Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Универсальный конвейер для анализа динамических изменений в ядерных телах в различных типах клеток

1.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/66874

⸱

28 июня 2024 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Istituto Nazionale di Genetica Molecolare "Romeo ed Enrica Invernizzi" (INGM), 2SEMM, European School of Molecular Medicine, 3Department of Biosciences, University of Milan, 4T-One Therapeutics Srl

В этой статье

Краткое содержание

Этот метод описывает протокол иммунофлуоресценции и конвейер количественной оценки для оценки распределения белка с различными структурами ядерной организации в Т-лимфоцитах человека. Этот протокол обеспечивает пошаговое руководство, начиная с подготовки образца и заканчивая выполнением полуавтоматического анализа на Фиджи и заканчивая обработкой данных с помощью блокнота Google Colab.

Аннотация

Различные ядерные процессы, такие как транскрипционный контроль, происходят в дискретных структурах, известных как очаги, которые можно различить с помощью метода иммунофлуоресценции. Изучение динамики этих очагов в различных клеточных условиях с помощью микроскопии дает ценную информацию о молекулярных механизмах, управляющих клеточной идентичностью и функциями. Тем не менее, проведение иммунофлуоресцентных анализов для различных типов клеток и оценка изменений в сборке, диффузии и распределении этих очагов сопряжены с многочисленными проблемами. Эти проблемы включают в себя сложности подготовки образцов, определения параметров для анализа данных визуализации и управления значительными объемами данных. Кроме того, существующие рабочие процессы обработки изображений часто адаптированы для опытных пользователей, что ограничивает доступность для более широкой аудитории.

В этом исследовании мы представляем оптимизированный протокол иммунофлуоресценции, предназначенный для изучения ядерных белков в различных типах первичных Т-клеток человека, которые могут быть настроены для любого белка, представляющего интерес, и типа клеток. Кроме того, мы представляем метод несмещенной количественной оценки окрашивания белков, независимо от того, образуют ли они отдельные очаги или демонстрируют диффузное распределение ядер.

Предлагаемый нами метод представляет собой всеобъемлющее руководство, от клеточного окрашивания до анализа, с использованием полуавтоматического конвейера, разработанного в Jython и исполняемого на Фиджи. Кроме того, мы предоставляем удобный скрипт Python для оптимизации управления данными, который находится в открытом доступе в блокноте Google Colab. Наш подход продемонстрировал свою эффективность в получении высокоинформативных иммунофлуоресцентных анализов белков с различными структурами ядерной организации в различных контекстах.

Введение

Организация эукариотического генома регулируется несколькими слоями эпигенетических модификаций1, координирующих несколько ядерных функций, которые могут происходить в специализированных отсеках, называемых ядерными телами или конденсатами2. В этих структурах происходят такие процессы, как инициация транскрипции3, процессинг РНК 4,5,6, репарация ДНК 7,8, биогенез рибосом 9,10,11 и регуляция гетерохроматина 12,13. Регуляция ядерных тел корректируется как в пространственном, так и во временном измерениях, чтобы удовлетворить потребности клеток, руководствуясь принципами разделения фаз14,15. Следовательно, эти тела функционируют как переходные фабрики, где функциональные компоненты собираются и разбираются, претерпевая изменения в размерах и пространственном распределении. Таким образом, понимание характеристик ядерных белков с помощью микроскопии, включая их склонность к образованию тел и их пространственное расположение в различных клеточных условиях, дает ценную информацию об их функциональных ролях. Флуоресцентная микроскопия является широко используемым методом изучения ядерных белков, позволяющим обнаруживать их с помощью флуоресцентных антител или непосредственно экспрессировать мишени с помощью флуоресцентного белка-репортера16,17.

В этом контексте ядерные тела предстают в виде ярких очагов или точек, с заметной степенью сферичности, что делает их легко отличимыми отокружающей среды. Методы сверхвысокого разрешения, такие как STORM и PALM, обеспечивая улучшенное разрешение (до 10 нм)19, позволяют более точно характеризовать структуру и состав конкретныхконденсатов20. Однако их доступность ограничена затратами на оборудование и специальными навыками, необходимыми для анализа данных. Таким образом, конфокальная микроскопия остается популярной благодаря выгодному балансу между разрешением и более широким использованием. Такой популярности способствует неизбежное удаление расфокусированного света, что снижает потребность в обширных процедурах постобработки для точной сегментации, его широкой доступности в научно-исследовательских институтах, эффективном времени получения и обычно эффективной подготовке образцов. Тем не менее, точное измерение распределения, сборки или диффузии белка с помощью иммунофлуоресцентных анализов в различных клеточных условиях представляет собой проблему, поскольку во многих существующих методах отсутствуют рекомендации по выбору подходящих параметров для белков с различными моделями распределения. Кроме того, обработка большого объема данных может быть сложной задачей для пользователей с ограниченным опытом анализа данных, что может поставить под угрозу биологическую значимость результатов.

Для решения этих проблем мы представляем подробный пошаговый протокол подготовки иммунофлуоресценции и анализа данных, направленный на обеспечение объективного метода количественной оценки окрашивания белков с различными структурами организации (Рисунок 1). Этот полуавтоматический конвейер предназначен для пользователей с ограниченными знаниями в области вычислительного анализа и анализа изображений. Он сочетает в себе функции двух известных фиджийских плагинов: FindFoci22 и 3D suite23. Благодаря интеграции возможностей точной идентификации очагов FindFoci с функциями идентификации объектов и сегментации в 3D-пространстве, предлагаемыми 3D Suite, наш подход генерирует два файла CSV на канал для каждой области приобретения. Эти файлы содержат дополнительную информацию, которая облегчает расчет метрик, подходящих для различных типов распределения сигналов, таких как количество очагов на ячейку, расстояние фокусов от ядерного центроида и коэффициент неоднородности (IC), который мы ввели для диффузного окрашивания белков. Кроме того, мы признаем, что экстраполяция данных может отнимать много времени у пользователей с ограниченными навыками работы с данными. Чтобы упростить этот процесс, мы предоставляем скрипт Python, который автоматически компилирует все собранные измерения в один файл для каждого эксперимента. Пользователи могут выполнять этот скрипт без необходимости установки какого-либо программного обеспечения на языке программирования. Мы предоставляем исполняемый код на Google Colab, облачной платформе, которая позволяет писать скрипты Python прямо в браузере. Это гарантирует, что наш метод интуитивно понятен и легко доступен для немедленного использования.

Мы демонстрируем эффективность нашего протокола в анализе и количественной оценке изменений в распределении сигнала двух ядерных белков: бромдомен-содержащего белка 4 (BRD4) и супрессора zeste-12 (SUZ12). BRD4 является хорошо документированным белком-коактиватором в составе медиаторного комплекса, который, как известно, образует конденсаты, связанные с полимеразой II-зависимой инициацией транскрипции24,25. SUZ12 является белковым компонентом репрессивного комплекса Polycomb 2 (PRC2), отвечающего за регуляцию отложения гистона H3K27me3 модификации26,27. Эти белки демонстрируют различные паттерны в двух различных типах клеток: свежевыделенные человеческие CD4+ наивные Т-клетки, которые находятся в состоянии покоя и демонстрируют медленную скорость транскрипционной активности, и дифференцированные in vitro TH1 CD4+ клетки, которые являются специализированными, пролиферирующими эффекторными клетками, демонстрирующими повышенную транскрипцию.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Использование образцов человека в исследовательских целях было одобрено Комитетами по этике Fondazione Istituto di Ricovero e Cura a Carattere Scientifico (IRCCS) Cà Granda Ospedale Maggiore Policlinico (Милан), и было получено информированное согласие всех субъектов (номер разрешения: 708_2020). Протокол состоит из трех основных разделов: выполнение иммунофлуоресценции, получение изображений и анализ изображений. В среднем для его выполнения требуется 4 рабочих дня (Рисунок 1).

1. Иммунофлюоресцентный препарат

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол иммунофлуоресценции может быть легко настроен для различных типов клеток и белковых мишеней путем регулировки условий фиксации и пермеабилизации. Иммунофлуоресцентный препарат обычно занимает менее 3 дней, при этом продолжительность первичной инкубации антител варьируется в зависимости от качества антител и целевого белка (рис. 1).

