Методическая статья

Резюме ятрогенной травмы: техника электроэксцизии для моделирования стриктуры уретры у крыс

1.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/66864

⸱

11 октября 2024 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Urology, The Fifth Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, 2Guangdong Provincial Key Laboratory of Biomedical Imaging, The Fifth Affiliated Hospital, Sun Yat-Sen University

В этой статье

Краткое содержание

В этом исследовании мы представляем новую, эффективную и стабильную модель стриктуры уретры у крыс, созданную путем электроэксцизии уретры крысы, которая эффективно имитирует ятрогенное повреждение, наблюдаемое в клинических условиях.

Аннотация

Стриктура уретры (УЗИ) является распространенным клиническим заболеванием в урологии, характеризующимся высокой распространенностью и заболеваемостью во всех возрастных группах. Современные методы лечения УЗИ, такие как дилатация уретры и внутренняя уретротомия, не могут полностью устранить это состояние и связаны с высокой частотой рецидивов и осложнений.

Кроме того, патогенез УЗИ недостаточно изучен. Для изучения патогенеза УЗИ и разработки новых терапевтических стратегий крайне важно создать стандартизированную модель на крысе, которая точно отражает клинические проявления. В этом исследовании описан простой и воспроизводимый метод индуцирования УЗИ у крыс с помощью высокочастотного электрического ножа. Метод предполагает выполнение продольного разреза электрическим ножом, установленным в униполярный режим смешанной резки при мощности 4 Вт, что наносит значительное повреждение уретры. Гистопатологический анализ показывает утолщение уротелия, воспалительную инфильтрацию и дезорганизацию коллагеновых волокон. Эта модель эффективно воспроизводит ятрогенное повреждение путем электроэксцизии в уретре крысы. Таким образом, это исследование успешно создает новую, эффективную и стабильную модель УЗИ на крысах, которая точно имитирует клинический сценарий, предоставляя ценный инструмент для дальнейших исследований механизмов и новых методов лечения УЗИ.

Введение

Стриктура уретры (УЗИ) является одним из старейших урологических заболеваний и продолжает широко распространена. Последние данные свидетельствуют о том, что на 100 000 мужчин приходится от 229 до 627 случаевУЗИ1. Те, кто страдает от УЗИ, испытывают ряд симптомов, включая симптомы нижних мочевыводящих путей2, боль 3 и сексуальную дисфункцию4. Существует несколько медицинских методов лечения, таких как уретротомия, уретропластика и дилатация5. Тем не менее, эти методы лечения часто осложняются такими проблемами, как кровотечение, инфекция и недержание, что способствует бремени болезни и демонстрирует различную частоту рецидивов 6,7. Следовательно, определение наиболее эффективных терапевтических подходов остается важнейшей задачей, привлекающей исследователей и клиницистов.

УЗИ обычно характеризуется как сужение передней уретры, вызванное фиброзом и рубцеванием слизистой оболочки уретры и окружающей спонгиозной ткани8. Несмотря на распространенность, причины и механизмы, лежащие в основе УЗИ, плохо изучены, и не хватает подходящих животных моделей для углубленного изучения. Ятрогенное повреждение, в первую очередь в результате трансуретральной хирургии, в настоящее время является основной причиной УЗИ, на долю которого приходится 41% случаев9. Таким образом, идеальная животная модель для исследований в США должна точно воспроизводить распространенные клинические травмы, демонстрировать близкое геномное и протеомное сходство с человеком, а также демонстрировать как эффективность, так и стабильность. Такая модель значительно облегчила бы более глубокие исследования патогенеза УЗИ и разработку более эффективных методов лечения.

Для изучения патогенетического процесса и механизма распространенных клинических типов были разработаны различные животные модели с использованием крупных животных, таких как кролики10,11, собаки12 и свиньи13,14, с использованием таких методов, как электрокоагуляция, электрорезекция15 и инъекции блеомицина16. Тем не менее, эти модели часто сталкиваются с проблемами из-за ограничений размера выборки и генетических отличий от людей. Кроме того, необходимо учитывать экономическую эффективность использования крупных животных; Несмотря на высокие затраты, связанные с ежедневным уходом, крупные животные также несут значительные риски заражения, что требует обширного послеоперационного ухода и значительных затрат. Хорошо известно, что грызуны имеют общие физиологические и патологические характеристики с человеком во многих системах органов. Недавнее исследование показало гомологию между клетками мочевыводящих путей животных-грызунов и человека17. Кроме того, затраты на приобретение, содержание и послеоперационный уход за крысами значительно ниже, чем за крупными животными18. Следовательно, крысиная модель США считается подходящей; Однако развитие таких моделей на крысах описано недостаточно.

