-PEBioLegend1002061:500 разбавление
CD45-Alex 700BioLegend1031281:500 разбавление
CD45-BV421Biolegend1031331:500 разбавление
Клеточный фильтр 70 мкмAvantor732-2758
Пинцет для перевязкиV. MuellerNL1410
ЭДТАInvitrogen15575-038
Fc BlockBiolegend1013201:100 разбавление
ПинцетRobozRS-5047
Набор для окрашивания клеток LIVE/DEAD Fixable BlueThermo Fisher ScientificN71671:500 разбавление
Ly6G-BV421BioLegend1276281:500 разбавление
Ly6G-PerCp-cy5.5BioLegend1276151:500 разбавление
NK1.1-APC-cy7BioLegend1087231:500 разбавление
Percoll (грануляционная среда)Cytiva17089101
Фосфатный буферный раствор (10x)Gibco70011-044
Буфер лизиса эритроцитов (10x)BioLegend420302
НожницыSKLAR64-1250
WHEATON Dounce тканевая ступка, размер 15 млDWK Life Sciences357544
```

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bohr, T., et al. The glymphatic system: Current understanding and modeling. iScience. 25 (9), 104987(2022).
  2. Jiang-Xie, L. F., et al. Neuronal dynamics direct cerebrospinal fluid perfusion and brain clearance. Nature. 627 (8002), 157-164 (2024).
  3. Goertz, J. E., Garcia-Bonilla, L., Iadecola, C., Anrather, J. Immune compartments at the brain's borders in health and neurovascular diseases. Semin Immunopathol. 45 (3), 437-449 (2023).
  4. Herisson, F., et al. Direct vascular channels connect skull bone marrow and the brain surface enabling myeloid cell migration. Nat Neurosci. 21 (9), 1209-1217 (2018).
  5. Mazzitelli, J. A., et al. Skull bone marrow channels as immune gateways to the central nervous system. Nat Neurosci. 26 (12), 2052-2062 (2023).
  6. Cugurra, A., et al. Skull and vertebral bone marrow are myeloid cell reservoirs for the meninges and CNS parenchyma. Science. 373 (6553), 7844(2021).
  7. Brioschi, S., et al. Heterogeneity of meningeal b cells reveals a lymphopoietic niche at the CNS borders. Science. 373 (6553), 9277(2021).
  8. Smyth, L. C. D., et al. Identification of direct connections between the dura and the brain. Nature. 627, 165-173 (2024).
  9. Mazzitelli, J. A., et al. Cerebrospinal fluid regulates skull bone marrow niches via direct access through dural channels. Nat Neurosci. 25 (5), 555-560 (2022).
  10. Pulous, F. E., et al. Cerebrospinal fluid can exit into the skull bone marrow and instruct cranial hematopoiesis in mice with bacterial meningitis. Nat Neurosci. 25 (5), 567-576 (2022).
  11. Li, R., et al. Mouse cardiac arrest model for brain imaging and brain physiology monitoring during ischemia and resuscitation. J Vis Exp. (194), e65340(2023).
  12. Wang, W., et al. Development and evaluation of a novel mouse model of asphyxial cardiac arrest revealed severely impaired lymphopoiesis after resuscitation. J Am Heart Assoc. 10 (11), e019142(2021).
  13. Li, X., et al. Single-cell transcriptomic analysis of the immune cell landscape in the aged mouse brain after ischemic stroke. J Neuroinflammation. 19 (1), 83(2022).
  14. Wang, Y. C., et al. Perk (protein kinase RNA-like er kinase) branch of the unfolded protein response confers neuroprotection in ischemic stroke by suppressing protein synthesis. Stroke. 51 (5), 1570-1577 (2020).
  15. Posel, C., Moller, K., Boltze, J., Wagner, D. C., Weise, G. Isolation and flow cytometric analysis of immune cells from the ischemic mouse brain. J Vis Exp. (108), e53658(2016).
  16. Srakocic, S., et al. Proposed practical protocol for flow cytometry analysis of microglia from the healthy adult mouse brain: Systematic review and isolation methods' evaluation. Front Cell Neurosci. 16, 1017976(2022).
  17. Disano, K. D., et al. Isolating central nervous system tissues and associated meninges for the downstream analysis of immune cells. J Vis Exp. (159), e61166(2020).
  18. Mattei, D., et al. Enzymatic dissociation induces transcriptional and proteotype bias in brain cell populations. Int J Mol Sci. 21 (21), (2020).
  19. Mcgill, C. J., Lu, R. J., Benayoun, B. A. Protocol for analysis of mouse neutrophil netosis by flow cytometry. STAR Protoc. 2 (4), 100948(2021).
  20. Su, Y., et al. Meningeal immunity and neurological diseases: New approaches, new insights. J Neuroinflammation. 20 (1), 125(2023).
  21. Niu, C., et al. Mechanical isolation of neonatal and adult mouse dura leukocytes for flow cytometry analysis. STAR Protoc. 4 (2), 102272(2023).
  22. Roussel-Queval, A., Rebejac, J., Eme-Scolan, E., Paroutaud, L. A., Rua, R. Flow cytometry and immunohistochemistry of the mouse dural meninges for immunological and virological assessments. STAR Protoc. 4 (1), 102119(2023).
  23. Louveau, A., Filiano, A. J., Kipnis, J. Meningeal whole mount preparation and characterization of neural cells by flow cytometry. Curr Protoc Immunol. 121 (1), e50(2018).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи