Методическая статья

Электропенетрография AC-DC для изучения зондирования и проглатывания комаров Culex tarsalis на руках человека

DOI:

10.3791/66877

⸱

29 ноября 2024 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Entomology, Kansas State University, 2Department of Pathobiology, Auburn University, 3National Bio and Agro-Defense Facility, USDA Agricultural Research Service

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Описаны процедуры для изучения поведения комаров Culex tarsalis при проглатывании на руках человека с использованием электропенетрографии AC-DC.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Комары передают патогены, которые негативно влияют на здоровье человека и животных. Более глубокое понимание их биологии кровопитания и взаимодействия с хозяевами и патогенами может быть использовано для разработки новых мишеней для борьбы с болезнями, переносимыми комарами. К сожалению, зондирование (т.е. укусы) поведения комаров плохо изучено, потому что они происходят внутри тканей хозяина. Здесь описана неинвазивная процедура использования электропенетрографии AC-DC (EPG) для косвенной визуализации и количественной оценки пищевого поведения комаров путем регистрации изменений электрических сигналов, генерируемых при зондировании и проглатывании на руках человека. Тонкие золотые провода прикрепляются к комарам с помощью токопроводящего серебряного клея и подключаются к прибору EPG. Человек-хозяин держит в руке датчик напряжения подложки. Зондирование хозяина проводным комаром завершает электрическую цепь, и электрические сигналы записываются на компьютер в виде «осциллограмм», которые затем могут быть измерены и перечислены для анализа. Эта методология была использована для характеристики поведения комаров Aedes aegypti и Culex tarsalis при проглатывании и может быть применена к другим видам комаров. EPG можно использовать для изучения влияния патогенов, инсектицидов и других факторов на пищевое поведение комаров.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Комары причиняют страдания и экономические потери во всем мире из-за своей роли переносчиков болезней и надоедливых вредителей1. Комары Anopheles переносят малярию, которая ежегодно вызывает около 219 миллионов случаев заболевания во всем мире, более 400 000 смертей2, и 12 миллиардов долларов США прямых затрат3. Комары Aedes являются наиболее заметными переносчиками важности для общественного здравоохранения, потому что они имеют почти глобальное присутствие и передают возбудителей чикунгуньи, лихорадки денге, лимфатического филяриатоза, лихорадки Рифт-Валли, желтой лихорадки и Зика, которые уносят жизни, перегружают системы здравоохранения и приводят к хроническим страданиям, пожизненной заболеваемости и инвалидности4,5. Кроме того, комары Culex передают возбудителей лошадиного энцефалита, японского энцефалита, лимфатического филяриатоза, энцефалита Сент-Луиса и лихорадки Западного Нила, которые влияют как на здоровье человека, так и на здоровье животных"xref">4.

Борьба с переносчиками болезней с помощью инсектицидов является ведущим методом борьбы с трансмиссивными болезнями во всем мире6,7. Однако количество инсектицидов, доступных для борьбы с комарами, ограничено. Кроме того, устойчивость к инсектицидам развивается у многих видов, особенно у комаров Aedes, что влияет на нашу способность бороться с трансмиссивными болезнями и вызывает потребность в новых стратегиях борьбы6,8. Лучшее понимание биологии комаров, взаимодействий комаров, хозяина и патогена, а также процессов, регулирующих передачу патогенов, может способствовать разработке новых инструментов для борьбы с переносчиками6.

Поведение зондирования и проглатывания в тканях хозяина может повлиять на передачу патогена и патологию заболевания9,10,11,12. Например, больше микрофилярий было проглочено, когда Aedes aegypti питался непосредственно из капилляров, а не собирался кровью вне разорванных сосудов13. Таким образом, фундаментальные и прикладные исследования по этой теме могут помочь в разработке, уточнении и оценке стратегий борьбы с комарами и других контрмер для передачи патогенов. Тем не менее, существуют значительные пробелы в знаниях о загадочном поведении при питании кровью, которое происходит под поверхностью кожи хозяина, потому что это поведение часто требует инвазивных процедур на живых животных моделях или использует прозрачные искусственные субстраты или жидкие диеты9,11,14,15. Методы неинвазивной электропенетрографии (ЭПГ; также называемые графами электрического проникновения) были использованы для изучения пищевого поведения насекомых, питающихся растениями, связанными с передачей патогенов растений, сопротивлением растений-хозяев и механизмами действия инсектицидов, поскольку они позволяют исследователям косвенно наблюдать, записывать и количественно оценивать движения ротового аппарата и поведение, которые происходят внутри тканей хозяина<>"xref">12.

С 1950-х годов к членистоногим, питающимся кровью, применяются методы электронного мониторинга проникновения, включая комаров16,17,18,19,20. Тем не менее, EPG никогда не был широко принят для питающихся кровью членистоногих, потому что биологическая активность, соответствующая формам волн, никогда не была проверена21. Кроме того, дизайн и электроника ранних инструментов привели к чрезмерному акценту на некоторых электрических сигналах, высокому соотношению шума к сигналу, низкому разрешению и искажению форм сигналов, а также раздражению позвоночных хозяев12,22. Более новый инструмент, монитор AC-DC EPG 23, имеет переменные настройки и улучшенную обработку сигнала, что делает его более подходящим для записи кровосочувствующих членистоногих и расшифровки биологического происхождения форм волн в экспериментальных корреляционных исследованиях10,12.

Для EPG электрический сигнал подается на хост через датчик напряжения подложки (т.е. электрод сравнения). Членистоногое прикрепляется к записывающему электроду и размещается на хозяине. Когда членистоногое вставляет свои ротовые аппараты (т.е. стилеты) в хозяина, электрический сигнал передается на монитор AC-DC EPG для обработки сигнала. Затем электрические сигналы отображаются на компьютере в виде "волновых форм", соответствующих конкретному поведению, такому как движения ротового аппарата, проглатывание, слюноотделение и приобретение/инокуляция патогена10,12. Последовательные и непоследовательные переменные отклика, связанные с продолжительностью и количеством осциллограмм class<="xref">24,25 на различных иерархических уровнях (семействах, типах и подтипах), могут быть рассчитаны на основе частоты и продолжительности сигналов, чтобы получить представление о пищевом поведении, происходящем внутри и между видами, а также в ответ на биотические и абиотические факторы, Например, хозяева, патогены, пестициды и условия окружающей среды<класс SUP ="xref">10,<класс SUP ="XRF">12.

до сих пор монитор AC-DC EPG использовался для характеристики поведения при исследовании и проглатывании Ae. aegypti26 и Culex tarsalis27 комаров, питающихся человеческими руками, и клещей Dermacentor variabilis и Amblyomma americanum, питающихся бычьими телятами28. Кроме того, недавно была разработана мышиная модель для EPG29 для облегчения исследований патогенов с использованием этого инструмента. Человеческие руки идеально подходят для первоначальной характеристики волны комара, потому что человек-хозяин может сообщить, когда они чувствуют зондирование комара, а также о других действиях, что облегчает корреляцию форм волн с поведением (Таблица 1). Кроме того, лучшее понимание пластичности пищевого поведения комаров в различных популяциях человека может способствовать разработке более специализированных мер по борьбе с комарами и патогенами, которые они переносят.

Таблица 1: Описание семейств осциллограмм, используемых для классификации электрических сигналов, записанных от Culex tarsalis на руках человека с помощью AC-DC EPG. Фаза зондирования и биологическая активность, соответствующие каждому семейству сигналов. Смотрите Cooper et al.27 для получения дополнительной информации. Сокращение: AC = переменный ток, DC = постоянный ток, EPG = электропенетрограф. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Чтобы облегчить использование EPG для изучения биологии комаров и взаимодействий хозяин-переносчик, здесь представлена методология количественной оценки пищевого поведения комаров Cx. tarsalis на руках человека с использованием монитора AC-DC EPG. Эти протоколы основаны на фундаментальных процедурах AC-DC EPG, описанных в онлайн-ресурсах30, и предполагают, что пользователи обладают базовыми рабочими знаниями о AC-DC EPG и связанном с ним программном обеспечении31. Описанные процедуры могут быть модифицированы для других видов комаров и хозяев и послужат основой для облегчения гипотетических исследований пищевого поведения комаров.

Таблица 2: Определения общей терминологии AC-DC EPG. Определения основаны на тех, которые приведены в онлайн-ресурсах30,31 и научной литературе32. Сокращение: AC = переменный ток, DC = постоянный ток, EPG = электропенетрограф. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол (IRB-10729) был одобрен Институциональным наблюдательным советом (IRB) по исследованиям человека в Университете штата Канзас27 и предназначен для использования только с комарами, свободными от патогенов. Добровольцы дали свое информированное согласие на участие в исследовании и публикацию своих данных. Прежде чем начинать какую-либо работу с животными, людьми или биологическими опасностями, убедитесь, что все процедуры были рассмотрены и одобрены соответствующими институциональными регулирующими комитетами или надзорными лицами. Подробную информацию обо всем оборудовании и материалах, используемых в этом протоколе, см. в Таблице материалов.

1. Первоначальная подготовка и настройка

  1. Настройте монитор AC-DC EPG (Рисунок 1A), каркас Фарадея (Рисунок 1B,C) и программное обеспечение, как описано ранее30,31, используя изменения, описанные ниже (шаги 1.1.1-1.1.5). Обратитесь к онлайн-ресурсам30 для получения пошаговых инструкций по настройке и использованию оборудования и программного обеспечения. Сохраните требуемую настройку по умолчанию в программном обеспечении для управления оборудованием и просмотра осциллограмм. В таблице 2 приведен список общих терминов AC-DC EPG и их определения.
    1. Подключите усилитель головной ступени (головной усилитель) и щуп напряжения подложки к каналу 1 блока управления.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Запись с одного канала отображается, несмотря на то, что монитор переменного тока может одновременно вместить четырех насекомых и хозяев.
    2. Убедитесь, что канал 1 на блоке управления включен, а соответствующие каналы Pre-1 и Post-1 на интерфейсном блоке коммутатора включены.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Неиспользуемые каналы должны оставаться выключенными.
    3. Используйте программное обеспечение для управления оборудованием, чтобы включить каналы 1 и 3 на плате DI-710 A/D (но не другие) для записи предварительных и последующих выпрямленных сигналов.
    4. Отформатируйте программное обеспечение для управления оборудованием для просмотра/наложения пре- и поствыпрямленных осциллограмм (например, 1 = 1 для предварительного сигнала и 2 = 3 для постсигнала).
    5. Установите частоту дискретизации в программном обеспечении для управления оборудованием равной 100 выборкам в секунду на канал (т. е. S/s/CHAN: 100).
  2. Создание заглушек насекомых26,27,29,30:
    1. Разогрейте паяльник до температуры, рекомендованной для конкретного припоя с канифолевым сердечником.
    2. Используйте инструмент для резки проводов, чтобы снять пластиковое покрытие на расстоянии ~6 см от конца рулона медной проволоки 20 AWG, но избегайте разрыва или маркировки пучка медных проводов внутри (Рисунок 2A). Затем отрежьте оголенный пучок медной проволоки и распутайте его на отдельные пряди (Рисунок 2B).
    3. Используйте плоскогубцы с игольчатым носиком, чтобы обернуть одну прядь медной проволоки вокруг стержня подходящего штифта накладки под головкой (т.е. плоской вершины) так, чтобы большая часть медной проволоки выходила за головку штифта. Загните хвостик провода на головку контакта, чтобы закрепить провод на месте (Рисунок 2C).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Установите штифты накладки, чтобы определить те, которые плотно прилегают к порту головного усилителя (когда он выключен, отключен от сети и установлен на 106 Ом (Ω)).
    4. Зажмите стержень штифта накладки в помогающие руки вспомогательным средством пайки так, чтобы медная проволока была направлена вверх. Затем нанесите небольшое количество (шарик ~0,2 см) водорастворимого флюса на место соединения штифта накладки и медной проволоки (Рисунок 2D).
      ВНИМАНИЕ: Флюс токсичен, и с ним следует обращаться осторожно.
    5. Размотайте ~10 см припоя и выпрямите его. Прижмите горячий паяльник к головке штифта в течение нескольких секунд, пока флюс не расплавится и металл не нагреется. Затем прижмите наконечник припоя к головке контакта рядом с паяльником до тех пор, пока припой не расплавится и полностью не покроет место соединения, сплавляя штифт и провод в заглушку от насекомых.
    6. Пока огрызок от насекомых остывает, очистите наконечник паяльника стальной ватой и влажной губкой.
    7. Как только остынет, удалите огрызок насекомых из рук помощи. Промойте окорок от насекомых в 70% этаноле, а затем водой, чтобы удалить остатки флюса. Обрежьте медную проволоку до нужной длины (~3 см, Рисунок 2E).
    8. Повторяйте шаги 1.2.3-1.2.7 до тех пор, пока не будет построено 20-30 огрызков насекомых.
  3. Соберите аспиратор для насекомых26,27:
    1. Пропустите кончик стеклянной пастеровской пипетки через пламя, слегка поворачивая пипетку. Повторяйте до тех пор, пока до конца пипетки не будет подходящего размера, чтобы плотно прилегать к брюшку насекомого.
    2. Накройте большой конец модифицированной пипетки Пастера москитной сеткой, затем вставьте ее прямо в силиконовую трубку, подключенную к лабораторному аспиратору, и закрепите место соединения изолентой, чтобы получился аспиратор от насекомых (Рисунок 2H).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Дозатор и сетка Пастера могут быть вставлены в короткий кусок пластиковой трубки, оснащенный быстроразъемным разъемом для легкого переключения между различными размерами (Рисунок 2H).

figure-protocol-1
Рисунок 1: Настройка оборудования для мониторинга AC-DC EPG для записи на руках человека. (A) Компоненты EPG, включая (1) блок управления, (2) блок интерфейса переключателя, (3) источник питания, (4) плату DI-710 A/D, (5) компьютер, (6) регулятор мощности и (B) клетку Фарадея, содержащую (C) цифровой микроскоп (7) на стойке на гусиной шее, (8) пузырчатая пленка и воздушные подушки, (9) щуп напряжения на подложке и (10) усилитель на головном столике на лабораторном стенде. Сокращения: AC = переменный ток, DC = постоянный ток, EPG = электропенетрограф. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-protocol-2
Рисунок 2: Записывающие электроды для подключения комаров и аспиратор от насекомых для манипуляций с комарами во время проводки. (A) Медный провод 20 AWG с 6 см пластикового покрытия удален, чтобы обнажить пучок медных проводов внутри. (Б) Отдельные пряди пучка медной проволоки. (C) Одна прядь медной проволоки, обернутая вокруг головки латунного штифта с хвостиком проволоки, загнутым на головку штифта. (D) Капля флюса на стыке латунного штифта накладки и медной проволоки, удерживаемой вспомогательным помощником для пайки при подготовке к пайке. (E) Готовый огрызок от насекомых, изготовленный из латунного гвоздя, припаянного к медной проволоке. (F) Записывающий электрод, изготовленный из золотой проволоки, обернутой вокруг кончика медной проволоки огрызка от насекомых и закрепленного на месте серебряным клеем. (G) Крупный план золотой петли на кончике записывающего электрода. (H) Собранный (вверху) и разобранный (внизу) аспиратор от насекомых, изготовленный из модифицированных пипеток Пастера, москитной сетки, пластиковой трубки, изоленты и быстроразъемных разъединителей с наружной резьбой, рядом с лабораторной трубкой аспиратора, оснащенной быстроразъемным соединителем с внутренней резьбой (вверху справа). Масштабные линейки = 1 см (A-F), 200 μм (G). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

2. Проводка комаров

  1. Приготовьте противомоскитные препараты и серебряный клей (во второй половине дня / вечером перед EPG):
    1. Заведите и обслуживайте комаров типа Cx. tarsalis KNWR, как описано ранее27.
    2. Быстрое отсеивание взрослых самок комаров через 5-17 дней после эклозии в течение 8-12 часов, чтобы увеличить скорость зондирования, но обеспечить доступ к воде во избежание смертности.
    3. Приготовьте свежий серебряный клей26,27,28,29,30:
      1. Добавьте 510 мг серебряных чешуек размером 4-8 мкм в стакан объемом 20 мл. Взбейте баланс и добавьте 1 100 мг нетоксичного школьного клея в стакан поверх серебряной чешуйки.
      2. Взбейте весы, добавьте 510 мг серебряных чешуек размером 8-10 мкм в стакан поверх клея, а затем добавьте 1 000 μл воды с помощью пипетки.
      3. Аккуратно добавьте в стакан полоску для перемешивания и положите ее на тарелку для перемешивания. Начните медленно помешивать, постепенно увеличивайте до режима «быстро» и помешивайте 4 минуты. Убедитесь, что все содержимое включено.
      4. С помощью переводной пипетки (с отрезанным кончиком) перенесите серебряный клей в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл.
      5. Оберните верхушки тюбиков серебряного клея парапленкой и храните на столе до использования.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Серебряный клей имеет правильную консистенцию в течение 2 дней, но рекомендуется сделать свежий клей вечером перед использованием30.
  2. Подготовьте записывающие электроды26,27,29,30:
    1. Перед использованием обильно смочите серебряный клей.
    2. Оберните пенопластовый блок свежей полиэтиленовой пленкой, чтобы удержать подготовленные огрызки насекомых и проволочных комаров.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пена должна быть достаточно большой, чтобы комары могли стоять на поверхности, не касаясь друг друга, но достаточно маленькой, чтобы поместиться в ящике для хранения. ВНИМАНИЕ: Выделительные капли, выделяющиеся после кормления кровью, могут содержать патогенные микроорганизмы. Выбросьте полиэтиленовую пленку/пенопластовый блок соответствующим образом после использования.
    3. Удалите потускнение (и старый серебряный клей при повторном использовании огрызков насекомых) с кончика медной проволоки, соскоблив верхний 1 см медной проволоки лезвием бритвы до блеска со всех сторон. Подготовьте по одному огрызку от насекомых для каждого комара, а также несколько дополнительных.
    4. Золотую проволоку разрезаем диаметром 0,025 мм на куски длиной 4-5 см. Всегда держите проволоку в самозакрывающихся щипцах, замаскированных лентой, чтобы не повредить проволоку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Золотая проволока гораздо легче видна на черном фоне.
    5. Поместите конец золотой проволоки вдоль чистого кончика медной проволоки огрызка от насекомых и аккуратно оберните золотую проволоку 3 раза вокруг медной проволоки.
    6. С помощью рассекающего щупа нанесите серебряный клей, чтобы удержать золотую проволоку на месте. Убедитесь, что нет хвоста или свободного конца. Поместите огрызок от насекомых в пенопласт, пока клей не высохнет.
    7. Аккуратно погладьте золотую проволоку, прикрепленную к огрызку от насекомых, чтобы разгладить и придать ей длинную мягкую дугу (Рисунок 2F). Обрежьте проволоку до нужной длины (~2,5-3 см).
    8. Работая под микроскопом для препарирования, с помощью тонкозаостренных щипцов сделайте золотую петлю на кончике золотой проволоки и согните петлю под углом 90°, как описано ниже (шаги 2.2.8.1-2.2.8.4; рисунок 2E,F). Убедитесь, что золотая петля полностью закрыта. Верните огрызок от насекомых в поролоновый блок.
      1. Используя недоминантную руку, держите огрызок насекомого за латунный ноготь, причем кончик золотой проволоки касается предметного столика микроскопа. Доминирующей рукой возьмитесь за самый конец золотой проволоки тонконаправленными щипцами.
      2. С помощью тонкозаостренных щипцов перекрестите кончик золотой проволоки над медной проволокой огрызка от насекомых рядом с тем местом, где приклеена золотая проволока. Прикоснитесь концом тонкозаостренных щипцов и золотой проволокой к предметному столику микроскопа.
      3. Осторожно потяните за огрызок от насекомых, пока золотая проволока не образует маленькую золотую петлю вокруг кончика тонких щипцов (не тяните слишком туго). Освободите золотую проволоку и осторожно снимите щипцы.
      4. Все еще держа огрызок насекомого в недоминантной руке, возьмитесь за золотую петлю тонконаправленными щипцами так, чтобы щипцы находились под перпендикулярным углом к горловине проволоки, а кончик щипцов охватывал середину золотой петли, таким образом, захватывая обе стороны петли. Осторожно потяните за огрызок насекомого, слегка поворачивая щипцы в сторону от окурка насекомого, пока петля не будет изогнута под углом 90° к горловине проволоки (Рисунок 2G).
  3. Прикрепите записывающие электроды к комарам26,27,29,30 (утро EPG):
    1. Обезболите голодающих комаров газомСО2 до тех пор, пока все движения не прекратятся. Расположите комаров на спине на салфетке для анестезии так, чтобы их живот был обращен к исследователю.
    2. Положите кусок лабораторной ленты ~2 см под микроскоп для вскрытия липкой стороной вниз. Нанесите на ленту каплю 0,5 см (~10 μл) серебристого клея.
    3. Отсасывайте брюшную полость комара, находящегося под наркозом, в модифицированную пипетку Пастера, используя отсасывание ровно на время, достаточное для того, чтобы живот оставался на месте. Подержите комара под рассекающим эндоскопом над серебряным клеем с помощью аспиратора.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Крылья могут находиться внутри или снаружи кончика модифицированной пипетки Пастера, но наличие их внутри поможет предотвратить выпадение комара. Не допускайте изгиба или повреждения крыльев.
    4. Работая быстро, окуните мельчайшую булавку в серебряный клей и нанесите тонкий слой на переднеспинку комара (т.е. на тыльную поверхность грудной клетки). По возможности немедленно переходите к следующему шагу (или при необходимости повторно обезболите комара).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется удалять чешуйки на переднеспинке, растирая штифт вперед и назад, чтобы обеспечить проникновение клея в поры в кутикуле. Избегайте попадания клея на любую другую часть комара.
    5. Быстро окуните золотую петлю на кончике записывающего электрода в серебряный клей и поместите ее на пятно серебряного клея на переднеспинке комара. Покачивайте петлю вперед и назад, чтобы она прилегала заподлицо с переднеспинкой. Держите проволоку до высыхания клея (~20-25 с).
    6. Установите огрызок от насекомых в пенопласт под углом, который позволит комару удобно стоять, когда он проснется. Приступаем к проводке следующего mosquito.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется делать заметки о качестве каждой работы по электропроводке.
    7. После того, как нужное количество комаров будет подключено, поместите пенопластовый блок в ящик для хранения. Поддерживайте комаров в нормальных условиях выращивания до использования.

3. Настройка и подготовка EPG (утром перед EPG)

  1. Включите монитор AC-DC EPG (щелкнув переключателем на источнике питания) не менее чем за 30 минут до начала записи, чтобы обеспечить балансировку прибора и устранить любые неисправности.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Каналы, используемые на блоке управления и интерфейсном блоке переключателя, можно оставить включенными.
  2. Включите компьютер и откройте программное обеспечение для управления оборудованием.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если сигналы не отображаются в виде плоских тонких линий, требуется устранение неполадок (см. раздел обсуждения).
  3. Выполните touch test27,30 для проверки функциональности оборудования:
    1. Находясь на земле (т.е. прикасаясь к клетке Фарадея голой кожей), поверните диск на головном усилителе на 106 Ω и вставьте в порт стержень от насекомых><. ПРИМЕЧАНИЕ: Проведение теста на касание при более высоком уровне входного сопротивления (Ri) может привести к повреждению усилителя головы.
    2. Находясь на земле, включите усилитель и трижды крепко возьмитесь за медную проволоку огрызка от насекомых между указательным и большим пальцами. Если EPG работает правильно, на экране появятся три больших пика как пред, так и после сигналов. Если это не так, требуется устранение неполадок (см. раздел обсуждения).
  4. Отрегулируйте настройки прибора на переменный ток (AC) 150 мВ с Ri10 7 Ω, аппаратным усилением 20-40x, отрицательным смещением, исходным базовым уровнем и программным усилением 8-16x27,30, как описано ниже (шаги 3.4.1-3.4.3).
    1. Установите напряжение, тип тока, аппаратное усиление (диапазон, коэффициент усиления и умножитель), смещение и базовую линию (ноль) с помощью переключателей и дисков на канале 1 блока управления.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подходящая настройка аппаратного усиления зависит от качества проводки и серебряного клея, поэтому ожидаются колебания оптимальных настроек усиления от комара к комару и изо дня в день. Аппаратное усиление может потребоваться скорректировать во время записи, если сигнал достигает пика (определено в таблице 2 и показано в рисунок 3A,C) или слишком мал для визуализации. Любые изменения аппаратного усиления навсегда повлияют на запись (показано в Рисунок 3A,C).
    2. Установите уровень Ri с помощью диска на головном усилителе.
    3. Установите и отрегулируйте программное усиление с помощью программного обеспечения для управления оборудованием (например, выберите сигнал до или после сигнала, а затем щелкните левой кнопкой мыши, чтобы увеличить программное усиление, или щелкните правой кнопкой мыши, чтобы уменьшить программное усиление).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Любые изменения усиления, внесенные в программное обеспечение, НЕ повлияют на запись навсегда.
  5. Настройте новую запись в программном обеспечении для управления оборудованием, но не начинайте запись до шага 4.3 в следующем разделе.