В предыдущих исследованиях использовались хирургические инструменты, такие как лезвия или иглы, для индуцирования УЗИ у крыс модели19. Этот подход был связан с такими рисками, как повреждение периуретральных кровеносных сосудов, приводящее к значительному кровотечению. Субъективный характер этих хирургических процедур также может привести к вариабельности в степени механической травмы, отсутствию количественных критериев для моделирования, что может повлиять на оценку результатов восстановления уретры в последующих терапевтических исследованиях.

Учитывая эти соображения, существует явная потребность в разработке дополнительной модели для крыс в США. Чтобы создать эффективную, экономичную и стабильную модель УЗИ на крысах, мы использовали высокочастотную электрическую ножевую машину. Эта модель облегчит дальнейшие исследования механизмов УЗИ и оценку новых терапевтических подходов до перехода к клиническим испытаниям.

Протокол

В этом исследовании были задействованы двадцать 6-месячных самцов крыс породы Спрэг-Доули, каждый весом 400-500 г. Все процедуры на животных проводились в соответствии с рекомендациями Комитета по уходу за животными и их использованию в Пятой аффилированной больнице Университета Сунь Ятсена (номер разрешения: 00349). Животные были размещены в помещении с контролируемой температурой и условиями освещения. Фундаментальной характеристикой стриктуры уретры является развитие рубцов внутри уретры. Основываясь на установленных сроках формирования рубца, которое обычно происходит в течение 4 недель после травмы, мы определили наличие заметной рубцовой ткани в уретре на 4-недельной послеоперационной отметке в качестве экспериментальной конечной точки.

1. Подготовка хирургических инструментов

  1. Подготовьте следующие хирургические материалы: катетер с тефлоновым покрытием (0,6 х 1 мм), рассасывающиеся шовные нити (6-0), ножницы для швов, тканевые щипцы, плоскогубцы для удержания иглы, гладкие щипцы, высокочастотный электрохирургический аппарат (Рисунок 1), включая панель высокочастотного электрического ножа, хирургический электрод высокочастотного электрохирургического ножа и анальный проводящий стержень (см. Таблицу материалов).
  2. Очистите операционную область спиртовыми салфетками, содержащими 75% этанола.
  3. Подготовка к использованию высокочастотного электрического ножа в униполярном режиме электрорезки.
    1. Подключите высокочастотный электрический нож к заземленному основному источнику питания 220 В с помощью шнура питания.
    2. Вставьте стерилизованную ручку ножа с ручным управлением и проводящий стержень в соответствующие гнезда (рис. 1C).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что все кабели питания надежно подключены для обеспечения безопасности операции.

2. Подготовка животного

  1. Наберите в шприц пентобарбитал натрия (60 мг/кг).
  2. Обезопасьте крысу, схватив ее за хвост доминирующей рукой и удерживая кожу ушей и шеи недоминирующей рукой, чтобы убедиться, что она надежно зафиксирована.
  3. Обнажите нижнюю часть живота крысы и продезинфицируйте область с помощью ватных шариков, смоченных в 75% этаноле.
  4. Введите иглу шприца примерно на 1-2 мм рядом со средней линией живота в нижней части живота, направив ее в брюшную полость под углом 45°.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вы почувствуете потерю сопротивления, когда игла проникнет в брюшину.
  5. Осторожно оттяните поршень шприца, чтобы убедиться, что в шприце нет крови или жидкости.
  6. Медленно вводите пентобарбитал натрия. Извлеките иглу, завершив инъекцию, и снова продезинфицируйте место с помощью ватных шариков, смоченных в 75% этаноле.
  7. Следите за ритмом дыхания крысы и щипайте ее заднюю лапу, чтобы проверить наличие рефлексов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что дыхание крысы ровное и что у нее нет рефлексов, прежде чем приступать к операции.
  8. Выдавите эритромициновую мазь и обмакните в мазь ватный тампон. Нанесите мазь ватным тампоном на роговицы обоих глаз, чтобы предотвратить высыхание роговицы во время процедуры.
  9. Используйте электробритву для бритья нижней части живота и промежности после подтверждения анестезии.
  10. Сотрите выпавшие волосы с выбритого участка салфеткой, смоченной в физрастворе.
  11. Продезинфицируйте участок, дважды протерев его марлевой губкой, смоченной в йодофоре, чтобы свести к минимуму раздражение кожи.
  12. Положите крысу под глубоким наркозом на грелку, установленную на 37°C, в лежачем положении. Обеспечьте стерильность во время хирургических процедур, надев медицинские перчатки.

