Методическая статья

Выделение субклеточных субпопуляций рибосом на основе биотинилирования, специфичного для рекомбинантных пептидных меток, ограниченного расположением и освещения

DOI:

10.3791/66881

⸱

24 июля 2026 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Genetics, Stanford School of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Биотинилирование с ограниченным местоположением AviTag (ALIBi) — это новый оптогенетически активированный метод, разработанный для маркировки и очистки субклеточных популяций рибосом с целью дальнейшего секвенирования и протеомного анализа.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Растущие данные свидетельствуют о том, что трансляция мРНК — это сильно компартментированный процесс внутри клетки, и что субклеточная транспортировка и локализация определённых мРНК являются ключом к тому, чтобы белки с специфическими функциями компартмента производились в идеальной среде и в соответствующих количествах. Однако методы субклеточной изоляции и характеристики рибосом, транслирующей эти мРНК, до сих пор ограничены, поэтому многое остаётся неизвестным о том, как состав трансляционного механизма способствует регуляции локализованной трансляции мРНК.

Здесь мы демонстрируем специфическую биотинилирование с ограниченным местоположением и освещением (ALIBi) — метод, который сочетает эпитопную маркировку, недавно разработанную оптогенетически активированную сплит-биотин-лигазу и аффинитную очистку для быстрой и конкретной метки и изоляции рибосом, локализованных в любом субклеточном компартменте. Во-первых, редактирование CRISPR/Cas9 используется для слияния пептида AviTag, участка расщепления протеазы вируса табачного травления (TEV) и эпитопной метки FLAG с рибосомным белком. Разделённая биотиновая лигаза, сросшаяся с доменом, нацеляющим органеллы, экспрессируется в этой клеточной линии и неактивна при нормальной концентрации биотина. При активации дополнительного биотина и синего света лигаза биотинилирует рибосомы, отмеченные AviTaged, непосредственно поблизости, что позволяет очищать биотинилированные рибосомы, связанные с ними белки и мРНК на бусинах, покрытых стрептавидином. Неденатурирующее элюирование через расщепление протеазы TEV даёт образцы, подходящие для дальнейшей характеристики основных рибосомных белков, связанных с рибосомами белков и мРНК, связанных с рибосомами, с помощью секвенирования РНК или протеомики масс-спектрометрии.

В этом протоколе мы рассматриваем принципы проектирования слияния AviTag с рибосомным белком и нацеления на фермент разделённой биотин-лигазы на интересующую органеллу. Мы демонстрируем активацию системы ALIBi, лизис клеток, очищение аффинитета и элюирование образцов. Наконец, мы обсуждаем типичные результаты и способы устранения неполадок.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Существует важная необходимость в инструментах, способных изолировать биологические образцы из определённых субклеточных компартментов для лучшего изучения того, как субклеточная организация и трафик влияют на клеточные процессы. Трансляция мРНК — ключевой пример такого процесса: растущие данные свидетельствуют о том, что трансляция сильно разделена на части, и, в частности, многие мРНК локализованы в органеллах, где их закодированные белкибудут находиться 1,2. Однако о субклеточной локализации трансляционного механизма известно меньше. Рибосомы начинают своё существование в ядрах и ядре, где начинается сборка из рибосомных белков (РП) и рибосомных РНК (рРНК). Затем их экспортируют в цитоплазму для финальных стадий сборки, после чего начинаются трансляциимРНК 3,4. Канонические участки трансляции включают цитоплазму и эндоплазматическую сеткулю; в последнем случае синтезируются интегральные мембранные белки и белки, предназначенные для мембранно-связанных органелл или внеклеточнойсекреции. Более поздно выявленные участки локализованной трансляции включают митохондрии, пероксисому и нейронныепроцессы 6,7,8,9,10,11,12. Интересно, что также появляются доказательства того, что особенности трансляционного механизма, такие как белки, связанные с рибосомами, посттрансляционные модификации, модификации рРНК и неканоническая стехиометрия основных рибосомных белков, участвуют в регуляторных механизмах, регулирующих трансляцию определённых мРНК и параметров, таких как верность и скоростьтрансляции 13,14,15,16,17,18, 19, 20. Например, были выявлены сотни белков, которые взаимодействуют с рибосомой и могут привести к различиям в субклеточном составерибосом 13. Однако методы выделения субклеточных популяций рибосом до сих пор ограничены; таким образом, многое остаётся неизвестным о том, как состав трансляционных механизмов способствует регулированию локализованной трансляции мРНК. Появление универсальных методов изоляции субклеточных популяций рибосом, особенно совместимых с модельными системами млекопитающих, позволит исследовать эти особенности трансляционного механизма на субклеточном уровне.