4. EPG на человеческих руках26,27 :

  1. После получения информированного согласия (в соответствии с IRB домашнего учреждения) пусть хозяин сядет рядом с клеткой Фарадея одной рукой внутрь, одновременно сжимая датчик напряжения подложки и держа его ниже головного усилителя
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рука должна удобно лежать на пузырчатой пленке или аналогичной непроводящей подложке. Ручной и подгосударственный щуп напряжения не должен соприкасаться с клеткой Фарадея или головным усилителем во время записи. Чтобы избежать повреждений, крайне важно, чтобы волонтер не прикасался к головному усилителю после его включения. Если усилитель для головы случайно прикоснулся, проведите описанный выше тест на касание, чтобы оценить его функциональность.
  2. Как только ведущий будет на месте, поверните усилитель головы в сторону. Достаньте проводного комара из ящика для хранения и подключите его к прибору, вставив латунный штифт заглушки от насекомых в порт на головном усилителе. Оставьте комара болтаться.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Держите рядом пульверизатор с 70% этанолом, чтобы контролировать любых комаров, которые отсоединяются от провода.
  3. Запустите запись с помощью программного обеспечения для управления оборудованием. Расположите усилитель над рукой так, чтобы комар мог удобно стоять и прощупывать.
  4. Включите усилитель головы, находясь на земле. Запустите таймер на 10 минут. При необходимости отрегулируйте положение руки хозяина, чтобы помочь в успешном исследовании.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании комаров, наклоненных к зонду, немедленно включите усилитель для головы, прежде чем положить комара на руку. Тонкий деревянный дюбель или непроводящая ручка кисти можно использовать, чтобы согнуть медную проволоку огрызка от насекомых для дальнейшей регулировки положения комара. Увеличительное стекло или цифровой микроскоп на стойке на гусиной шее могут помочь в наблюдении за комарами во время ЭПГ, особенно для исследований поведенческой корреляции.
  5. Используйте программное обеспечение для управления оборудованием для проведения наблюдений с отметками времени (например, маркеров событий) во время записи в отношении ответов хозяина, поведения комаров, изменений усиления и т. д.). При необходимости отрегулируйте положение сигналов на экране и усиление программного обеспечения, чтобы оба сигнала были четко видны на экране. Отрегулируйте аппаратное усиление, если сигнал (сигналы) достигает максимума (Рисунок 3A, C и Таблица 2) или если волны кажутся слишком маленькими при максимальном программном усилении. Отрегулируйте смещение, если наблюдается огибание выпрямителя (Рисунок 3C,C' и Таблица 2). Обратитесь к руководству по программному обеспечению31 и онлайн-ресурсам30 для получения подробных инструкций о том, как внести эти изменения.
    1. Чтобы настроить положение сигналов на экране, выберите сигнал до или после (например, нажав на
      1 = 1       или 2 = 3), а затем перетащите сигнал в нужное место на экране (в идеале ближе к середине экрана, но не перекрываясь).
    2. Чтобы настроить усиление программного обеспечения, используйте программное обеспечение для управления оборудованием, описанное в шаге 3.4.3.
    3. Чтобы отрегулировать аппаратное усиление, начните с поворота регулятора усиления для канала 1 вправо или влево, чтобы увеличить или уменьшить усиление соответственно. Если этой регулировки недостаточно для устранения пиковых значений (слишком большое усиление; Рисунок 3A,C) или позвольте четко визуализировать детали сигнала (слишком низкое усиление), переключите переключатели диапазона и умножителя канала 1, чтобы отрегулировать усиление дальше.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется использовать маркеры событий для записи времени регулировки аппаратного усиления для облегчения интерпретации данных осциллограммы.
    4. Чтобы отрегулировать смещение, переверните переключатель смещения канала 1 на блоке управления в положение «Нет», затем поворачивайте диск смещения канала 1 до тех пор, пока пики сигналов до и после не появятся на экране компьютера в одном и том же направлении. Если диск смещения будет повернут слишком далеко, сигнал пост-сигнала снова переключится.
  6. Если комар не прощупает голову в течение 10 минут (или другого определенного момента времени), выключите головной усилитель. Если комар находится в середине зонда на временной отметке, дайте ему закончить зондирование, прежде чем выключать головной усилитель. Попросите хозяина осторожно убрать руку, затем удалите комара с помощью прикрепленного огрызка от насекомых. Замените комара в ящике для хранения.
  7. Остановите/закройте запись с помощью программного обеспечения для управления оборудованием. Приступайте к EPG при следующем нахождении комара (Шаг 4.2).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не забывайте менять имя файла после каждого комара.
  8. Выключите головной усилитель и источник питания в конце сеанса и закройте программу.
  9. Ознакомьтесь с заявлением об итогах полета участников или аналогичным заявлением с волонтером, как указано в утвержденном IRB.
  10. Утилизируйте комаров в соответствии с требованиями протокола. Снимите полиэтиленовую пленку с пенопласта и выбросьте ее соответствующим образом.
  11. После того, как сбор данных будет завершен, просмотрите и измерьте осциллограммы и проанализируйте данные, как описано ранее24,25,26,27,29,30. Обратитесь к онлайн-ресурсам30 для получения пошаговых руководств по использованию программного обеспечения для просмотра осциллограмм, создания фигур, изображающих осциллограммы, измерения осциллограмм, экспорта данных для анализа, проведения статистического анализа и подробного объяснения общих переменных отклика осциллограммы.

figure-protocol-3
Рисунок 3: Примеры неоптимальных записей из-за выхода на пик, изменения усиления блока управления, неясных изменений напряжения из-за некачественной проводки, переключения выпрямителя и шума. Формы сигналов от комаров Culex tarsalis, питающихся до восполнения на руках человека, искажаются в результате (А) выхода на пик (синяя горизонтальная стрелка) и последующего изменения усиления блока управления от 100-кратного до 80-кратного увеличения до 40-кратного до 60-кратного увеличения до 40-кратного увеличения (оранжевые вертикальные стрелки), (В) неясные изменения напряжения и (В) сворачивание выпрямителя в пост- (черный) сигнале по сравнению с пред- (красным) сигналом (см. осциллограмму J, крупный план показан на панели C'), линейный шум (синусоида 11 Гц видна только в сигнале предварительного выпрямления (красный), крупный план показан на панели C'), выход на пик (синяя горизонтальная стрелка) и изменение усиления блока управления от 500x до 200x (оранжевая вертикальная стрелка). Имена осциллограмм отображаются в верхней части каждой панели. Фиолетовые стрелки в правом нижнем углу панели C указывают, когда усилитель головы был выключен после завершения работы датчика, и представляют собой еще один пример переключения выпрямителя. Красные горизонтальные линии, связанные с сигналом предварительного выпрямления на панели C, указывают, когда маркеры событий использовались для записи заметок с отметками времени. Уровни ri, приложенные сигналы, временные шкалы и программные коэффициенты усиления: (A) 107 Ω, 150 мВ постоянного тока, 13,2 с/дел, 8x; (B) 107 Ω, 150 мВ постоянного тока, 4,4 с/дел, 128x; и (C) 107 Ω, 150 мВ переменного тока, 7,4 с/дел, 2x; (C') 0,2 с/дел, 8x. Сокращения: AC = переменный ток, DC = постоянный ток, Ri = входное сопротивление, мВ = милливольт, Ω = Ом, s/div = секунды на деление. Этот рисунок был подготовлен с использованием данных Cooper et al.27. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

AC-DC EPG записи крови комаров Cx. tarsalis, питающихся человеческими руками (Рисунок 4) сгенерировали интерпретируемые формы волн, пригодные для анализа и публикации27. Интерпретируемые осциллограммы содержали отчетливые, различимые повторяющиеся паттерны, которые можно было классифицировать по семействам осциллограмм (Таблица 1 и Рисунок 4), типам и подтипам, когда компрессия (определена в Таблице 2) и усиление программного обеспечения были скорректированы в программном обеспечении для обзора осциллограмм software27,31. Все семейства осциллограмм (J, K, L, M, N) и типы (L1, L2, M1, M2), ранее описанные в Ae. aegypti, питающиеся на человеческих руках26, были идентифицированы в волнах, генерируемых Cx. tarsalis, питающихся человеческими руками, что подтверждает валидность описанных здесь методов. Кроме того, были идентифицированы три новых типа сигналов (M3, N1, N2) и многочисленные подтипы L1, L2, M1 и M227. Кроме того, падение напряжения до исходного уровня при извлечении мундштуков из хоста было названо семейством осциллограмм W27.

Систематическое изменение настроек прибора (текущий тип и уровни Ri) в соответствии с описанными здесь процедурами позволило определить оптимальные настройки для регистрации кормления Cx. tarsalis на руках человека, электрические источники каждой формы сигнала, среднюю продолжительность в секундах полных и неполных зондов на комара, а также для статистического сравнения длительности сигнала в секундах на насекомое (WDI), количество событий формы волны на насекомое (NWEI) и продолжительность формы волны в секундах на событие на насекомое (WDEI) по параметрам settings27. Комары также прерывались во время различных форм волны и препарировались, чтобы определить, какая форма волны коррелирует с проглатыванием крови27. Аналогичное исследование было проведено для Ae. aegypti с использованием сопоставимой методологии26.

