Методическая статья

Электропенетрография AC-DC для изучения зондирования и проглатывания комаров Culex tarsalis на руках человека

1.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/66877

⸱

29 ноября 2024 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Entomology, Kansas State University, 2Department of Pathobiology, Auburn University, 3National Bio and Agro-Defense Facility, USDA Agricultural Research Service

В этой статье

Краткое содержание

Описаны процедуры для изучения поведения комаров Culex tarsalis при проглатывании на руках человека с использованием электропенетрографии AC-DC.

Аннотация

Комары передают патогены, которые негативно влияют на здоровье человека и животных. Более глубокое понимание их биологии кровопитания и взаимодействия с хозяевами и патогенами может быть использовано для разработки новых мишеней для борьбы с болезнями, переносимыми комарами. К сожалению, зондирование (т.е. укусы) поведения комаров плохо изучено, потому что они происходят внутри тканей хозяина. Здесь описана неинвазивная процедура использования электропенетрографии AC-DC (EPG) для косвенной визуализации и количественной оценки пищевого поведения комаров путем регистрации изменений электрических сигналов, генерируемых при зондировании и проглатывании на руках человека. Тонкие золотые провода прикрепляются к комарам с помощью токопроводящего серебряного клея и подключаются к прибору EPG. Человек-хозяин держит в руке датчик напряжения подложки. Зондирование хозяина проводным комаром завершает электрическую цепь, и электрические сигналы записываются на компьютер в виде «осциллограмм», которые затем могут быть измерены и перечислены для анализа. Эта методология была использована для характеристики поведения комаров Aedes aegypti и Culex tarsalis при проглатывании и может быть применена к другим видам комаров. EPG можно использовать для изучения влияния патогенов, инсектицидов и других факторов на пищевое поведение комаров.

Введение

Комары причиняют страдания и экономические потери во всем мире из-за своей роли переносчиков болезней и надоедливых вредителей1. Комары Anopheles переносят малярию, которая ежегодно вызывает около 219 миллионов случаев заболевания во всем мире, более 400 000 смертей2, и 12 миллиардов долларов США прямых затрат3. Комары Aedes являются наиболее заметными переносчиками важности для общественного здравоохранения, потому что они имеют почти глобальное присутствие и передают возбудителей чикунгуньи, лихорадки денге, лимфатического филяриатоза, лихорадки Рифт-Валли, желтой лихорадки и Зика, которые уносят жизни, перегружают системы здравоохранения и приводят к хроническим страданиям, пожизненной заболеваемости и инвалидности4,5. Кроме того, комары Culex передают возбудителей лошадиного энцефалита, японского энцефалита, лимфатического филяриатоза, энцефалита Сент-Луиса и лихорадки Западного Нила, которые влияют как на здоровье человека, так и на здоровье животных"xref">4.

Борьба с переносчиками болезней с помощью инсектицидов является ведущим методом борьбы с трансмиссивными болезнями во всем мире6,7. Однако количество инсектицидов, доступных для борьбы с комарами, ограничено. Кроме того, устойчивость к инсектицидам развивается у многих видов, особенно у комаров Aedes, что влияет на нашу способность бороться с трансмиссивными болезнями и вызывает потребность в новых стратегиях борьбы6,8. Лучшее понимание биологии комаров, взаимодействий комаров, хозяина и патогена, а также процессов, регулирующих передачу патогенов, может способствовать разработке новых инструментов для борьбы с переносчиками6.

Поведение зондирования и проглатывания в тканях хозяина может повлиять на передачу патогена и патологию заболевания9,10,11,12. Например, больше микрофилярий было проглочено, когда Aedes aegypti питался непосредственно из капилляров, а не собирался кровью вне разорванных сосудов13. Таким образом, фундаментальные и прикладные исследования по этой теме могут помочь в разработке, уточнении и оценке стратегий борьбы с комарами и других контрмер для передачи патогенов. Тем не менее, существуют значительные пробелы в знаниях о загадочном поведении при питании кровью, которое происходит под поверхностью кожи хозяина, потому что это поведение часто требует инвазивных процедур на живых животных моделях или использует прозрачные искусственные субстраты или жидкие диеты9,11,14,15. Методы неинвазивной электропенетрографии (ЭПГ; также называемые графами электрического проникновения) были использованы для изучения пищевого поведения насекомых, питающихся растениями, связанными с передачей патогенов растений, сопротивлением растений-хозяев и механизмами действия инсектицидов, поскольку они позволяют исследователям косвенно наблюдать, записывать и количественно оценивать движения ротового аппарата и поведение, которые происходят внутри тканей хозяина<>"xref">12.

С 1950-х годов к членистоногим, питающимся кровью, применяются методы электронного мониторинга проникновения, включая комаров16,17,18,19,20. Тем не менее, EPG никогда не был широко принят для питающихся кровью членистоногих, потому что биологическая активность, соответствующая формам волн, никогда не была проверена21. Кроме того, дизайн и электроника ранних инструментов привели к чрезмерному акценту на некоторых электрических сигналах, высокому соотношению шума к сигналу, низкому разрешению и искажению форм сигналов, а также раздражению позвоночных хозяев12,22. Более новый инструмент, монитор AC-DC EPG 23, имеет переменные настройки и улучшенную обработку сигнала, что делает его более подходящим для записи кровосочувствующих членистоногих и расшифровки биологического происхождения форм волн в экспериментальных корреляционных исследованиях10,12.

Для EPG электрический сигнал подается на хост через датчик напряжения подложки (т.е. электрод сравнения). Членистоногое прикрепляется к записывающему электроду и размещается на хозяине. Когда членистоногое вставляет свои ротовые аппараты (т.е. стилеты) в хозяина, электрический сигнал передается на монитор AC-DC EPG для обработки сигнала. Затем электрические сигналы отображаются на компьютере в виде "волновых форм", соответствующих конкретному поведению, такому как движения ротового аппарата, проглатывание, слюноотделение и приобретение/инокуляция патогена10,12. Последовательные и непоследовательные переменные отклика, связанные с продолжительностью и количеством осциллограмм class<="xref">24,25 на различных иерархических уровнях (семействах, типах и подтипах), могут быть рассчитаны на основе частоты и продолжительности сигналов, чтобы получить представление о пищевом поведении, происходящем внутри и между видами, а также в ответ на биотические и абиотические факторы, Например, хозяева, патогены, пестициды и условия окружающей среды<класс SUP ="xref">10,<класс SUP ="XRF">12.

до сих пор монитор AC-DC EPG использовался для характеристики поведения при исследовании и проглатывании Ae. aegypti26 и Culex tarsalis27 комаров, питающихся человеческими руками, и клещей Dermacentor variabilis и Amblyomma americanum, питающихся бычьими телятами28. Кроме того, недавно была разработана мышиная модель для EPG29 для облегчения исследований патогенов с использованием этого инструмента. Человеческие руки идеально подходят для первоначальной характеристики волны комара, потому что человек-хозяин может сообщить, когда они чувствуют зондирование комара, а также о других действиях, что облегчает корреляцию форм волн с поведением (Таблица 1). Кроме того, лучшее понимание пластичности пищевого поведения комаров в различных популяциях человека может способствовать разработке более специализированных мер по борьбе с комарами и патогенами, которые они переносят.

Таблица 1: Описание семейств осциллограмм, используемых для классификации электрических сигналов, записанных от Culex tarsalis на руках человека с помощью AC-DC EPG. Фаза зондирования и биологическая активность, соответствующие каждому семейству сигналов. Смотрите Cooper et al.27 для получения дополнительной информации. Сокращение: AC = переменный ток, DC = постоянный ток, EPG = электропенетрограф. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Чтобы облегчить использование EPG для изучения биологии комаров и взаимодействий хозяин-переносчик, здесь представлена методология количественной оценки пищевого поведения комаров Cx. tarsalis на руках человека с использованием монитора AC-DC EPG. Эти протоколы основаны на фундаментальных процедурах AC-DC EPG, описанных в онлайн-ресурсах30, и предполагают, что пользователи обладают базовыми рабочими знаниями о AC-DC EPG и связанном с ним программном обеспечении31. Описанные процедуры могут быть модифицированы для других видов комаров и хозяев и послужат основой для облегчения гипотетических исследований пищевого поведения комаров.

Таблица 2: Определения общей терминологии AC-DC EPG. Определения основаны на тех, которые приведены в онлайн-ресурсах30,31 и научной литературе32. Сокращение: AC = переменный ток, DC = постоянный ток, EPG = электропенетрограф. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Протокол

Данный протокол (IRB-10729) был одобрен Институциональным наблюдательным советом (IRB) по исследованиям с участием людей при Университете штата Канзас27 и предназначено для использования только с безпатогенными комарами. Добровольцы из числа людей дали свое информированное согласие на участие в исследовании и публикацию своих данных. Перед началом любой работы с животными, людьми или биологически опасными материалами убедитесь, что все процедуры были рассмотрены и одобрены соответствующими институциональными регулирующими комитетами или контролирующими лицами. См. Таблица материалов подробная информация о всем оборудовании и материалах, использованных в данном протоколе.

