Получение сшитых микросфер альгината натрия с различными ионами металлов с помощью технологии микрофлюидного электрораспыления

Системы доставки лекарств являются горячей точкой исследований в области био-тканевой инженерии, направленной на повышение эффективности и результативности доставки лекарств и снижение побочных реакций и побочных эффектов¹. Среди этих систем гидрогелевые микросферы, характеризующиеся хорошей биосовместимостью, перестраиваемыми механическими свойствами и функциональной пластичностью, являются одними из наиболее часто используемых средств для загрузки^{и доставки лекарств}. Они могут использоваться как для медленного, так и для контролируемого высвобождения лекарств, обеспечивают хорошие защитные эффекты для лекарств, предотвращают или минимизируют неспецифические эффекты лекарств в других тканях, а также нацеливают доставку лекарств к конкретным тканевым^{структурам}. Таким образом, гидрогелевые микросферы стали новой и эффективной системой доставки лекарств, и^{постепенно появляются исследования} в этой области4.

Гидрогелевые микросферы обычно синтезируются из биоразлагаемых материалов, включая полисахариды, белки и природные полимеры⁵. Среди них ALG является биосовместимым, биоразлагаемым полисахаридом, извлеченным из морских бурых водорослей⁶. Его молекулярная цепь содержит свободные гидроксильные и карбоксильные группы, которые могут сшиваться с большинством двухвалентных или поливалентных катионов с образованием нерастворимой в воде гидрогелевой структуры с трехмерной сетью⁵. Гидрогелевые микросферы, образованные ALG, могут быть преобразованы в отрицательно заряженные полиэлектролиты в нейтральных и щелочных растворах. Это отталкивание между отрицательными зарядами приводит к набуханию микросфер, что позволяет высвобождать инкапсулированный активный ингредиент или лекарство. Эти свойства привели к рассмотрению микросфер ALG в качестве перспективных носителей лекарств, широко используемых для загрузки лекарств и контролируемого высвобождения7.

Существуют различные методы получения гидрогелевых микросфер. К традиционным методам получения ALGMS обычно относятся золь-гель метод или эмульсионно-зольный метод. Эти методы включают в себя такие стадии, как реакции осаждения, совместного осаждения и гелеобразования для получения целевых микросфер⁸. В последние годы, с непрерывным развитием микрофлюидных технологий, метод микрофлюидного электрораспыления постепенно стал эффективным и точным методом подготовки микросфер⁹. В этом методе используется микрофлюидная технология для электрораспыления полимерного раствора через микротонкую сопло с образованием капель и микросфер микрометрового размера в ходе последующего процесса отверждения или сшивания¹⁰. По сравнению с традиционным методом, микрофлюидное электроспрей обеспечивает точный контроль размера и морфологии частиц микросфер путем регулировки таких параметров, как расход раствора, напряжение и размер сопла^{тонкой очистки 11}. Он также обеспечивает высокоскоростное непрерывное приготовление микросфер, повышая эффективность приготовления и поддерживая мягкие условия реакции. Кроме того, ALGMS может быть подготовлен для выполнения различных функций, таких как препараты с контролируемым высвобождением и загруженные катализаторы, что позволяет легко применять их в различных областях.

Здесь мы представляем протокол получения микросфер ALG методом микрофлюидного электрораспыления. Процесс включает в себя пропускание раствора ALG через микрофлюидное устройство и воздействие на него электрораспыления. Полученные капли собирали в растворе, содержащем различные ионы металлов (Ca²⁺, Cu²⁺, Zn²⁺ и Fe³⁺) для инициирования реакции сшивки. Эта реакция улучшает стабильность и адгезию микросфер и наделяет их различными функциональными возможностями. Этот метод прост в исполнении, и синтезированные микросферы демонстрируют хорошую однородность размеров в своей морфологии. Кроме того, мы исследовали их антимикробные свойства, медленную способность к высвобождению лекарств и биосовместимость. Этот протокол будет полезен для дальнейшей разработки и производства лекарств.

Кровь, использованная в экспериментах, была получена от самок мышей BALB/c SPF-класса весом 20-25 г и возрастом около 7 недель. Комитет по этике экспериментов на животных колледжа Чжэцзян Шужэнь одобрил все процедуры по уходу за животными и эксперименты.

1. Приготовление раствора

1. Взвесьте ALG и растворите в ультрачистой воде, помешивая на водяной бане при 50 °C до получения 2% раствора ALG.
2. Отдельно готовят массовую фракцию с 5% (или молярной массовой концентрацией 0,3 М) растворами CaCl₂, FeCl₃, ZnSO₄ и CuSO₄ в ультрачистой воде. Каждый раствор вылейте отдельно в сборную посуду.

2. Устройство для микрожидкостного электрораспыления

1. Возьмите стеклянную капиллярную трубку и поместите ее над пламенем паяльной лампы, чтобы она размягчилась, затем растяните ее до различных диаметров (50 мкм-500 мкм). Отрежьте мелкие части стеклорезом и аккуратно отполируйте отверстие наконечника высококачественной наждачной бумагой из карбида кремния. После очистки подсоедините толстый конец капиллярной трубки к длинной трубке, а другой конец трубки — к дозирующей игле и шприцу объемом 5 мл (дополнительный рисунок 1).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Острые края порезов стеклянной трубки трудно вставить в шланг; Таким образом, излом должен быть закруглен по краю пламени.
2. Прикрепите шприц к микрофлюидному шприцевому насосу, а капиллярную трубку с одного конца — к держателю. Подсоедините красный высоковольтный концевой зажим высоковольтного источника питания к дозирующей игле шприца и поместите серебряный зажим в жидкость для сбора. Такая конфигурация создает простое микрофлюидное электрораспыление (рис. 1A).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Расположите капиллярную трубку перпендикулярно столу.

3. Подготовка микросфер ALG

1. Поместите отдельные чашки для сбора, содержащие различные ионы металлов, непосредственно под капиллярную трубку. Включите микрофлюидный шприцевой насос и выберите Fast Forward, чтобы заполнить трубку ALG, затем установите соответствующую скорость потока (2 мл/ч).
2. Включите высоковольтный выключатель питания и поверните ручку, чтобы установить соответствующее напряжение (5-7 кВ).
3. Добавьте 20 мл раствора в каждую из 90 мм чашек Петри, чтобы собрать микросферы ALG и сформировать ALGMS, сшитые с различными ионами металлов (рис. 1B).
4. АЛГ образует микросферы под действием электрического поля и гравитации в различных ионосборных растворах в течение нескольких секунд. Отасканируйте микросферы с помощью стерилизованной пипетки и перенесите их в отдельные центрифужные пробирки объемом 1,5 мл для получения гидрогелевых микросфер Zn²⁺, Ca²⁺, Cu²⁺ и Fe³⁺ -ALG (рис. 1C). Маркируйте пробирки Zn-ALGMS, Ca-ALGMS, Cu-ALGMS и Fe-ALGMS.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Микросферы различных диаметров могут быть получены путем регулировки таких параметров, как напряжение, диаметр наконечника, скорость потока и концентрация раствора.
5. Возьмите небольшое количество подготовленных микросфер, распределите их как можно более равномерно в PBS и поместите под микроскоп для визуализации.
6. Случайно выбранные 10 полей наблюдения в одной и той же партии микросфер, импортируйте изображения для измерения в программное обеспечение ImageJ, преобразуйте изображения в соответствующий режим оттенков серого и используйте технологию пороговой сегментации для точного определения площади целевых частиц и запустите функцию анализа частиц, чтобы ImageJ мог идентифицировать и измерить целевые частицы. Получите данные о микросферах, а затем импортируйте данные в программное обеспечение Origin для анализа и картирования размеров частиц.

4. Тест на антимикробную эффективность

1. Приготовьте 5 мл суспензий золотистого стафилококка (S. aureus) и кишечной палочки (E. coli) с исходным бактериальным помутнением 0,2 мкФ с использованием жидкой среды Лурия-Бертани (LB).
2. Добавьте по 10 мл каждого бактериального раствора в 4 отдельные стерильные центрифужные пробирки объемом 15 мл. Затем добавьте 0,5 мл Zn-ALGMS, Ca-ALGMS, Cu-ALGMS и Fe-ALGMS ALG в каждую пробирку и поместите их в шейкер с постоянной температурой при 37 °C и 200 об/мин на 12 часов. Добавьте равное количество физиологического раствора в контрольную группу.
3. Разведите каждый бактериальный раствор до 10⁵ раз стерильной водой. С помощью стерильной стеклянной бусины распределите 200 мкл бактериального раствора по твердой среде LB.
4. Быстро и равномерно распределите раствор по пластине для покрытия, избегая движения вперед и назад на одном и том же участке. Затем поместите планшеты в инкубатор при температуре 37 °C на 12 часов. Наблюдайте за колониями разных групп.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Все асептические процедуры следует проводить вблизи спиртовой лампы. Стерилизуйте сосуды для микробных культур, посуду для посевов и питательные среды.

