В протоколе описано получение микросфер альгината натрия, сшитых с различными ионами металлов с помощью микрофлюидного устройства для конструирования носителей лекарств. Также были исследованы антимикробные свойства и медленное высвобождение лекарств из этих микросфер.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Получение сшитых микросфер альгината натрия с различными ионами металлов с помощью технологии микрофлюидного электрораспыления
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Микросферы представляют собой частицы микрометрового размера, которые могут загружать и постепенно высвобождать лекарства посредством физической инкапсуляции или адсорбции на поверхности и внутри полимеров. В области биомедицины гидрогелевые микросферы широко изучаются на предмет их применения в качестве носителей лекарств благодаря их способности снижать частоту введения лекарств, сводить к минимуму побочные эффекты и улучшать комплаентность пациентов. Альгинат натрия (ALG) представляет собой встречающийся в природе линейный полисахарид с тремя основными гликозидными связями. В каждой из фракций полимера присутствуют две вспомогательные гидроксильные группы, которые обладают характеристиками спиртовой гидроксильной группы. Синтетические звенья ALG могут вступать в химические реакции сшивания с ионами металлов, образуя сшитую сетчатую структуру полимерных стеков, в конечном итоге образуя гидрогель. Гидрогелевые микросферы могут быть получены с помощью простого процесса, включающего ионные сшивающие свойства ALG. В этом исследовании мы получили гидрогелевые микросферы (АЛГМ) на основе АЛГ с использованием стратегии микрофлюидного электроосаждения. Подготовленные гидрогелевые микросферы имели одинаковый размер и хорошо диспергировались благодаря точному контролю потока микрофлюидного электроспрея. Методом микрофлюидного электрораспыления, сочетающего микрофлюидное и высокое электрическое поле, были получены ALGMS, сшитые с различными ионами металлов, и исследованы его антимикробные свойства, способность к медленному высвобождению лекарственного средства и биосовместимость. Эта технология перспективна для применения в разработке и производстве передовых лекарств.
Введение
Системы доставки лекарств являются горячей точкой исследований в области био-тканевой инженерии, направленной на повышение эффективности и результативности доставки лекарств и снижение побочных реакций и побочных эффектов1. Среди этих систем гидрогелевые микросферы, характеризующиеся хорошей биосовместимостью, перестраиваемыми механическими свойствами и функциональной пластичностью, являются одними из наиболее часто используемых средств для загрузкии доставки лекарств. Они могут использоваться как для медленного, так и для контролируемого высвобождения лекарств, обеспечивают хорошие защитные эффекты для лекарств, предотвращают или минимизируют неспецифические эффекты лекарств в других тканях, а также нацеливают доставку лекарств к конкретным тканевымструктурам. Таким образом, гидрогелевые микросферы стали новой и эффективной системой доставки лекарств, ипостепенно появляются исследования в этой области4.
Гидрогелевые микросферы обычно синтезируются из биоразлагаемых материалов, включая полисахариды, белки и природные полимеры5. Среди них ALG является биосовместимым, биоразлагаемым полисахаридом, извлеченным из морских бурых водорослей6. Его молекулярная цепь содержит свободные гидроксильные и карбоксильные группы, которые могут сшиваться с большинством двухвалентных или поливалентных катионов с образованием нерастворимой в воде гидрогелевой структуры с трехмерной сетью5. Гидрогелевые микросферы, образованные ALG, могут быть преобразованы в отрицательно заряженные полиэлектролиты в нейтральных и щелочных растворах. Это отталкивание между отрицательными зарядами приводит к набуханию микросфер, что позволяет высвобождать инкапсулированный активный ингредиент или лекарство. Эти свойства привели к рассмотрению микросфер ALG в качестве перспективных носителей лекарств, широко используемых для загрузки лекарств и контролируемого высвобождения7.
Существуют различные методы получения гидрогелевых микросфер. К традиционным методам получения ALGMS обычно относятся золь-гель метод или эмульсионно-зольный метод. Эти методы включают в себя такие стадии, как реакции осаждения, совместного осаждения и гелеобразования для получения целевых микросфер8. В последние годы, с непрерывным развитием микрофлюидных технологий, метод микрофлюидного электрораспыления постепенно стал эффективным и точным методом подготовки микросфер9. В этом методе используется микрофлюидная технология для электрораспыления полимерного раствора через микротонкую сопло с образованием капель и микросфер микрометрового размера в ходе последующего процесса отверждения или сшивания10. По сравнению с традиционным методом, микрофлюидное электроспрей обеспечивает точный контроль размера и морфологии частиц микросфер путем регулировки таких параметров, как расход раствора, напряжение и размер соплатонкой очистки 11. Он также обеспечивает высокоскоростное непрерывное приготовление микросфер, повышая эффективность приготовления и поддерживая мягкие условия реакции. Кроме того, ALGMS может быть подготовлен для выполнения различных функций, таких как препараты с контролируемым высвобождением и загруженные катализаторы, что позволяет легко применять их в различных областях.