1. Первоначальная подготовка и настройка

  1. Настройте монитор AC-DC EPG (Рисунок 1A), клетку Фарадея (Рисунок 1B,C) и программное обеспечение, как было описано ранее30,31, используя модификации, приведенные ниже (шаги 1.1.1–1.1.5). Пошаговые инструкции по настройке и использованию оборудования и программного обеспечения см. в онлайн-ресурсах30. Сохраните выбранную конфигурацию как настройку по умолчанию в ПО для управления оборудованием и анализа форм сигнала. Список общепринятых терминов AC-DC EPG и их определения приведены в Таблице 2.
    1. Подключите усилитель головного блока (head amp) и зонд напряжения подложки к каналу 1 блока управления.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Запись с одного канала представлена для примера, хотя монитор AC-DC может одновременно обслуживать четырех насекомых и их хозяев.
    2. Убедитесь, что канал 1 на блоке управления включен, а соответствующие каналы Pre-1 и Post-1 на интерфейсном блоке переключателей также включены.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Неиспользуемые каналы должны оставаться выключенными.
    3. С помощью ПО для управления оборудованием активируйте каналы 1 и 3 на плате АЦП DI-710 (остальные оставить выключенными) для записи сигналов до и после выпрямления.
    4. Настройте ПО для управления оборудованием так, чтобы формы сигналов до и после выпрямления отображались/накладывались друг на друга (например, 1 = 1 для сигнала до выпрямления и 2 = 3 для сигнала после выпрямления).
    5. Установите частоту дискретизации в ПО для управления оборудованием на уровне 100 выборок в секунду на канал (т. е. S/s/CHAN: 100).
  2. Изготовьте заготовки для насекомых (insect stubs)26,27,29,30:
    1. Разогрейте паяльник до температуры, рекомендованной для конкретного припоя с канифольным сердечником.
    2. С помощью стриппера снимите пластиковую изоляцию примерно на 6 cm от конца медного провода калибра 20 AWG, стараясь не перерезать и не повредить пучок медных жил внутри (Рисунок 2A). Затем отрежьте обнаженный пучок медных жил и расплетите его на отдельные волокна (Рисунок 2B).
    3. С помощью узкогубцев оберните одну жилу медного провода вокруг стержня подходящего декоративного гвоздика (escutcheon pin) под головкой (плоской частью) так, чтобы большая часть провода выходила за пределы головки гвоздика. Загните конец провода над головкой гвоздика, чтобы зафиксировать его (Рисунок 2C).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Протестируйте несколько гвоздиков, чтобы подобрать те, которые плотно входят в порт усилителя головного блока (при выключенном и отсоединенном от сети устройстве с установленным сопротивлением 106 Ohms (Ω)).
    4. Зажмите стержень гвоздика в зажиме («третьей руке»), чтобы медный провод был направлен вверх. Затем нанесите небольшую каплю (~0.2 cm) водорастворимого флюса в место соединения гвоздика и медного провода (Рисунок 2D).
      ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Флюс токсичен, с ним следует обращаться осторожно.
    5. Размотайте ~10 cm припоя и выпрямите его. Приложите разогретый паяльник к головке гвоздика на несколько секунд, пока флюс не расплавится, а металл не нагреется. Затем прижмите конец припоя к головке гвоздика рядом с паяльником до тех пор, пока припой не расплавится и полностью не покроет место соединения, сплавив гвоздик и провод в заготовку для насекомого.
    6. Пока заготовка остывает, очистите жало паяльника стальной ватой и влажной губкой.
    7. После остывания извлеките заготовку из зажима. Промойте заготовку в 70% этаноле, а затем в воде, чтобы удалить остатки флюса. Обрежьте медный провод до нужной длины (~3 cm, Рисунок 2E).
    8. Повторяйте шаги 1.2.3–1.2.7, пока не будет изготовлено 20–30 заготовок.
  3. Соберите аспиратор для насекомых26,27:
    1. Пронесите кончик стеклянной пипетки Пастера через пламя, слегка вращая ее. Повторяйте процедуру до тех пор, пока конец пипетки не достигнет размера, позволяющего плотно обхватить брюшко насекомого.
    2. Закройте широкий конец модифицированной пипетки Пастера москитной сеткой, затем вставьте ее непосредственно в силиконовую трубку, подключенную к лабораторному аспиратору, и закрепите соединение изолентой, чтобы сформировать аспиратор для насекомых (Рисунок 2H).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пипетку Пастера с сеткой можно вставить в короткий отрезок пластиковой трубки с быстроразъемным соединителем для удобной смены насадок разных размеров (Рисунок 2H).

Установка электрофизиологической лаборатории для записи ЭЭГ; включает усилитель, компьютер, клетку Фарадея и датчики.
Рисунок 1: Схема установки монитора AC-DC EPG для записи на руках человека. (A) Компоненты EPG, включая (1) блок управления, (2) блок интерфейсного переключателя, (3) источник питания, (4) АЦП-плату DI-710, (5) компьютер, (6) регулятор мощности, и (B) клетку Фарадея, содержащую (C) цифровой микроскоп (7) на гибком штативе, (8) воздушно-пузырьковую пленку и воздушные подушки, (9) зонд напряжения подложки и (10) усилитель входного каскада на лабораторном штативе. Сокращения: AC = переменный ток, DC = постоянный ток, EPG = электропенетрограф. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Процесс сборки катетера с трубками, проволокой и инструментами; схема экспериментальной установки для переноса жидкости.
Рисунок 2: Регистрирующие электроды для подключения комаров и инсектный аспиратор для манипуляций с комарами во время подключения. (A) Медная проволока 20 AWG, у которой удалено 6 cm пластикового покрытия для обнажения пучка медных проволок внутри. (B) Отдельные нити пучка медной проволоки. (C) Одна нить медной проволоки, обернутая вокруг головки латунного декоративного гвоздика, при этом конец проволоки загнут поверх головки гвоздика. (D) Капля флюса на месте соединения латунного декоративного гвоздика и медной проволоки, зафиксированных помощью вспомогательного устройства для пайки в подготовке к пайке. (E) Готовый «штырек» для насекомого, изготовленный из латунного гвоздя, припаянного к медной проволоке. (F) Регистрирующий электрод, изготовленный из золотой проволоки, обернутой вокруг кончика медной проволоки «штырька» для насекомого и закрепленной серебряным клеем. (G) Крупный план золотой петли на конце регистрирующего электрода. (H) Собранный (сверху) и разобранный (снизу) инсектный аспиратор, изготовленный из модифицированных пипеток Пастера, москитной сетки, пластиковых трубок, изоленты и быстроразъемных соединений («папа»), рядом с лабораторной аспирационной трубкой, оснащенной быстроразъемным соединением («мама») (справа сверху). Масштабные отрезки = 1 cm (A-F), 200 µm (G). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