  1. Подготовка образцов
    1. Выделите мононуклеарные клетки периферической крови человека (PBMC) с помощью центрифугирования с градиентом плотности в среде с плотностью около 1,077 г/мл в соответствии с инструкциями производителя (Таблица материалов).
    2. Выделите CD4+ Т-клетки из PBMC с помощью магнитных шариков, следуя инструкциям производителя (Таблица материалов).
    3. Окрашивают клетки антителами к CD4, CD45RA и CD45RO (Таблица материалов) и приступают к FACS-сортировке наивных CD4+ Т-клеток как CD4+/CD45RA+/CD45RO-клетки, как описано в других разделах29,30.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Технические характеристики сортировщика FACS, используемого в этом протоколе, см. в Таблице материалов .
    4. Индуцировать дифференцировку наивных CD4+ Т-клеток в Т-хелперы 1 (T,H1, CD4+ клетки), как описано в пункте 29. Вкратце, культивируют 1,5 x 106 клеток/мл наивных CD4+ Т-клеток, отсортированных методом FACS, в среде TH1, стимулируя их анти-CD3/анти-CD28 магнитными шариками в соотношении 1:1. Подсчитайте клетки и разделите их, когда они достигнут 1,5 ×10 6 клеток/мл каждые 2-3 дня (см. Таблицу 1 для среднего состава TH1).
    5. Оцените секрецию цитокинов эффекторной функции после 7 дней дифференцировки, как описано в пункте 29.
  2. Фиксация клеток и пермеабилизация
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все эти процедуры были описаны в 30,31 с незначительными адаптациями.
    1. Для обеспечения оптимальной адгезии ячеек обрабатывайте стеклянные покровные стекла (10 мм, толщина 1,5 H) раствором для нанесения покрытий (Таблица 1) следующим образом:
      1. Очистите стеклянные покровные стекла, сначала промойте их дистиллированной водой (ddH2O), затем промойте 70% этанолом (EtOH) и дайте им высохнуть на воздухе.
      2. Поместите промытые покровные стекла в 24-многолуночную пластину для выполнения шагов 1.2.1.3-1.3.
      3. Нанесите каплю 200 μл лакокрасочного раствора на стеклянную защитную крышку. Через 5 минут удалите каплю и дайте ей высохнуть на воздухе.
      4. Промойте покровные стекла, нанеся каплю 200 μL ddH2O. Через 5 минут удалите каплю и высушите на воздухе.
      5. Повторите 3 шага 1.2.1.3-1.2.1.4.
    2. Ресуспендируйте наивные CD4+ Т-клетки и TH1 CD4+ клетки в 1x фосфатно-солевом буфере (PBS) в концентрации 2 × 106 клеток/мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Указанная концентрация рекомендуется специально для малых клеток, таких как первичные Т-лимфоциты человека. Для адгезивных клеток обработка стеклом не требуется. Вместо этого приступайте непосредственно к выращиванию клеток на стеклянной поверхности с использованием соответствующей среды для культивирования клеток.
    3. Нанесите каплю суспензии ячейки объемом 200 мкл на стеклозащитный лист. Дайте ячейкам посеять семена при комнатной температуре (RT) в течение 30 минут; Затем удалите каплю.
    4. Зафиксируйте клетки свежеотфильтрованным 3% параформальдегидом (раствор PFA, табл. 1) на 10 мин при RT.
    5. Промойте стекло с помощью TPBS (Таблица 1) в течение 3 x 5 минут при температуре RT.