3. Катетеризация уретры и процедура травмирования

  1. Вставьте проводящий стержень в анальное отверстие крысы, чтобы создать эффективную замкнутую цепь для высокочастотной электрической ножевой машины (рис. 2A).
  2. Катетеризируйте мочеиспускательный канал крысы, чтобы помочь в позиционировании и обеспечить поддержку на этапах постобработки операции.
    1. Смажьте мочевой катетер парафиновым маслом.
    2. Обнажите пенис, сжимая кожу вокруг него, чтобы он выступал из брюшной полости.
    3. Продезинфицируйте половой член крысы марлевой губкой, смоченной в йодофоре.
    4. Аккуратно откройте отверстие уретры с помощью гладких щипцов и введите смазанный катетер в уретру.
    5. Осторожно ввести катетер с тефлоновым покрытием в уретру в ритме сокращения уретры; избегайте принудительного введения (Рисунок 2B).
    6. При возникновении сопротивления осторожно потяните пенис к вентральной стороне, чтобы отрегулировать угол изгиба полового члена, и продолжайте продвигаться катетером в мочевой пузырь до тех пор, пока моча не вытечет (Рисунок 2C).
    7. Подтвердите успешную катетеризацию, убедившись, что половой член образует угол примерно 45° к брюшной полости (рисунок 2D).
  3. Включите высокочастотный электрический ножевой станок, нажмите кнопки на высокочастотной панели ножей, чтобы выбрать режим униполярной смешанной резки, и установите мощность на 4 Вт для следующих этапов электроиссечения пениса слой за слоем.
  4. Совместите разрез с катетером. Нажмите желтую кнопку на рукоятке электрохирургического ножа и сделайте разрез вдоль линии маркировки катетера от кожи полового члена до внешнего слоя мочеиспускательного канала с помощью электрического ножа до тех пор, пока уретра не обнажится (рис. 3A, B).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что вы нажимаете желтую кнопку для электроэксцизии, а не синюю кнопку для электрокоагуляции.
  5. Продолжайте делать продольный разрез на 0,5 см в уретре с помощью электрического ножа, обеспечивая поперечный диаметр 0,1 см, до тех пор, пока катетер не станет видимым (рисунок 3C).
  6. Сшивайте рану и поверхностную поверхность кожи слой за слоем с помощью рассасывающихся швов (6-0) непрерывными или прерывистыми швами (рис. 3D,E).
  7. Извлеките катетер уретры и измените положение полового члена (рисунок 3F).
  8. Выключите высокочастотный электрический нож и извлеките проводящий стержень из анального отверстия крысы.
  9. Очистите хирургические материалы спиртовыми салфетками (75% этанола).

4. Послеоперационный уход

  1. Положите крысу на подогретую подушку (37 °C) и внимательно следите за ее восстановлением после анестезии. Обратите пристальное внимание на физическое состояние крысы, включая ритм дыхания, температуру тела и уровень сознания.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не возвращайте крысу в клетку до тех пор, пока не будет наблюдаться полное выздоровление.
  2. Поместите крыс в чистую клетку и наполните бутылку водой с добавлением морфина (0,4 мг/кг) для ежедневного обезболивания после выздоровления.
  3. Вводите нестероидные противовоспалительные препараты (такие как карпрофен, 0,5 мг/кг, подкожное введение) для полного восстановления крыс от послеоперационной боли.