Самые ранние методы выделения субклеточных фракций, содержащих рибосомы, основывались на принципах последовательного лизиса ицентрифугирования 21,22. Обычно эти методы ограничены определёнными органеллами и часто требуют длительного времени обработки. Более современный метод основан на биотинлигазе BirA, которая специально биотинилирует субстрат пептидаAviTag 10,23,24. BirA может быть генетически локализован в органелле интереса в клетках, где рибосомы были помечены AviTag. Однако, поскольку BirA активен при физиологических концентрациях биотина, необходимо культивировать клетки в условиях истощения биотина, чтобы избежать конститутивного и неспецифического биотинилирования рибосом с AviTag10,24. Это ограничивает использование BirA в типах клеток, чувствительных к истощениюбиотина 25. Наконец, были разработаны методы промискуитетной биотинилирования, использующие инженерные ферменты, такие как BioID, TurboID и APEX 26,27,28. При индукции эти ферменты производят реактивный биотин-промежуточный продукт, который ковалентно изменяет остатки лизина в радиусе фермента. Методы промискуитетного биотинилирования очень полезны для картирования субклеточных протеом, но менее информативны для различия белков в общей близости локализованных рибосом по сравнению с белками, находящимися в более близкой к ним.

Здесь мы демонстрируем наш недавно разработанный метод маркировки и изоляции субклеточных популяций рибосом, называемый AviTag-специфической биотинилированием с ограниченным местоположением и освещением (ALIBi). Этот метод использует инженерно разработанный разделённый BirA, сплавленный с оптогенетически усиленными магнитными (eMag) переключателями (рисунок 1A), которые гетеродимеризуются под синимсветом 29; а также пептидную метку, состоящую из эпитопа FLAG, участка расщепления протеазы вируса табака (TEV) и AviTag (FTA), сросшейся с рибосомным белком Rpl31 (см. рисунок 1B). Расщеплённый фермент может быть генетически нацелен на выбранные органеллы, неактивен при физиологических концентрациях биотина и может восстанавливаться в течение нескольких минут после освещения синим светом и добавления дополнительного биотина (рисунок 1C-E). Последующий лиз клеток, аффинитная очистка и неденатурирующая ферментативная элюция с помощью расщепления протеазы TEV дают рибосомы и коочищающие молекулы, такие как мРНК и белки, связанные с рибосомами, которые подходят для дальнейших аналитических методов, таких как секвенирование РНК и протеомика масс-спектрометрии (рисунок 1A). Таким образом, этот метод выявляет не только состав рибосом, но и мРНК, к которым связаны рибосомы. В недавней статье, описывающей фундаментальное применение ALIBi для характеристики субклеточных популяций рибосом, мы успешно нацелели расщеплённый фермент на цитоплазму, ядро, ядро, эндоплазматический ретикулум, плазматическую мембрану и митохондрии (Таблица 1)30. В результате сравнения трансляционного механизма между этими субклетовыми компартментами привели к новым и неожиданным открытиям относительно трансляции в эндоплазматической сетке и митохондриях, а также к потенциальным направлениям для будущих исследований факторов биогенеза рибосом в ядре и нуклеоле.

Этот протокол содержит подробную демонстрацию трансфекции и активации системы ALIBi, лизиса клеток, очистки аффинитета и элюции образцов. Мы также обсуждаем, как проверить успешное очищение аффинности с помощью вестерн-блота и даём рекомендации по проведению нижнего секвенирования РНК или протеомного анализа масс-спектрометрии (MS) (см. Дополнительный файл 1). Этот протокол разработан для экспериментов с использованием мышиных эмбриональных стволовых клеток (mESC), экспрессирующих Rpl31, сросшийся с FTA (L31-FTA) гомозигогенно из эндогенного локуса Rpl31; Эта линия сота доступна у авторов по запросу. Стратегия генерации этой клеточной линии описана в Дополнительном файле 1 , а также в Дополнительном рисунке S1 и Дополнительном рисунке S2. Плазмиды, кодирующие расщеплённые ферменты, направленные на несколько органелл, доступны на Addgene (каталожные номера #235608 по 235643). Принципы проектирования для нацеливания разделённых ферментов на эти органеллы описаны в дополнительном файле 1. Протокол предполагает, что каждый образец происходит из mESC, выращенных в пластине диаметром 10 см. Мы обнаружили, что масштаб 10 см даёт достаточно материала для протеомики масс-спектрометрии, тогда как шкала с 6 лунками достаточно для западных блотов или секвенирования РНК.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Культура клеток mESC