5. Тестирование на высвобождение лекарственного средства

1. Чтобы оценить способность различных микросфер к высвобождению лекарственных средств, используйте бычий сывороточный альбумин (БСА) в качестве загруженного модельного препарата. Добавьте по 500 мкл каждой микросферы (Ca-ALGMS, Cu-ALGMS, Zn-ALGMS и Fe-ALGMS) в суспензию 1 мг/мл BSA в течение 24 ч.
2. Для анализа высвобождения лекарственного препарата каждый насыщенный образец добавляют в 5,0 М фосфатно-солевого буфера (PBS; pH 7,4) с последующим перемешиванием в течение 15 мин при 37 °C с непрерывным встряхиванием при 80 об/мин.
3. Используйте 100 μл раствора и замените среду на свежую через 1, 3, 6, 12, 24, 36 и 48 часов.
4. Количественно оценивайте концентрации белка надосадочной жидкости в определенное время с помощью набора BCA в соответствии с инструкциями производителя. Количественно измерьте высвобождаемое лекарственное средство по ферментному маркеру для получения соответствующей абсорбции и переведите измеренное значение в фактическую концентрацию лекарственного средства по стандартной кривой. Рассчитайте скорость высвобождения препарата по следующей формуле:
   Процент высвобождения наркотика = (концентрация высвобождаемого наркотика в определенный момент времени / начальная концентрация наркотика) x 100%
5. Через равные промежутки времени извлекайте равный объем PBS из каждой лунки и заменяйте его равным объемом свежей среды.

6. Тест на гемолиз

1. Приготовленные Ca-ALGMS, Cu-ALGMS, Zn-ALGMS и Fe-ALGMS поместите в PBS и инкубируйте их при 37 °C в течение 24 ч для приготовления инкубационного раствора.
2. Получить цельную кровь от здоровых мышей BALB/c методом флеботомии глаза, собранную в антикоагулированные пробирки, содержащие цитрат натрия. Вортекс и центрифуги при 1509 х г в течение 15 мин для получения эритроцитов.
3. Промойте эритроциты в 2-3 раза PBS и приготовьте 10% раствор эритроцитов с PBS.
4. Приготовление различных ALGMS: Возьмите по 500 мкл каждой микросферы для опытной группы, 1 мл сверхчистой воды (ddH₂O) для положительной контрольной группы и 1 мл раствора PBS для отрицательной контрольной группы и смешайте каждую с 20 μл раствора клеток крови.
5. Образцы инкубировать при 37 °C в течение 4 ч, центрифугировать при 1509 x g, 15 мин. Отложите надосадочную жидкость в сторону и сфотографируйте эритроциты в каждой группе после гемолиза.
6. Примите уровень гемолиза в группе положительного контроля за 100% и в группе отрицательного контроля за 0%. Измерьте значения абсорбции надосадочной жидкости в каждой группе и рассчитайте скорость гемолиза по формуле:
   Гемолиз (%) = (Значения поглощения надосадочной жидкости каждой группы
   Значения поглощения только дистиллированной воды) / (Значения поглощения положительной контрольной группы - Значения поглощения только дистиллированной воды) x 100