Здесь мы представляем протокол получения микросфер ALG методом микрофлюидного электрораспыления. Процесс включает в себя пропускание раствора ALG через микрофлюидное устройство и воздействие на него электрораспыления. Полученные капли собирали в растворе, содержащем различные ионы металлов (Ca2+, Cu2+, Zn2+ и Fe3+) для инициирования реакции сшивки. Эта реакция улучшает стабильность и адгезию микросфер и наделяет их различными функциональными возможностями. Этот метод прост в исполнении, и синтезированные микросферы демонстрируют хорошую однородность размеров в своей морфологии. Кроме того, мы исследовали их антимикробные свойства, медленную способность к высвобождению лекарств и биосовместимость. Этот протокол будет полезен для дальнейшей разработки и производства лекарств.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Кровь, использованная в экспериментах, была получена от самок мышей BALB/c SPF-класса весом 20-25 г и возрастом около 7 недель. Комитет по этике экспериментов на животных колледжа Чжэцзян Шужэнь одобрил все процедуры по уходу за животными и эксперименты.
1. Приготовление раствора
- Взвесьте ALG и растворите в ультрачистой воде, помешивая на водяной бане при 50 °C до получения 2% раствора ALG.
- Отдельно готовят массовую фракцию с 5% (или молярной массовой концентрацией 0,3 М) растворами CaCl2, FeCl3, ZnSO4 и CuSO4 в ультрачистой воде. Каждый раствор вылейте отдельно в сборную посуду.
2. Устройство для микрожидкостного электрораспыления
- Возьмите стеклянную капиллярную трубку и поместите ее над пламенем паяльной лампы, чтобы она размягчилась, затем растяните ее до различных диаметров (50 мкм-500 мкм). Отрежьте мелкие части стеклорезом и аккуратно отполируйте отверстие наконечника высококачественной наждачной бумагой из карбида кремния. После очистки подсоедините толстый конец капиллярной трубки к длинной трубке, а другой конец трубки — к дозирующей игле и шприцу объемом 5 мл (дополнительный рисунок 1).
ПРИМЕЧАНИЕ: Острые края порезов стеклянной трубки трудно вставить в шланг; Таким образом, излом должен быть закруглен по краю пламени. - Прикрепите шприц к микрофлюидному шприцевому насосу, а капиллярную трубку с одного конца — к держателю. Подсоедините красный высоковольтный концевой зажим высоковольтного источника питания к дозирующей игле шприца и поместите серебряный зажим в жидкость для сбора. Такая конфигурация создает простое микрофлюидное электрораспыление (рис. 1A).
ПРИМЕЧАНИЕ: Расположите капиллярную трубку перпендикулярно столу.
3. Подготовка микросфер ALG
- Поместите отдельные чашки для сбора, содержащие различные ионы металлов, непосредственно под капиллярную трубку. Включите микрофлюидный шприцевой насос и выберите Fast Forward, чтобы заполнить трубку ALG, затем установите соответствующую скорость потока (2 мл/ч).
- Включите высоковольтный выключатель питания и поверните ручку, чтобы установить соответствующее напряжение (5-7 кВ).
- Добавьте 20 мл раствора в каждую из 90 мм чашек Петри, чтобы собрать микросферы ALG и сформировать ALGMS, сшитые с различными ионами металлов (рис. 1B).
- АЛГ образует микросферы под действием электрического поля и гравитации в различных ионосборных растворах в течение нескольких секунд. Отасканируйте микросферы с помощью стерилизованной пипетки и перенесите их в отдельные центрифужные пробирки объемом 1,5 мл для получения гидрогелевых микросфер Zn2+, Ca2+, Cu2+ и Fe3+ -ALG (рис. 1C). Маркируйте пробирки Zn-ALGMS, Ca-ALGMS, Cu-ALGMS и Fe-ALGMS.