Из-за чувствительной и сложной природы EPG, не все записи были такими же чистыми, как показано на рисунке Рисунок 4. Выход на пик (Рисунок 3A,C), изменения усиления оборудования (Рисунок 3A,C), худшие работы с проводкой (Рисунок 3B), свертывание выпрямителя в форме сигнала J (Рисунок 3C,C') и электрический шум (Рисунок 3C,C") иногда искажали и маскировали формы сигналов, делая их непригодными для использования в показателях качества публикаций и затрудняя оценку и анализ. Таким образом, рекомендуется использовать усилия на начальном этапе для совершенствования навыков проводки, оптимизации настроек усиления и напряжения, регулировки смещения и контроля электрических шумов. Интересно, что сдвиг выпрямителя наблюдался только в семействе волн J для Cx. tarsalis (рисунок 3C,C') и не повторялся после первоначальной корректировки смещения, даже когда использовались другие виды комаров (Ae. aegypti и Culex quinquefasciatus) (данные не показаны). Кроме того, при устранении неполадок выяснилось, что неконтролируемый электрический шум, показанный на рисунке Рисунок 3 (панели C и C'), был результатом неисправной клетки Фарадея. Записи, сделанные в неисправной клетке Фарадея, все еще можно было использовать, но проблемы с шумом были решены, когда была построена улучшенная клетка Фарадея (Рисунок 1B).

Даже когда были приняты все меры предосторожности и оптимизированы интерфейс, небольшие изменения качества прикрепления электрода к комару и другие неизвестные факторы, которые искажали сигнал и периодически изменяли отношение сигнал/шум, требовали корректировки аппаратного усиления во время записи, чтобы гарантировать, что сигнал находится в видимом диапазоне, а разрешение пиков в каждой форме волны достаточно для идентификации и определения характеристик сигнала. К сожалению, регулировка аппаратного усиления во время записи может привести к резким сдвигам напряжения (Рисунок 3A, C), что делает осциллограммы непригодными для публикации, но все еще пригодными для использования (полностью или частично) для измерения и анализа.

figure-results-1
Рисунок 4: Репрезентативные формы сигналов от зонда Culex tarsalis на человеческой руке, записанные с Ri 107 Ω с использованием приложенного сигнала 250 мВ переменного тока. Имена осциллограмм на уровне семейства (NP, J, K, L, M, W) отображаются в верхней части каждой панели. На нижних панелях показаны увеличенные области выбранных областей на панели А. На вставленных панелях отображаются увеличенные области. Временные масштабы и выигрыш программного обеспечения составляют (A) 7,0 с/дел,16x; (B) 1,0 с/дел, 64x; (B') 0,2 с/дел, 64x; (C) 1,0 с/дел, 64x; (C') 0,2 с/дел, 32x; (D) 1,0 с/дел, 64x; (D') 0,2 с/дел, 64x. Сокращения: AC = переменный ток, Ri = входное сопротивление, мВ = милливольт, Ω = Ом, с/дел = секунды на деление. Этот рисунок был подготовлен с использованием данных Cooper et al.27. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

При использовании AC-DC EPG крайне важно иметь базовое представление о работе аппаратного и программного обеспечения30 и тщательно следовать описанным здесь протоколам, чтобы не повредить оборудование. В частности, не прикасайтесь к головному усилителю при его включении, если он не заземлен на клетку Фарадея. Рекомендуется вести запись как можно дальше назад в клетке Фарадея30. Дверцы клетки не обязательно должны быть закрыты для получения интерпретируемых осциллограмм, если только они не записываются в среде с чрезмерным окружающим электрическим шумом. Ничего моторизованного в клетке Фарадея быть не может. Важно отметить, что сама клетка Фарадея должна быть электрически заземлена исключительно через головной усилитель, чтобы она работала должным образом. Это достигается путем подключения головного усилителя к металлическому лабораторному стенду с отшлифованной краской с одного фута стенда, чтобы обеспечить проводящий путь для электричества, захваченного клеткой Фарадея, который поступает на лабораторный стенд, в металлический корпус головного усилителя, вниз по шнуру к блоку управления. через блок питания в правильно заземленную настенную розетку, а в землю через строительную площадку30. Мультиметр может использоваться для проверки качества соединения между компонентами внутри клетки путем измерения удельного сопротивления (которое является обратной проводимостью) между различными точками. Беспроводное AM-радио также может быть размещено внутри клетки Фарадея, чтобы убедиться, что звук значительно снижается (или, в идеале, исчезает) при закрытии дверей, подтверждая, что клетка Фарадея адекватно улавливает воздушные электрические сигналы (E. Backus per. Comm.).

Правильное и стандартизированное приготовление серебряного клея и прикрепление записывающих электродов к насекомым имеют решающее значение для получения пригодных для использования записей. Кутикула насекомого является изолятором и действует как конденсатор, если серебряный клей недостаточно проникает в поры кутикулы, создавая путь для прохождения электричества изнутри насекомого к золотому проводу на поверхности переднеспинки30. Готовьте серебряный клей в одно и то же время перед каждым сеансом EPG, работайте со свежим серебряным клеем из тюбика и часто заменяйте его энергично вихревым серебряным клеем во время процедуры электромонтажа. Убедитесь, что золотая петля расположена напротив грудной клетки, чтобы вся петля соприкасалась с кутикулой, а не наклонялась в одну сторону или не была отделена толстым слоем серебряного клея и чешуек, чтобы сформировать прочное электрическое соединение, а также предотвратить отсоединение и побег комара из провода.

Описанные здесь протоколы должны быть оптимизированы при работе с разными видами комаров. Оптимальные настройки EPG (уровень Ri, напряжение, тип тока и аппаратное усиление) для записи на данное членистоногое должны быть определены экспериментально12,30. Однако, как только смещение будет отрегулировано, его не нужно будет повторно регулировать при работе с аналогичными комарами. Определены оптимальные настройки для AC-DC EPG с Ae. aegypti26 и Cx. tarsalis27. Библиотеки осциллограмм (определенные в таблице 2) для дополнительных видов облегчат внедрение EPG для комаров. Также необходимо оптимизировать анестезию для интересующего комара, так как поведение при питании кровью может по-разному зависеть от вида комара и выбора анестезии. Например, Cx. tarsalis требует 4-часового периода восстановления после 15 минут анестезии CO2, тогда как для Ae. aegypti достаточно 15-минутного периода восстановления после 15-минутного периода анестезии льдом. Culex tarsalis, однако, трудно сбить с ног при воздействии холода, поэтому CO2 преимущественно используется, несмотря на длительный период восстановления.

Несмотря на то, что монитор AC-DC EPG прост в использовании после просмотра онлайн-ресурсов 30,31 или обучения у опытного пользователя, требуется некоторое устранение неполадок. Первоначально авторские записи EPG зондов на комаров содержали неожиданную сигнальную волну с частотой 11 Гц в предварительном сигнале, которая не наблюдалась и не была сообщена Ваяданде и коллегами26. Консультации с Э. Бэкусом показали, что клетка Фарадея, вероятно, была проблемой из-за мешающих контуров заземления. Новая клетка Фарадея, сконструированная из медного экрана с высокой проводимостью, соединенного с алюминиевой рамой, прикрепленной болтами к большой алюминиевой плите пола, поддерживаемой резиновыми ножками, чтобы изолировать ее от стола внизу (рис. 1B), решила шумовой сигнал с частотой 11 Гц (рис. 3C, C'). Кроме того, иногда, когда источник питания EPG был впервые включен, сигналы до и после выпрямления отображались в виде толстых нечетких линий, а не прямых, гладких, тонких линий. Обычно это исправлялось путем выключения прибора и проверки всех соединений шнура. Если это не помогало, обычно помогало отключение прибора от сети на 1-3 минуты. Очень редко сигналы до и после работы становятся толстыми и нечеткими, что решалось путем выключения прибора и подключения его к другой розетке или использования регулятора напряжения и стабилизатора питания для подключения EPG перед подключением его к розетке. В идеале, выделенная линия для монитора EPG должна устранять шум линии, исходящий от холодильников и другого оборудования, подключенного к той же электрической цепи, что и EPG30.