5. Гистологическое исследование

  1. Через четыре недели после операции вызовите у крыс рефлекс мочеиспускания, подняв хвосты. Поместите крысу в бокс для эвтаназии, откройте клапан трансмиссионной трубы CO2 и гуманно усыпьте крыс с помощью передозировки CO2.
  2. Закройте клапан после подтверждения того, что крыса неподвижна и не дышит и наблюдая, что зрачок расширен. Продолжайте наблюдать за физическим состоянием крысы в течение 2 минут, чтобы убедиться, что эвтаназия прошла успешно.
  3. Извлеките крысу из ящика для эвтаназии.
  4. Очистите операционную область и хирургические материалы салфетками, смоченными на 75% в этаноле.
  5. Рассеките брюшную полость, чтобы наблюдать за состоянием наполнения мочевого пузыря и собрать всю уретру.
  6. После забора уретры поместите крысу в герметичный пакет и храните его в холодильнике при температуре 4 °C для обработки лаборантами.
  7. Морфологически оценивают УЗИ на грубую патологию, ориентируясь на цвет и гладкость тканей.
  8. Окрашивание ткани уретры гематоксилином и эозином (H&E) для визуализации структуры раны и слоя уротелиальных клеток.
    1. Окуните предметные стекла в ксилол для депарафинизации (2 х 5 мин).
    2. Регидратируйте предметные стекла в этаноле по порядку (100% 1 x 3 мин, 95% 1 x 3 мин, 85% 1 x 3 мин, 75% 1 x 3 мин).
    3. Промойте слайды в деионизированной воде (2 мин).
    4. Покрасьте предметные стекла гематоксилином (10 мин).
    5. Промойте горки в деионизированной воде (5 мин).
    6. Дифференцируйте образцы с помощью дифференцировочного раствора (40 с).
    7. Промойте предметные стекла в деионизированной воде (2 х 3 мин).
    8. Покрасьте предметные стекла эозином (2 мин).
    9. Регидратируйте предметные стекла в этаноле в порядке (100% 1 x 3 с, 95% 1 x 3 с, 85% 1 x 3 с, 75% 1 x 3 с)
    10. Окуните предметные стекла в 100% этанол (1 минута) и прозрачите предметные стекла ксилолом (2 x 1 минута).
    11. Добавьте нейтральный бальзам и запечатайте крышкой.
  9. Нанесите трихромное окрашивание Массона на ткани мочеиспускательного канала, чтобы подчеркнуть структуру коллагеновых волокон.
    1. Окуните предметные стекла в ксилол для депарафинизации (2 х 5 мин).
    2. Регидратируйте предметные стекла в этаноле по порядку (100% 1 x 3 мин, 95% 1 x 3 мин, 85% 1 x 3 мин, 75% 1 x 3 мин).
    3. Промойте слайды в деионизированной воде (2 мин).
    4. Окрасьте предметные стекла в раствор гематоксилина железа Вейгерта (5 мин).
    5. Промойте горки в деионизированной воде (5 мин).
    6. Окрашиваем горки в фукшин Бибриха с алой кислотой (5 мин).
    7. Промойте предметные стекла в деионизированной воде (2 х 3 мин).
    8. Покрасьте предметные стекла раствором фосфомолибдиновой кислоты (5 мин).
    9. Поместите слайды в раствор Анилиновый синий (5 мин). Раствор выбросить.
    10. Промойте предметные стекла, обезвожьте с помощью спирта и очистите от ксилола.
    11. Добавьте нейтральный бальзам и запечатайте крышкой.
  10. Выполните иммунофлуоресцентное окрашивание с использованием антитела TGF-β для оценки слоя уротелиальных клеток.
    1. Добавьте в скороварку соответствующий буфер для извлечения антигена. Поставьте скороварку на конфорку и включите ее на полную мощность.
    2. После закипания переложите горки из водопроводной воды в скороварку. Налейте на плиту холодную воду и нагрейте горки в течение 10 минут.
    3. Выключите скороварку и снимите горки. Остудите горки до комнатной температуры.
    4. Промойте горки раствором PBS.
    5. Отметьте поля образцов ручкой-блокатором жидкости.
    6. Опустите предметные стекла в PBS плюс 0,3% Triton X-100 на 30 минут.
    7. Вымойте предметные стекла в PBS с легким помешиванием (2 x 5 мин).
    8. Заблокируйте 10% козью сыворотку в PBS при комнатной температуре (60 мин).
    9. Буфер, блокирующий аспират, и инкубировать с первичным антителом при 4 °C в течение ночи.
    10. Вымойте слайды с помощью 1x PBS (3 x 5 мин).
    11. Инкубируйте с меченным флуорохромом вторичным антителом, разведенным в буфере для разведения антител.
    12. Вымойте слайды с помощью 1x PBS (3 x 3 мин).
    13. Закрепите и загерметизируйте слайды.
  11. Отсканируйте испачканные слайды в цифровом виде с помощью объектива с 40-кратным увеличением в сканере слайдов.
  12. Проанализируйте изображения и измерьте толщину уротелия с помощью указанного программного обеспечения (Table of Materials).
    1. Откройте программу.
    2. Нажмите «Локальный компьютер», чтобы выбрать изображения с пятнами на слайдах.
    3. Нажмите кнопку Измерить расстояние, чтобы измерить толщину уротелия.
    4. Запишите данные о толщине уротелия.

