Методическая статья

Анализ ресборки расщепленной люциферазы для измерения контактов эндоплазматических ретикулум-митохондрий в живых клетках

2.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/66862

⸱

11 октября 2024 г.

 ,  ,  , 
1Department of Pathology, Cedars-Sinai Medical Center, 2Department of Biomedical Science Education, College of Medicine, Charles R. Drew University of Medicine and Science

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Мы разработали анализ ресборки расщепленной люциферазы для мониторинга контактов эндоплазматических ретикулум-митохондрий в живых клетках. Используя этот анализ, мы описываем протокол количественного измерения уровня этих межорганелльных связей в HEK293T клетках при условии химической обработки.

Аннотация

Места контакта эндоплазматических ретикулумов (ER) с митохондриями играют важнейшую роль в здоровье клеток и гомеостазе, такие как регуляция гомеостаза Ca2+ и липидов, митохондриальная динамика, биогенез аутофагосом и митофагосом, а также апоптоз. Неспособность поддерживать нормальную ER-митохондриальную связь связана со многими нейродегенеративными заболеваниями, такими как болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, боковой амиотрофический склероз и наследственная спастическая параплегия. Большое значение имеет изучение того, как нарушение регуляции ER-митохондриальных контактов может привести к гибели клеток и может ли восстановление этих контактов до нормального уровня улучшить нейродегенеративные состояния. Таким образом, усовершенствованные анализы, которые измеряют уровень этих контактов, могут помочь пролить свет на патогенные механизмы этих заболеваний. В конечном счете, проведение простых и надежных анализов будет способствовать разработке новых терапевтических стратегий. Здесь мы описываем анализ расщепленной люциферазы для количественного измерения уровня контактов ER-митохондрий в живых клетках. Этот анализ может быть использован для изучения патофизиологической роли этих контактов, а также для идентификации их модуляторов при высокопроизводительном скрининге.

Введение

Взаимодействие между ЭР и митохондриями жизненно важно для клеточного гомеостаза и выживаемости 1,2,3,4. Предыдущие данные указывают на то, что любой тип нарушения или дисрегуляции в контактных участках ER-митохондрий может способствовать развитию нескольких нейродегенеративных, метаболических и сердечно-сосудистых заболеваний, а также рака 5,6,7,8,9,10. Например, аномальное увеличение поглощенияCa2+ в митохондриях может привести к гибели клеток за счет открытия переходных пор проницаемости митохондрий, которые обычно наблюдаются в некоторых моделях болезни Альцгеймера 5,11. Аналогичным образом, сокращение контактов ER-митохондрий может привести к снижению продукции АТФ и ухудшению потребления Ca2+, как видно на моделях бокового амиотрофического склероза 5,11,12. По мере того, как проводится все больше исследований в области контактов ER-митохондрий, обнаруживаются дополнительные белки и гены, связанные с заболеваниями, которые могут влиять на эти контакты. Несмотря на современные знания и доказательства, демонстрирующие роль контактных сайтов ER-митохондрий, все еще требуется большая работа, чтобы выяснить, как эти контакты могут привести к потере клеточной функции и, в конечном итоге, к гибели клеток.

Были разработаны различные методы для оценки близости двух мембран, структурной морфологии и расстояния между местами контакта двух органелл 3,4,13. Подходы к мониторингу связи ER-митохондрий включают визуализацию на основе флуоресцентных маркеров14,15, визуализацию на основе репортеров FRET16 и визуализацию на основе расщепленных флуоресцентных зондов17,18, в которых используются эпифлуоресценция и конфокальная микроскопия. Микроскопия со сверхвысоким разрешением и микроскопия с атомным разрешением также являются мощными инструментами для точной визуализации межорганелльных контактов, хотя их использование для анализа контактных сайтов все еще ограничено, поскольку они требуют специализированных микроскопов и технических знаний. Кроме того, широко используются просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ), сканирующая электронная микроскопия (СЭМ) и другие методы ЭМ, такие как электронная томография (ЭТ) и криоэлектронная микроскопия, поскольку они обеспечивают ультраструктурную визуализацию контактных участков с высоким разрешением, которые часто невозможно исследовать с помощью других экспериментальных подходов 20,21,22. Тем не менее, эти методы на основе ЭМ являются очень низкопроизводительным методом, на который также могут влиять процедуры химической фиксации. В последнее время методы, основанные на бесконтактном мечении, используются для обнаружения контактных сайтов, а также для идентификации новых белков контактных сайтов. Например, анализ бесконтактного лигирования (PLA) был использован для количественной оценки близости органелл23,24, в то время как пересмотренная версия анализа аскорбатпероксидазы (APEX) была использована для идентификации новых белков контактных сайтов25,26. Важно признать, что все эти методы, описанные выше, имеют сильные стороны и внутренние ограничения в обнаружении контактов между органеллами. Таким образом, требуется сопряжение различных методик для получения тщательной интерпретации мест контакта органелл.