В настоящее время существует два основных ограничения на использование EPG для изучения комаров. Во-первых, было проведено несколько корреляционных исследований, чтобы проверить, какое поведение зондирования соответствует формам сигналов. Несмотря на то, что существуют сильные гипотезы о том, что происходит во время каждого семейства волн (Таблица 1) и некоторых типов волн (M1 и M2), некоторые из этих гипотез были экспериментально подтверждены, за исключением того, что проглатывание крови коррелирует с семейством волн M26,27. Самое главное, необходимо идентифицировать формы волн, соответствующие событиям слюноотделения, потому что многие патогенные микроорганизмы передаются со слюной. Корреляция форм волн EPG с биологической активностью у комаров потребуется для осмысленной интерпретации существенных различий в продолжительности и количестве волн между группами лечения. Во-вторых, скорость зондирования и поглощения во время ЭПГ может быть намного ниже, чем ожидалось27. Индивидуальное привязывание комаров к коротким проводам и размещение их непосредственно на хозяине может предотвратить поиск хозяина на большом расстоянии и социальное питание, что может повлиять на поведение при зондировании и проглатывании. Правильно подключенные насекомые могут нормально ходить и летать. Тем не менее, комары часто тянут за провода и иногда запутываются или держатся под неестественными углами, что указывает на то, что нахождение проводов в некоторой степени влияет на их поведение. Авторы протестировали множество стратегий для повышения скорости зондирования во время EPG, и голодание комаров в течение ночи, использование пожилых особей, воздействие на них человеческого дыхания непосредственно перед тем, как положить их на руку, и нанесение человеческой слюны на руку были наиболее эффективными, а также использование хозяев, которые постоянно вносили тонкие корректировки в положение своей руки, чтобы убедиться, что комар находится в идеальном положениидля зонда.

Несмотря на эти ограничения, AC-DC EPG имеет множество преимуществ по сравнению с другими подходами к изучению поведения зондов и приема. Такие системы, как BiteOScope11, flyPAD15 и Automated Biomaterial Platform14, которые были разработаны для количественной оценки зондирования и глотания, а также выделения слюны во время кормления кровью, используют прозрачные искусственные субстраты и жидкие диеты, в которых отсутствуют нормальные системы тканей хозяина и сигналы хозяина. В то время как эти синтетические платформы полезны для многих экспериментальных целей, явным преимуществом AC-DC EPG является возможность изучения поведения членистоногих и переменных, представляющих интерес в естественных системах хозяев. Кроме того, определяемая пользователем адаптивность системы AC-DC EPG обеспечивает дополнительное преимущество по сравнению с другими приборами EPG22,33 и EPG-подобными электронными устройствамиконтроля 16,21, которые не имеют регулируемых уровней Ri, типов тока и уровней напряжения, которые необходимы для получения осциллограмм с максимальным объемом информации и минимизации неблагоприятных воздействий на широкий спектр хозяев и членистоногих22. 23. Методы электромиографии (ЭМГ) также используются для изучения питания кровью. Тем не менее, электрическая цепь обычно включает только членистоногое, и регистрируются только мышечные потенциалы, ближайшие к регистрирующему электроду, поэтому формы сигналов не предоставляют подробной информации о действиях, происходящих на границе хозяин-насекомое, таких как разрывы клеток, расположение и активность стилетов, а также потоковые потенциалы через ротовые органы28,34. Методы прижизненной микроскопии могут быть использованы для визуализации детальных движений ротового аппарата и активности непосредственно в живых тканях хозяина, но эти методы включают инвазивные процедуры на живых животных моделях9. Только монитор AC-DC EPG может предоставить очень подробную информацию в режиме реального времени о зондировании, проглатывании и слюноотделении, которые происходят в живых непрозрачных тканях хозяина без необходимости инвазивных процедур, и может быть адаптирован для использования у широкого спектра членистоногих.