2. Подключение комаров

  1. Подготовка комаров и серебряного клея (днем или вечером накануне EPG):
    1. Разводите и поддерживайте популяцию комаров Cx. tarsalis штамма KNWR, как описано ранее27.
    2. Голодайте взрослых самок комаров в возрасте 5–17 дней после вылета в течение 8–12 ч для повышения частоты пробирования, обеспечив при этом доступ к воде во избежание гибели.
    3. Приготовьте свежий серебряный клей26,27,28,29,30:
      1. Добавьте 510 mg серебряных чешуек размером 4–8 µm в стакан объемом 20 mL. Обнулите весы и добавьте в стакан поверх серебряных чешуек 1 100 mg нетоксичного школьного клея.
      2. Обнулите весы, добавьте в стакан поверх клея 510 mg серебряных чешуек размером 8–10 µm, затем с помощью пипетки добавьте 1 000 µL воды.
      3. Осторожно поместите магнитную мешалку в стакан и установите его на магнитную płytку. Начните медленное перемешивание, постепенно увеличивая скорость до режима «быстро» (fast), и перемешивайте в течение 4 min. Убедитесь, что все компоненты полностью перемешались.
      4. С помощью переносной пипетки (с обрезанным кончиком) перенесите серебряный клей в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 mL.
      5. Обмотайте крышки пробирок с серебряным клеем Parafilm и храните на рабочем столе до использования.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Серебряный клей сохраняет подходящую консистенцию до 2 дней, однако рекомендуется готовить свежий клей вечером накануне использования30.
  2. Подготовка записывающих электродов26,27,29,30:
    1. Интенсивно перемешайте серебряный клей на вортексе перед использованием.
    2. Оберните пенопластовый блок свежей пищевой пленкой для фиксации подготовленных заготовок (штифтов) для насекомых и комаров с закрепленными электродами.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пенопласт должен быть достаточно большим, чтобы комары с электродами могли стоять на поверхности, не касаясь друг друга, но достаточно маленьким, чтобы поместиться в контейнер для хранения. ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Экскреторные капли, выделяемые после кормления кровью, могут содержать патогены. После использования утилизируйте пищевую пленку/пенопластовый блок надлежащим образом.
    3. Удалите окислый слой (и остатки старого серебряного клея, если заготовки используются повторно) с кончика медной проволоки, зачистив верхние 1 cm медной проволоки лезвием бритвы до появления блеска со всех сторон. Подготовьте по одной заготовке для каждого комара, а также несколько запасных.
    4. Нарежьте золотую проволоку диаметром 0,025 mm на отрезки длиной 4–5 cm. Всегда держите проволоку самозажимным пинцетом, обмотанным лентой, чтобы избежать деформации проволоки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Золотую проволоку гораздо легче видеть на черном фоне.
    5. Приложите конец золотой проволоки к чистому кончику медной проволоки заготовки и осторожно оберните золотую проволоку вокруг медной 3 раза.
    6. Используя диссекционный зонд, нанесите серебряный клей, чтобы зафиксировать золотую проволоку. Убедитесь в отсутствии свободного конца или «хвоста». Поместите заготовку в пенопласт до высыхания клея.
    7. Осторожно поглаживайте золотую проволоку, закрепленную на заготовке, чтобы выровнять её и придать форму длинной пологой дуги (Рисунок 2F). Обрежьте проволоку до нужной длины (~2,5–3 cm).
    8. Работая под диссекционным микроскопом, с помощью остроконечного пинцета сформируйте золотую петлю на кончике золотой проволоки и согните петлю под углом 90°, как описано ниже (шаги 2.2.8.1–2.2.8.4; Рисунок 2E,F). Убедитесь, что золотая петля полностью замкнута. Верните заготовку в пенопластовый блок.
      1. Недоминирующей рукой удерживайте заготовку за латунный гвоздь так, чтобы кончик золотой проволоки касался предметного столика микроскопа. Доминирующей рукой захватите самый край золотой проволоки остроконечным пинцетом.
      2. С помощью остроконечного пинцета перекрестите кончик золотой проволоки над медной проволокой заготовки рядом с местом приклейки золотой проволоки. Прижмите конец пинцета и золотую проволоку к предметному столику микроскопа.
      3. Осторожно потяните заготовку, пока золотая проволока не образует небольшую петлю вокруг кончика остроконечного пинцета (не тяните слишком сильно). Отпустите золотую проволоку и осторожно извлеките пинцет.
      4. Продолжая удерживать заготовку недоминирующей рукой, захватите золотую петлю остроконечным пинцетом так, чтобы пинцет находился перпендикулярно «шейке» проволоки, а кончики пинцета охватывали середину золотой петли, захватывая обе её стороны. Осторожно потяните заготовку, слегка поворачивая пинцет в сторону от заготовки, пока петля не согнется под углом 90° к шейке проволоки (Рисунок 2G).
  3. Закрепление записывающих электродов на комарах26,27,29,30 (утром в день EPG):
    1. Анестезируйте голодавших комаров газом CO2 до полной остановки движений. Поместите комаров на спину на анестезирующую подложку брюшком к исследователю.
    2. Под диссекционным микроскопом положите кусочек лабораторной клейкой ленты длиной ~2 cm липкой стороной вниз. Нанесите на ленту каплю серебряного клея диаметром 0,5 cm (~10 µL).
    3. С помощью модифицированной пипетки Пастера втяните брюшко анестезированного комара, используя всасывание ровно столько, сколько необходимо для фиксации брюшка. Удерживайте комара под диссекционным микроскопом над каплей серебряного клея с помощью аспиратора.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Крылья могут находиться как внутри, так и снаружи кончика модифицированной пипетки Пастера, но их нахождение внутри поможет предотвратить выпадение комара. Избегайте сгибания или повреждения крыльев.
    4. Действуя быстро, окуните иголку minutien в серебряный клей и нанесите тонкий слой на пронотум комара (т. е. на дорсальную поверхность груди). По возможности немедленно переходите к следующему шагу (или повторно анестезируйте комара при необходимости).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется удалить чешуйки на пронотуме, растирая иголку вперед-назад, чтобы обеспечить проникновение клея в поры кутикулы. Избегайте попадания клея на любые другие части тела комара.
    5. Быстро окуните золотую петлю на конце записывающего электрода в серебряный клей и поместите её на пятно серебряного клея на пронотуме комара. Слегка покачайте петлю, чтобы она плотно прилегала к пронотуму. Удерживайте проволоку до высыхания клея (~20–25 s).
    6. Верните заготовку в пенопласт под таким углом, чтобы комар с закрепленным электродом мог комфортно стоять после пробуждения. Переходите к установке электрода следующему комару.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется делать заметки о качестве каждой установки электрода.
    7. После того как необходимое количество комаров будет подготовлено, поместите пенопластовый блок в контейнер для хранения. Содержите комаров в обычных условиях разведения до момента использования.

3. Настройка и подготовка EPG (утром накануне EPG)

  1. Включите монитор AC-DC EPG (переключив выключатель на блоке питания) как минимум за 30 минут до начала записи, чтобы прибор стабилизировался и была возможность устранить возможные неисправности.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Каналы, используемые в блоке управления и интерфейсном блоке переключателей, могут оставаться включенными.
  2. Включите компьютер и откройте программное обеспечение для управления оборудованием.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если сигналы не выглядят как плоские тонкие линии, необходимо провести поиск и устранение неисправностей (см. раздел «Обсуждение»).
  3. Проведите тест на тактильную чувствительность27,30 для проверки функциональности оборудования:
    1. Находясь в заземлении (т. е. прикасаясь к клетке Фарадея открытым участком кожи), поверните ручку на предусилитель к 106 Ω и вставьте стержень заготовки насекомого в порт.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Проведение теста на касание при более высоком уровне входного сопротивления (Ri) может привести к повреждению головного усилителя.
    2. Находясь под заземлением, включите головной усилитель и трижды крепко зажмите медный провод штекера для насекомого между указательным пальцем и большим пальцем. Если электрографограмма (EPG) работает правильно, на экране в предварительном и последующем сигналах появятся три больших пика. Если этого не произойдет, потребуется поиск и устранение неисправностей (см. раздел «Обсуждение»).
  4. Отрегулируйте настройки прибора следующим образом: 150 мВ переменный ток (переменный ток) с помощью Ri, равный 107 Ω, а аппаратное усиление 20–40x, а отрицательное смещение, а исходный уровень в естественных условиях, и а программное усиление из 8-16x27,30, как описано ниже (шаги 3.4.1–3.4.3).
    1. Установите напряжение, тип тока, аппаратное усиление (диапазон, коэффициент усиления и множитель), смещение и базовую линию (ноль) с помощью переключателей и регуляторов на канале 1 блока управления.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальная настройка аппаратного усиления зависит от качества пайки и нанесенного токопроводящего клея на основе серебра, поэтому ожидаются различия в оптимальных настройках усиления для разных комаров и в разные дни. При возникновении зашкаливания сигнала (определяемого как) может потребоваться корректировка аппаратного усиления непосредственно в процессе записи. Таблица 2 и показано на Рисунок 3A,С) или слишком мал для визуализации. Любые изменения аппаратного усиления будут необратимо влиять на запись (показано в Рисунок 3A,C).
    2. Установите уровень входного сопротивления (Ri) с помощью регулятора на головном усилителе.
    3. Установите и отрегулируйте программное усиление с помощью программного обеспечения для управления оборудованием (например, выберите предварительный или последующий сигнал, затем нажмите левой кнопкой мыши для увеличения программного усиления или правой кнопкой мыши для его уменьшения).
      ПРИМЕЧАНИЕ: любые изменения коэффициента усиления, внесенные в программном обеспечении, НЕ повлияют на запись на постоянной основе.
  5. Создайте новую запись в программном обеспечении для управления оборудованием, но не начинайте запись до выполнения шага 4.3 в следующем разделе.