    6. Удалите TPBS и добавьте раствор для пермеабилизации (Таблица 1) в течение 10 минут при RT.
    7. Сбросить раствор для проникновения и инкубировать образец в растворе для хранения (Таблица 1) от 1 ч до ночи (ON) при 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе протокол может быть безопасно остановлен, а стекла могут быть сохранены в растворе для хранения в 24-многолуночной пластине в течение 3-4 недель.
  3. Иммунофлюоресценция
    1. (Дополнительный) Снимите покровное стекло с пластины 24-multiwell и быстро заморозьте на сухом льду в течение 30 с, разморозьте при RT, а затем промойте стекло покровным стеклом в предварительно заполненной лунке с раствором для хранения.
    2. (Дополнительный) Повторите 3 шага 1.3.1.
    3. Постирайте в растворе для пермеабилизации в течение 5 минут при температуре RT. Затем постирайте в течение 2 х 5 минут с TPBS в RT.
    4. Инкубировать в 0,1 Н HCl в течение 12 мин при РТ.
    5. Выполните две быстрые промывки в 1x PBS.
      Указанные условия пемеабилизации клеток, включая этапы замораживания и размораживания и обработку HCl, являются оптимальными для окрашивания ядерных компонентов в клетках, характеризующихся плотно упакованным хроматином. Однако при работе с клетками, характеризующимися менее уплотненным хроматином, рекомендуется уменьшить или избегать этих этапов. Кроме того, для нацеливания на цитоплазматические компоненты рассмотрите возможность снижения или отмены лечения HCl.
    6. Инкубируйте клетки с первичным антителом (BRD4, 1:500 или SUZ12, 1:100), разведенным в буфере для разведения антител (табл. 1) (200 мкл для каждого стеклянного покровного стекла) при 4 °C.
      Иммунофлуоресценция может быть выполнена путем мультиплексирования более чем одного первичного антитела в зависимости от экспериментальных потребностей, вторичных антител и систем обнаружения.
    7. Вымыть 3 x 5 мин с помощью PBS-T (Таблица 1) в RT с легким встряхиванием.
    8. Инкубируйте клетки с вторичными антителами, разведенными в буфере для разведения антител (200 мкл на каждое стеклостекло) в течение 1 ч в режиме ЛТ.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите вторичное антитело, которое наилучшим образом соответствует экспериментальным потребностям и имеющимся системам обнаружения. Убедитесь, что каждое вторичное антитело нацелено на вид, из которого получено первичное антитело. Кроме того, выбирайте флуорофоры, совместимые с фильтрами микроскопа и источником света. Крайне важно избегать спектрального перекрытия между выбранным флуорофором и спектром излучения ядерного пятна.
    9. Устирайте 3 x 5 минут с PBS-T при RT с легким встряхиванием.
    10. Окрашивание 1 нг/мл 4',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI), разведенного в 1x PBS в течение 5 минут в режиме RT.
      Примечание: Альтернативные красители могут быть использованы для ядерного окрашивания при условии, что они не перекрываются со спектром излучения вторичных антител.
    11. Выполните несколько быстрых стирок в 1x PBS.
    12. Закрепите стеклянное покровное стекло на предметном стекле для микроскопии с помощью монтажного материала, препятствующего выцветанию.