Это первая подробная пошаговая процедура подключения комаров, создания аспиратора для насекомых и выполнения EPG на людях-хозяевах. Ожидается, что эти протоколы будут способствовать принятию AC-DC EPG в отношении комаров, питающихся людьми-хозяевами. Примеры будущих исследований с использованием AC-DC EPG могут включать исследования фундаментальных механизмов питания крови и повреждения тканей хозяина10, включая идентификацию стереотипных последовательностей зондирующего поведения перед приемом крови, исследование кровотока через ротовые органы и сравнение пластичности питания внутри и между видами членистоногих/стадиями развития26. EPG также может быть использован для количественной оценки эффектов инсектицидов, антифидантов и репеллентов12. Представленные здесь процедуры использования AC-DC EPG для изучения комаров на руках человека ускорят эти исследования и позволят получить новое представление о биологии комаров, питающихся кровью.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть. Упоминание торговых названий или коммерческих продуктов в данной публикации осуществляется исключительно с целью предоставления конкретной информации и не подразумевает рекомендации или одобрения со стороны Министерства сельского хозяйства США. Выводы в этом отчете принадлежат авторам и не обязательно отражают точку зрения Министерства сельского хозяйства США.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарны профессору Астри Вайаданде из Университета штата Оклахома за новаторскую процедуру подключения комаров, а также доктору Элейн Бэкус из USDA-ARS в Парлье, Калифорния, и мистеру Эндрю Доуэллу из EPG Technologies Inc. в Гейнсвилле, Флорида, за помощь в устранении неполадок оборудования EPG. Мы также благодарим доктора Дастина Суонсона и мистера Уильяма Ярнелла из Инсектария USDA-ARS в Манхэттене, штат Канзас, за предоставление комаров, а также мисс Мириам Рухинда из Университета штата Канзас в Манхэттене, штат Канзас, за ее помощь в съемке процедурных видео. Эта работа стала возможной благодаря доступу к Интегрированному молекулярному энтомологическому ядру (IEMC) в Университете штата Канзас. Это исследование было поддержано Соглашением о развитии трудовых ресурсов в области исследований, образования и экономики Министерства сельского хозяйства США (#58-3022-0-002) и проектом Hatch Multistate (NE1943). Данная рукопись является рукописью No 24-194-J от Канзасской сельскохозяйственной опытной станции, Университет штата Канзас, Манхэттен, Канзас, США.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Instrumentation
AC-DC 4-канальный электропенетрографEPG Technologies, Inc.Для EPG включает в себя блок питания, блок управления, блок интерфейса переключателя, четыре усилителя головной ступени, четыре датчика напряжения подложки и связанные с ними шнуры
Воздушные подушкиAmazon.comчеловек-хозяин может положить свою руку во время
установки оборудования для сбора данных EPG DI-710 (AD Board)DATAQ Instruments Inc.для оцифровки аналоговых сигналов EPG с целью их визуализации на компьютерной светодиодной
увеличительной лампе с регулируемой яркостью, большом 5-кратном свободном увеличительном стекле со светом и подставке для чтения хобби Ремесла Швейный верстакAmazon.comдля наблюдения за поведением во время EPG; использование только при отключении от сети во время EPG, иначе шум может привести к
Dino-Lite Edge Digital Microscope (250-кратное увеличение)Dino-LiteAF4915ZTдля поведенческого наблюдения во время EPG
Dino-Lite Flex-arm Настольная подставкаDino-LiteMS22Bдля удержания и манипулирования камерой
Eisco Steel Retort Base Stand and Rod SetFisher ScientificS41740для удержания головного усилителя сцены и заземления клетки Фарадея (должна быть изготовлена из металла)
EPG Online WorkshopUF IFAS Extensionhttps://ifas-crec-entomology.catalog.instructure.com/courses/epg-workshop-2022AKA, «онлайн-ресурсы» для изучения EPG (настройка прибора, сбор и анализ данных, построение Фарадея, подготовка серебряного клея, конструирование огрызков насекомых и т.д.)
Furman P-1800 AR Power Regulator/Power ConditionerAmazon.comдля снижения шума линии
Small Bubble Cushioning WrapAmazon.comдля использования в качестве барьера между хозяином и клеткой Фарадея
Troemner Talboys Labjaws Regular Clamp HolderFisher Scientific02-217-121для удержания усилителя головной сцены и заземления клетки Фарадея (должна быть изготовлена из металла и не покрыта пластиком)
Компьютер с WindowsBest Buyдля EPG и статистического анализа
Software
Backus 2.0 Data Analysis SAS program UF IFAS Extensionhttps://crec.ifas.ufl.edu/extension/epg/data-analysis/для статистического анализа осциллограммных данных
Ebert 1.0 File Manipulator and Error Checker, программыUF IFAS Extensionhttps://crec.ifas.ufl.edu/extension/epg/data-analysis/для подготовки файлов для статистического анализа осциллограмм,
SAS версии 9.4SAS Institute Inc.для статистического анализа осциллограммных данных
WinDaq Lite DATAQ Instruments Inc.для записи и просмотра данных EPG. Включает в себя программное обеспечение WinDaq Hardware Manager (также известное как "программное обеспечение для управления оборудованием") и программное обеспечение браузера WinDaq Waveform (также известное как "программное обеспечение для просмотра осциллограмм"). Только для использования на компьютерах с Windows. 
Faraday Cage
Алюминиевый экранный каркасHome DepotMSCF5167для  стен клетки Фарадея
Алюминиевый лист, толщина 0,125 (1/8) 3003-H14Metals DepotS318для основания клетки Фарадея
Угловые скобы, 1" Home Depot339547для  стен клетки Фарадея
Винты с плоской головкой Phillips, #6-32 x 1"Home Depot459999для строительства клетки Фарадея
Плоские шайбы, #6 Home Depot638977для строительства клетки Фарадея
Цифровой мультиметр Fluke 15B+ для электрических применений, измеряет измерения переменного/постоянного напряжения и тока до 1000 В и 10 А, а также сопротивления, непрерывности, диода и емкостиAmazon.comдля тестирования клетки
ФарадеяПортативный радиоприемник AM FM, транзисторный радиоприемник Goodes с громкоговорителем, разъем для наушников, радиоприемник на батарейках 2AA для приема на большом расстоянии, карманный радиоприемник для внутреннего, наружного и аварийного использованияAmazon.comдля тестирования экрана Faraday Cage
из чистой меди, 16 x 16 сеток с диаметром провода 0,11, 36 x 12 дюймовMetro Screenworksдля  стен комбинированных винтов для машины Faraday Cage
с круглой головкой, #6-32 x 3/4"Home Depot528466для строительства клетки Фарадея
Наждачная бумага, 1/2" на 1", 150 GritHome Depot19036-20-CCдля удаления краски с нижней части лабораторного стенда
Углы рамы экрана, 5/16" Home DepotWCORN516для  стенки решетки Фарадея
Screen spline, 0.14" Home Depot3034719для  стен клетки Фарадея
Insect Stubs
Brass Escutcheon PinsHome Depot801294для конструирования опенок от насекомых   
Медная проволока, 20 AWGAmazon.comдля конструирования заглушек от насекомых   
Водорастворимый грипп HarrisHome Depot355398для помощи в пайке покрытия проволоки от насекомых и формирования прочного соединения
Плоскогубцы с игольчатымHome Depotдля сгибания проволоки при конструировании заглушек
от насекомых Pro's Kit 900-015 Helping Hands Вспомогательное средство для пайкиAmazon.comудержания штифтов накладки во время пайки
Припой (с канифолевым сердечником)Home Depot296497для конструирования орубков насекомых   
Инструмент для зачистки проволокиHome Depotдля снятия изоляции и резки медной проволоки при создании отрубов
от насекомых YIHUA 928D-III Spating Iron, 110 Вт High Power, полностью цифровой дисплей ПаяльникAmazon.comдля создания огрызков насекомых; поставляется в комплекте с подставкой, губкой и стальной ватой для очистки
Insect Aspirator
Лабораторный аспиратор Accuris ASPIREAccuris instrumentsV0020для подачи всасывания на аспиратор насекомых; включает в себя ручной вакуумный контроллер, адаптер с тонким наконечником (40 мм) из нержавеющей стали и адаптер для наконечника пипетки
Chemglass Life Sciences Pasteur, длиной 5 3/4 дюймаFisher ScientificNC0230004для использования в качестве аспиратора от насекомых при подключении комаров
Коммерческая электрическая цветная виниловая изолентаHome Depotдля крепления модифицированной пипетки Пастера к вакуумной линии
Салфетка для комаров, квадратная тканьJoann Fabrics10для предотвращения всасывания комаров в вакуумный насос
Saint Gobain Performance Plastics Tube Tygon 1/4 x 7/16Fisher Scientific50-206-8914для быстрого и легкого переключения между различными модифицированными пипетками Пастера
Thermo Scientific Nalgene HDPE Quick Disconnects (от 3/8 до 7/16 дюймов) Удостоверение личности)Fisher Scientific15-315Bдля быстрого и легкого переключения между различными модифицированными пипетками Пастера
Silver Glue 
Elmer's Glue-All Многоцелевой белый клейAmazon.comдля приготовления серебряного клея
Silver Flake 99,9% чистоты,  4-8 &микро; mThermoFisher786.09для приготовления серебряного клея
Silver Flake 99,95% чистоты, 8-10 &; mInframat Advanced Materials47MR-12Fдля приготовления серебряного клея
Insect Anesthesia
CO2 набор для баблера, 1000 мл, #9 Резиновая пробкаFlyStuff59-181для предотвращения высыхания насекомых при использовании флайпада
Flypad  рамка, типоразмераFlyStuff59-118для предотвращения падения комаров с площадки
FlyStuff BrushFlyStuff59-205для снижения статики при работе на площадке
для мух Flystuff  Flypad  стандартный размерFlyStuff59-114aka "салфетка для анестезии" для обезболивания комаров
Воронка (диаметр 4 дюйма)Amazon.comдля отравления чашек с комарами перед переносом на флайпад
Стекло из плексигласа или плоская пластиковая крышка (обрезанная по размеру)Home DepotMC-27для накрытия площадки от комаров
Зажимы для шланга из пластиковой трубки однопозиционные и регулируемые открытые (разновидность от 1/8" до 1/2")Amazon.comдля отвода газа между накладкой и воронкой
Одноступенчатый регулятор CO2 регуляторFlyStuff59-142для регулирования потока газа из CO2 tank
" T” Фитинг для трубки с внутренним диаметром 1/8 дюймаFlyStuff59-123для подключения как флайпада, так и воронки к резервуару CO2
Трубки, прозрачные FlyStuff59-124Cдля подключения воронки и флайпада к регулятору на баке CO2
Insect Wiring
Черный картон, (65 фунтов, 176 г/м2) 8,5" x 11"Michael's Stores Inc.327826для облегчения визуализации золотой проволоки
Черная строительная бумага квадрат 3,5" x 4,0Скобы956221для облегчения визуализации золотой проволоки
Ватные шарикиAmazon.comдля голодающих комаров
Крафтовая пена #12 блок (3,1 см x 17,2 см x 30,2 см)Joann Fabric and Craft Store1941079для удержания комаров с проводами
Deflecto Ribbon Диспенсер, ПрозрачныйAmazon.comдля хранения золотой проволоки
Легкие энтомологические щипцыFisher ScientificS72110для манипуляций с насекомыми
Тонкие щипцы (FST by Dumont: #5 91150-20, Inox-Electronic)Fine Science Tools91150-20для создания золотой петли при подключении комаров
Кисть для рисования тонкой точкойAmazon.comдля манипуляций с комарами при прокладке проводки и EPG; должен иметь пластиковую или деревянную ручку, если используется для EPG
Fine-tip стандартные переводные пипетки, узкие, 5,8 млThomas Scientific7761D21для приготовления серебряного клея
Золотая проволока, 99,99% чистоты, толщина 0,025 ммGoodfellowAU005121для проводки комаров
Minutien pins, наконечник 0,2 мм, 1 смFisher ScientificNC9681411для нанесения клея на комаров
Бумажные стаканчики Жесткая бумажная тубадля голодающих комаров     
Штифтовые тискиFisher Scientific50-996-811для удержания мельчайшего штифта во время проводки от насекомых
Пластиковый ящик для хранения с крышкой (7 дюймов x 9 дюймов x 14 дюймов)Amazon.comдля транспортировки проводных комаров
Стекло из плексигласа или плоская пластиковая крышка (обрезанная по размеру)Home DepotMC-27для укрытия площадки от мух, если комары начинают просыпаться
Самозакрывающиеся щипцыFisher Scientific08-906для удержания и манипулирования золотой проволокой
Compressed Gas
CO2 gas GasMathesonдля обезболивания комаров с помощью флайпада
Common Lab Items
Одноразовые автоклавные пакеты Biohazard, 8 1/2" x 11"Fisher Scientific03-410-591для утилизации комаров, питающихся кровью
Горелка Бунзена или пропановая горелкаAmazon.comдля модификации пипеток Пастера
Цветная лабораторная лентаDaigger Расходные материалыEF9763Rдля маркировки, приготовления серебряного клея и маскировочных щипцов
Одноразовые наконечники для пипеток, 1000 & микро; Л.Фишер Научный для аликвотирования воды при изготовлении серебряного клея
Диссекционный микроскопLeica Microsystemsдля проводки комаров
Диссекционный зондFisher ScientificNC9109673для перемешивания и нанесения серебряного клея
Колба Эрленмейера, 1000 млFisher Scientific для предотвращения высыхания насекомых при использовании flypad
Этанол, 70% Fisher Scientific04-355-122для восстановления сбежавших комаров
Стеклянные чашки ПетриFisher Scientific08-747Bдля обезболивания комаров льдом
ПерчаткиFisher Scientificдля индивидуальной защиты
Kimwipes KimTech Science марки Деликатные салфетки для задач Fisher Scientific06-666для раздавливания комаров
Лабораторные халатыFisher Scientificдля личной защиты
Баллончики с распылителем LiBa, многоразовые пустые пульверизаторы (безопасные для медицинского спирта)Amazon.comдля восстановления сбежавших комаров
Магнитная мешалка, длина 2 смFisher Scientific для смешивания серебряного клея
Механическая одноканальная пипетка, 1000 & микро; Л.Фишер Научный 13-690-032для аликвотирования воды при изготовлении серебряного клея
Микроцентрифужные пробирки, 1,5 млFisher Scientific 780420для хранения серебряного клея
Parafilm M Fisher Scientific50-998-944для герметизации тюбиков серебряного клея
Полиэтиленовая пленкаAmazon.comдля покрытия пеноблока
Pyrex 20 мл стаканFisher Scientific 07-250-051для замешивания серебряного клея
Semi-Micro BalanceFisher Scientific 10-919-370для взвешивания клея и серебряных чешуек
Ручка Sharpie, тонкаяAmazon.comдля маркировки
Лезвие бритвы однолезвийное ElectronMicroscopy Sciences71980для чистки огрызков
Стандартные одноразовые переводные пипеткиFisher Scientific 133-711-7млдля переноса серебряного клея в накопительную пробирку 
Тарелка для перемешиванияFisher Scientific для смешивания серебряного клея
Таймер/секундомерFisher Scientificдля измерения времени, как долго хозяин подвергается воздействию каждого насекомого
Ультрачистая (18 MΩ) водаFisher Scientific для приготовления серебряного клея
Универсальные ножницыFisher Scientific08-945для резки золотой проволоки
Вихревой миксерFisher Scientific для смешивания серебряного клея
Study Organisms
Culex tarsalis комаровUSDA ARS Center for Grain and Animal Health Research in Manhattan KSдля использования в качестве субъектов исследования
на которые , , носиком для x 10 см 16651622 ", насекомых