4. EPG на человеческих руках26,27 :

  1. После получения информированного согласия (согласно требованиям IRB соответствующего учреждения) попросите добровольца сесть рядом с клеткой Фарадея, поместив одну руку внутрь, удерживая зонд напряжения подставки и располагая его под головным усилителем.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рука должна удобно лежать на пузырчатой пленке или аналогичном непроводящем субстрате. Кисть руки и зонд напряжения подставки не должны касаться клетки Фарадея или головного усилителя во время записи. Чтобы избежать повреждений, крайне важно, чтобы доброволец не касался головного усилителя после его включения. В случае случайного касания головного усилителя проведите описанный выше тест касания для оценки его функциональности.
  2. Когда доброволец займет нужное положение, разверните головный усилитель боком. Достаньте привязанного комара из контейнера для хранения и подключите его к прибору, вставив латунную шпильку крепления насекомого в порт на головном усилителе. Оставьте комара в подвешенном состоянии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Держите под рукой пульверизатор с 70% этанолом для контроля комаров, которые могут освободиться от проволоки.
  3. Запустите запись с помощью программного обеспечения для управления оборудованием. Расположите головный усилитель над кистью руки так, чтобы комар мог свободно стоять и осуществлять зондирование.
  4. Включите головный усилитель при наличии заземления. Запустите 10-минутный таймер. При необходимости скорректируйте положение руки добровольца, чтобы облегчить успешное зондирование.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании комаров, склонных к немедленному зондированию, включайте головный усилитель до помещения комара на руку. Для дальнейшей корректировки положения комара можно использовать тонкий деревянный штырь или непроводящую ручку кисти для изгиба медной проволоки крепления насекомого. Лупа или цифровой микроскоп на гибком штативе могут помочь в наблюдении за комаром во время EPG, особенно при проведении исследований поведенческой корреляции.
  5. Используйте программное обеспечение для управления оборудованием для внесения пометок с временными метками (например, маркеров событий) во время записи относительно реакций хозяина, поведения комаров, изменений усиления и т. д.). При необходимости отрегулируйте положение сигналов на экране и программное усиление, чтобы оба сигнала оставались четко видимыми. Отрегулируйте аппаратное усиление, если наблюдается ограничение амплитуды сигнала («срезание» пиков) (Рисунок 3A,C и Таблица 2) или если волны кажутся слишком маленькими при максимальном программном усилении. Отрегулируйте смещение (offset), если наблюдается инверсия выпрямителя (Рисунок 3C,C' и Таблица 2). Подробные инструкции по выполнению этих настроек см. в руководстве к программному обеспечению31 и онлайн-ресурсах30.
    1. Чтобы отрегулировать положение сигналов на экране, выберите предварительный (pre) или последующий (post) сигнал (например, нажав на
      1 = 1       или 2 = 3), а затем перетащите сигнал в нужное положение на экране (в идеале — ближе к центру экрана, но без перекрытия).
    2. Для настройки программного усиления используйте программное обеспечение для управления оборудованием, описанное в пункте 3.4.3.
    3. Чтобы настроить аппаратное усиление, начните с поворота регулятора усиления (Gain Dial) для канала 1 вправо или влево для увеличения или уменьшения усиления соответственно. Если этой настройки недостаточно для устранения ограничения амплитуды (слишком высокое усиление; Рисунок 3A,C) или для четкой визуализации деталей сигнала (слишком низкое усиление), переключите переключатели диапазона и множителя канала 1 (Channel 1 Range and Multiplier Switches) для дальнейшей корректировки усиления.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется использовать маркеры событий для фиксации времени изменения аппаратного усиления, чтобы облегчить интерпретацию данных волновой формы.
    4. Чтобы отрегулировать смещение (offset), переведите переключатель смещения канала 1 (Channel 1 Offset Switch) на блоке управления в положение neg, затем поворачивайте регулятор смещения канала 1 (Channel 1 Offset Dial) до тех пор, пока пики предварительного и последующего сигналов не станут направлены в одну сторону на экране компьютера. Если регулятор смещения будет повернут слишком далеко, последующий сигнал снова инвертируется.
  6. Если комар не приступил к зондированию в течение 10 мин (или другого установленного периода), выключите головный усилитель. Если в момент окончания времени комар находится в процессе зондирования, дайте ему закончить перед выключением головного усилителя. Попросите добровольца осторожно убрать руку, затем снимите комара вместе с креплением. Поместите комара обратно в контейнер для хранения.
  7. Остановите/закройте запись с помощью программного обеспечения для управления оборудованием. Переходите к EPG следующего комара (шаг 4.2).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не забудьте изменить имя файла после каждого комара.
  8. По окончании сеанса выключите головный усилитель и источник питания, затем закройте программу.
  9. Обсудите с добровольцем заявление о развенчании (Debriefing Statement) или аналогичный документ, как указано в утвержденном протоколе IRB.
  10. Утилизируйте комаров в соответствии с требованиями протокола. Снимите пластиковую упаковку с пенопластового блока и утилизируйте ее надлежащим образом.
  11. После завершения всего сбора данных просмотрите и измерьте волновые формы, а затем проанализируйте данные, как описано ранее24,25,26,27,29,30. Пошаговые инструкции по использованию ПО для просмотра волновых форм, созданию графиков, измерению параметров, экспорту данных для анализа, проведению статистического анализа, а также подробное объяснение общих переменных отклика волновой формы см. в онлайн-ресурсах30.

График электрофизиологических данных, иллюстрирующий переходные изменения амплитуды сигнала с течением времени.
Рисунок 3: Примеры субоптимальных записей из-за перегрузки сигнала (пикирования), изменений коэффициента усиления блока управления, неясных изменений напряжения вследствие некачественной разводки проводов, эффекта «складывания» выпрямителя и шума. Осциллограммы комаров Culex tarsalis, питающихся до полного насыщения на руках человека, искаженные (A) перегрузкой сигнала (голубая горизонтальная стрелка) и последующими изменениями коэффициента усиления блока управления со 100x до 80x, затем до 40x, 60x, 40x и 20x (оранжевые вертикальные стрелки), (B) неясными изменениями напряжения и (C) эффектом «складывания» выпрямителя в после- (черный) сигнале по сравнению с до- (красный) сигналом (см. осциллограмму J, увеличенный фрагмент на панели C'), сетевым шумом (синусоида 11 Hz, видимая только в сигнале до выпрямления (красном), увеличенный фрагмент на панели C'), перегрузкой сигнала (голубая горизонтальная стрелка) и изменением коэффициента усиления блока управления с 500x до 200x (оранжевая вертикальная стрелка). Названия осциллограмм указаны в верхней части каждой панели. Фиолетовые стрелки в нижнем правом углу панели C указывают на момент выключения головного усилителя после завершения измерения и служат еще одним примером «складывания» выпрямителя. Красные горизонтальные линии, относящиеся к сигналу до выпрямления на панели C, указывают моменты использования маркеров событий для записи заметок с временными метками. Уровни Ri, приложенные сигналы, временные шкалы и программное усиление составляют (A) 107 Ω, 150 mV DC, 13.2 s/div, 8x; (B) 107 Ω, 150 mV DC, 4.4 s/div, 128x; и (C) 107 Ω, 150 mV AC, 7.4 s/div, 2x; (C') 0.2 s/div, 8x. Сокращения: AC = переменный ток, DC = постоянный ток, Ri = входное сопротивление, mV = милливольт, Ω = Ом, s/div = секунд на деление. Данный рисунок подготовлен на основе данных Cooper et al.27. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Результаты

Записи ЭПГ в режиме AC-DC при питании комаров Cx. tarsalis кровью из рук человека (Рисунок 4) позволили получить интерпретируемые формы волн, пригодные для анализа и публикации27. Интерпретируемые формы волн содержали четкие, различимые повторяющиеся паттерны, которые могли быть классифицированы по семействам форм волн (Таблица 1 и Рисунок 4), типам и подтипам при регулировке сжатия (определенного в Таблице 2) и усиления программного обеспечения в программе для анализа форм волн27,31. Все семейства форм волн (J, K, L, M, N) и типы (L1, L2, M1, M2), ранее описанные при питании Ae. aegypti кровью из рук человека26, были выявлены в формах волн, полученных при питании Cx. tarsalis кровью из рук человека, что подтверждает достоверность описанных здесь методов. Кроме того, были выявлены три новых типа форм волн (M3, N1, N2) и многочисленные подтипы L1, L2, M1 и M227. Кроме того, падение напряжения до базовой линии при извлечении ротовых органов из тела хозяина было названо семейством форм волн W27.

Систематическое изменение настроек прибора (типа тока и уровней Ri) при соблюдении описанных здесь процедур позволило определить оптимальные настройки для записи питания Cx. tarsalis на руках человека, установить электрическое происхождение каждой формы волны, рассчитать среднюю продолжительность в секундах полных и неполных зондирований на одну особь комара, а также провести статистическое сравнение продолжительности формы волны в секундах на насекомое (WDI), количества событий формы волны на насекомое (NWEI) и продолжительности формы волны в секундах на одно событие на насекомое (WDEI) при различных настройках27. Также комаров прерывали во время различных форм волны и препарировали, чтобы определить, какая форма волны коррелирует с заглатыванием крови27. Аналогичное исследование было проведено для Ae. aegypti с использованием сопоставимой методологии26.