Результаты

Протокол, изложенный в этом исследовании, успешно установил стабильную стриктуру уретры у крыс и продемонстрировал высокую воспроизводимость. Средняя продолжительность операций составила 20 минут, при этом никаких технических проблем во время процедур не возникало. Образцы уретры были успешно собраны через 4 недели после процедуры.

В экспериментальной группе мочевые пузыри крыс показали признаки перерастяжения, в отличие от контрольной группы, где мочевые пузыри были пустыми (рис. 4). Эти наблюдения указывают на значительное ухудшение функции мочеиспускания у крыс после экспериментального моделирования.

Через четыре недели после операции участки раны превратились в восковую белую рубцовую ткань, выступающую из поверхности уретры (Рисунок 5B), в то время как участки уретры в контрольной группе выглядели гладкими и бледно-красными (Рисунок 5A).

При гистологическом исследовании с окрашиванием отдела уретры гематоксилином и эозином (H&E) выявлено значительное утолщение уротелия и агрегация лимфоцитов. Кроме того, окрашивание по Массону выявило выраженный красноватый участок гиперпластической и метапластической эпителиальной ткани уретры, сопровождающийся нарушением коллагеновых волокон (подробные изображения окрашивания по Массону см. на дополнительном рисунке S1 ), что указывает на аномалии в структуре гладкой мускулатуры и коллагеновых волокон (рисунок 6).

Иммунофлуоресцентный анализ криосрезов показал повышенное содержание TGF-β в ткани уретры после операции (рис. 7), что позволяет предположить, что формирование структуры уретры связано с повышенной экспрессией TGF-β.

figure-results-1
Рисунок 1: Ключевые инструменты, использованные для создания модели США. (А) катетер с тефлоновым покрытием (0,6 х 1 мм); (B) рассасывающиеся швы (6-0), тканевые щипцы, игольчатые плоскогубцы и гладкие щипцы (слева направо); (В) высокочастотная электрохирургическая ручка и анальный проводящий стержень; (D) панель высокочастотного электрического ножа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2: Подготовка к операции. (А) Оббрейте нижнюю половину живота крысы и подсоедините анальный проводящий стержень. (Б-Г) Проиллюстрируйте размещение уретрального катетера внутри уретры. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-3
Иллюстрация 3: Процесс электрорезекции. (А) Показано создание продольного разреза на коже полового члена размером 0,8 см; (В) обнажение мочеиспускательного канала; (C) подробно описывает электросекцию через все слои стенки уретры до тех пор, пока катетер внутри уретры не станет видимым. (Д,Э) Изображено удаление катетера уретры и изменение положения полового члена. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-4
Рисунок 4: Состояние наполнения мочевого пузыря у крыс в анатомических условиях. (A) Наличие пустого мочевого пузыря у крыс контрольной группы; (В) показывает переполненный мочевой пузырь крыс в экспериментальной группе. Мочевые пузыри находятся в пределах красного пунктирного контура. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-5
Рисунок 5: Макроскопические данные резецированных образцов уретры. (A) Нормальная ткань уретры. (Б) Рубцовая ткань уретры. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-6
Рисунок 6: Результаты гистологии образцов уретры. (А) Ткань уретры из контрольной группы, окрашенная H&E (первоначальное увеличение, 100x). (B) Трихромное окрашивание уретры по Массону при 100-кратном первоначальном увеличении. (C) Увеличение и данные измерений нормальной толщины урофелия, которая составляет 85,9 мкм. Масштабная линейка = 20 мкм. (D) Показывает H&E окрашивание ткани уретры из экспериментальной группы при 100-кратном первоначальном увеличении. (E) Изображено трихромное окрашивание ткани уретры Массоном из экспериментальной группы, также при 100-кратном первоначальном увеличении. Масштабные линейки = 100 мкм. (F) Увеличение рубца уретры и данные измерений утолщенного уротелия - 231,2 мкм. Масштабная линейка = 20 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-7
Рисунок 7: Результаты иммуногистохимии на образцах иссеченной уретры. Мечение антител TGF-β выделяет уротелиальные клетки; При связывании антитела с клетками испускается зеленая флуоресценция. (А-С) Показать более низкую интенсивность сигнала в уротелиальных клетках контрольной группы по сравнению с (D-F) более высокой интенсивностью сигнала в уротелиальных клетках опытной группы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Дополнительный рисунок S1: Полное изображение окрашивания образцов уретры по Массону. (А) окрашивание контрольной группы массоном; (Б) Окрашивание опытной группы Массоном. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Обсуждение

США представляют собой значительную нагрузку на здравоохранение со значительными экономическими последствиями, негативно влияющими как на психологическое, так и на физическое благополучие20. По-прежнему существует потребность в лечении, которое не только полностью излечивает УЗИ, но и эффективно предотвращает его рецидив.