ПРИМЕЧАНИЕ: Перед активацией ALIBi и лизом клеток mESC следует обрабатывать стандартной стерильной техникой для культивирования клеток. Центрифугирование целых mESC следует выполнять при 200 × г в течение 3 минут при комнатной температуре, если не указано иное. Предварительно разогрейте среду до 37 °C в водяной бане перед использованием, если не указано иное. mESC следует вводить в свежую сетку для культуры тканей, которая была желатинизирована за ночь (см. шаг 1.1).

  1. За день до размораивания MESC L31-FTA покрыть дно пластины диаметром 10 см 5 мл желатина 0,1%. Инкубировать при 37 °C ночью.
  2. Объедините компоненты среды mESC (Таблица 2) и пропустите фильтр 0,2 мкм. Храните при 4 °C до месяца.
  3. В день оттаивания нагрейте 5 мл аликвота для разбавления оттаявшихся клеток и 10 мл аликвот для их покрывания.
  4. Извлечь криовиал, содержащий ~5 × 106 L31-FTA mESC из жидкого азота. Сразу же оттаяйте, покрутив дно флакона в водяной бане при температуре 37 °C.
  5. Аккуратно смешайте 0,5–1 мл материала из 5 мл аликвота с криовиальным содержимым, насколько позволяет емкость флакона, затем переведите криовиальное содержимое обратно в 5 мл среды аликвот.
  6. Гранулируйте клетки центрифугированием. Аспирировать супернатант.
  7. Подвесьте клеточную гранулу с помощью 10 мл среднего аликвота.
  8. Аспирируйте желатин с 10-сантиметровой пластины и немедленно перенесите клеточную суспензию в пластину. Инкубировать при 37 °C.
  9. Каждые 24 часа (кроме дней прохождения) аспирируйте старый носитель из пластины и заменяйте на 10 мл свежего материала.
  10. Когда колонии сходятся на 70–80% (обычно через 48 часов после нанесения), аспирируйте старую среду и дважды промывайте 10 мл фосфатно-буферного физиологического раствора Dulbecco (DPBS).
  11. После аспирации DPBS покрыть пластину 2 мл трипсина 0,05% (Таблица 2). Инкубировать при 37 °C в течение 5 минут.
  12. Нейтрализуйте трипсин, добавив в пластину 4 мл холодного mESC материала. Сразу же используйте серологическую пипету объемом 5 или 10 мл, чтобы 15-кратно поднять и опустить по пластине, чтобы диссоциировать колонии в одноклеточную суспензию.
  13. Перенесите подвеску в коническую трубу. По желанию удалите аликвот для подсчета клеток с помощью гемоцитометра.
  14. Гранулируйте клетки центрифугированием. Аспирировать супернатант.
  15. Суспензируйте клеточную гранулу в свежей среде. Пластина 5 × 106ячеек (обычно соотношение прохода 1:6) в свежей желатинизированной пластине диаметром 10 см и инкубируется при 37 °C. Повторяйте шаги 1.9–1.15 по мере необходимости, пока не будете готовы к трансфекции.
  16. Для получения замороженных клеточных запасов трипсинизуйте пластину mESC (как в шагах 1.10–1.14). Суспензировать клеточную гранулу в замороженной среде (250–500 мкл на 5 × 106 клеток), аликвотировать в криовиалы и медленно заморозить в контейнере для замораживания при -80 °C на ночь, прежде чем перенести в жидкий азот.

2. Трансфекция

ПРИМЕЧАНИЕ: Проводите трансфекцию в день, когда mESC готовы к передаче. Плазмиды могут начать экспрессироваться уже через 3–5 часов после трансфекции. После экспрессии мы рекомендуем работать с клетками в темноте и минимизировать воздействие температур ниже 37 °C, чтобы предотвратить преждевременную активацию, поскольку предыдущие исследования показали, что магнитные оптогенетические домены димеризуются не только при синем свете, но и при воздействиихолодного 31. Храните тарелки в отдельном инкубаторе или защищайте полку в общем инкубаторе от света с помощью алюминиевой фольги. При работе с ячейками вне инкубатора заранее выключайте или заблокируйте все комнатные светильники и окна, а также используйте красный свет для наблюдения. Не оставляйте дверцу инкубатора открытой дольше, чем необходимо. Вынимайте из инкубатора только небольшие партии пластин и кладите их на утеплительную поверхность (то есть чистую крышку из пенопласта), чтобы минимизировать контакт с рабочими поверхностями комнатной температуры. Полностью подогрейте медиа перед использованием. Не осматривайте пластины под светоизлучающим микроскопом.

  1. За день до трансфекции желатинизируйте пластину диаметром 10 см.
  2. В день трансфекции аспирируйте желатин из пластины и добавьте 7,5 мл среды для предварительного нагрева при 37 °C. Предварительно разогрейте редуцированную сывороточную среду при 37 °C для ресуспензии клеток.
  3. Разбавить 18,75 мкл трансфекционного реагента в 250 мкл восстановленной сывороточной среды. Аккуратно постукайте, чтобы перемешать, и инкубировать 5 минут при комнатной температуре.
  4. Если соэкспрессируются две плазмиды, кодирующие N- и C-фрагменты, добавьте по 3,75 мкг каждой плазмиды к 250 мкл восстановленной сывороточной среды. Если экспрессировать только одну плазмиду (то есть отрицательный контроль с GFP или полноценный положительный контроль BirA), добавьте вместо этого 7,5 мкг одной плазмиды.
  5. Добавьте смесь плазмидной среды и редуцированной сывороточной среды в смесь реагента для трансфекции и редуцированной сывороточной среды и разведите/инвертируйте для смешивания. Инкубировать при комнатной температуре в течение 15 минут.
  6. Тем временем трипсинизируйте и гранулируйте mESC (шаги 1.10–1.14). Суспензировать гранулу в нагретой редуцированной сывороточной среде до концентрации 10 ×10 6 клеток/мл.
  7. Добавьте 7,5 × 106 (750 мкл) ревзвешенных клеток в смесь плазмиды/трансфекционного реагента/редуцированной сывороточной среды. Переверните трубку для смешивания. Инкубировать 10 минут на RT, время от времени инвертируя трубки, чтобы клетки оставались в состоянии.
  8. Ненадолго инвертируйте трубки и добавьте смесь mESC/плазмиды/трансфекционного реагента/редуцированной сывороточной среды в пластину с нагретой средой. Аккуратно покачивайте пластину, чтобы равномерно распределить клетки.
  9. Инкубировать пластину при 37 °C в течение 3–5 часов, позволяя клеткам прилипнуть за это время.
    ПРИМЕЧАНИЕ: С этого момента мы рекомендуем соблюдать вышеуказанные меры предосторожности против воздействия света и температур ниже 37 °C.
  10. Аккуратно впитывайте старые медиа. Добавьте свежую подогревшуюся среду, прокладывая пипетом по стенке пластины, чтобы избежать смещения ячеек. Возобновить инкубацию при 37 °C.
  11. Если происходит активация/лизирование через 24 часа после трансфекции, переходите к секции 3. Если планируете активировать/лизировать через 48 часов после трансфекции, меняйте среду через ~24 часа после нанесения клеток.

3. Активация ALIBi и лизис клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжайте обрабатывать клетки/образцы в темноте до начала элюции (шаг 5.4). После охлаждения клеток на льду (шаг 3.15) сохраняйте образцы холодными и используйте только охлаждённые реагенты до начала элажуния. Убедитесь, что рабочие поверхности, оборудование, реагенты и пластики не содержат РНК, используя свежеоткрытые изделия и протирая или промывая твердые поверхности раствором для дезинфекции РНК и 70% этанола. Надевайте перчатки при работе с образцами или оборудованием. Для образцов, предназначенных для протеомики РС, также минимизировать загрязнение кератином, сохраняя рабочее пространство чистым от пыли; Прикройте обнажённую кожу и завяжите длинные волосы.