Из-за чувствительного и сложного характера EPG не все записи были такими же чистыми, как представленные на рисунке 4. Перегрузки (рисунок 3A,C), изменения коэффициента усиления оборудования (рисунок 3A,C), несовершенство монтажа проводки (рисунок 3B), эффект «заваливания» выпрямляющего каскада в форме волны J (рисунок 3C,C') и электрический шум (рисунок 3C,C') периодически искажали и маскировали формы волн, что делало их непригодными для использования в иллюстрациях публикационного качества и затрудняло количественную оценку и анализ. Таким образом, рекомендуется предварительная работа по совершенствованию навыков монтажа, оптимизации настроек усиления и напряжения, регулировке смещения и контролю электрического шума. Примечательно, что эффект «заваливания» выпрямляющего каскада наблюдался только в семействе форм волн J для Cx. tarsalis (рисунок 3C,C') и не повторялся после первоначальной регулировки смещения, даже при использовании других видов комаров (Ae. aegypti и Culex quinquefasciatus) (данные не представлены). Кроме того, в ходе поиска и устранения неисправностей выяснилось, что неконтролируемый электрический шум, показанный на рисунке 3 (панели C и C'), был вызван неисправностью клетки Фарадея. Записи, сделанные в неисправной клетке Фарадея, оставались пригодными для использования, однако проблемы с шумом были решены после создания усовершенствованной клетки Фарадея (рисунок 1B).

Даже при соблюдении всех мер предосторожности и проведении предварительных оптимизаций, незначительные различия в качестве прикрепления электродов к комару и другие неизвестные факторы, искажавшие сигнал и изменявшие соотношение сигнал/шум, периодически вызывали необходимость регулировки аппаратного усиления в процессе записи. Это требовалось для того, чтобы сигнал оставался в видимом диапазоне, а разрешение пиков в каждой форме волны было достаточным для их идентификации и характеристики. К сожалению, регулировка аппаратного усиления во время записи может привести к резким скачкам напряжения (Рисунок 3A, C), что делает формы волн малопригодными для публикации, но все еще пригодными (полностью или частично) для измерений и анализа.

Диаграммы статического равновесия, показывающие анализ сил; графики выделяют уравнения ΣFx=0, ΣFy=0.
Рисунок 4: Репрезентативные формы сигналов при зондировании Culex tarsalis человеческой руки, записанные при Ri = 107 Ω с использованием подаваемого сигнала 250 mV AC. Названия форм сигналов на уровне семейств (NP, J, K, L, M, W) указаны в верхней части каждой панели. Нижние панели показывают увеличенные фрагменты выбранных областей на панели A. Вставки показывают увеличенные изображения указанных областей. Временные шкалы и программное усиление составляют (A) 7,0 s/div, 16x; (B) 1,0 s/div, 64x; (B') 0,2 s/div, 64x; (C) 1,0 s/div, 64x; (C') 0,2 s/div, 32x; (D) 1,0 s/div, 64x; (D') 0,2 s/div, 64x. Сокращения: AC = переменный ток, Ri = входное сопротивление, mV = милливольт, Ω = Ом, s/div = секунд на деление. Этот рисунок был подготовлен на основе данных Cooper et al.27. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Обсуждение

При использовании AC-DC EPG крайне важно иметь базовое представление о работе аппаратного и программного обеспечения30 и тщательно следовать описанным здесь протоколам, чтобы не повредить оборудование. В частности, не прикасайтесь к головному усилителю при его включении, если он не заземлен на клетку Фарадея. Рекомендуется вести запись как можно дальше назад в клетке Фарадея30. Дверцы клетки не обязательно должны быть закрыты для получения интерпретируемых осциллограмм, если только они не записываются в среде с чрезмерным окружающим электрическим шумом. Ничего моторизованного в клетке Фарадея быть не может. Важно отметить, что сама клетка Фарадея должна быть электрически заземлена исключительно через головной усилитель, чтобы она работала должным образом. Это достигается путем подключения головного усилителя к металлическому лабораторному стенду с отшлифованной краской с одного фута стенда, чтобы обеспечить проводящий путь для электричества, захваченного клеткой Фарадея, который поступает на лабораторный стенд, в металлический корпус головного усилителя, вниз по шнуру к блоку управления. через блок питания в правильно заземленную настенную розетку, а в землю через строительную площадку30. Мультиметр может использоваться для проверки качества соединения между компонентами внутри клетки путем измерения удельного сопротивления (которое является обратной проводимостью) между различными точками. Беспроводное AM-радио также может быть размещено внутри клетки Фарадея, чтобы убедиться, что звук значительно снижается (или, в идеале, исчезает) при закрытии дверей, подтверждая, что клетка Фарадея адекватно улавливает воздушные электрические сигналы (E. Backus per. Comm.).

Правильное и стандартизированное приготовление серебряного клея и прикрепление записывающих электродов к насекомым имеют решающее значение для получения пригодных для использования записей. Кутикула насекомого является изолятором и действует как конденсатор, если серебряный клей недостаточно проникает в поры кутикулы, создавая путь для прохождения электричества изнутри насекомого к золотому проводу на поверхности переднеспинки30. Готовьте серебряный клей в одно и то же время перед каждым сеансом EPG, работайте со свежим серебряным клеем из тюбика и часто заменяйте его энергично вихревым серебряным клеем во время процедуры электромонтажа. Убедитесь, что золотая петля расположена напротив грудной клетки, чтобы вся петля соприкасалась с кутикулой, а не наклонялась в одну сторону или не была отделена толстым слоем серебряного клея и чешуек, чтобы сформировать прочное электрическое соединение, а также предотвратить отсоединение и побег комара из провода.

Описанные здесь протоколы должны быть оптимизированы при работе с разными видами комаров. Оптимальные настройки EPG (уровень Ri, напряжение, тип тока и аппаратное усиление) для записи на данное членистоногое должны быть определены экспериментально12,30. Однако, как только смещение будет отрегулировано, его не нужно будет повторно регулировать при работе с аналогичными комарами. Определены оптимальные настройки для AC-DC EPG с Ae. aegypti26 и Cx. tarsalis27. Библиотеки осциллограмм (определенные в таблице 2) для дополнительных видов облегчат внедрение EPG для комаров. Также необходимо оптимизировать анестезию для интересующего комара, так как поведение при питании кровью может по-разному зависеть от вида комара и выбора анестезии. Например, Cx. tarsalis требует 4-часового периода восстановления после 15 минут анестезии CO2, тогда как для Ae. aegypti достаточно 15-минутного периода восстановления после 15-минутного периода анестезии льдом. Culex tarsalis, однако, трудно сбить с ног при воздействии холода, поэтому CO2 преимущественно используется, несмотря на длительный период восстановления.

Несмотря на то, что монитор AC-DC EPG прост в использовании после просмотра онлайн-ресурсов 30,31 или обучения у опытного пользователя, требуется некоторое устранение неполадок. Первоначально авторские записи EPG зондов на комаров содержали неожиданную сигнальную волну с частотой 11 Гц в предварительном сигнале, которая не наблюдалась и не была сообщена Ваяданде и коллегами26. Консультации с Э. Бэкусом показали, что клетка Фарадея, вероятно, была проблемой из-за мешающих контуров заземления. Новая клетка Фарадея, сконструированная из медного экрана с высокой проводимостью, соединенного с алюминиевой рамой, прикрепленной болтами к большой алюминиевой плите пола, поддерживаемой резиновыми ножками, чтобы изолировать ее от стола внизу (рис. 1B), решила шумовой сигнал с частотой 11 Гц (рис. 3C, C'). Кроме того, иногда, когда источник питания EPG был впервые включен, сигналы до и после выпрямления отображались в виде толстых нечетких линий, а не прямых, гладких, тонких линий. Обычно это исправлялось путем выключения прибора и проверки всех соединений шнура. Если это не помогало, обычно помогало отключение прибора от сети на 1-3 минуты. Очень редко сигналы до и после работы становятся толстыми и нечеткими, что решалось путем выключения прибора и подключения его к другой розетке или использования регулятора напряжения и стабилизатора питания для подключения EPG перед подключением его к розетке. В идеале, выделенная линия для монитора EPG должна устранять шум линии, исходящий от холодильников и другого оборудования, подключенного к той же электрической цепи, что и EPG30.