ПРИМЕЧАНИЕ: Микросферы различных диаметров могут быть получены путем регулировки таких параметров, как напряжение, диаметр наконечника, скорость потока и концентрация раствора. - Возьмите небольшое количество подготовленных микросфер, распределите их как можно более равномерно в PBS и поместите под микроскоп для визуализации.
- Случайно выбранные 10 полей наблюдения в одной и той же партии микросфер, импортируйте изображения для измерения в программное обеспечение ImageJ, преобразуйте изображения в соответствующий режим оттенков серого и используйте технологию пороговой сегментации для точного определения площади целевых частиц и запустите функцию анализа частиц, чтобы ImageJ мог идентифицировать и измерить целевые частицы. Получите данные о микросферах, а затем импортируйте данные в программное обеспечение Origin для анализа и картирования размеров частиц.
4. Тест на антимикробную эффективность
- Приготовьте 5 мл суспензий золотистого стафилококка (S. aureus) и кишечной палочки (E. coli) с исходным бактериальным помутнением 0,2 мкФ с использованием жидкой среды Лурия-Бертани (LB).
- Добавьте по 10 мл каждого бактериального раствора в 4 отдельные стерильные центрифужные пробирки объемом 15 мл. Затем добавьте 0,5 мл Zn-ALGMS, Ca-ALGMS, Cu-ALGMS и Fe-ALGMS ALG в каждую пробирку и поместите их в шейкер с постоянной температурой при 37 °C и 200 об/мин на 12 часов. Добавьте равное количество физиологического раствора в контрольную группу.
- Разведите каждый бактериальный раствор до 105 раз стерильной водой. С помощью стерильной стеклянной бусины распределите 200 мкл бактериального раствора по твердой среде LB.
- Быстро и равномерно распределите раствор по пластине для покрытия, избегая движения вперед и назад на одном и том же участке. Затем поместите планшеты в инкубатор при температуре 37 °C на 12 часов. Наблюдайте за колониями разных групп.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все асептические процедуры следует проводить вблизи спиртовой лампы. Стерилизуйте сосуды для микробных культур, посуду для посевов и питательные среды.
5. Тестирование на высвобождение лекарственного средства
- Чтобы оценить способность различных микросфер к высвобождению лекарственных средств, используйте бычий сывороточный альбумин (БСА) в качестве загруженного модельного препарата. Добавьте по 500 мкл каждой микросферы (Ca-ALGMS, Cu-ALGMS, Zn-ALGMS и Fe-ALGMS) в суспензию 1 мг/мл BSA в течение 24 ч.
- Для анализа высвобождения лекарственного препарата каждый насыщенный образец добавляют в 5,0 М фосфатно-солевого буфера (PBS; pH 7,4) с последующим перемешиванием в течение 15 мин при 37 °C с непрерывным встряхиванием при 80 об/мин.
- Используйте 100 μл раствора и замените среду на свежую через 1, 3, 6, 12, 24, 36 и 48 часов.
- Количественно оценивайте концентрации белка надосадочной жидкости в определенное время с помощью набора BCA в соответствии с инструкциями производителя. Количественно измерьте высвобождаемое лекарственное средство по ферментному маркеру для получения соответствующей абсорбции и переведите измеренное значение в фактическую концентрацию лекарственного средства по стандартной кривой. Рассчитайте скорость высвобождения препарата по следующей формуле:
Процент высвобождения наркотика = (концентрация высвобождаемого наркотика в определенный момент времени / начальная концентрация наркотика) x 100% - Через равные промежутки времени извлекайте равный объем PBS из каждой лунки и заменяйте его равным объемом свежей среды.
6. Тест на гемолиз
- Приготовленные Ca-ALGMS, Cu-ALGMS, Zn-ALGMS и Fe-ALGMS поместите в PBS и инкубируйте их при 37 °C в течение 24 ч для приготовления инкубационного раствора.
- Получить цельную кровь от здоровых мышей BALB/c методом флеботомии глаза, собранную в антикоагулированные пробирки, содержащие цитрат натрия. Вортекс и центрифуги при 1509 х г в течение 15 мин для получения эритроцитов.
- Промойте эритроциты в 2-3 раза PBS и приготовьте 10% раствор эритроцитов с PBS.
- Приготовление различных ALGMS: Возьмите по 500 мкл каждой микросферы для опытной группы, 1 мл сверхчистой воды (ddH2O) для положительной контрольной группы и 1 мл раствора PBS для отрицательной контрольной группы и смешайте каждую с 20 μл раствора клеток крови.