7. Тест на цитобиосовместимость

1. Промойте различные ALGMS 2x с PBS и поместите в чашку Петри объемом 5 мл на 15 минут и выбросьте надосадочную жидкость.
2. Отдельно добавить различные ALGMS по 0,2 мл в полнокультуральную среду (DMEM), содержащую 10% FBS, инкубировать при 37 °C в течение 24 ч и отфильтровать раствор до получения фильтрата.
3. Культивируют клетки NIH3T3 примерно до 70% плотности в 24-луночных планшетах, обрабатывают клетки NIH3T3 раствором для выщелачивания микросфер и продолжают культивирование полной средой в течение еще 24 ч.
4. Удалите среду для культивирования клеток и промойте клетки PBS.
5. Оцените жизнеспособность клеток с помощью анализа Calcein-AM/PI. Возьмите 2,5 мкл раствора Кальцеин-АМ (4 мМ) и 12,5 мкл раствора ПИ (2 мМ) и добавьте их к 5 мл 1х ПБС и хорошо перемешайте до получения рабочего раствора с 2 мкМ Кальцеин-АМ и 5 мкМ ПИ.
6. Добавьте рабочий раствор в предварительно засеянные клеточные культуральные планшеты из расчета 500 μл на лунку, инкубируйте при 37 °C под светозащитой в течение 15 минут, наблюдайте и фотографируйте под инвертированным флуоресцентным микроскопом. Настройте три репликации для каждой группы.
7. Рассчитать жизнеспособность клеток можно по следующей формуле:
   Жизнеспособность клеток (%) = количество жизнеспособных клеток / (количество жизнеспособных клеток + количество мертвых клеток)

Определение характеристик сшитых ALGMS с различными ионами металлов
Оптическая морфология Ca-ALGMS, Cu-ALGMS, Zn-ALGMS и Fe-ALGMS показана на рисунке 2, демонстрируя хорошую сферичность, гладкую поверхность, равномерное распределение частиц по размерам (дополнительный рисунок 2) и превосходную монодисперсность. Кроме того, мы выполнили микроскопическую характеристику с помощью сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) и энергодисперсионной спектроскопии (ЭДС). Как показано на рисунке 3, микросферы, как правило, имели сферическую форму с четко выраженной округлостью. Поверхность Zn-ALGMS была распределена неравномерно, выглядела более шероховатой с множеством морщин. Для определения распределения содержания ионов металлов, участвующих в реакции сшивания в геле, была проведена энергодисперсионная спектроскопия. Примечательно, что размер микросферы можно регулировать, изменяя такие параметры, как расстояние сбора, концентрация геля и напряжение электрическогополя12. В изложенном протоколе, регулируя параметры микрофлюидного устройства и концентрацию жидкости, можно легко получить частицы разного размера в соответствии с конкретными требованиями.

Оценка антимикробных свойств
Мы оценивали антимикробную способность различных микросфер с помощью планшетного метода, как показано на рисунке 4. Различные микросферы проявляли антибактериальную активность в отношении E. coli и S. aureus, при этом Cu-ALGMS и Zn-ALGMS проявляли наиболее сильные антибактериальные свойства. Такая повышенная эффективность объясняется антимикробной активностью металлов, а именно меди (Cu) и цинка (Zn)13. Sukhodub et al. продемонстрировали, что Fe3+, Zn2+, Ca2+ и Cu2+ проявляли синергетические антибактериальные эффекты с хитозаном, в то время как образцы без хитозана не проявляли такой активности, что подтверждает синергетический антибактериальный эффект сформированных комплексов14. Полученные результаты согласуются с данным исследованием, при этом Cu-ALGMS и Zn-ALGMS превосходят другие гидрогелевые микросферы в лечении бактериальных инфекционных заболеваний.

Оценка свойств высвобождения лекарственных средств
Оценка высвобождения препарата из различных альгинатных гидрогелевых микросфер на основе металлов с использованием БСА в качестве модельного препарата выявила различия в профилях их высвобождения. (Дополнительный рисунок 3). Ионы продемонстрировали лучшую способность к медленному высвобождению лекарств, чем ионы других материалов. Скорость высвобождения лекарственного средства Fe2+ была относительно выше, чем у трех других ионов, в то время как скорость высвобождения лекарственного средства Ca2+ и Zn2+ была относительно медленнее. Эти результаты подчеркивают различия во влиянии различных ионов на высвобождение лекарств. Мы предполагаем, что Fe2+ может взаимодействовать с препаратом или связываться таким образом, что облегчает его высвобождение, в то время как Ca2+ и Zn2+ связываются с препаратом более плотно, или существуют другие факторы, ограничивающие скорость высвобождения. Это устойчивое высвобождение лекарственного препарата из гидрогелевых микросфер может быть связано с прочностью сшивания между металлом и альгинатным полисахаридом. Кроме того, разница в адсорбционной способности различных металлов по сравнению с адсорбционной способностью БСА, вероятно, способствовала различиям, наблюдаемым в способности лекарственного препарата замедлять действие.