В этом исследовании мы использовали модель на крысе для разработки простого и воспроизводимого метода имитации повреждения уретры у пациентов, за которым последовало повреждение уретры, вызванное трансуретральной хирургией. Крыс предпочитают в качестве моделей для животных, потому что они экономичны, просты в обращении, обеспечивают воспроизводимость и предоставляют надежные данные. Модель на крысе, используемая в этом исследовании, имеет ряд преимуществ по сравнению с другими моделями: она обычно используется в различных омиксных анализах и проста в управлении. Кроме того, сходство в экспрессии генов эпителиальных клеток мочевыводящих путей у грызунов и человека делает модель УЗИ крысы особенно подходящей для болееглубоких исследований.

Как видно на рисунке 7, TGF-β экспрессировался во всем круге уретры как в контрольной, так и в экспериментальной группах, причем экспрессия TGF-β в опытной группе была заметно выше, чем в контрольной группе. В предыдущих работах было документально подтверждено, что резидентные клетки уротелия практически претерпевают фенотипическое переключение в миофибробласты после травмы, процесс которого в основном управляется TGF-β, который оказывает значительное влияние на образование рубцов, регулируя выработку ECM (внеклеточного матрикса), иммунную модуляцию, пролиферацию клеток, миграцию и дифференцировку22,23. Полученные нами данные свидетельствуют о том, что гиперэкспрессия TGF-β может способствовать образованию рубцов на уретре, а секреция TGF-β не ограничивается резидентными клетками на поверхности раны, а требует участия всей уретры.

Малый диаметр и кривизна уретры самцов крыс создают проблемы при обнаружении изменений в уродинамике после моделирования. Существует нехватка исследований методов оценки функции мочеиспускания у самцов крыс. В этом исследовании мы использовали косвенные методы для наблюдения за изменениями в функции мочеиспускания путем оценки состояния наполнения мочевого пузыря через 4 недели после операции. Наблюдение за рассеченным брюшной полостью крысы при стимуляции мочеиспускательного рефлекса показало, что в экспериментальной группе наблюдалась стойкая полнота мочевого пузыря, что свидетельствует о значительном ухудшении функции мочеиспускания после моделирования. Эти результаты согласуются с клиническими симптомами затрудненного мочеиспускания, испытываемыми у пациентов со стенозом уретры24. Тем не менее, разработка методов проведения физиологических исследований параметров мочеиспускания у самцов крыс, таких как частота мочеиспускания, средний объем мочеиспускания и эффективность мочеиспускания, остается сложной задачей.

Выбор режимов и настроек мощности высокочастотных электрических ножей критически влияет на степень травматизма при хирургических манипуляциях. В этом исследовании представлена хирургическая техника, которая обеспечивает соответствующий уровень травмы, и адекватная степень высокочастотного электрического ножа, которая составляет 4 Вт, для разработки модели УЗИ на крысах. Наиболее распространенный метод на крысиных моделях УЗИ предполагает выполнение надрезов иглой или скальпелем25. Тем не менее, использование скальпеля, как правило, увеличивает вероятность непрерывного кровотечения из-за гладкой поверхности и небольшого диаметра уретры крысы, что может непреднамеренно повредить окружающие кровеносные сосуды.

Высокочастотный нож имеет значительное преимущество, обеспечивая одновременный гемостаз за счет подачи стабильного и регулируемого электрического тока на ткани, повышая стабильность и удобство процедуры. Кроме того, управляемость настройки мощности позволяет количественно оценить нанесенный ущерб.