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Becker, N., et al. Medical importance of mosquitoes in Mosquitoes and their control. , 2nd ed, Springer. Los Angeles, CA. 25-42 (2010).
  2. World Health Organization. Vector-borne diseases. , (2024).
  3. Woodstream Corporation, Inc. The economic cost of mosquito-borne diseases. AMosquito Magnet. , (2022).
  4. Bartlow, A. W., et al. Forecasting zoonotic infectious disease response to climate change: Mosquito vectors and a changing environment. Vet Sci. 6 (2), 40(2019).
  5. Naslund, J., et al. Emerging mosquito-borne viruses linked to Aedes aegypti and Aedes albopictus: Global status and preventive strategies. Vector Borne Zoonotic Dis. 21 (10), 731-746 (2021).
  6. Shaw, W. R., Catteruccia, F. Vector biology meets disease control: Using basic research to fight vector-borne diseases. Nat Microbiol. 4 (1), 20-34 (2019).
  7. Wilson, A. L., et al. The importance of vector control for the control and elimination of vector-borne diseases. PLoS Negl Trop Dis. 14 (1), e0007831(2020).
  8. Dusfour, I., et al. Management of insecticide resistance in the major Aedes vectors of arboviruses: Advances and challenges. PLoS Negl Trop Dis. 13 (10), e0007615(2019).
  9. Choumet, V., et al. Visualizing non infectious and infectious Anopheles gambiae blood feedings in naïve and saliva-immunized mice. PLoS ONE. 7 (12), e50464(2012).
  10. Backus, E. A., Cervantes, F. A., Guedes, R. N. C., Li, A. Y., Wayadande, A. C. AC-DC electropenetrography for in-depth studies of feeding and oviposition behaviors. Ann Entomol Soc Am. 112 (3), 236-248 (2019).
  11. Hol, F. J., Lambrechts, L., Prakash, M. BiteOscope, an open platform to study mosquito biting behavior. Elife. 9, e56829(2020).
  12. Backus, E. A., Guedes, R. N., Reif, K. E. AC-DC electropenetrography: Fundamentals, controversies, and perspectives for arthropod pest management. Pest Manag Sci. 77 (3), 1132-1149 (2021).
  13. Gordon, R. M., Lumsden, W. H. R. A study of the behavior of the mouthparts of mosquitoes when taking up blood from living tissue; together with some observations on the ingestion of microfilariae. Ann Trop Med Parasitol. 33, 259-278 (1939).
  14. Janson, K. D., et al. Development of an automated biomaterial platform to study mosquito feeding behavior. Front Bioeng Biotechnol. 11, 1103748(2023).
  15. Henriques-Santos, B. M., Xiong, C., Pietrantonio, P. V. Automated analysis of feeding behaviors of females of the mosquito Aedes aegypti using a modified flyPAD system. Sci Rep. 13, 20188(2023).
  16. Kashin, P., Wakeley, H. G. An insect 'Bitometer. Nature. 208 (5009), 462-464 (1965).
  17. Kashin, P. Electronic recording of the mosquito bite. J Insect Physiol. 12, 281-286 (1966).
  18. Kashin, P. Development of an orally effective insect repellent. IIT Research Institute. , (1967).
  19. Kashin, P., Arneson, B. E. An automated repellency assay system. II. a new electronic "Bitometer-timer.". J Econ Entomol. 62 (1), 200-205 (1969).
  20. Shieh, J. -N. Salivation and engorgement parameters of sucking insect vectors: Implications in pathogen transmission. , Oregon State University. (1994).
  21. Kimsey, R. B. Measuring and recording arthropod blood feeding. History, Development, and Applications of AC Electronic Insect Feeding Monitors. , Entomological Society of America. 122-128 (1994).
  22. Backus, E. A., Devaney, M. J., Bennett, W. H. Comparison of signal processing circuits among seven AC electronic monitoring systems for their effects on the emf and R components of aphid (Homoptera: Aphididae) waveforms. Principles and Applications of Electronic Monitoring and Other Techniques in the Study of Homopteran Feeding Behavior. Walker, G. P., Backus, E. A. , Entomological Society of America: Lanham, MD. 102-143 (2000).
  23. Backus, E. A., Bennett, W. H. The AC-DC correlation monitor: New EPG design with flexible input resistors to detect both R and emf components for any piercing-sucking hemipteran. J Insect Physiol. 55 (10), 869-884 (2009).
  24. Backus, E. A., Cline, A. R., Ellerseick, M. R., Serrano, M. S. Lygus hesperus (Hemiptera: Miridae) feeding on cotton: New methods and parameters for analysis of nonsequential electrical penetration graph data. Annals of the Entomological Society of America. 100, 296-310 (2007).
  25. Ebert, T. A., Backus, E. A., Cid, M., Fereres, A., Rogers, M. E. A new SAS program for behavioral analysis of electrical penetration graph data. Comput Electron Agr. 116, 80-87 (2015).
  26. Wayadande, A. C., et al. Waveforms from stylet probing of the mosquito Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) measured by AC-DC electropenetrography. J Med Entomol. 57 (2), 353-368 (2020).
  27. Cooper, A. M. W., et al. An electropenetrography waveform library for the probing and ingestion behaviors of Culex tarsalis on human hands. Insect Sci. 31 (4), 1165-1186 (2024).
  28. Reif, K. E., Backus, E. A. AC-DC electropenetrography unmasks fine temporal details of feeding behaviors for two tick species on unsedated hosts. Sci Rep. 11 (1), 2040(2021).
  29. Vaughan, L. D., et al. Electropenetrography as a tool to quantify probing and injection behaviors of mosquitoes (Aedes aegypti) in mice under biocontainment housing. Comp Med. 73 (6), 25(2023).
  30. Backus, E. A., Shugart, H. Electropenetrography (EPG) Online Workshop. Hosted by L. Diepenbrock at the University of Florida. Institute of Food and Agricultural Sciences Extension. , https://ifas-crec-entomology.catalog.instructure.com/courses/epg-workshop-2022 (2022).
  31. Dataq Instruments Inc. WinDaq recording and playback software. , (2024).
  32. Backus, E. A. Our own jabberwocky: clarifying the terminology of certain piercing-sucking behaviors of homopterans. Principles and applications of electronic monitoring and other techniques in the study of homopteran feeding. Walker, G. P., Backus, E. A. , Entomological Society of America: Lanham, MD. 102-143 (2000).
  33. Tjallingii, W. F. Comparison of AC and DC systems for electronic monitoring of stylet penetration activities by homopterans. Principles and Applications of Electronic Monitoring and Other Techniques in the Study of Homopteran Feeding Behavior. Walker, G. P., Backus, E. A. , Entomological Society of America. 41-69 (2000).
  34. Mizrahi, J. Advances in Applied Electromyography. , IntechOpen. Rijeka, Croatia. (2011).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи