В этом протоколе описываются методологии создания простой и эффективной модели имплантации эмбриона in vitro для оценки соответствующих молекул, влияющих на процесс имплантации эмбриона.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Создание модели имплантации эмбриона in vitro
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Имплантация эмбриона – это первый шаг в установлении успешной беременности. Модель in vitro для имплантации эмбриона имеет решающее значение для фундаментальных биологических исследований, разработки лекарств и скрининга. В этой статье представлена простая, быстрая и высокоэффективная модель имплантации эмбриона in vitro . В этом протоколе мы сначала вводим получение бластоцисты мыши и подготовку клеток аденокарциномы эндометрия человека (Исикава) к имплантации, а затем метод совместного культивирования эмбрионов мышей и клеток Исикавы. Наконец, мы провели исследование для оценки влияния различных концентраций 17-β-эстрадиола (Е2) и прогестерона (Р4) на скорость адгезии эмбрионов на основе этой модели. Наши результаты показали, что высокие концентрацииЕ2 значительно снижают адгезию эмбрионов, в то время как добавление прогестерона может восстановить скорость адгезии. Эта модель предлагает простую и быструю платформу для оценки и скрининга молекул, участвующих в процессе адгезии, таких как цитокины, лекарства и факторы транскрипции, контролирующие имплантацию и рецептивность эндометрия.
Введение
Имплантация эмбриона, первый этап успешной беременности, имеет решающее значение для понимания его биологической основы и решения проблем бесплодия. Тем не менее, этические ограничения создают значительные ограничения при сборе образцов клинических эмбрионов человека, препятствуя исследованию сложных взаимодействий между человеческими эмбрионами и эндометрием на ранних сроках беременности1. Глубокое понимание этих сложных механизмов жизненно важно для продвижения фундаментальных биологических исследований, разработки лекарств и репродуктивного здоровья.
В предыдущих моделях in vitro использовались модели адгезии, в которых монослойные эпителиальные клетки эндометрия человека (RL95-2)2 культивировались совместно с эмбриональными заменителями, такими как клетки хориокарциномы BeWo, JAr или Jeg-33 . Тем не менее, выбор размера сфероидов в диапазоне от 70 до 100 мкм имел решающее значение, поскольку большие или меньшие клеточные агрегаты могли поставить под угрозу точность эксперимента. Примечательно, что только 25% сфероидов в каждом препарате соответствовали стандарту для подходящего размера4, и были значительные различия по сравнению с физиологическими условиями бластоцист.
Кроме того, трехмерные (3D) системы культивирования эндометрия и бластоцисты предлагают более физиологически значимую среду5, но они требуют высокой технической квалификации, медленного роста клеток, высоких затрат на ресурсы и обслуживание, сложности стандартизации и низкой воспроизводимости.
В этом протоколе мы представляем экономически эффективную и быструю модель имплантации эмбриона in vitro, которая может быть разработана и использована в большинстве лабораторий. Общая цель этого метода заключается в том, чтобы обеспечить надежную и воспроизводимую платформу для изучения взаимодействия между эмбрионами и эндометрием в контролируемой среде. Моделируя ключевые события имплантации эмбриона in vitro, эта модель направлена на преодоление разрыва между животными моделями и клиническими условиями, обеспечивая более точные и целенаправленные исследования.
По сравнению с эмбриональными заменителями, использование мышиных бластоцист обеспечивает более физиологически значимое представление процесса имплантации эмбриона in vivo7. Кроме того, клеточная линия Исикавы, полученная из аденокарциномы эндометрия человека, обладает смешанными характеристиками железистого эпителия и просветного эпителияматки 1, что позволяет ей экспрессировать ферменты, структурные белки и функциональные стероидные рецепторы, аналогичные тем, которые обнаруживаются в нормальном эндометрии, тем самым обеспечивая физиологически значимый субстрат для имплантации эмбриона. Простота и быстрота системы совместного культивирования позволяют проводить высокопроизводительный скрининг и тестирование на наркотики 8,9,10. Предоставляя надежную и воспроизводимую платформу, этот метод дает возможность углубить наше понимание имплантации эмбрионов и ее влияния на здоровье человека.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Работа с мышами и экспериментальные исследования проводились в соответствии с протоколами, утвержденными Комитетом по животным Шанхайского института биомедицинских и фармацевтических технологий. Обеспечьте процедуры безопасности: Всегда надевайте соответствующие средства индивидуальной защиты (СИЗ) при работе с химическими или биологическими материалами.
1. Приобретение эмбрионов мышей
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе описан процесс получения эмбрионов мыши. Взрослых самок мышей (в возрасте 6-8 недель, гибрид C57BL/6 и DBA/2) содержали в стандартных условиях окружающей среды 12 часов в светлом свете и 12 часов в темноте при 20-25 °C и влажности 40-60% с предоставлением пищи и воды в неограниченном количестве.
- Самкам мышей внутрибрюшинно вводят 10 МЕ гонадотропина сыворотки крови беременной кобылы (PMSG), а затем вводят 10 МЕ хорионического гонадотропина человека (ХГЧ) с интервалом 42-48 часов.
- Спарьте каждую самку мыши с самцом сопоставимого возраста и проверьте наличие вагинальной пробки на следующее утро.
ПРИМЕЧАНИЕ: Вагинальная пробка представляет собой светло-желтый комок суппозитория, образующийся после затвердевания спермы у входа во влагалище. - Усыпьте самок мышей с вагинальными пробками путем ингаляции CO2 .
- Вскрыть брюшную полость и найти женские гениталии; растянуть яйцевод, яичник и жировые подушечки с помощью щипцов; разрезать ножницами яйцевод и завязь; а затем разрезать яйцевод и матку (Рисунок 1).
- Полученный яйцевод переложите в чашку Петри диаметром 35 мм, предварительно заполненную средой М2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Среду М2 следует предварительно разогреть в инкубаторе (37 °C, 5%CO2) в течение 30 минут. - Проколите увеличенную ампулу яйцевода иглой 25 G, чтобы освободить или защемить кумулюсно-зиготный комплекс (рисунок 2).
- С помощью щипцов перенесите кумулюсно-зиготный комплекс в раствор М2, содержащий 0,5 мг/мл гиалуронидазы и инкубируйте в течение нескольких минут до тех пор, пока кумулюсные клетки не диссоциируют (рисунок 3).
- Соберите зиготы с помощью пипетки для переноса яиц и промойте их в среде M2, содержащей 4 мг/мл BSA, чтобы удалить остаточную гиалуронидазу, кумулюсные клетки и примеси.
2. Культивирование эмбриона мыши in vitro
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе подробно описан процесс культивирования in vitro эмбрионов мыши от зигот до бластоцист. Микрокапли культуры КСОМ следует готовить за 24 ч для обеспечения температурного и газового равновесия.
- Приготовьте 12 микрокапель среды КСОМ, каждая объемом 20 μл, на дно чашки Петри диаметром 35 мм. Залейте микрокапли 3-5 мл минерального масла (рис. 4) и поместите чашки Петри в инкубатор при температуре 37 °C с 5%CO2 для уравновешивания.
- Перенесите эмбрионы мышей из среды М2 в среду КСОМ с помощью трансферной пипетки для тщательной промывки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого шага требуется стереомикроскоп с нагревательным столиком 37 °C. Свести к минимуму продолжительность работы с эмбрионами вне инкубатора. - Поместите промытые эмбрионы в подготовленные микрокапли КСОМ и инкубируйте их при температуре 37 °С с 5%СО2 в течение 4 дней.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для обеспечения адекватного питания культивируйте 5-10 эмбрионов на 20 мкл микрокапель. - Выбирайте бластоцисты в зависимости от их размера (100-130 мкм), внутренней клеточной массы (внутренняя клеточная масса состоит из множества уплотненных клеток), количества клеток трофобласта (трофэктодерма состоит из множества клеток, которые скреплены и упакованы вместе) и степени расширения (бластоцель занимает 80-100% эмбриона).
3. Подготовка клеток эндометрия
- В шкафу биобезопасности отасуньте 1 мл 2% желатина с помощью пипетки и распределите его в 12-луночный планшет для культивирования. Аккуратно поворачивайте пластину, чтобы обеспечить полное покрытие дна желатином. Поместите планшет в инкубатор с температурой 37 °C на 30 минут. После этого отсадите излишки желатина и дайте дну тарелки полностью высохнуть.
- После завершения процесса нанесения покрытия клетки аденокарциномы эндометрия человека (Исикава) с DMEM/F12 (подробнее см. Таблицу материалов ), 1 мМ пирувата натрия, 2 мМ L-глутамина, 100 мкг/мл стрептомицина и 100 МЕ/мл пенициллина, засеивают их в покрытые желатином 12-луночные планшеты (2 × 105клеток/лунку) и инкубируют в течение 24 ч.