  1. Охладите центрифугу до 4 °C.
  2. При выключенном свете переместите трансфектированные пластины в временный инкубатор при температуре 37 °C, чтобы они не подвергались колебаниям температуры в основном инкубаторе после установки транслиминатора внутрь.
  3. Протрите синий светосветитель 70% этанолом и подключите его к питанию. Поместите транслиминатор в основной инкубатор и дайте условиям инкубатора вновь уравновеситься, продолжая процесс настройки.
  4. Подогрейте аликвот среды, которую можно дозать биотином и циклогексимидом (CHX) (10 мл среды на 10 см пластину) до 37 °C. Если проводят контрольные образцы без дополнительного биотина, также нагрейте отдельный аликвот для дозировки только CHX.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые компоненты буфера можно смешивать за день до использования и хранить на ночь при 4 °C (см. таблицу 2). Обратите внимание, что для экспериментов с протеомикой Western Blot или MS и для секвенирования РНК использовались разные рецепты лизиса и буфера мойки.
  5. Охладите аликвот DPBS для дозировки CHX (20 мл на пластину 10 см).
  6. Подготовьте буферы для удаления РНКозы, соляной промывки, буфера для лизиса и буфера для промывки (см. Таблицу 2). Для буферов с плотными/вязкими компонентами, такими как глицерин и Triton X-100, пипетируйте готовый буфер для равномерного смешивания. Охлаждайте буферы на льду перед использованием.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для этапов промывания бусины коротко прокрутите трубку с бусинами в текущем буфере в карманной центрифуге, чтобы собрать содержимое на дне. Поместите трубку в магнитную стойку на 1 минуту или пока шарики полностью не переместятся. Аспирируйте супернатант, не касаясь гранулы бусины. Не давая грануле высохнуть, добавьте следующий буфер. Чтобы подвесить шарик обратно, либо аккуратно прокатывайте трубку между пальцами, прижимая её к магнитной стойке, чтобы шарики быстро тянулись магнитом в разных направлениях. Наконец, несколько раз переверните подвесные бусины, чтобы убедиться, что внутренние стенки трубки были промыты.
  7. Подвесьте бутылку со стрептавидином с помощью аккуратной пипеты или покачивания. Перенесите 450 мкл шариков в белоковую трубку с низким уровнем связывания для каждой 10-сантиметровой пластины mESC.
  8. Следуя вышеуказанному ПРИМЕЧАНИЮ по промывке бусин, выбросьте буфер для хранения шариков и промывайте шарики дважды с 900 мкл буфера для удаления РНК.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Переходите к следующему этапу без задержек; Длительное время в буфере удаления РНК может снизить способность связывать шарики.
  9. Стирите бусины 1 раз с 900 мкл соляной жидкости.
  10. Мойте шарики дважды с 900 мкл буфера Wash I Buffer. После повторного суспензия шариков во втором раунде буфера Wash I храните их в буфере при 4 °C при активации и лизе клеток.
  11. Добавьте биотин (конечная концентрация 50 мкм; разбавление 1:1 000 запаса 50 мм) и CHX (конечная концентрация 100 мкг/мл; разбавление 1:1 000 запаса 100 мг/мл) в зависимости от нагретого аликвота среды. Держите при 37 °C до использования.
  12. Добавьте CHX (100 мкг/мл конечную концентрацию; разбавление 1:1 000 100 мг/мл бульона) в холодный аликвот DPBS и храните в охлажденном состоянии до использования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие два шага описывают активацию ALIBi с помощью дополнительного биотина и освещения синим светом. Идеальная продолжительность активации достаточно длительна, чтобы обеспечить достаточное количество биотинилирования рибосомы для дальнейших анализов, но достаточно короткая для сохранения пространственно-временного разрешения. Идеальное время активации может варьироваться в зависимости от таких параметров, как тип клетки, масштаб эксперимента, уровень экспрессии расщеплённых ферментов, количество рибосом рядом с интересующей органеллой и чувствительность метода анализа. Мы рекомендуем 15 минут в качестве отправной точки, это время активации, используемое в наших репрезентативных результатах (рисунок 2) и в сопутствующейработе 30.
  13. Аспирационные среды из трансфектированных пластин. Сразу добавьте 10 мл тёплого материала с CHX ± биотином на одну пластину.
  14. Чтобы негативные управляющие пластины не были освещены, поместите их в тёмный инкубатор. Для освещения пластин положите их прямо поверх транслиминатора, включите его и инкубуйте 15 минут.
  15. После завершения освещения немедленно промыйте пластины 2 раза с 10 мл холодного DPBS + CHX на каждую пластину. Положите тарелки на лёд между и после стирки. После аспирации второй промывки наклоните пластину и аспирируете остатки DPBS.
  16. Держа каждую пластину максимально ровной на льду, переходите к лизису с добавлением 2 мл ледяного буфера лизиса. Инкубировать пластину на льде в течение 5 минут, постукивая по пластине, чтобы вывести клетки 2–3 раза за это время.
    ПРИМЕЧАНИЕ: если держать в темноте под фольгой и на льду, пластины можно переместить из зоны культивирования клеток в другое тёмное пространство в это время.
  17. Удалять оставшиеся клетки с помощью микропипетки для пипетирования лизата вверх и вниз по поверхности пластины, избегая образования пузырей, затем перенесите лизат в охлаждённую и маркированную белоковую трубку с низким связыванием.
    ПРИМЕЧАНИЕ: ПО ЖЕЛАНИЮ: Для некоторых трудно лилизируемых органелл, таких как ядро и ядро, может помочь соникация.
  18. В случае трудно лизируемых органелл соникуйте все образцы эксперимента в течение 45 с при 4 °C (при мощности 3 ватт). Если конструкция соникатора требует вставки зонд в открытую пробирку, сначала перенесите лизат из пластины в большую трубку, чтобы предотвратить переполнение во время соникации; затем перенесите в трубку на 2 мл.
  19. Инкубировать лизат на льду в течение 15 минут.
  20. Центрифугуйте лизат при 17 000 × г в течение 3 минут при 4 °C. Переместить супернатант (очищенный лизат) в охлаждённую белковую низкосвязывающую трубку, не нарушая гранулу клеточного остатка.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если предполагается анализ РНК-секвенации, теперь можно собрать аликвот очищенного лисата как общую долю РНК (см. Дополнительный файл 1, «Рекомендации по секвенированию РНК» шаг 1.1) для подробностей.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если количество клеток, условия трансфекции/культуры и условия лизиса были одинаковыми для всех образцов, мы обычно предполагаем, что концентрации лизата сопоставимы между образцами и проводим без количественной оценки общей концентрации белка. Это минимизирует прошедшее время между активацией и очищением аффинитета.