Идеальный протокол эксперимента должен постоянно производить уретральные раны одинакового размера и глубины. В данном исследовании был выбран униполярный режим смешанной резки для индуцирования повреждения уретры. В отличие от режима электрокоагуляции, который в первую очередь вызывает испарение жидких компонентов, сушку, коагуляцию тканей и герметизацию кровеносных сосудов без разрыва тканей, что приводит к быстрому пригоранию и адгезии тканей, режим разрезания позволяет делать точные, послойные разрезы в ткани полового члена. В то время как электрокоагуляция широко используется в моделях кроликов в США и требует дополнительныхдействий, таких как отделение пениса от радия и выполнение разрезов другими хирургическими инструментами, что увеличивает риск травм животных и осложнений, униполярный режим смешанного разрезания позволяет делать прямые разрезы в крайней плоти для обнажения уретры. Этот метод повышает эффективность работы и сводит к минимуму травматизацию подопытных животных.

Настройка мощности в предыдущем исследовании не была подробно указана, так как обычно она зависит от веса подопытных животных и площади контакта между электронным ножом и тканью. В данном исследовании экспериментальными объектами были 6-месячные крысы SD с массой от 400 г до 500 г. Для этих условий оптимальная мощность была определена в диапазоне от 4 до 7 Вт, что позволяло точно контролировать размер и глубину разреза. Мы рекомендуем операторам начать с более низкой настройки мощности при первом использовании высокочастотного ножа для разработки модели американской крысы, корректируя ее по мере необходимости, чтобы найти наиболее подходящее значение для различных условий.

Кроме того, одним из важнейших этапов является катетеризация уретры крыс перед операцией. Успешная катетеризация подтверждается при правильном размещении катетера в мочевом пузыре. Хотя катетер служит в качестве временного каркаса, он должен сохранять положение уретры и помогать в определении места операции. Мочеиспускательный канал самца крысы имеет относительно небольшой диаметр, а пространство между крайней плотью и тканями полового члена ограничено, что позволяет легко ошибочно ввести катетер в неправильное отверстие, что потенциально может усложнить последующие процедуры. Правильное расположение катетера проверяется, когда моча вытекает, что указывает на то, что она надежно находится в мочевом пузыре. Кроме того, катетеризированный пенис должен быть расположен под углом 45° для повышения стабильности в уретре и облегчения хирургической процедуры.

В заключение следует отметить, что данное исследование демонстрирует новый, высокоэффективный и экономичный метод создания модели УЗИ на крысах. Этот метод характеризуется своей простотой, высоким уровнем успеха и стабильностью, предлагая ценный инструмент для исследования широкого спектра инновационных методов лечения стриктуры уретры.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Благодарности

Данное исследование было поддержано грантами Фонда естественных наук провинции Гуандун (No.2019A1515012116 и No.2022A1515012559).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
рассасывающиеся шовные материалы (6-0)KERONG COMPANYKR2230814
Операционная площадка для животныхПредоставлена Ключевой лабораторией биомедицинской визуализации провинции ГуандунNA
CaseViewer 2.43DHISTECH Ltd.
КарпрофенСигма-ОлдричMFCD00079028
CoraLite488-конъюгированный козий анти-кроличий IgG(H+L)ProteintechSA00013-2
H& E Набор для морилкиAbcamab150669
  высокочастотный электрохирургический аппаратBeijing Taktvoll Technology CompanyES-100v
Masson набор для окрашиванияMerckHT15
игольчатые плоскогубцыRWD Life ScienceS15001-11
Парафиновое маслоNANA
гладкие щипцыRWD Life ScienceF13019-12
ПентобарбиталнатрияГуандунская ключевая лаборатория биомедицинской визуализацииNA
Sprague– Dawley ratGuangdong Medical Laboratory AnimalGDMLAC-035
ножницы для швовRWD Life ScienceS15001-11
катетер с тефлоновым покрытием (0,6 мм x 1 мм)DGZF новые материалы компанияNA
TGF Beta 1 Поликлональное антителоProteintech21898-1-AP
Ножницы для тканейRWD Life ScienceS13029-14
Center