Ранее мы разработали анализ ресборки расщепленной Ренилл-люциферазы 8 (split-Rluc анализ) для мониторинга уровня контактов мембран ER-митохондрий (Рисунок 1A)24,26,27. Вкратце, каждая разделенная половина люциферазы Renilla конъюгирована с последовательностью, нацеленной на ER- или митохондрии. При совместной трансфекции каждая разделенная половина фермента экспрессируется либо в ER, либо в митохондриальной мембране. Когда ЭР и митохондрии расположены в непосредственной близости друг от друга, разделенные половинки объединяются и восстанавливают весь фермент с люциферазной активностью. Для конструкции split-Rluc мы использовали Renilla luciferase 8 (Rluc8) в pBAD/Myc-His27 в качестве исходного шаблона. Сайт расщепления (между аминокислотами 91 и 92) определяли на основании предыдущих отчетов27. Для N-концевой половины R luc8последовательности ДНК аминокислот 1-91 R luc8были слиты с 3'-концом метки FLAG и мышиной последовательностью AKAP1, нацеленной на митохондрии, в векторе pcDNA3.1 TOPO методом ПЦР27. Для С-концевой половины, нацеленной на ER, последовательности ДНК, кодирующие аминокислоты 92-311, были слиты с 5'-концом myc-метки и последовательностью локализации UBC6 ER дрожжей. Здесь мы модернизировали конструкцию плазмиды split-Rluc таким образом, что расщепленные половины люциферазы Renilla экспрессируются в одном векторе (pCAG) под одним и тем же промотором и впоследствии расщепляются на два фрагмента, в то время как T2A, последовательность саморасщепляющегося пептида 2A из вируса Thosea asigna, вставляется между двумя разделенными половинами (рис. 1B). Карта и последовательности плазмидной ДНК представлены в Дополнительном файле 1 и Дополнительном рисунке S1. Используя эту систему, мы измерили влияние трех химических веществ (ингибирующих ГТФазы, участвующие в полимеризации актина) на контакты с ER-митохондриями. Этот анализ с расщеплением Rпредставляет собой простую, но надежную систему анализа для высокопроизводительного скрининга межорганелльных контактных модуляторов24.

Протокол

1. Обслуживание клеток и посев (День 1)

  1. Поддерживайте HEK293T клетки в средах для культивирования клеток, содержащих модифицированную среду Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) с 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) (в 100 мм чашках для культивирования) в увлажненном инкубаторе при температуре 37 °C с 5%CO2.
  2. Перед началом работы проверьте слияние пластины, просмотрев ее под микроскопом. Когда конфлюенция клеток достигнет примерно 80-90%, приготовьтесь к посеву клеток в 6-луночный культуральный планшет, удалив среду и промыв 10 мл фосфатно-солевого буфера Дульбекко (DPBS).
  3. Удалите DPBS из чашки для культивирования и обработайте клетки 1 мл 0,05% фенолового красного трипсина-ЭДТА. Инкубируйте в течение 3 минут, затем достаньте планшет из инкубатора и добавьте 9 мл питательных сред (DMEM с 10% FBS), чтобы остановить реакцию трипсина. Медленно проводите пипеткой вверх и вниз, чтобы убедиться, что все ячейки, все еще прилипшие к пластине, смещены. Перенесите клеточную суспензию в трубку объемом 50 мл.
  4. Центрифугировать при 300 × г в течение 5 мин при комнатной температуре. Удалите среду и повторно суспендируйте клеточные гранулы с 1 мл свежей среды (DMEM + 10% FBS).
  5. Посчитайте количество клеток с помощью гемоцитометра.
    1. Обеспечьте равномерное распределение клеток, аккуратно вращая трубку. Немедленно выньте 10 мкл клеточной суспензии и поместите в микроцентрифужную пробирку объемом 1,7 мл. Добавьте 90 μL среды в ту же пробирку.
    2. Осторожно перемешав клетки и среду, возьмите клеточную суспензию и нанесите по 10 мкл на каждую из камер гемоцитометра, аккуратно пипетируя под покровным стеклом.
    3. С помощью объектива с 10-кратным увеличением сфокусируйте линии сетки гемоцитометра под микроскопом. Сфокусировавшись, подсчитайте количество ячеек в одном наборе из 16 квадратов (4 x 4 квадрата) с помощью счетчика подсчета рук. Повторяйте до тех пор, пока не будут подсчитаны все четыре набора по 16 квадратов.
    4. Рассчитайте общее количество клеток/мл, взяв среднее количество клеток (из каждого из 16 угловых квадратов) и умножив его на 105.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вместо использования гемоцитометра для подсчета клеток, можно использовать автоматический счетчик клеток в соответствии с инструкциями производителя.
  6. После завершения подсчета клеток приготовьте пластинчатые клетки в 6-луночном планшете с плотностью 7,5 × 105 клеток/лунку с 2 мл среды/лунки. В пробирку объемом 50 мл добавьте необходимый объем клеток вместе с 13 мл среды. Дозируйте по 2 мл разбавленной клеточной суспензии в каждую из 6 лунок.
    1. Перед нанесением покрытия рассчитайте количество клеток, необходимое для 7,5 × 105 клеток/лунку, используя C1V1 = C2V2 , где C1 - начальное количество клеток (количество клеток/мл), V1 - необходимый объем из исходной клеточной суспензии, C2 - желаемая плотность целевых клеток (количество клеток/мл), а V2 — это конечный объем, необходимый для посева клеток.
  7. После дозирования осторожно постучите по тарелке со всех сторон, чтобы распределить ячейки, а затем поместите ее во влажный инкубатор при температуре 37 °C с 5%CO2 на ночь.

2. Полиэтиленимин-опосредованная (PEI)-опосредованная трансфекция клеток и посттрансфекционный посев клеток (день 2)

  1. Извлеките из инкубатора планшет с 6 лунками и отсасывайте имеющиеся питательные среды из каждой лунки. Добавьте 2 мл свежей среды на лунку.
  2. Трансфектируйте клетки плазмидной ДНК с расщепленным R-luc(pCAG-MitoRluc N-T2A-R lucCER-IRES-mCherry), растворенной в TE-буфере (pH 8,0).
    1. Для каждой лунки смешайте ДНК (750 нг) и PEI (соотношение ДНК/PEI = 1:3) в 200 мкл DMEM в микроцентрифужной пробирке объемом 1,7 мл. Быстро перемещайте ДНК/ПЭИ на уровне 8 в течение примерно 2 с, чтобы убедиться, что они хорошо смешиваются друг с другом и образуют комплекс. После этого кратковременно раскрутите его в мини-центрифуге (<3 с).
    2. Дайте смеси ДНК/ПЭИ инкубироваться при комнатной температуре в течение 15 минут, а затем добавьте смесь (капнув ее) на поверхность питательной среды в 6-луночный планшет, содержащий клетки. Осторожно постучите по пластине (чтобы равномерно распределить смесь) и инкубируйте ее во влажном инкубаторе при температуре 37 °C с 5%CO2 в течение 6 часов.
  3. Во время инкубации приготовьте 96-луночный планшет, покрытый поли-D-лизином (PDL), предварительно добавив 70 мкл PDL (50 мкг/мл в DPBS) в каждую лунку и инкубируя во влажном инкубаторе при 37 °C с 5%CO2 в течение не менее 1 ч. Удалите раствор PDL, а затем промойте каждую лунку 2 раза 100 мкл DPBS. В конце второй промывки убедитесь, что все остатки DPBS удалены.
  4. Через 6 ч после трансфекции приготовьте посев трансфицированных клеток в 96-луночный планшет с PDL-покрытием.
    1. Выньте из инкубатора 6-луночный планшет с трансфицированными клетками, отасуньте среду и промойте каждую лунку 2 мл DPBS. После удаления DPBS добавьте 350 μл 0,05% фенолового красителя Trypsin-EDTA и инкубируйте в течение 1-2 минут. Чтобы остановить реакцию трипсина, добавьте по 1,7 мл среды в каждую лунку.
    2. После переноса клеток вместе со средой в пробирку объемом 50 мл вращайте пробирку при давлении 300 × г в течение 5 минут в настольной центрифуге. Аспирируйте среду и ресуспендируйте клеточную гранулу 1 мл свежей среды. Подсчитайте количество клеток с помощью гемоцитометра (как описано в пункте 1.5).
  5. Засейте клетки в 96-луночный планшет с PDL-покрытием плотностью 4 ×10 4 клеток/лунку в 100 мкл питательных сред. Для этого в пробирку объемом 50 мл добавьте необходимый объем клеток (расчет см. ниже) вместе с подходящим объемом среды (общий объем 12 мл). С помощью многоканальной пипетки диспенсируйте по 100 мкл разбавленной клеточной суспензии в каждую из 96 лунок. Инкубируйте клетки в течение 18 ч во влажном инкубаторе при температуре 37 °C с 5%CO2.
    1. Рассчитайте количество клеток, необходимое для 4 × 104 клеток/лунку, используя C1V1 = C2V2 , где C1 — начальное количество клеток (количество клеток/мл), V1 — необходимый объем из исходной клеточной суспензии, C2 — желаемая плотность клеток-мишеней (число клеток/мл), а V2 — конечный объем, необходимый для посева клеток.

3. Химическая обработка и анализ люциферазы в живых клетках (день 3)

  1. В пробирке с микрофугой объемом 1,7 мл приготовьте три свежих раствора 50 мкМ Розина (50 мМ в ДМСО), 25 мкМ Ehop-016 (25 мМ в ДМСО) и 50 мкМ ZCL278 (50 мМ в ДМСО) путем разбавления каждого стокового раствора (50 мМ Розин, 25 мМ Ehop-016 и 50 мл ZCL278; все в ДМСО) 1:1000 в необходимом количестве (50 мкл/лунка × количество лунок) питательных сред. В каждый раствор добавляют субстрат живых клеток (50 мМ в ДМСО) для люциферазы Ренилла , разведенной 1:2000 до конечной концентрации 25 мкМ. Для получения 0,5, 5 и 50 мкМ растворов ZCL278 проводят последовательное разведение с использованием исходного 50 мкМ ZCL278 в питательных средах.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если время химической инкубации составляет менее 1-1,5 ч, клетки можно предварительно инкубировать с субстратом живых клеток (для Renilla luciferase) в течение 1-1,5 ч перед обработкой каждым химическим веществом. Мы добавляем химические вещества и субстрат живых клеток одновременно, чтобы оптимизировать протокол высокопроизводительного скрининга лекарств.
  2. Удалите среду из каждой лунки 96-луночного планшета, содержащего трансфицированные клетки, и добавьте в каждую лунку 50 мкл смеси химических веществ и субстрата.
  3. После инкубации клеток в течение 1 ч, 2 ч или 5 ч извлеките культуральную пластину из инкубатора, загрузите ее на считыватель люминесцентных пластин и измерьте люминесценцию.
    1. Перед началом работы убедитесь, что считыватель пластин включен. Получите доступ к программному обеспечению для чтения микропланшетов и создайте новый файл, нажав кнопку «Новый сеанс». Установите температуру считывателя планшетов на 37 °C , нажав «Инкубатор», проверив параметр температуры и введя 37 °C. В разделе Схема расположения пластин выберите опцию Неизвестно и укажите скважины для измерения, щелкнув и перетащив их.
    2. В разделе Протокол нажмите Люминесценция и оставьте настройки по умолчанию. После завершения настройки загрузите пластину со снятой крышкой в считыватель пластин и выберите Run Plate In. Нажмите «Пуск» и появится окно сохранения файла. Сохраните файл на рабочем столе, переименовав его и нажав «Сохранить».
      ПРИМЕЧАНИЕ: Люминесценция будет продолжать производиться в течение >24 ч после добавления субстрата живых клеток.
  4. После завершения считывания извлеките пластину из считывателя пластин и нажмите «Запустить пластину», чтобы вставить считыватель обратно. По завершении поместите планшет обратно в увлажненный инкубатор (37 °C, 5%CO2) до следующего показания.
  5. Когда закончите, перенесите данные люминесценции в графическую программу, чтобы построить график единиц относительной люминесценции (RLU) (ось y) для каждой переменной (например, химических веществ или концентраций) (ось x) и проанализировать данные.