2. Получение изображения

ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжительность получения изображения зависит от прибора и выбранных настроек.

  1. Получение данных с помощью конфокального микроскопа
    1. Захватывайте 3D-изображения с помощью конфокального микроскопа, устанавливая шаг 0,25 мкм по z и размер пикселя 0,1-0,2 мкм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для достижения оптимального разрешения, ограниченного световой дифракцией, с помощью объектива 63x 1.4 NA Oil, мы установили размер отверстия на 0.8 а.е., среднее значение по линии в 2 раза, и размер кадра от 1024 × 1024 пикселей. Возбуждающий лазер, а также последовательность захвата канала были выбраны намеренно, чтобы предотвратить помехи или перекрестные помехи между используемыми флуорофорами. Тем не менее, регулировка параметров должна быть адаптирована к конкретным характеристикам микроскопа и образца. Технические характеристики конфокального микроскопа, используемого в данном протоколе, см. в Таблице материалов .
    2. Соберите постоянное количество случайных полей, чтобы охватить примерно 50 клеток на биологическую репликацию.

3. Анализ изображений

  1. Установка программного обеспечения
    1. Загрузите и установите последнюю доступную версию Fiji с официальной страницы загрузки Fiji (https://imagej.net/software/fiji/downloads).
    2. Установите 3D Suite с сайта обновлений Fiji или вручную, следуя инструкциям на веб-сайте 3D Suite (https://mcib3d.frama.io/3d-suite-imagej/#download).
    3. Установите GDSC (FindFoci) либо через сайт обновлений Fiji, либо вручную, следуя инструкциям в репозитории GitHub (https://github.com/aherbert/gdsc).
  2. Конвертация TIFF
    1. Скачайте скрипт "convert_to_TIFF.py" (Дополнительный файл 1).
    2. Перетащите скрипт на Фиджи и запустите код.
    3. На появившейся панели перейдите к пути, по которому хранится эксперимент. Подпапка, содержащая преобразованные файлы TIFF, создается в той же папке эксперимента.
  3. Инициализируйте настройки в 3D Manager.
    1. Откройте панель настроек 3D Manager , нажав на Plugins | 3DSuite | 3D Manager Options.
    2. В окне параметров 3D Manager установите флажки, соответствующие следующим измерениям: Объем (единица измерения), Среднее значение серого, Ограничивающая рамка (пиксели), Стандартное значение серого значения, Центроид (пиксели) и Центроид (единицы измерения).
    3. Отметьте галочками следующие опции: Исключить объекты на ребрах XY и Исключить объекты на ребрах Z и нажмите OK.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг необходимо выполнить только один раз для первоначальной настройки метрик, которые будут храниться в файлах пространственной и количественной информации. Выбранные метрики необходимы для обеспечения правильной работы воронки продаж. На этом шаге можно включить необязательные дополнительные метрики, как описано в разделе Обсуждение.
  4. Установите параметры в графическом интерфейсе FindFoci.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг нужно сделать всего один раз, чтобы настроить полуавтоматический конвейер с оптимальными параметрами, которые затем будут включены в скрипты.
    1. Откройте тестовое изображение. Продублируйте белковый канал, включая стек (Ctrl + Shift + D), установите флажок гиперстек и укажите соответствующий номер канала в поле Каналы (c) и переименуйте его соответствующим образом.
    2. Запустите рекордер макросов Fiji, перейдя в раздел Плагины | Макросы | Рекорд.
    3. Откройте плагин FindFoci (нажмите на Плагины | ГДСК | FindFoci | FindFoci GUI) и выберите изображение для анализа из выпадающего меню "Изображение".
    4. Установите параметры следующим образом (рисунок 2A): размытие по Гауссу = 1.5; фоновый метод = SD выше среднего; параметр фона = 9; метод поиска = дробь пика - фон; параметр поиска = 0.7; метод пика = относительный над фоном; пиковый параметр = 0,2; минимальный размер = 5; Максимальное количество пиков = 1 000 000.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Указанные параметры были выбраны на основе наших тематических исследований и могут не подходить для других процедур окрашивания.
    5. Чтобы улучшить идентификацию очагов, настройте следующие параметры:
      1. Размытие по Гауссу определяет степень сглаживания до лучших фокусов сегмента. Держите его близко к диаметру фокусов (пикселю).
      2. Параметр фона задает порог для отличия фона от сигнала фокуса. Увеличьте значения, чтобы установить более строгие пороговые значения.
      3. Параметр поиска определяет процент флуоресценции от пика, который включается в распознавание сигнала. Уменьшите значения, чтобы включить области, удаленные от пика флуоресценции.
      4. Параметр пика определяет степень, в которой два пика сигнала считаются непрерывными или разделенными. Уменьшение значения приведет к разделению пиков.
      5. Максимальное количество пиков указывает максимальное количество идентифицируемых фокусов. Установите большие числа, чтобы включить все фокусы на изображении.
    6. Запустите FindFoci и скопируйте строку, которая появится в окне регистратора (шаг 3.4.2, рисунок 2B), содержащую выбранные параметры, за исключением кавычек. Для получения дополнительной информации, связанной с настройками, обратитесь к инструкции 22 к руководству по плагину.
  5. Конвейер количественного определения ядерных белков
    1. Скачайте скрипт "nuclear_prot_q.py" (Дополнительный файл 2).
    2. Перетащите скрипт на Фиджи и нажмите кнопку «Выполнить», чтобы выполнить код.
    3. Следуйте инструкциям в отображаемом диалоговом окне для обработки изображений.
      1. Канал ядра: введите число, соответствующее каналу DAPI (или любому ядерному окрашиванию).
      2. Nucleus Gaussian Blur: введите значение сигма, необходимое для размытия изображения для сегментации.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Поддерживайте этот параметр ближе к диаметру ядра (т.е. 5-6 мкм). Более высокие значения сигма указаны для неоднородного окрашивания.
      3. Белковый канал: введите число, соответствующее каналу интересующего окрашивания.
      4. Параметр FindFoci: вставьте строку, полученную на этапе записи макроса в отрывок 3.4.6 (рисунок 2B).
      5. (Дополнительный) Контроль качества: проверка качества сегментированных ядер. Это приостановит работу скрипта и позволит вручную проверять каждую сгенерированную ядерную область интереса (ROI).
      6. Выберите каталог изображений: нажмите кнопку «Обзор », чтобы перейти к папке, содержащей файлы TIFF для анализа.
    4. После того как все поля будут скомпилированы, нажмите OK , чтобы продолжить выполнение.
    5. Если ядро неправильно сегментировано и не соответствует требованиям к качеству, удалите или измените его, как показано на рисунке 2C.
      1. Проверьте список ROI в окне ROIManager3D; Если список пуст, выберите окно объединения и нажмите Quantify 3D, чтобы обновить менеджер. Затем закройте таблицу результатов Quantify 3D. Выберите канал ядер и нажмите кнопку Live-ROI в положение ON.
      2. Выберите ROI, принадлежащий тому же ядру, и нажмите « Объединить » или нажмите «Delete » в случае нежелательных ядер.
      3. Нажмите «Выбрать все » и продолжите анализ, нажав OK в окне Проверка маски .
      4. Для получения результатов найдите папку Quantification в пределах пути к файлу, указанному в шаге 3.5.3.6, содержащую txt-файл с записями параметра, используемого для анализа.
  6. Pipeline в Google Colab
    1. Скачать блокнот "final_nuclear_protein_metrics.ipynb" (Дополнительный файл 3).
    2. Откройте блокнот в Google Colab (https://colab.research.google.com/).
    3. Загрузите все папки, содержащие .csv файлы каждого поля изображения, в нужную папку на Google Диске.
    4. Укажите в записной книжке путь к папке, в которой хранятся подпапки с результатами и запустите все ячейки. Когда компиляция кода завершена, окончательный файл таблицы, содержащий все скомпилированные данные, создается в той же папке, куда были загружены .csv файлы.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Протокол, изложенный в этом методе, облегчает визуализацию и количественную оценку изменений в окрашивании ядерных белков в первичных Т-клетках человека, и может быть адаптирован для различных типов клеток и белковых мишеней. В качестве примера мы провели и проанализировали окрашивание BRD4 и SUZ12 в наивных и TH1CD4+ клетках.

BRD4 демонстрирует хорошо пунктирный рисунок окрашивания как в покоящихся, так и в дифференцированных клетках TH1 CD4

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В этом исследовании мы представляем метод проведения иммунофлуоресцентных экспериментов на ядерных белках в Т-лимфоцитах человека. Этот метод обеспечивает гибкость для использования с различными типами клеток за счет незначительных изменений в этапах фиксации и пермеабилизации, как описано ранее30,31.

Наш рабочий процесс обработки изображений основан на проверенных методах, описанных в литературе, в частности, FindFoci и 3D Suite

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

R.V. сотрудничает с научным проектом T-One Therapeutics Srl; Б.Б. и Ф.М. являются соучредителями стартапа T-One Therapeutics Srl; В настоящее время Э.. работает в компании T-One Therapeutics Srl; Все остальные авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.

Благодарности

Мы выражаем признательность за научную и техническую помощь Центру визуализации INGM, в частности, К. Кордильери и А. Фашиани, а также сортировочному центру INGM FACS, в частности М.К. Крости (Istituto Nazionale di Genetica Molecolare 'Romeo ed Enrica Invernizzi' (INGM), Милан, Италия). Выражаем признательность М. Джаннаккари за его техническую информационную поддержку. Эта работа была профинансирована следующими грантами: Fondazione Cariplo (Bando Giovani, грант No 2018-0321) и Fondazione AIRC (грант No MFAG 29165) для F.M. Ricerca Finalizzata, (грант No GR-2018-12365280), Fondazione AIRC (грант No 2022 27066), Fondazione Cariplo (грант No 2019-3416), Fondazione Regionale per la Ricerca Biomedica (FRRB CP2_12/2018,), Piano Nazionale di Ripresa e Resilienza (PNRR) (грант No G43C22002620007) и Progetti di Rilevante Interesse Nazionale (PRIN) (грант No 2022PKF9S) B. B.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1,5 мл Safe-Lock TubesEppendord#0030121503Раздел протокола 1
10 мл Серологические пипеткиVWR#612-3700Протокол Раздел 1
20 &; L барьерный наконечник для дозатораThermo Scientific#2149P-HRПротокол секция 1
50 мл Полипропиленовая коническая трубкаFalcon#352070Протокол секция 1
200 &; L барьерный наконечник для дозатораThermo Scientific#2069-HRПротокол раздел 1
раствор против выцветания - ProlongGlass - монтаж медиаInvitrogen#P36984Шаг 1.3.12
BSA (Бычья сыворотка альбумина)Sigma#A7030Шаг 1.3.6., 1.3.8.
CD4+ T Набор для изоляции клетокMiltenyi Biotec#130-096-533Шаг 1.1.2.
DAPI (4,6-диамидино-2-фенилиндол)InvitrogenCat#D1306Шаг 1.3.10.
Сухой ледШаг 1.3.1.
Бусины Dynabeads Т-активатор человека анти-CD3/анти-CD28 бусиныLife Technologies#1131Dмагнитные бусины шаг 1.1.4.
EtOHCarlo Erba#4146320Шаг 1.2.1.1.
FACSAria SORPBD BioscencesШаг 1.1.3. Оснащен программным обеспечением BD FACSDiva версии 8.0.3
FBS (Фетальная бычья сыворотка)Life Technologies#10270106Step 1.1.4
FICOLL PAQUE PLUSEurocloneGEH17144003F32Step 1.1.1.
ФИДЖИ Версия 2.14.0--Протокол раздел 3
Стеклянный покровный стекло (10 мм, толщина 1,5 H)Электронная микроскопия Sciences#72298-13Шаг 1.2.1.
ГлицеринСигма#G5516шаг 1.2.7-1.3.1.
Козий антикролик AF568 вторичное антителоInvitrogenA11036Шаг 1.3.8.
HClSigma#320331Шаг 1.3.4.
нейтрализующий человека анти-IL-4Miltenyi BiotecCat#130-095-753Шаг 1.1.4.
человеческий рекомбинантный IL-12Miltenyi BiotecCat#130-096-704Шаг 1.1.4.
человеческий рекомбинантный IL-2Miltenyi BiotecCat#130-097-744Шаг 1.1.4.
Leica TCS SP5 Конфокальный микроскопLeica Microsystems-ProtocolSection 2, оснащен объективом HCX PL APO 63x, 1,40 NA масляным иммерсионным объективом, с дополнительным 3-кратным зумом. Размер отверстия: 0,8 а.е. Среднее значение строки 2×. Размер кадра 1024&крат; 1024 пикселя.
MEM Раствор заменимых аминокислот LifeTechnologies#11140035Шаг 1.1.4.
Предметные стекла для микроскопаVWR#631-1552шаг 1.3.12.
Мышиный моноклональный античеловеческий CD4 APC-Cy7 (клон RPA-T4)BD Bioscience#557871Шаг 1.1.3.
Мышиный моноклональный античеловеческий CD45RA PECy5 (клон 5H9)BD Bioscience#552888Шаг 1.1.3.
Мышиный моноклональный анти-Human CD45RO APC (клон UCHL1)Miltenyi Biotec#130-113-546Шаг 1.1.3.
Multiwell 24 лункиFalcon#353047Протокол раздел 1
Нормальная козья сывороткаInvitrogenPCN5000Шаг 1.3.6., 1.3.8.
PBSLife Technologies#14190094Раздел протокола 1
Раствор пенициллина/стрептомицинаLife Technologies#15070063Шаг 1.1.4.
PFASigma#P6148Шаг 1.2.4.
поли-L-лизинСигма#P89201.2.1.
Первичное антитело - BRD4Abcam#ab128874Шаг 1.3.6.
Первичное антитело - SUZ12Cel SignallingmAb #3737Шаг 1.3.6.
RPMI 1640 W/GLUTAMAX-ILife Technologies#61870010Шаг 1.1.4.
Технологии жизни пирувата натрия#11360039Шаг 1.1.4.
Тритон Х-100Сигма#T8787Шаг 1.2., 1.3.
TWEEN 20Sigma#P9416шаг 1.3.
Пинцет--Протоколраздел 1