4. Прикрепление эмбриона
- Аккуратно поместите 5-15 свежих бластоцист в каждую лунку 12-луночного планшета, содержащего клетки Исикавы, приготовленные на предыдущем этапе для совместного культивирования (Рисунок 5).
- После 48-часовой инкубации понаблюдайте за эмбрионами под микроскопом, чтобы оценить статус их прикрепления. Чтобы наблюдать за прикреплением эмбриона, быстро переместите пластину три раза. Неприкрепленные эмбрионы будут демонстрировать плавающие или перекатывающиеся движения по поверхности клеток Исикавы.
- Рассчитать скорость имплантации эмбрионов с помощью уравнения (1); Используйте скорость адгезии эмбриона для представления эффекта имплантации.
Коэффициент имплантации эмбрионов = (Прикрепленные эмбрионы/Общее количество имплантированных эмбрионов) × 100% (1)
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
В процессе вспомогательных репродуктивных техник контролируемая гиперстимуляция яичников (ГН) является важнейшим этапом, приводящим к значительному повышению уровня эстрогенов у пациенток более чем в 10-20 раз по сравнению с естественными циклами11. Учитывая этот контекст, мы задались вопросом, влияют ли высокие концентрации эстрогена в сыворотке крови на имплантацию эмбрионов во время переноса свежих эмбрионов. Основываясь на этой модели имплантации эмбриона, мы изучили влияние различных концентр...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Простота и быстрота предлагаемой модели in vitro для имплантации эмбрионов дают замечательные преимущества для скрининга лекарств на ранних стадиях и других исследовательских приложений. Простой протокол в сочетании с высокой пропускной способностью клеточных линий Исикавы делает его идеальным кандидатом для крупномасштабного скрининга, особенно на ранних стадиях разработки лекарств. Лян13 обнаружил, что нокдаун TAGLN2 снижает способность клеток трофобласта к инвазии. Грин
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют конфликта финансовых или иных интересов, о котором они могли бы заявить.
Благодарности
Наши исследования были поддержаны Национальным фондом естественных наук Китая (82171603), Фондом Шанхайской муниципальной комиссии по здравоохранению (202140341), Комиссией по науке и технологиям муниципалитета Шанхая (23JC1403803) и Программой продвижения инноваций NHC и Shanghai Key Labs, SIBPT (RC2023-02).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 17-β-эстрадиол | SIGMA | 3301 | Самый мощный эстрогенный гормон млекопитающих |
| BD Falcon BD | 353001 | Бактериологические чашки Петри 35 x 10 мм с плотной крышкой, кристаллический первичный полистирол, стерильный | |
| Шкаф биобезопасности | класса ESCO |  BSC | Асептические операции, изготовление культуральных чаш, аликвотирование реагентов и т.д |
| . CO2 Инкубатор | Thermo | 8000DH | Культура эмбрионов |
| Культуральная пластина | Corning | 3506 | Клеточная культура |
| DMEM/F12 | Gibco | 1133032 | DMEM/F12 (1x), жидкость 1:1, Содержит L-глутамин и 15 мМ HEPES буфер |
| Фетальная бычья сыворотка | Gibco | 10099141 | Фетальная бычья сыворотка, сертифицированная, австралийское происхождение |
| Желатин | SIGMA | G9391 | тип B, порошок, биореагент, подходит для клеточной культуры |
| HCG | Nanjing Aibei | M2520 | Стерилизационный реагент, внутрибрюшинное введение, 50 МЕ/мл |
| гиалуронидазы | SIGMA | V900833 | Реагент марки, порошок |
| KSOM | Merck | MR-020P-D | (1x), порошок, без фенола красного, 5 x 10 мл |
| L-глутамина | Gibco | 25030081 | L-глутамина-200 мМ (100x), жидкий |
| M2 | Merck | MR-015-D | EmbryoMax M2 Medium (1x), жидкий, с феноловым красным |
| минеральным маслом | Минеральное масло SIGMA | M8410 | подходит для использования в качестве покровного слоя для контроля испарения и перекрестного загрязнения в различных областях молекулярной биологии |
| Пенициллин-стрептомицин, жидкий | Gibco | 15140122 | 10 000 единиц пенициллина (основание) и 10 000 единиц стрептомицина (основание), с использованием пенициллина G (натриевая соль) и стрептомицина сульфата в 0,85% физиологическом растворе |
| PMSG | Nanjing Aibei | M2620 | Стерилизационный реагент, внутрибрюшинное введение, 50 МЕ/мл |
| Прогестерон | SIGMA | 5341 | Стероидный гормон, секретируемый желтым телом во второй половине менструального цикла |
| Пируват натрия | Gibco | 11360070 | Пируват натрия обычно добавляется в среду для культивирования клеток в качестве источника углерода в дополнение к глюкозе |
| Стереомикроскоп | Olympus | SZX7 | Извлечение эмбрионов и наблюдение за развитием эмбрионов |
Ссылки
- Hannan, N. J., Paiva, P., Dimitriadis, E., Salamonsen, L. A. Models for study of human embryo implantation: choice of cell lines. Biol Reprod. 82 (2), 235-245 (2010).