4. Валидация анализа split-Rluc другими методами.

  1. Выполняйте другие анализы, такие как анализ близости-лигирования (PLA), просвечивающая электронная микроскопия и мониторинг поглощения кальция митохондриями, для проверки результатов, полученных с помощью анализа Split-Rluc, как описано ранее24.

Результаты

Мы использовали описанный выше протокол для измерения уровня контактов ER-митохондрий при добавлении трех соединений, которые, как известно, ингибируют специфические ГТФазы. CDC42, RHO и RAC представляют собой ГТФазы, которые способствуют полимеризации актина28 при активации и ингибируются ZCL278, Rhosin и Ehop-016,соответственно24. HEK293T клетки, трансфицированные split-R luc, обрабатывали DMSO (контроль), ZCL278 (50 мкМ), Rhosin (50 мкМ) или Ehop-016 (25 мкМ) и инкубировали в течение 1 ч, 2 ч и 5 ч. С помощью считывателя пластин мы измерили активность split-Rluc в определенные моменты времени (рис. 2).

Клетки, обработанные розином (ингибитором RHO GTPase), не показали существенных изменений активности люциферазы по сравнению с контрольными клетками, обработанными ДМСО, через 1 ч, 2 ч и 5 ч лечения (p > 0,9999, p = 0,6956, p > 0,9999) (рис. 2). Эти результаты показывают, что Rhosin не влияет на контакты ER-митохондрий, что предполагает отсутствие участия активности RHO GTPase в регуляции контактов между двумя органеллами.

Напротив, ингибитор ГТФазы RAC Ehop-016 показал значительно более низкую активность люциферазы, чем ДМСО, через 1 ч, 2 ч и 5 ч лечения (p = 0,0106, p = 0,0009, p = 0,0024) (рис. 2). Эти данные указывают на то, что активность ГТФазы RAC необходима для поддержания нормального взаимодействия ER-митохондрий в клетке.

Наконец, ингибитор CDC42 ZCL278 показал наиболее радикальные изменения в активности люциферазы (рис. 2). Клетки, обработанные ZCL278, показали значительное снижение активности люциферазы по сравнению с контрольным ДМСО и имели самые низкие p-значения во всех трех временных точках, поддерживая p < 0,0001 на протяжении всего периода. Наши данные демонстрируют сильное ингибирование связи ER-митохондрий, когда активность CDC42 GTPase блокируется ZCL278, что согласуется с нашим предыдущим отчетом с использованием оригинального анализа split-Rluc, выполненного в клетках, совместно трансфицированных двумя векторами, кодирующими каждую половину расщепленной люциферазыотдельно 24.

Учитывая поразительные результаты применения ZCL278, особенно по сравнению с другими ингибиторами ГТФазы, активность ZCL278 была дополнительно проверена в различных концентрациях [0,5 мкМ, 5 мкМ, 50 мкМ] в контрольной группе ДМСО. Активность люциферазы, измеренная через 1 ч, 2 ч и 5 ч после лечения, показала дозозависимый ответ; 0,5 мкМ ZCL278 оказывал самое слабое влияние на активность люциферазы, в то время как 5 мкМ оказывал более сильное, а 50 мкМ демонстрировало самое сильное снижение активности восстановленного фермента (рис. 3). В совокупности наши результаты показывают, что ZCL278 снижает активность расщепленного Rluc дозозависимым образом, и с течением времени более высокие концентрации ZCL278 (ингибитора CDC42) все еще демонстрируют значительные изменения по сравнению с контрольным ДМСО по сравнению с более низкими концентрациями.