- Образцы инкубировать при 37 °C в течение 4 ч, центрифугировать при 1509 x g, 15 мин. Отложите надосадочную жидкость в сторону и сфотографируйте эритроциты в каждой группе после гемолиза.
- Примите уровень гемолиза в группе положительного контроля за 100% и в группе отрицательного контроля за 0%. Измерьте значения абсорбции надосадочной жидкости в каждой группе и рассчитайте скорость гемолиза по формуле:
Гемолиз (%) = (Значения поглощения надосадочной жидкости каждой группы
Значения поглощения только дистиллированной воды) / (Значения поглощения положительной контрольной группы - Значения поглощения только дистиллированной воды) x 100
7. Тест на цитобиосовместимость
- Промойте различные ALGMS 2x с PBS и поместите в чашку Петри объемом 5 мл на 15 минут и выбросьте надосадочную жидкость.
- Отдельно добавить различные ALGMS по 0,2 мл в полнокультуральную среду (DMEM), содержащую 10% FBS, инкубировать при 37 °C в течение 24 ч и отфильтровать раствор до получения фильтрата.
- Культивируют клетки NIH3T3 примерно до 70% плотности в 24-луночных планшетах, обрабатывают клетки NIH3T3 раствором для выщелачивания микросфер и продолжают культивирование полной средой в течение еще 24 ч.
- Удалите среду для культивирования клеток и промойте клетки PBS.
- Оцените жизнеспособность клеток с помощью анализа Calcein-AM/PI. Возьмите 2,5 мкл раствора Кальцеин-АМ (4 мМ) и 12,5 мкл раствора ПИ (2 мМ) и добавьте их к 5 мл 1х ПБС и хорошо перемешайте до получения рабочего раствора с 2 мкМ Кальцеин-АМ и 5 мкМ ПИ.
- Добавьте рабочий раствор в предварительно засеянные клеточные культуральные планшеты из расчета 500 μл на лунку, инкубируйте при 37 °C под светозащитой в течение 15 минут, наблюдайте и фотографируйте под инвертированным флуоресцентным микроскопом. Настройте три репликации для каждой группы.
- Рассчитать жизнеспособность клеток можно по следующей формуле:
Жизнеспособность клеток (%) = количество жизнеспособных клеток / (количество жизнеспособных клеток + количество мертвых клеток)
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Определение характеристик сшитых ALGMS с различными ионами металлов
Оптическая морфология Ca-ALGMS, Cu-ALGMS, Zn-ALGMS и Fe-ALGMS показана на рисунке 2, демонстрируя хорошую сферичность, гладкую поверхность, равномерное распределение частиц по размерам (дополнительный рисунок 2) и превосходную монодисперсность. Кроме того, мы выполнили микроскопическую характеристику с помощью сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) и энергодисперсионной спектроскопии (...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В данном протоколе мы представляем способ приготовления АЛГМ на основе технологии микрофлюидного электрораспыления. Метод прост в эксплуатации и позволяет получить большое количество микросфер с равномерной округлостью и контролируемым диаметром. Такой подход обеспечивает удобство для исследователей и может способствовать исследованию и применению гидрогелевых микросфер. Кроме того, за счет сшивания с ионами различных металлов были улучшены стабильность и биологическая активность АЛГМС. В антимикробных экспериментах Cu-A...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Конфликты интересов не подлежат разглашению.
Благодарности
Эта работа была поддержана исследовательским проектом Чжэцзянского университета Шужэнь (2023R053 и 2023KJ237).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Экран 120 меш | Solarbio, Китай | YA0946 | |
| Спиртовая горелка | Solarbio, Китай | YA2320 | |
| BALB/c мыши | Wukong Biotechnology, Китай | ||
| реагент для анализа бицинхониновой кислоты | Meilunbio, Китай | MA0082 | |
| Бычья сыворотка альбумин | Lablead, Китай | 9048-46-8 | |
| CaCl2& НБСП; порошок | Аладдин,Китай | 10043-52-4 | |
| Кальцеин-AM/PI | Biosharp,Китай | BL130A | |
| Центрифужные пробирки | Corning,Америка | 430290 | |
| CuSO4 порошок | Jnxinyuehuagong,Китай | 7758-99-8 | |
| DMEM Gibicol,Китай | C11995500BT | ||
| FeCl3 порошок | Аладдин,Китай | 7705-08-0 | |
| Фетальная сыворотка крупного рогатого скота | HAKATA,Китай | HN-FBS | |
| Стеклянные трубки | Sartorius,Германия | CC0028 | |
| Световая микроскопия | Evidentscientific,Япония | BX53(LED) | |
| Микрофлюидный шприцевой насос | Longerpump,Англия | LSP01-3A | |
| NIH3T3 | HyGyte,Китай | TCM-C752 | |
| Чашка Петри | Thermofisher, Америка | 150464 | |
| Фосфатный буферный раствор | Thermofisher, Америка | 3002 | |
| Сканирующий электронный микроскоп | Thermofisher, Америка | Axia ChemiSEM | |
| Порошок альгината натрия | Bjbalb,Китай | Y13095 | |
| ZnSO4 порошок | Jnxinyuehuagong,Китай | 7733-02-0 |
Ссылки
- Gong, J., et al. A review of recent advances of cellulose-based intelligent-responsive hydrogels as vehicles for controllable drug delivery system. Int J BiolMacromol. 264 (2), 130525(2024).