4. Очищение по аффинитету

  1. Пеллетируйте вымытые бусины стрептавидина с помощью магнитной решётки. Аспирируйте буфер для мойки.
  2. Перенесите 1 200 мкл очищенного лизата в трубку с промытыми бусинами. Аккуратно подвесите бусины. Оставшийся просветлённый лизат храните при -80 °C.
  3. Инкубировать лизат шариками при 4 °C в темноте в течение 1 часа на вращательном трубке.
  4. Во время этой инкубации подготовьте буфер элюирования TEV (Таблица 2).

5. Элюция

  1. Следуя примечаниям по мытью бусины в разделе 3, пеллетируйте бусины на магнитную стойку и перенесите супернатант в охлаждённую белковую трубку с низким связыванием. Храните супернатант при -80 °C.
  2. Стирите шарики дважды с 900 мкл буфера Wash I.
  3. Промывайте шарики 1 раз с 900 мкл буфера Wash II.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После завершения этого шага сэмплы больше не нужно обрабатывать в темноте.
  4. Добавьте 450 мкл буфера элюции TEV к шарикам.
  5. Инкубировать шарики в буфере элюции TEV в течение 1 часа при комнатной температуре на ротаторе трубки. Для экспериментов меньшего масштаба с использованием малых объёмов буфера элюции TEV инкубируют лампы на шейкере при скорости 1000–2000 об/мин.
  6. Гранулируйте бусины на магнитную стойку. Перенесите элуат в белоковую трубку с низким уровнем связывания. Если требуется анализ протеомики или вестерн-блот, сохраняйте элуат при -80 °C. Если предполагается анализ РНК-последовательности, см. дополнительный файл 1 «Рекомендации по секвенированию РНК» шаг 1.2 для инструкций по хранению элуата.
  7. НЕОБЯЗАТЕЛЬНО: Для предварительного определения, дала ли аффинитная очистка значительные рРНК/мРНК (указывая на выделение рибосом), проанализируйте элюаты на микрообъёмном спектрофотометре, используя буфер элюции TEV в качестве бланка.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Элюаты из клеток, содержащих активированную систему, должны обладать большей поглощённостью на 260 нм, чем элюаты клеток без расщеплённых ферментов, синего света/биотина или L31-FTA.

6. Вестерн блот

ПРИМЕЧАНИЕ: До тех пор, пока образцы лизата и проточных образцов не будут денатурированы в буфере Леммли, мы рекомендуем продолжать избегать воздействия света. Мы используем сборные гели, коммерчески доступный буфер для переноса и буфер для прохода, а также полусухую систему переноса (см. Таблицу материалов). SDS-PAGE и western blot выполняются согласно инструкциям производителя для этих компонентов, если иное не указано ниже.

  1. Добавьте 6x буфера Laemmli в образцы лисата, проточного и/или элюирующего до конечной концентрации 1x буфера Laemmli. Нагрейте при 95 °C в нагревательном блоке или термоциклере в течение 10 минут. Если на крышке/стенках трубки образуется конденсат, ненадолго прокрутите трубки вниз.
  2. Установите гель с пусковым буфером в гелевом баке, согласно инструкциям производителя. Загрузите образцы и лестницу.
  3. Пропустите гель при 125 В в течение 45–75 минут, пока передняя часть красителя не приблизится к нижней части геля. Тем временем подготовьте буферы PBST и блокировки (Таблица 2).
  4. Выполните полусухую передачу согласно инструкции производителя системы переноса.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На всех этапах промывания/инкубации мембраны убедитесь, что мембрана полностью погружена под воду, и размещайте мембранный лоток на орбитальной или наклонной коромысле. Для лотка размером 10 x 15 см требуется 25–50 мл буфера.
  5. Вынимите мембрану из пересадной трубы и немедленно переходите к следующему этапу, чтобы мембрана не высохла.
    ПРИМЕЧАНИЕ: ПО ЖЕЛАНИЮ: Сухие пятна на мембране могут приводить к неравномерному блокированию или связыванию, особенно у зондов с короткими инкубациями, таких как стрептавидин-хрен пероксидаза. Чтобы избежать этой проблемы, мы снова увлажняем мембраны после переноса в 100% метаноле в течение 30 секунд, затем в воде на 5 минут. Эта мера схожа с общими рекомендациями по повторному увлажнению мембран PVDF, которые высохли послепереноса 32,33.
  6. Промой мембрану в PBST 3 x 10 минут при комнатной температуре.
  7. Следуя условиям, указанным в Таблице 3 для каждого зонда Western blot, проводите блокировку, промывку, инкубацию зонда и инкубацию вторичных антител.
  8. После финальной промывки на этапе 6.7 смешайте компоненты подложки ECL согласно инструкции производителя и равномерно покройте мембрану. Зафиксируйте изображение на гелевую систему хемилиминесценции.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Western blot (раздел 6 протокола) — самый быстрый способ предварительной оценки успеха эксперимента. При исследовании мембран стрептавидин-HRP лизат из клеток, где присутствовали все компоненты системы, должен содержать полосу, соответствующую биотинилированному L31-FTA (рисунок 2A, полоса 20). Та же полоса должна присутствовать, обычно с большей интенсивностью, если клетки были трансфектированы полноразмерным BirA в качестве положительного контроля (