Оценка биосовместимости
Хорошая биосовместимость является обязательным условием для носителей доставки лекарств в клиническом применении. Поэтому мы оценивали гемосовместимость микросфер с помощью теста на гемолиз in vitro . Мы использовали чистую воду в качестве положительного контроля и раствор PBS в качестве отрицательного контроля. Экспериментальные результаты показаны на дополнительном рисунке 4, показывая, что эритроциты в суспензии оставались нетронутыми при контакте с различными микросферами, что указывает на минимальный гемолиз микросфер. Результаты цитобиосовместимости показали, что микросферы не влияют на клеточную активность (дополнительный рисунок 5). Эти результаты показали, что микросферы обладают хорошей совместимостью с клетками крови.

Рисунок 1: Получение микросфер альгинатного гидрогеля. (А) Установка технологии микрофлюидного электрораспыления. (B) Изображение процесса микрофлюидного электрораспыления в реальном времени. (C) Полученные альгинатные гидрогелевые микросферы Ca2+, Cu2+, Zn2+ и Fe3+ . Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Микросфера альгинатгидрогеля. Микрофотография (A) Ca-ALGMS, (B) Cu-ALGMS, (C) Zn-ALGMS и (D) Fe-ALGMS в PBS (pH 7,4). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3: Сканирующая электронная микроскопия и энергодисперсионная спектроскопия. На изображениях показана характеристика (A) Ca-ALGMS, (B) Cu-ALGMS, (C) Zn-ALGMS и (D) Fe-ALGMS с i и ii для данных сканирующей микроскопии и iii-v для данных спектроскопии. На изображениях iii-v показано картирование EDS, в котором EDS выбирает грань на поверхности образца для сканирования для получения информации о распределении элементов по всей площади. Режим развертки карты используется в приложениях для анализа состава, анализа фазовых зон и распределения частиц по размерам материалов, где каждый элемент представлен разным цветом, как показано на рисунке. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 4. Антимикробные свойства микросфер. (А) Антимикробные свойства групп были проверены с использованием метода бактериального мазка. (В, В) Количественная оценка результатов подсчета бактериальных мазков для каждой группы. Контрольные образцы показывают колонии, выращенные на среде LB без каких-либо добавок. Относительные колонии для других бактерий были рассчитаны путем принятия количества клонов контрольной группы за 100% и использования его в качестве исходного уровня. Планка погрешности: стандартное отклонение, n = 3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Дополнительный рисунок 1: Стеклянная трубка соединена со шприцем через длинную резиновую трубку. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 2: Размер частиц. (A) Zn-ALGMS, (B) Ca-ALGMS, (C) Cu-ALGMS, (D) Fe-ALGMS. Для всех образцов использовалась молярная концентрация 5%. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 3: Высвобождение лекарственного средства. Кривая высвобождения Ca-ALGMS, Cu-ALGMS, Zn-ALGMS и Fe-ALGMS в PBS (pH 7,4). Погрешность: стандартное отклонение, n = 3 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный рисунок 4: Анализ гемолиза Ca-ALGMS, Cu-ALGMS, Zn-ALGMS и Fe-ALGMS. PC (положительный контроль): ddH2O; NC (отрицательный контроль): PBS. Планка погрешности: стандартное отклонение, n = 3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 5: Цитотоксичность микросфер, сшитых с различными ионами. Проведена оценка биосовместимости Zn-ALGMS, Ca-ALGMS, Cu-ALGMS и Fe-ALGMS. Для проведения теста использовался Calcein-AM/PI, и для получения результатов здесь случайным образом были выбраны 5 полей зрения. ImageJ был использован для анализа соотношения эритроцитов и мертвых клеток для получения относительной жизнеспособности клеток. 1. ПК, положительный контроль, 2.NC, отрицательный контроль, 3. Zn-ALGMS, 4. Ca-ALGMS, 5. Cu-ALGMS, 6. Fe-ALGMS, Погрешность: стандартное отклонение, n = 3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Конфликты интересов не подлежат разглашению.