Ссылки

  1. Aboelnour, E., Bonev, B. Decoding the organization, dynamics, and function of the 4D genome. Dev Cell. 56 (11), 1562-1573 (2021).
  2. Erdel, F., Rippe, K. Formation of chromatin subcompartments by phase separation. Biophys J. 114 (10), 2262-2270 (2018).
  3. Henninger, J. E., et al. RNA-mediated feedback control of transcriptional condensates. Cell. 184 (1), 207-225 (2021).
  4. Guo, Y. E., et al. Pol II phosphorylation regulates a switch between transcriptional and splicing condensates. Nature. 572 (7770), 543-548 (2019).
  5. Bhat, P., et al. 3D genome organization around nuclear speckles drives mRNA splicing efficiency. bioRxiv. , (2023).
  6. Spector, D. L., Lamond, A. I. Nuclear speckles. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (2), a000646(2011).
  7. Kilic, S., et al. Phase separation of 53BP1 determines liquid-like behavior of DNA repair compartments. EMBO J. 38 (16), e101379(2019).
  8. Parker, M. W., et al. A new class of disordered elements controls DNA replication through initiator self-assembly. Elife. 8, e48562(2019).
  9. Feric, M., et al. Coexisting liquid phases underlie nucleolar subcompartments. Cell. 165 (7), 1686-1697 (2016).
  10. Yoneda, M., Nakagawa, T., Hattori, N., Ito, T. The nucleolus from a liquid droplet perspective. J Biochem. 170 (2), 153-162 (2021).
  11. Alberti, S., Carra, S. Nucleolus: A liquid droplet compartment for misbehaving proteins. Curr Biol. 29 (19), R930-R932 (2019).
  12. Strom, A. R., et al. Phase separation drives heterochromatin domain formation. Nature. 547 (7662), 241-245 (2017).
  13. Sanulli, S., et al. HP1 reshapes nucleosome core to promote phase separation of heterochromatin. Nature. 575 (7782), 390-394 (2019).
  14. Hyman, A. A., Weber, C. A., Julicher, F. Liquid-liquid phase separation in biology. Annu Rev Cell Dev Biol. 30, 39-58 (2014).
  15. Feric, M., Misteli, T. Phase separation in genome organization across evolution. Trends Cell Biol. 31 (8), 671-685 (2021).
  16. Mitrea, D. M., et al. Methods for physical characterization of phase-separated bodies and membrane-less organelles. J Mol Biol. 430 (23), 4773-4805 (2018).
  17. Fetter, J., et al. Endogenous gene tagging with fluorescent proteins. Methods Mol Biol. 1239, 231-240 (2015).
  18. Alberti, S., Gladfelter, A., Mittag, T. Considerations and challenges in studying liquid-liquid phase separation and biomolecular condensates. Cell. 176 (3), 419-434 (2019).
  19. Galbraith, C. G., Galbraith, J. A. Super-resolution microscopy at a glance. J Cell Sci. 124 (10), 1607-1611 (2011).
  20. Scalisi, S., Ahmad, A., D'Annunzio, S., Rousseau, D., Zippo, A. Quantitative analysis of PcG-associated condensates by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Methods Mol Biol. 2655, 183-200 (2023).
  21. Shihan, M. H., Novo, S. G., Le Marchand, S. J., Wang, Y., Duncan, M. K. A simple method for quantitating confocal fluorescent images. Biochem Biophys Rep. 25, 100916(2021).
  22. Herbert, A. D., Carr, A. M., Hoffmann, E. FindFoci: a focus detection algorithm with automated parameter training that closely matches human assignments, reduces human inconsistencies and increases speed of analysis. PLoS One. 9 (12), e114749(2014).
  23. Ollion, J., Cochennec, J., Loll, F., Escude, C., Boudier, T. TANGO: a generic tool for high-throughput 3D image analysis for studying nuclear organization. Bioinformatics. 29 (14), 1840-1841 (2013).
  24. Sabari, B. R., et al. Coactivator condensation at super-enhancers links phase separation and gene control. Science. 361 (6400), 3958(2018).
  25. Jang, M. K., et al. The bromodomain protein Brd4 is a positive regulatory component of P-TEFb and stimulates RNA polymerase II-dependent transcription. Mol Cell. 19 (4), 523-534 (2005).
  26. Pasini, D., Bracken, A. P., Jensen, M. R., Denchi, E. L., Helin, K. Suz12 is essential for mouse development and for EZH2 histone methyltransferase activity. EMBO J. 23 (20), 4061-4071 (2004).
  27. Margueron, R., Reinberg, D. The Polycomb complex PRC2 and its mark in life. Nature. 469 (7330), 343-349 (2011).
  28. Peng, Z., et al. Brd4 regulates the homeostasis of CD8(+) T-lymphocytes and their proliferation in response to antigen stimulation. Front Immunol. 12, 728082(2021).
  29. Marasca, F., et al. LINE1 are spliced in non-canonical transcript variants to regulate T cell quiescence and exhaustion. Nat Genet. 54 (2), 180-193 (2022).
  30. Marasca, F., Cortesi, A., Bodega, B. 3D COMBO chrRNA-DNA-ImmunoFISH. Methods Mol Biol. 2157, 281-297 (2021).
  31. Marasca, F., Cortesi, A., Manganaro, L., Bodega, B. 3D Multicolor DNA FISH tool to study nuclear architecture in human primary cells. J Vis Exp. (155), (2020).
  32. Jakob, B., Splinter, J., Durante, M., Taucher-Scholz, G. Live cell microscopy analysis of radiation-induced DNA double-strand break motion. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (9), 3172-3177 (2009).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Динамика ядерных телецметод иммунофлуоресцентного анализаорганизация хроматинаколичественное определение окрашивания белковТ-лимфоциты человекаанализ изображений в Fijiплагин FindFoci3D-сегментация изображенийпоказатели ядерных белковклеточная пластичность
Универсальный конвейер для анализа динамических изменений в ядерных телах в различных типах клеток
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.