В настоящее время существует два основных ограничения на использование EPG для изучения комаров. Во-первых, было проведено несколько корреляционных исследований, чтобы проверить, какое поведение зондирования соответствует формам сигналов. Несмотря на то, что существуют сильные гипотезы о том, что происходит во время каждого семейства волн (Таблица 1) и некоторых типов волн (M1 и M2), некоторые из этих гипотез были экспериментально подтверждены, за исключением того, что проглатывание крови коррелирует с семейством волн M26,27. Самое главное, необходимо идентифицировать формы волн, соответствующие событиям слюноотделения, потому что многие патогенные микроорганизмы передаются со слюной. Корреляция форм волн EPG с биологической активностью у комаров потребуется для осмысленной интерпретации существенных различий в продолжительности и количестве волн между группами лечения. Во-вторых, скорость зондирования и поглощения во время ЭПГ может быть намного ниже, чем ожидалось27. Индивидуальное привязывание комаров к коротким проводам и размещение их непосредственно на хозяине может предотвратить поиск хозяина на большом расстоянии и социальное питание, что может повлиять на поведение при зондировании и проглатывании. Правильно подключенные насекомые могут нормально ходить и летать. Тем не менее, комары часто тянут за провода и иногда запутываются или держатся под неестественными углами, что указывает на то, что нахождение проводов в некоторой степени влияет на их поведение. Авторы протестировали множество стратегий для повышения скорости зондирования во время EPG, и голодание комаров в течение ночи, использование пожилых особей, воздействие на них человеческого дыхания непосредственно перед тем, как положить их на руку, и нанесение человеческой слюны на руку были наиболее эффективными, а также использование хозяев, которые постоянно вносили тонкие корректировки в положение своей руки, чтобы убедиться, что комар находится в идеальном положениидля зонда.

Несмотря на эти ограничения, AC-DC EPG имеет множество преимуществ по сравнению с другими подходами к изучению поведения зондов и приема. Такие системы, как BiteOScope11, flyPAD15 и Automated Biomaterial Platform14, которые были разработаны для количественной оценки зондирования и глотания, а также выделения слюны во время кормления кровью, используют прозрачные искусственные субстраты и жидкие диеты, в которых отсутствуют нормальные системы тканей хозяина и сигналы хозяина. В то время как эти синтетические платформы полезны для многих экспериментальных целей, явным преимуществом AC-DC EPG является возможность изучения поведения членистоногих и переменных, представляющих интерес в естественных системах хозяев. Кроме того, определяемая пользователем адаптивность системы AC-DC EPG обеспечивает дополнительное преимущество по сравнению с другими приборами EPG22,33 и EPG-подобными электронными устройствамиконтроля 16,21, которые не имеют регулируемых уровней Ri, типов тока и уровней напряжения, которые необходимы для получения осциллограмм с максимальным объемом информации и минимизации неблагоприятных воздействий на широкий спектр хозяев и членистоногих22. 23. Методы электромиографии (ЭМГ) также используются для изучения питания кровью. Тем не менее, электрическая цепь обычно включает только членистоногое, и регистрируются только мышечные потенциалы, ближайшие к регистрирующему электроду, поэтому формы сигналов не предоставляют подробной информации о действиях, происходящих на границе хозяин-насекомое, таких как разрывы клеток, расположение и активность стилетов, а также потоковые потенциалы через ротовые органы28,34. Методы прижизненной микроскопии могут быть использованы для визуализации детальных движений ротового аппарата и активности непосредственно в живых тканях хозяина, но эти методы включают инвазивные процедуры на живых животных моделях9. Только монитор AC-DC EPG может предоставить очень подробную информацию в режиме реального времени о зондировании, проглатывании и слюноотделении, которые происходят в живых непрозрачных тканях хозяина без необходимости инвазивных процедур, и может быть адаптирован для использования у широкого спектра членистоногих.

Это первая подробная пошаговая процедура подключения комаров, создания аспиратора для насекомых и выполнения EPG на людях-хозяевах. Ожидается, что эти протоколы будут способствовать принятию AC-DC EPG в отношении комаров, питающихся людьми-хозяевами. Примеры будущих исследований с использованием AC-DC EPG могут включать исследования фундаментальных механизмов питания крови и повреждения тканей хозяина10, включая идентификацию стереотипных последовательностей зондирующего поведения перед приемом крови, исследование кровотока через ротовые органы и сравнение пластичности питания внутри и между видами членистоногих/стадиями развития26. EPG также может быть использован для количественной оценки эффектов инсектицидов, антифидантов и репеллентов12. Представленные здесь процедуры использования AC-DC EPG для изучения комаров на руках человека ускорят эти исследования и позволят получить новое представление о биологии комаров, питающихся кровью.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть. Упоминание торговых названий или коммерческих продуктов в данной публикации осуществляется исключительно с целью предоставления конкретной информации и не подразумевает рекомендации или одобрения со стороны Министерства сельского хозяйства США. Выводы в этом отчете принадлежат авторам и не обязательно отражают точку зрения Министерства сельского хозяйства США.