- Zhao, Z., et al. Injectable microfluidic hydrogel microspheres for cell and drug delivery. Adv Funct. 31 (31), 2103339(2021).
- Qiao, S., Chen, W., Zheng, X., Ma, L. Preparation of pH-sensitive alginate-based hydrogel by microfluidic technology for intestinal targeting drug delivery. Int J Biol Macromol. 254 (2), 127649(2024).
- Lei, L., et al. Antimicrobial hydrogel microspheres for protein capture and wound healing. Mater Design. 215, 110478(2022).
- Ju, Y., et al. Zn2+ incorporated composite polysaccharide microspheres for sustained growth factor release and wound healing. Mater Today Bio. 22, 100739(2023).
- El-Sayed, N. S., Hashem, A. H., Khattab, T. A., Kamel, S. New antibacterial hydrogels based on sodium alginate. Int. J Biol Macromol. 248, 125872(2023).
- Olukman Şahin, M., Şanlı, O. In vitro 5-fluorouracil release properties investigation from pH sensitive sodium alginate coated and uncoated methyl cellulose/chitosan microspheres. Int J Biol Macromol. 258 (1), 128895(2024).
- Chi, H., Qiu, Y., Ye, X., Shi, J., Li, Z. Preparation strategy of hydrogel microsphere and its application in skin repair. Front Bioeng Biotechnol. 11, 1239183(2023).
- Yang, L., et al. Bio-inspired dual-adhesive particles from microfluidic electrospray for bone regeneration. Nano Res. 16 (4), 5292-5299 (2022).
- Zheng, H., et al. Celastrol-encapsulated microspheres prepared by microfluidic electrospray for alleviating inflammatory pain. Biomater Adv. 149, 213398(2023).
- Yang, L., Yang, W., Xu, W., Zhao, Y., Shang, L. Bio-inspired Janus microcarriers with sequential actives release for bone regeneration. Chem Eng J. 476, 146797(2023).
- Yang, L., Sun, L., Zhang, H., Bian, F., Zhao, Y. Ice-inspired lubricated drug delivery particles from microfluidic electrospray for osteoarthritis treatment. ACS Nano. 15 (12), 20600-20606 (2021).
- Li, S., et al. Ultra-flexible stretchable liquid metal circuits with antimicrobial properties through selective laser activation for health monitoring. Chem Eng J. 482, 149173(2024).
- Sukhodub, L., Kumeda, M., Sukhodub, L., Bielai, V., Lyndin, M. Metal ions doping effect on the physicochemical, antimicrobial, and wound healing profiles of alginate-based composite. Carbohydr Polym. 304, 120486(2023).
- Daly, A. C., Riley, L., Segura, T., Burdick, J. A. Hydrogel microparticles for biomedical applications. Nat Rev Mater. 5 (1), 20-43 (2020).
- Bertsch, P., Diba, M., Mooney, D. J., Leeuwenburgh, S. C. G. Self-healing injectable hydrogels for tissue regeneration. Chem Rev. 123 (2), 834-873 (2023).
- Yang, L., et al. Biomass microcapsules with stem cell encapsulation for bone repair. Nanomicro Lett. 14 (1), 4(2021).
- Wu, D., et al. NK-Cell-Encapsulated porous microspheres via microfluidic electrospray for tumor immunotherapy. ACS Appl Mater. 11 (37), 33716-33724 (2019).
- Nan, L., Zhang, H., Weitz, D. A., Shum, H. C. Development and future of droplet microfluidics. LOC. 24 (5), 1135-1153 (2024).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