Ссылки

  1. Rourke, K. F., et al. Canadian Urological Association guideline on male urethral stricture. Cuaj-Can Urol Assoc. 14 (10), 305-316 (2020).
  2. Cotter, K. J., et al. Prevalence of post-micturition incontinence before and after anterior urethroplasty. J Urol. 200 (4), 843-847 (2018).
  3. Bertrand, L. A., et al. Lower urinary tract pain and anterior urethral stricture disease: Prevalence and effects of urethral reconstruction. J Urol. 193 (1), 184-189 (2015).
  4. Mondal, S., Bandyopadhyay, A., Mandal, M. M., Pal, D. K. Erectile dysfunction in anterior urethral strictures after urethroplasty with reference to vascular parameters. Med J Armed Forces India. 72 (4), 344-349 (2016).
  5. Campos-Juanatey, F., et al. European association of urology guidelines on urethral stricture disease (part 2): Diagnosis, perioperative management, and follow-up in males. Eur Urol. 80 (2), 201-212 (2021).
  6. Hoy, N. Y., Chapman, D. W., Dean, N., Rourke, K. F. Incidence and predictors of complications due to urethral stricture in patients awaiting urethroplasty. J Urol. 199 (3), 754-759 (2018).
  7. Anger, J. T., Buckley, J. C., Santucci, R. A., Elliott, S. P., Saigal, C. S. Trends in stricture management among male medicare beneficiaries: Underuse of urethroplasty. Urology. 77 (2), 481-485 (2011).
  8. Milenkovic, U., Albersen, M., Castiglione, F. The mechanisms and potential of stem cell therapy for penile fibrosis. Nat Rev Urol. 16 (2), 79-97 (2018).
  9. European Association of Urology. EAU guidelines on urethral-strictures. , Available from: https://uroweb.org/guidelines/urethral-strictures (2023).
  10. Faydacı, G., et al. Comparison of two experimental models for urethral stricture in the anterior urethra of the male rabbit. Urology. 80 (1), 225.e7-225.e11 (2012).
  11. Yang, M., et al. Urine-microenvironment-initiated composite hydrogel patch reconfiguration propels scarless memory repair and reinvigoration of the urethra. Adv Mater. 34 (14), 210952(2022).
  12. Orabi, H., Aboushwareb, T., Zhang, Y., Yoo, J. J., Atala, A. Cell-seeded tubularized scaffolds for reconstruction of long urethral defects: A preclinical study. Eur Urol. 63 (3), 531-538 (2013).
  13. Sievert, K. -D., et al. Introducing a large animal model to create urethral stricture similar to human stricture disease: A comparative experimental microscopic study. J Urol. 187 (3), 1101-1109 (2012).
  14. Sievert, K. -D., et al. Urethroplasty performed with an autologous urothelium-vegetated collagen fleece to treat urethral stricture in the minipig model. World J Urol. 38 (9), 2123-2131 (2019).
  15. Hu, W. -F., Li, C. -L., Zhang, H. -P., Li, T. -T., Zeng, X. -Y. An experimental model of urethral stricture in rabbits using holmium laser under urethroscopic direct visualization. Urol Int. 93 (1), 108-112 (2014).
  16. Hua, X., et al. An experimental model of anterior urethral stricture in rabbits with local injections of bleomycin. Urology. 116, 230.e9-230.e15 (2018).
  17. Strittmatter, F., et al. Expression of fatty acid amide hydrolase (faah) in human, mouse, and rat urinary bladder and effects of faah inhibition on bladder function in awake rats. Eur Urol. 61 (1), 98-106 (2012).
  18. Abdullahi, A., Amini-Nik, S., Jeschke, M. G. Animal models in burn research. Cell Mol Life Sci. 71 (17), 3241-3255 (2014).
  19. Castiglione, F., et al. Adipose-derived stem cells counteract urethral stricture formation in rats. Eur Urol. 70 (6), 1032-1041 (2016).
  20. Cheng, X., et al. The changing trend in clinical characteristics and outcomes of male patients with urethral stricture over the past 10 years in China. Front Public Health. 9 (794451), 1-8 (2021).
  21. Yu, Z., et al. Single-cell transcriptomic map of the human and mouse bladders. J Am Soc Nephrol. 30 (11), 2159-2176 (2019).
  22. Lichtman, M. K., Otero-Vinas, M., Falanga, V. Transforming growth factor beta (tgf-β) isoforms in wound healing and fibrosis. Wound Repair Regen. 24 (2), 215-222 (2016).
  23. Tatler, A. L., Jenkins, G. Tgf-β activation and lung fibrosis. Proc Am Thorac Soc. 9 (3), 130-136 (2012).
  24. Palminteri, E., et al. Contemporary urethral stricture characteristics in the developed world. Urology. 81 (1), 191-197 (2013).
  25. Hedlund, P., Streng, T., Lee, T., Andersson, K. -E. Effects of tolterodine on afferent neurotransmission in normal and resiniferatoxin treated conscious rats. J Urol. 178 (1), 326-331 (2007).
  26. Yao, H. -J., et al. Three new experimental models of anterior urethral stricture in rabbits. Transl Androl Urol. 11 (6), 761-772 (2022).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Видео скоро будет доступно

Похожие статьи