В качестве способа валидации нашего анализа на расщепление Rluc могут быть проведены хорошо зарекомендовавшие себя независимые анализы, такие как анализ бесконтактного лигирования (PLA), просвечивающая электронная микроскопия (TEM) и мониторинг поглощения кальция митохондриями (Рисунок 4, данные не показаны)24. Изопротеренол, агонист β2-адренергических рецепторов, который является одним из соединений, идентифицированных в нашем скрининге контактных промоторов ER-митохондрий (рис. 4A), был использован для подтверждения того, что люциферазная активность расщепленного R lucпри обработке изопротеренолом была повышена из-за усиления контактов ER-митохондрий, о чем свидетельствуют изменения интенсивности сигнала PLA, а также поглощения митохондриального кальция (рис. 4B-E).

figure-results-1
Рисунок 1: Анализ повторной сборки Split-R Luc. (А) Схематическое изображение анализа Split-RLuc. При отсутствии мембранных контактов между митохондриями и эндоплазматическим ретикулумом Mito-R luc N и RlucC-ER не взаимодействуют, и, таким образом, активность Rluc8 отсутствует. Тем не менее, взаимодействие между Mito-R lucN и RlucC-ER, где мембраны ER и митохондрий вступают в контакт, приводит к полной ферментативной активности, которая обнаруживается путем преобразования субстрата в люминесценцию. (B) Схематическая карта конструкта ДНК split-Rluc (pCAG-MitoRluc N-T2A-R lucC ER-IRES-mCherry). (C) Схема рабочего процесса для анализа расщепленного Rluc в HEK293T ячейках. Сокращения: Mito = митохондрии; ER = эндоплазматический ретикулум; IRES, внутренний рибосомный входной сайт; rb_glob пА, сигнал полиаденилирования бета-глобина кролика; T2A, последовательность саморасщепляющегося пептида 2A вируса Thosea asigna. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
(A-C) Восстановленная активность люциферазы в (A) через 1 ч, (B) 2 ч или (C) через 5 ч после обработки ДМСО (контроль), Rhosin [50 мкМ], Ehop-016 [25 мкМ] или ZCL278 [50 мкМ] (n = 12 для каждой группы). Все данные были проанализированы с помощью одностороннего ANOVA с многократным сравнением. Значения p представлены как p > 0,05 (нс), p ≤ 0,05 (*), p ≤ 0,01 (**), p ≤ 0,001 (***), p ≤ 0,0001 (****). Полосы погрешности указывают на среднюю ± стандартную погрешность измерения. Сокращения: Mito = митохондрии; ER = эндоплазматический ретикулум; RLU = относительная световая единица. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-3
Рисунок 3: Активность split-Rluc при измерении уровней контактов ER-Mito в клетках, обработанных ZCL278. (А-С) Восстановленная активность люциферазы при (А) 1 ч, (В) 2 ч или (С) 5 ч после ДМСО (контроль) или ZCL278 при концентрации [0,5 мкМ], [5 мкМ] или [50 мкМ] (n = 12 для каждой группы). Все данные были проанализированы с помощью одностороннего ANOVA с многократным сравнением. Значения p представлены как p > 0,05 (нс), p ≤ 0,05 (*), p ≤ 0,01 (**), p ≤ 0,001 (***), p ≤ 0,0001 (****). Полосы погрешности указывают на среднюю ± стандартную погрешность измерения. Сокращения: Mito = митохондрии; ER = эндоплазматический ретикулум; RLU = относительная световая единица. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-4
Рисунок 4: Валидация анализа расщепленного R-луча. (А) Пример количественной оценки активности расщепленного R lucпосле обработки HEK293T клеток 11 препаратами, включая изопротеренол, идентифицированный в комплексном скрининге контактных промоторов ER-митохондрий. (B) Пример анализа бесконтактного лигирования в клетках HeLa, которые были обработаны ДМСО или изопротеренолом (1 мкМ). Сигнал PLA (красный) указывает на тесный контакт между ER и Mito. Sec61-GFP (зеленый): для маркировки ER; DAPI (синий): ядро. (C) Количественная оценка сигнала PLA в A (n = 4 эксперимента с 77-97 клетками в каждом; тест Манна-Уитни). (D) Поглощение митохондриального кальция в ответ на гистамин (100 мкМ). Изменение интенсивности флуоресценции Mito-R-GECO1 (среднее значение было измерено по нескольким клеткам HeLa) строилось каждые 2,5 с в клетках, обработанных ДМСО или изопротеренолом. Стрелка указывает на добавление гистамина. (E) Слева: Максимальный пик поглощения кальция митохондриями в А. Непарный двусторонний t-критерий (n = 10, DMOS; 14, изопротеренол). Справа: скорость поглощения кальция митохондриями (как в А; от 7,5 до 12,5 с). Проба Манна-Уитни (n = 12, ДМСО; 11, изопротеренол). Эта цифра изменена по Lim et al.24. Сокращения: RLU = относительная световая единица; PLA = анализ на близкое лигирование. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Таблица 1: Краткое изложение современных методов контактов с ER-митохондриями. Список преимуществ и ограничений для каждого метода. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Дополнительный файл 1: Zip-файл, содержащий последовательность ДНК (в форматах PDF и GBK) pCAG-MitoRluc N-T2A-R lucCER-IRES-mCherry. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок S1: Карта pCAG-MitoRluc N-T2A-R lucCER-IRES-mCherry. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Обсуждение

Мы использовали анализ ресборки расщепленной Ренилл-люциферазы 8 (split-Rluc анализ) для количественной оценки уровня связей ER-митохондрий. В данном исследовании мы модифицировали исходную конструкцию24 split-Rluc путем генерации одного вектора, pCAG-MitoRluc N-T2A-R luc CER-IRES-mCherry, кодирующего каждый компонент split-Rluc (MitoRlucN и RlucCER) и последовательность саморасщепляющегося пептида 2A из вируса Thosea asigna для обеспечения экспрессии одинакового количества каждой расщепленной половины люциферазы. В качестве субстрата для ренилл-люциферазы вместо целэнтеразина использовали модифицированный субстрат живых клеток (защищенное производное коэлентеразина; см. Таблицу материалов) по следующим причинам. Во-первых, в отличие от целэнтеразина, который генерирует аутофлюминесценцию в водной среде (особенно хуже в сыворотке), это защищенное производное генерирует очень низкую аутофлюминесценцию (часто не обнаруживаемую) в среде, содержащей 10% сыворотки, таким образом, его отношение сигнал/фон выше, чем у целентеразина. Во-вторых, в отличие от целэнтеразина, где люминесценция наиболее сильна вскоре после добавления субстрата, но начинает очень быстро уменьшаться, люминесценция, производимая модифицированным живым субстратом, достигает своей наивысшей точки, достижимой примерно через 1,5 ч после добавления субстрата, и остается непрерывной более 24 ч. Эти изменения в кинетике реакции облегчают измерение люминесценции в многолуночном планшете, что очень полезно для высокопроизводительного скрининга. Кроме того, люминесценция, производимая защищенной подложкой, остающаяся постоянной в долгосрочной перспективе, позволяет измерять один набор образцов в нескольких временных точках, в отличие от измерения нескольких наборов образцов, используемых в разные моменты времени (одна точка на образец).

Используя эту обновленную версию конструкции split-Rluc, мы проверили, участвуют ли RHO, RAC и CDC42 GTPasы в формировании контакта ER-Mito. Мы добавили ингибиторы ГТФазы, Rhosin (ингибитор RHO), Ehop-016 (ингибитор RAC) и ZCL278 (ингибитор CDC42) в HEK293T клетки, экспрессирующие компоненты Split-Rluc. Результаты нашего анализа показывают, что ZCL278 является наиболее мощным ингибитором формирования контактов ER-митохондрий, а Ehop-016 является следующим значимым ингибитором, в то время как Rhosin не влияет на их контакты. Эти данные свидетельствуют о том, что CDC42-опосредованная полимеризация актина (а также RAC-опосредованная в меньшей степени) требуется для поддержания контактов ER-митохондрий в клетке, в то время как RHO-опосредованная полимеризация актина, вероятно, не важна.

Чтобы обеспечить максимальную эффективность, необходимо учитывать множество критически важных шагов для этого протокола. Прежде всего, необходимо проверить количество трансфицированной конструкции, так как слишком большое количество ДНК может оказать токсическое воздействие на клетки. Во-вторых, поскольку количество клеток может оказывать значительное влияние на измеряемые уровни люциферазы, поддержание плотности клеток на уровне, близком к тому, что было указано в протоколе, имеет решающее значение для обеспечения идеальной и постоянной 80% конфлюенции клеток к моменту анализа. Может наблюдаться снижение люминесценции, если клетки достигают слияния во время химического воздействия, поскольку сливающиеся клетки производят меньше белка в целом. В-третьих, чтобы гарантировать, что клетки не отслаиваются во время добавления химикатов и субстрата, мы используем 96-луночный планшет, предварительно покрытый поли-D-лизином. В-четвертых, для соединений (включая субстрат), используемых в этом протоколе, важно поддерживать их при температуре -20 °C или ниже (-70 °C) в аликвотах и добавлять их в клетки сразу после размораживания. Наконец, из-за возможных колебаний температуры, которые могут повлиять на активность люциферазы, возможно, лучше всего использовать самые внутренние лунки планшета и игнорировать лунки, выстилающие внешнюю сторону планшета.

Анализ split-Rluc8 предлагает простой, но надежный метод определения контактов ER-митохондрий, идеально подходящий для высокопроизводительного скрининга; Однако есть некоторые ограничения, которые необходимо отметить. Для клеточной физиологии существует вопрос об изменениях в поведении клеток из-за постоянной сверхэкспрессии конструкционной ДНК. В настоящее время мы работаем над конструкцией с индуцируемым промотором для борьбы с потенциальными изменениями в физиологии клеток из-за постоянной сверхэкспрессии. Кроме того, когда этот анализ используется с целью скрининга, следует отметить, что ложноположительные результаты могут возникать в результате любого косвенного воздействия лекарственных средств на i) уровни экспрессии, ii) эффективность нацеливания на органеллы указанных белковых фрагментов или iii) ферментативную активность восстановленных люцифераз. Из-за этих ограничений этот анализ должен быть протестирован в сочетании с другими методами для дальнейшей проверки результатов. В таблице 1 представлены различные методы тестирования этих контактных сайтов, а также их преимущества и недостатки. Мы воспользовались другими методами, включая, помимо прочего, анализ близости-лигирования (PLA), который обнаруживает близость между белками, и просвечивающую электронную микроскопию (TEM), которая позволяет четко визуализировать контакты органелл, в сочетании с анализом split-Rluc, чтобы подтвердить, что результирующие изменения в RLU действительно связаны с изменениями в контактных сайтах ER-митохондрий (рис. 4 и Lim et al.24). Мы также показали корреляцию между изменением контактов ER-митохондрий и функциональными параметрами, такими как перенос кальция и деление митохондрий (Рисунок 4 и Lim et al.24). Чтобы гарантировать, что влияние препаратов на активность split-Rluc не связано с повышенной экспрессией гена split-Rluc, вместе с препаратами можно добавить ингибитор транскрипции или трансляции, как мыделали ранее.