- Li, H. Y., et al. Establishment of an efficient method to quantify embryo attachment to endometrial epithelial cell monolayers. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 38 (9), 505-511 (2002).
- Hohn, H. P., Linke, M., Denker, H. W. Adhesion of trophoblast to uterine epithelium as related to the state of trophoblast differentiation: in vitro studies using cell lines. Mol Reprod Dev. 57 (2), 135-145 (2000).
- Ho, H., Singh, H., Aljofan, M., Nie, G. A high-throughput in vitro model of human embryo attachment. Fertil Steril. 97 (4), 974-978 (2012).
- Karvas, R. M., et al. Stem-cell-derived trophoblast organoids model human placental development and susceptibility to emerging pathogens. Cell Stem Cell. 29 (5), 810-825 (2022).
- Xiang, L., et al. A developmental landscape of 3D-cultured human pre-gastrulation embryos. Nature. 577 (7791), 537-542 (2020).
- Ojosnegros, S., Seriola, A., Godeau, A. L., Veiga, A. Embryo implantation in the laboratory: an update on current techniques. Hum Reprod Update. 27 (3), 501-530 (2021).
- Berneau, S. C., et al. Characterisation of osteopontin in an in vitro model of embryo implantation. Cells. 8 (5), 432(2019).
- Jiang, R., et al. Enhanced HOXA10 sumoylation inhibits embryo implantation in women with recurrent implantation failure. Cell Death Discov. 3, 17057(2017).
- Kang, Y. J., Forbes, K., Carver, J., Aplin, J. D. The role of the osteopontin-integrin αvβ3 interaction at implantation: functional analysis using three different in vitro models. Hum Reprod. 29 (4), 739-749 (2014).
- Duan, C. C., et al. Oocyte exposure to supraphysiological estradiol during ovarian stimulation increased the risk of adverse perinatal outcomes after frozen-thawed embryo transfer: a retrospective cohort study. J Dev Orig Health Dis. 11 (4), 392-402 (2020).
- Chen, G., et al. Integrins β1 and β3 are biomarkers of uterine condition for embryo transfer. J Transl Med. 14 (1), 303-312 (2016).
- Liang, X., et al. Transgelin 2 is required for embryo implantation by promoting actin polymerization. FASEB J. 33 (4), 5667-5675 (2019).
- Green, C. J., Fraser, S. T., Day, M. L. Insulin-like growth factor 1 increases apical fibronectin in blastocysts to increase blastocyst attachment to endometrial epithelial cells in vitro. Hum Reprod. 30 (2), 284-298 (2015).
- Kang, Y. J., et al. MiR-145 suppresses embryo-epithelial juxtacrine communication at implantation by modulating maternal IGF1R. J Cell Sci. 128 (4), 804-814 (2015).
- Berger, C., Boggavarapu, N. R., Menezes, J., Lalitkumar, P. G., Gemzell-Danielsson, K. Effects of ulipristal acetate on human embryo attachment and endometrial cell gene expression in an in vitro co-culture system. Hum Reprod. 30 (4), 800-811 (2015).
- Li, X., et al. Three-dimensional culture models of human endometrium for studying trophoblast-endometrium interaction during implantation. Reprod Biol Endocrinol. 20 (1), 120-138 (2022).
- Fitzgerald, H. C., Schust, D. J., Spencer, T. E. In vitro models of the human endometrium: evolution and application for women's health. Biol Reprod. 104 (2), 282-293 (2021).
- Ahn, J., et al. Three-dimensional microengineered vascularised endometrium-on-a-chip. Hum Reprod. 36 (10), 2720-2731 (2021).
- Sternberg, A. K., Buck, V. U., Classen-Linke, I., Leube, R. E. How mechanical forces change the human endometrium during the menstrual cycle in preparation for embryo implantation. Cells. 10 (8), 2008(2021).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