Благодарности

Мы благодарны профессору Астри Вайаданде из Университета штата Оклахома за новаторскую процедуру подключения комаров, а также доктору Элейн Бэкус из USDA-ARS в Парлье, Калифорния, и мистеру Эндрю Доуэллу из EPG Technologies Inc. в Гейнсвилле, Флорида, за помощь в устранении неполадок оборудования EPG. Мы также благодарим доктора Дастина Суонсона и мистера Уильяма Ярнелла из Инсектария USDA-ARS в Манхэттене, штат Канзас, за предоставление комаров, а также мисс Мириам Рухинда из Университета штата Канзас в Манхэттене, штат Канзас, за ее помощь в съемке процедурных видео. Эта работа стала возможной благодаря доступу к Интегрированному молекулярному энтомологическому ядру (IEMC) в Университете штата Канзас. Это исследование было поддержано Соглашением о развитии трудовых ресурсов в области исследований, образования и экономики Министерства сельского хозяйства США (#58-3022-0-002) и проектом Hatch Multistate (NE1943). Данная рукопись является рукописью No 24-194-J от Канзасской сельскохозяйственной опытной станции, Университет штата Канзас, Манхэттен, Канзас, США.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Instrumentation
AC-DC 4-канальный электропенетрографEPG Technologies, Inc.Для EPG включает в себя блок питания, блок управления, блок интерфейса переключателя, четыре усилителя головной ступени, четыре датчика напряжения подложки и связанные с ними шнуры
Воздушные подушкиAmazon.comчеловек-хозяин может положить свою руку во время
установки оборудования для сбора данных EPG DI-710 (AD Board)DATAQ Instruments Inc.для оцифровки аналоговых сигналов EPG с целью их визуализации на компьютерной светодиодной
увеличительной лампе с регулируемой яркостью, большом 5-кратном свободном увеличительном стекле со светом и подставке для чтения хобби Ремесла Швейный верстакAmazon.comдля наблюдения за поведением во время EPG; использование только при отключении от сети во время EPG, иначе шум может привести к
Dino-Lite Edge Digital Microscope (250-кратное увеличение)Dino-LiteAF4915ZTдля поведенческого наблюдения во время EPG
Dino-Lite Flex-arm Настольная подставкаDino-LiteMS22Bдля удержания и манипулирования камерой
Eisco Steel Retort Base Stand and Rod SetFisher ScientificS41740для удержания головного усилителя сцены и заземления клетки Фарадея (должна быть изготовлена из металла)
EPG Online WorkshopUF IFAS Extensionhttps://ifas-crec-entomology.catalog.instructure.com/courses/epg-workshop-2022AKA, «онлайн-ресурсы» для изучения EPG (настройка прибора, сбор и анализ данных, построение Фарадея, подготовка серебряного клея, конструирование огрызков насекомых и т.д.)
Furman P-1800 AR Power Regulator/Power ConditionerAmazon.comдля снижения шума линии
Small Bubble Cushioning WrapAmazon.comдля использования в качестве барьера между хозяином и клеткой Фарадея
Troemner Talboys Labjaws Regular Clamp HolderFisher Scientific02-217-121для удержания усилителя головной сцены и заземления клетки Фарадея (должна быть изготовлена из металла и не покрыта пластиком)
Компьютер с WindowsBest Buyдля EPG и статистического анализа
Software
Backus 2.0 Data Analysis SAS program UF IFAS Extensionhttps://crec.ifas.ufl.edu/extension/epg/data-analysis/для статистического анализа осциллограммных данных
Ebert 1.0 File Manipulator and Error Checker, программыUF IFAS Extensionhttps://crec.ifas.ufl.edu/extension/epg/data-analysis/для подготовки файлов для статистического анализа осциллограмм,
SAS версии 9.4SAS Institute Inc.для статистического анализа осциллограммных данных
WinDaq Lite DATAQ Instruments Inc.для записи и просмотра данных EPG. Включает в себя программное обеспечение WinDaq Hardware Manager (также известное как "программное обеспечение для управления оборудованием") и программное обеспечение браузера WinDaq Waveform (также известное как "программное обеспечение для просмотра осциллограмм"). Только для использования на компьютерах с Windows. 
Faraday Cage
Алюминиевый экранный каркасHome DepotMSCF5167для  стен клетки Фарадея
Алюминиевый лист, толщина 0,125 (1/8) 3003-H14Metals DepotS318для основания клетки Фарадея
Угловые скобы, 1" Home Depot339547для  стен клетки Фарадея
Винты с плоской головкой Phillips, #6-32 x 1"Home Depot459999для строительства клетки Фарадея
Плоские шайбы, #6 Home Depot638977для строительства клетки Фарадея
Цифровой мультиметр Fluke 15B+ для электрических применений, измеряет измерения переменного/постоянного напряжения и тока до 1000 В и 10 А, а также сопротивления, непрерывности, диода и емкостиAmazon.comдля тестирования клетки
ФарадеяПортативный радиоприемник AM FM, транзисторный радиоприемник Goodes с громкоговорителем, разъем для наушников, радиоприемник на батарейках 2AA для приема на большом расстоянии, карманный радиоприемник для внутреннего, наружного и аварийного использованияAmazon.comдля тестирования экрана Faraday Cage
из чистой меди, 16 x 16 сеток с диаметром провода 0,11, 36 x 12 дюймовMetro Screenworksдля  стен комбинированных винтов для машины Faraday Cage
с круглой головкой, #6-32 x 3/4"Home Depot528466для строительства клетки Фарадея
Наждачная бумага, 1/2" на 1", 150 GritHome Depot19036-20-CCдля удаления краски с нижней части лабораторного стенда
Углы рамы экрана, 5/16" Home DepotWCORN516для  стенки решетки Фарадея
Screen spline, 0.14" Home Depot3034719для  стен клетки Фарадея
Insect Stubs
Brass Escutcheon PinsHome Depot801294для конструирования опенок от насекомых   
Медная проволока, 20 AWGAmazon.comдля конструирования заглушек от насекомых   
Водорастворимый грипп HarrisHome Depot355398для помощи в пайке покрытия проволоки от насекомых и формирования прочного соединения
Плоскогубцы с игольчатымHome Depotдля сгибания проволоки при конструировании заглушек
от насекомых Pro's Kit 900-015 Helping Hands Вспомогательное средство для пайкиAmazon.comудержания штифтов накладки во время пайки
Припой (с канифолевым сердечником)Home Depot296497для конструирования орубков насекомых   
Инструмент для зачистки проволокиHome Depotдля снятия изоляции и резки медной проволоки при создании отрубов
от насекомых YIHUA 928D-III Spating Iron, 110 Вт High Power, полностью цифровой дисплей ПаяльникAmazon.comдля создания огрызков насекомых; поставляется в комплекте с подставкой, губкой и стальной ватой для очистки
Insect Aspirator
Лабораторный аспиратор Accuris ASPIREAccuris instrumentsV0020для подачи всасывания на аспиратор насекомых; включает в себя ручной вакуумный контроллер, адаптер с тонким наконечником (40 мм) из нержавеющей стали и адаптер для наконечника пипетки
Chemglass Life Sciences Pasteur, длиной 5 3/4 дюймаFisher ScientificNC0230004для использования в качестве аспиратора от насекомых при подключении комаров
Коммерческая электрическая цветная виниловая изолентаHome Depotдля крепления модифицированной пипетки Пастера к вакуумной линии
Салфетка для комаров, квадратная тканьJoann Fabrics10для предотвращения всасывания комаров в вакуумный насос
Saint Gobain Performance Plastics Tube Tygon 1/4 x 7/16Fisher Scientific50-206-8914для быстрого и легкого переключения между различными модифицированными пипетками Пастера
Thermo Scientific Nalgene HDPE Quick Disconnects (от 3/8 до 7/16 дюймов) Удостоверение личности)Fisher Scientific15-315Bдля быстрого и легкого переключения между различными модифицированными пипетками Пастера
Silver Glue 
Elmer's Glue-All Многоцелевой белый клейAmazon.comдля приготовления серебряного клея
Silver Flake 99,9% чистоты,  4-8 &микро; mThermoFisher786.09для приготовления серебряного клея
Silver Flake 99,95% чистоты, 8-10 &; mInframat Advanced Materials47MR-12Fдля приготовления серебряного клея
Insect Anesthesia
CO2 набор для баблера, 1000 мл, #9 Резиновая пробкаFlyStuff59-181для предотвращения высыхания насекомых при использовании флайпада
Flypad  рамка, типоразмераFlyStuff59-118для предотвращения падения комаров с площадки
FlyStuff BrushFlyStuff59-205для снижения статики при работе на площадке
для мух Flystuff  Flypad  стандартный размерFlyStuff59-114aka "салфетка для анестезии" для обезболивания комаров
Воронка (диаметр 4 дюйма)Amazon.comдля отравления чашек с комарами перед переносом на флайпад
Стекло из плексигласа или плоская пластиковая крышка (обрезанная по размеру)Home DepotMC-27для накрытия площадки от комаров
Зажимы для шланга из пластиковой трубки однопозиционные и регулируемые открытые (разновидность от 1/8" до 1/2")Amazon.comдля отвода газа между накладкой и воронкой
Одноступенчатый регулятор CO2 регуляторFlyStuff59-142для регулирования потока газа из CO2 tank
" T” Фитинг для трубки с внутренним диаметром 1/8 дюймаFlyStuff59-123для подключения как флайпада, так и воронки к резервуару CO2
Трубки, прозрачные FlyStuff59-124Cдля подключения воронки и флайпада к регулятору на баке CO2
Insect Wiring
Черный картон, (65 фунтов, 176 г/м2) 8,5" x 11"Michael's Stores Inc.327826для облегчения визуализации золотой проволоки
Черная строительная бумага квадрат 3,5" x 4,0Скобы956221для облегчения визуализации золотой проволоки
Ватные шарикиAmazon.comдля голодающих комаров
Крафтовая пена #12 блок (3,1 см x 17,2 см x 30,2 см)Joann Fabric and Craft Store1941079для удержания комаров с проводами
Deflecto Ribbon Диспенсер, ПрозрачныйAmazon.comдля хранения золотой проволоки
Легкие энтомологические щипцыFisher ScientificS72110для манипуляций с насекомыми
Тонкие щипцы (FST by Dumont: #5 91150-20, Inox-Electronic)Fine Science Tools91150-20для создания золотой петли при подключении комаров
Кисть для рисования тонкой точкойAmazon.comдля манипуляций с комарами при прокладке проводки и EPG; должен иметь пластиковую или деревянную ручку, если используется для EPG
Fine-tip стандартные переводные пипетки, узкие, 5,8 млThomas Scientific7761D21для приготовления серебряного клея
Золотая проволока, 99,99% чистоты, толщина 0,025 ммGoodfellowAU005121для проводки комаров
Minutien pins, наконечник 0,2 мм, 1 смFisher ScientificNC9681411для нанесения клея на комаров
Бумажные стаканчики Жесткая бумажная тубадля голодающих комаров     
Штифтовые тискиFisher Scientific50-996-811для удержания мельчайшего штифта во время проводки от насекомых
Пластиковый ящик для хранения с крышкой (7 дюймов x 9 дюймов x 14 дюймов)Amazon.comдля транспортировки проводных комаров
Стекло из плексигласа или плоская пластиковая крышка (обрезанная по размеру)Home DepotMC-27для укрытия площадки от мух, если комары начинают просыпаться
Самозакрывающиеся щипцыFisher Scientific08-906для удержания и манипулирования золотой проволокой
Compressed Gas
CO2 gas GasMathesonдля обезболивания комаров с помощью флайпада
Common Lab Items
Одноразовые автоклавные пакеты Biohazard, 8 1/2" x 11"Fisher Scientific03-410-591для утилизации комаров, питающихся кровью
Горелка Бунзена или пропановая горелкаAmazon.comдля модификации пипеток Пастера
Цветная лабораторная лентаDaigger Расходные материалыEF9763Rдля маркировки, приготовления серебряного клея и маскировочных щипцов
Одноразовые наконечники для пипеток, 1000 & микро; Л.Фишер Научный для аликвотирования воды при изготовлении серебряного клея
Диссекционный микроскопLeica Microsystemsдля проводки комаров
Диссекционный зондFisher ScientificNC9109673для перемешивания и нанесения серебряного клея
Колба Эрленмейера, 1000 млFisher Scientific для предотвращения высыхания насекомых при использовании flypad
Этанол, 70% Fisher Scientific04-355-122для восстановления сбежавших комаров
Стеклянные чашки ПетриFisher Scientific08-747Bдля обезболивания комаров льдом
ПерчаткиFisher Scientificдля индивидуальной защиты
Kimwipes KimTech Science марки Деликатные салфетки для задач Fisher Scientific06-666для раздавливания комаров
Лабораторные халатыFisher Scientificдля личной защиты
Баллончики с распылителем LiBa, многоразовые пустые пульверизаторы (безопасные для медицинского спирта)Amazon.comдля восстановления сбежавших комаров
Магнитная мешалка, длина 2 смFisher Scientific для смешивания серебряного клея
Механическая одноканальная пипетка, 1000 & микро; Л.Фишер Научный 13-690-032для аликвотирования воды при изготовлении серебряного клея
Микроцентрифужные пробирки, 1,5 млFisher Scientific 780420для хранения серебряного клея
Parafilm M Fisher Scientific50-998-944для герметизации тюбиков серебряного клея
Полиэтиленовая пленкаAmazon.comдля покрытия пеноблока
Pyrex 20 мл стаканFisher Scientific 07-250-051для замешивания серебряного клея
Semi-Micro BalanceFisher Scientific 10-919-370для взвешивания клея и серебряных чешуек
Ручка Sharpie, тонкаяAmazon.comдля маркировки
Лезвие бритвы однолезвийное ElectronMicroscopy Sciences71980для чистки огрызков
Стандартные одноразовые переводные пипеткиFisher Scientific 133-711-7млдля переноса серебряного клея в накопительную пробирку 
Тарелка для перемешиванияFisher Scientific для смешивания серебряного клея
Таймер/секундомерFisher Scientificдля измерения времени, как долго хозяин подвергается воздействию каждого насекомого
Ультрачистая (18 MΩ) водаFisher Scientific для приготовления серебряного клея
Универсальные ножницыFisher Scientific08-945для резки золотой проволоки
Вихревой миксерFisher Scientific для смешивания серебряного клея
Study Organisms
Culex tarsalis комаровUSDA ARS Center for Grain and Animal Health Research in Manhattan KSдля использования в качестве субъектов исследования
на которые , , носиком для x 10 см 16651622 ", насекомых