Для применения системы split-Rluc в дифференцированных нейронах в культуре с низкой частотой трансфекции вирусная инфекция (с лентивирусом, экспрессирующим компоненты split-Rluc) может быть альтернативным подходом. Его использование может быть расширено для создания скрининговой системы, в которой клетки (например, индуцированные плюрипотентные стволовые клетки человека) сконструированы таким образом, чтобы стабильно экспрессировать каждый компонент расщепленного Rluc, MitoRlucN и RlucCER либо путем вирусной инфекции, либо путем CRSPR-опосредованного редактирования генов. Тем не менее, для стабильной системы экспрессии необходимо осознавать, что может существовать давление отбора для клеток, лучше переносящих систему split-Rluc, что может не отражать нормальное физиологическое состояние. Такая адаптация или отбор могут привести к систематической ошибке в результатах эксперимента.

Таким образом, несмотря на некоторые ограничения, рассмотренные выше, split-R lucявляется быстрым, простым и мощным анализом для высокопроизводительного скрининга малых молекул или генов, регулирующих межорганелльные контакты в клетке, как это было показано в нашемпредыдущем исследовании по скринингу лекарственных препаратов.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Авторы выражают благодарность доктору Джеффри Голдену (Медицинский центр Седарс-Синай) за критический отзыв о рукописи. Эта работа была частично профинансирована Национальным институтом неврологических заболеваний и инсульта (NINDS, R01NS113516).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1,7 мл SafeSeal Микроцентрифужная пробиркаSorenson16070
6-луночная пластина TC обработаннаяСША ScientificCC7682-7506
10 мл Наконечники для пипеток OneTipСША Scientific1110-3700
10 μ L наконечники для пипеток OneTipСША Scientific1110-3700
20-200 μ L Скошенные наконечники OneTipСША Scientific1111-1210
50 мл Полипропиленовая коническая трубкаFalcon352070
96-луночный флиппер микротрубчатые штативыThermoFisher Scientific8770-11
96-луночная пластина TC Treated США ScientificCC7682-7596
100 мм x 20 мм TC обработанная тарелкаСША ScientificCC7682-3394
1250 μ L Tips OneTipСША Центрифуга Scientific1112-1720
5910  Ri - Охлаждаемая центрифугаEppendorf5943000131
диметилсульфоксидом, безводным, ≥ 99,9%Sigma-Aldrich276855-100ML
DMEM, высокий уровень глюкозыThermoFisher Scientific11965092
DPBS, без кальция, без магнияThermoFisher Scientific14190144
EHop 016Bio-Techne Tocris6248Растворить в ДМСО; хранить при -70 °°; C
EnduRen Субстрат для живых клетокPromegaE6481Хранение аликвот при -70 °°; C
Eppendorf 2-20 μ L дозаторEppendorf3123000039
Eppendorf Research plus 100-1000 μ L пипеткаEppendorf3123000063
Eppendorf Research Plus 1-10 µ L дозаторEppendorf3123000020
Eppendorf Research plus 12-канальныйEppendorf3125000028
Eppendorf Research plus 200 μ L пипеткаEppendorf 
Фетальная сыворотка крупного рогатого скота, сертифицированная, одобренная Министерством сельского хозяйства США регионамиThermoFisher Scientific10437028
Forma Steri-Cycle CO2  Инкубатор, 184 л, полированная нержавеющая стальThermoFisher Scientific381
Ручной счетчикSigma-AldrichHS6594
HEK 293T КлеткиATCCCRL-3216
Гемацитометр - Neubauer Bright Line, двойная счетная камераLW ScientificCTL-HEMM-GLDR
Invitrogen TE BufferThermoFisher Scientific8019005
МикроскопZeissAxiovert 25 CFL
Мини-центрифугаBenchmark ScientificC1012
Мультипробирка Штатив для конических пробирок 50 мл, 15 мл конических и микроцентрифужных пробирокBoekel Scientific120008
PEI MAX - трансфекционный класс линейного полиэтиленина гидрохлорида (MW 40,000)Polysciences24765-100MG
Pipet-Aid XPСША Scientific4440-0101
Поли-D-лизина гидробромидSigma-AldrichP6407-5MG
Розина гидрохлоридBio-Techne Tocris5003Растворить в ДМСО; хранить при -70 °°;
C Трипсин-ЭДТА (0,05%), феноловый красныйThermoFisher Scientific25300054
многорежимный микропланшетный ридер Varioskan LUXThermoFisher ScientificVL0000D0
VortexThermoFisher Scientific2215365уровень 8
VWR Вакуумная аспирационная системаVWR75870-734
ZCL 278Bio-Techne Tocris4794Растворить в ДМСО; хранить при температуре -70 °°С; С
3123000055