Ссылки

  1. Becker, N., et al. Medical importance of mosquitoes in Mosquitoes and their control. , 2nd ed, Springer. Los Angeles, CA. 25-42 (2010).
  2. World Health Organization. Vector-borne diseases. , (2024).
  3. Woodstream Corporation, Inc. The economic cost of mosquito-borne diseases. AMosquito Magnet. , (2022).
  4. Bartlow, A. W., et al. Forecasting zoonotic infectious disease response to climate change: Mosquito vectors and a changing environment. Vet Sci. 6 (2), 40(2019).
  5. Naslund, J., et al. Emerging mosquito-borne viruses linked to Aedes aegypti and Aedes albopictus: Global status and preventive strategies. Vector Borne Zoonotic Dis. 21 (10), 731-746 (2021).
  6. Shaw, W. R., Catteruccia, F. Vector biology meets disease control: Using basic research to fight vector-borne diseases. Nat Microbiol. 4 (1), 20-34 (2019).
  7. Wilson, A. L., et al. The importance of vector control for the control and elimination of vector-borne diseases. PLoS Negl Trop Dis. 14 (1), e0007831(2020).
  8. Dusfour, I., et al. Management of insecticide resistance in the major Aedes vectors of arboviruses: Advances and challenges. PLoS Negl Trop Dis. 13 (10), e0007615(2019).
  9. Choumet, V., et al. Visualizing non infectious and infectious Anopheles gambiae blood feedings in naïve and saliva-immunized mice. PLoS ONE. 7 (12), e50464(2012).
  10. Backus, E. A., Cervantes, F. A., Guedes, R. N. C., Li, A. Y., Wayadande, A. C. AC-DC electropenetrography for in-depth studies of feeding and oviposition behaviors. Ann Entomol Soc Am. 112 (3), 236-248 (2019).
  11. Hol, F. J., Lambrechts, L., Prakash, M. BiteOscope, an open platform to study mosquito biting behavior. Elife. 9, e56829(2020).
  12. Backus, E. A., Guedes, R. N., Reif, K. E. AC-DC electropenetrography: Fundamentals, controversies, and perspectives for arthropod pest management. Pest Manag Sci. 77 (3), 1132-1149 (2021).
  13. Gordon, R. M., Lumsden, W. H. R. A study of the behavior of the mouthparts of mosquitoes when taking up blood from living tissue; together with some observations on the ingestion of microfilariae. Ann Trop Med Parasitol. 33, 259-278 (1939).
  14. Janson, K. D., et al. Development of an automated biomaterial platform to study mosquito feeding behavior. Front Bioeng Biotechnol. 11, 1103748(2023).
  15. Henriques-Santos, B. M., Xiong, C., Pietrantonio, P. V. Automated analysis of feeding behaviors of females of the mosquito Aedes aegypti using a modified flyPAD system. Sci Rep. 13, 20188(2023).
  16. Kashin, P., Wakeley, H. G. An insect 'Bitometer. Nature. 208 (5009), 462-464 (1965).
  17. Kashin, P. Electronic recording of the mosquito bite. J Insect Physiol. 12, 281-286 (1966).
  18. Kashin, P. Development of an orally effective insect repellent. IIT Research Institute. , (1967).
  19. Kashin, P., Arneson, B. E. An automated repellency assay system. II. a new electronic "Bitometer-timer.". J Econ Entomol. 62 (1), 200-205 (1969).
  20. Shieh, J. -N. Salivation and engorgement parameters of sucking insect vectors: Implications in pathogen transmission. , Oregon State University. (1994).
  21. Kimsey, R. B. Measuring and recording arthropod blood feeding. History, Development, and Applications of AC Electronic Insect Feeding Monitors. , Entomological Society of America. 122-128 (1994).
  22. Backus, E. A., Devaney, M. J., Bennett, W. H. Comparison of signal processing circuits among seven AC electronic monitoring systems for their effects on the emf and R components of aphid (Homoptera: Aphididae) waveforms. Principles and Applications of Electronic Monitoring and Other Techniques in the Study of Homopteran Feeding Behavior. Walker, G. P., Backus, E. A. , Entomological Society of America: Lanham, MD. 102-143 (2000).
  23. Backus, E. A., Bennett, W. H. The AC-DC correlation monitor: New EPG design with flexible input resistors to detect both R and emf components for any piercing-sucking hemipteran. J Insect Physiol. 55 (10), 869-884 (2009).
  24. Backus, E. A., Cline, A. R., Ellerseick, M. R., Serrano, M. S. Lygus hesperus (Hemiptera: Miridae) feeding on cotton: New methods and parameters for analysis of nonsequential electrical penetration graph data. Annals of the Entomological Society of America. 100, 296-310 (2007).
  25. Ebert, T. A., Backus, E. A., Cid, M., Fereres, A., Rogers, M. E. A new SAS program for behavioral analysis of electrical penetration graph data. Comput Electron Agr. 116, 80-87 (2015).
  26. Wayadande, A. C., et al. Waveforms from stylet probing of the mosquito Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) measured by AC-DC electropenetrography. J Med Entomol. 57 (2), 353-368 (2020).
  27. Cooper, A. M. W., et al. An electropenetrography waveform library for the probing and ingestion behaviors of Culex tarsalis on human hands. Insect Sci. 31 (4), 1165-1186 (2024).
  28. Reif, K. E., Backus, E. A. AC-DC electropenetrography unmasks fine temporal details of feeding behaviors for two tick species on unsedated hosts. Sci Rep. 11 (1), 2040(2021).
  29. Vaughan, L. D., et al. Electropenetrography as a tool to quantify probing and injection behaviors of mosquitoes (Aedes aegypti) in mice under biocontainment housing. Comp Med. 73 (6), 25(2023).
  30. Backus, E. A., Shugart, H. Electropenetrography (EPG) Online Workshop. Hosted by L. Diepenbrock at the University of Florida. Institute of Food and Agricultural Sciences Extension. , https://ifas-crec-entomology.catalog.instructure.com/courses/epg-workshop-2022 (2022).
  31. Dataq Instruments Inc. WinDaq recording and playback software. , (2024).
  32. Backus, E. A. Our own jabberwocky: clarifying the terminology of certain piercing-sucking behaviors of homopterans. Principles and applications of electronic monitoring and other techniques in the study of homopteran feeding. Walker, G. P., Backus, E. A. , Entomological Society of America: Lanham, MD. 102-143 (2000).
  33. Tjallingii, W. F. Comparison of AC and DC systems for electronic monitoring of stylet penetration activities by homopterans. Principles and Applications of Electronic Monitoring and Other Techniques in the Study of Homopteran Feeding Behavior. Walker, G. P., Backus, E. A. , Entomological Society of America. 41-69 (2000).
  34. Mizrahi, J. Advances in Applied Electromyography. , IntechOpen. Rijeka, Croatia. (2011).

Перепечатки и разрешения

Теги

Пищевое поведение комаровзондирующее поведениеповедение при заглатываниикровососаниерегистрация электрических сигналовпередача патогеновзолотой проволочный электродвзаимодействие с хозяином-человеком
Электропенетрография AC-DC для изучения зондирования и проглатывания комаров Culex tarsalis на руках человека
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.