Ссылки

  1. Aoyama-Ishiwatari, S., Hirabayashi, Y. Endoplasmic reticulum-mitochondria contact sites-emerging intracellular signaling hubs. Front Cell Dev Biol. 9, 653828(2021).
  2. Sassano, M. L., Felipe-Abrio, B., Agostinis, P. ER-mitochondria contact sites; a multifaceted factory for Ca2+ signaling and lipid transport. Front Cell Dev Biol. 10, 988014(2022).
  3. Scorrano, L., et al. Coming together to define membrane contact sites. Nat Commun. 10 (1), 1287(2019).
  4. Voeltz, G. K., Sawyer, E. M., Hajnóczky, G., Prinz, W. A. Making the connection: How membrane contact sites have changed our view of organelle biology. Cell. 187 (2), 257-270 (2024).
  5. Paillusson, S., et al. There's something wrong with my MAM; the ER-mitochondria axis and neurodegenerative diseases. Trends Neurosci. 39 (3), 146-157 (2016).
  6. Sasi, U. S. S., Sindhu, G., Raj, P. S., Raghu, K. G. Mitochondria associated membranes (MAMs): emerging drug targets for diabetes. Curr Med Chem. 27 (20), 3362-3385 (2019).
  7. Joshi, A. U., Kornfeld, O. S., Mochly-Rosen, D. The entangled ER-mitochondrial axis as a potential therapeutic strategy in neurodegeneration: A tangled duo unchained. Cell Calcium. 60 (3), 218-234 (2016).
  8. Moltedo, O., Remondelli, P., Amodio, G. The mitochondria-endoplasmic reticulum contacts and their critical role in aging and age-associated diseases. Front Cell Dev Biol. 7, 172(2019).
  9. Rieusset, J. The role of endoplasmic reticulum-mitochondria contact sites in the control of glucose homeostasis: an update. Cell Death Dis. 9 (3), 388(2018).
  10. Bouguerra, M. D., Lalli, E. ER-mitochondria interactions: Both strength and weakness within cancer cells. Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 1866 (4), 650-662 (2019).
  11. Tepikin, A. V. Mitochondrial junctions with cellular organelles: Ca2+ signalling perspective. Pflügers Arch. 470 (8), 1181-1192 (2018).
  12. Masson, G. L., Przedborski, S., Abbott, L. F. A computational model of motor neuron degeneration. Neuron. 83 (4), 975-988 (2014).
  13. Giamogante, F., Barazzuol, L., Brini, M., Calì, T. ER-mitochondria contact sites reporters: strengths and weaknesses of the available approaches. Int J Mol Sci. 21 (21), 8157(2020).
  14. Rizzuto, R., et al. Close contacts with the endoplasmic reticulum as determinants of mitochondrial Ca2+ responses. Science. 280 (5370), 1763-1766 (1998).
  15. Valm, A. M., et al. Applying systems-level spectral imaging and analysis to reveal the organelle interactome. Nature. 546 (7656), 162-167 (2017).
  16. Csordás, G., et al. Imaging interorganelle contacts and local calcium dynamics at the ER-mitochondrial interface. Mol Cell. 39 (1), 121-132 (2010).
  17. Cieri, D., et al. SPLICS: a split green fluorescent protein-based contact site sensor for narrow and wide heterotypic organelle juxtaposition. Cell Death Differ. 25 (6), 1131-1145 (2018).
  18. Kakimoto, Y., et al. Visualizing multiple inter-organelle contact sites using the organelle- targeted split-GFP system. Sci Rep. 8 (1), 6175(2018).
  19. Wu, M. M., Covington, E. D., Lewis, R. S. Single-molecule analysis of diffusion and trapping of STIM1 and Orai1 at ER-plasma membrane junctions. Mol Biol Cell. 25 (22), Mac.E14-06-1107 (2014).
  20. Csordas, G., et al. Structural and functional features and significance of the physical linkage between ER and mitochondria. J Cell Biol. 174 (7), 915-921 (2006).
  21. de Brito, O. M., Scorrano, L. Mitofusin 2 tethers endoplasmic reticulum to mitochondria. Nature. 456 (7222), 605-610 (2008).
  22. Kremer, A., et al. Developing 3D SEM in a broad biological context. J Microsc. 259 (2), 80-96 (2015).
  23. Söderberg, O., et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nat Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).
  24. Lim, Y., Cho, I. -T., Rennke, H. G., Cho, G. β2-adrenergic receptor regulates ER-mitochondria contacts. Sci Rep. 11 (1), 21477(2021).
  25. Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nat Methods. 12 (1), 51-54 (2014).
  26. Cho, I. -T., et al. Ascorbate peroxidase proximity labeling coupled with biochemical fractionation identifies promoters of endoplasmic reticulum-mitochondrial contacts. J Biol Chem. 292 (39), 16382-16392 (2017).
  27. Lim, Y., Cho, I. -T., Schoel, L. J., Cho, G., Golden, J. A. Hereditary spastic paraplegia-linked REEP1 modulates endoplasmic reticulum/mitochondria contacts. Ann Neurol. 78 (5), 679-696 (2015).
  28. Arnold, T. R., Stephenson, R. E., Miller, A. L. Rho GTPases and actomyosin: Partners in regulating epithelial cell-cell junction structure and function. Exp Cell Res. 358 (1), 20-30 (2017).

Перепечатки и разрешения

Теги

HEK293T
Анализ ресборки расщепленной люциферазы для измерения контактов эндоплазматических ретикулум-митохондрий в живых клетках
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.