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ALIBi предлагает несколько преимуществ по сравнению с существующими методами изучения субклеточного трансляции и имеет потенциальные будущие применения в биологии рибосом и за её пределами. Этот протокол требует примерно столько же или меньше времени по сравнению с последовательным лизом и центрифугированием21,22 и потенциально применим к любому субклетовому компартменту, который может быть генетически нацелен локализирующей пепт...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конфликта интересов, которые можно было бы заявлять.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы благодарят членов Barna Lab за полезные обсуждения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
-80 °C storageДля культуры клеток
0.1% желатин в водеMilliporeSigmaES-006-BДля культуры клеток
Фильтры 0.2 µmFisher04-977-158Для культуры клеток
0.5% трипсин-ЭДТА (10X)ThermoFisher15400-054Для культуры клеток
1 М MgCl2ThermoFisherAM9010Для лизиса и аффинной очистки
1 М Tris pH 7.5ThermoFisher15567027Для лизиса и аффинной очистки
1 М Tris pH 8ThermoFisherAM9855GОпционально: для вставки FTA в эндогенный локусс рибосомного белка
1.5 и 2 мл микроцентрифужные пробирки, стерилизованные автоклавированиемДля трансфекции
1.5, 2 мл и 5 мл пробирки с низкой адсорбцией белкаEppendorf022431081, 022431102,
0030108302		Для лизиса и аффинной очистки
10 см тканевые пластинки для культурДля культуры клеток
10 М NaOHMilliporeSigma72068-100MLДля лизиса и аффинной очистки
10x концентрат Tris/глицин/SDS буфера для электрофорезаBio-Rad1610772Для Western blot
Инкубатор для культуры клеток 37 °C х 2Для культуры клеток. Один из них используется как основной инкубатор для культуры клеток и иллюминации трансфектированных клеток. На день активации ALIBi требуется временное пространство во втором инкубаторе для размещения трансфектированных клеток во время настройки трансиллюминатора в основном инкубаторе.
Водяная баня 37 °CДля культуры клеток
5 М NaClThermoFisherAM9010Для лизиса и аффинной очистки
50 мМ биотинThermoFisherB20656Для лизиса и аффинной очистки
6x буфер LaemmliFIsher50-196-784Для Western blot
70% этанолДля дезинфекции
АцетонитрилFisherA955Опционально: для подготовки образцов для масс-спектрометрии
AcTEV протеазный наборThermoFisher12575015Для лизиса и аффинной очистки
Плазмида ALIBi C-фрагментAddgene#235615, 235636 – 235641Необходим Midi-prep масштаб для трансфекции
Плазмида ALIBi N-фрагментAddgene#235614, 235635, 235642, 235643Необходим Midi-prep масштаб для трансфекции
Алюминиевая фольгаДля лизиса и аффинной очистки
карбонат аммонияMilliporeSigma5.3305Опционально: для подготовки образцов для масс-спектрометрии
анти-FLAG антителоMilliporeSigmaF3165Для Western blot
анти-GAPDH антителоCell Signaling5174Для Western blot
анти-мышиное вторичное антителоGE HealthcareNA931VДля Western blot
анти-кроличье вторичное антителоGE HealthcareNA934VДля Western blot
анти-Rpl12 антителоAbcamab175219Для Western blot
анти-Rpl31 антителоAbcamab103991Для Western blot
анти-Rpl5 антителоProteinTech15430-1-APДля Western blot
анти-V5 антителоThermoFisherR960-25Для Western blot
АпиразаNEBM0398LДля лизиса и аффинной очистки
Бета-меркаптоэтанол (55 мМ)ThermoFisher21985-023Для культуры клеток
Синий свет трансиллюминаторClare Research ChemicalDR46B (малый) или DR196 (большой)Для лизиса и аффинной очистки
Бычачий сывороточный альбумин (BSA)FisherBP1600-100Для Western blot
C18 наконечники (OMIX C18 наконечники)AgilentA57003100Опционально: для подготовки образцов для масс-спектрометрии
Контейнер для замораживания клетокДля культуры клеток
Центрифуга, подходящая для 15 мл и/или 50 мл конусных пробирокДля культуры клеток
Центрифуга для 1.5-2 мл микроцентрифужных пробирокДля лизиса и аффинной очистки. Должна иметь возможность охлаждения до 4 С и скорости до 17,000 г. Идеально, если она находится в комнате, которую можно временно затемнить при переносе пробирок внутри и наружу.
Clarity ECL наборBio-Rad170-5061Для Western blot
Гель-

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fazal FM, et al. Atlas of subcellular RNA localization revealed by APEX-seq. Cell. 2019;178(2):473-90.e26.
  2. Padron A, Iwasaki S, Ingolia NT. Proximity RNA labeling by APEX-seq reveals the organization of translation initiation complexes and repressive RNA granules. Mol Cell. 2019;75(4):875-87.e5.
  3. Dorner K, Ruggeri C, Zemp I, Kutay U. Ribosome biogenesis factors: from names to functions. EMBO J. 2023;42(7):e112699.
  4. Klinge S, Woolford JL Jr. Ribosome assembly coming into focus. Nat Rev Mol Cell Biol. 2019;20(2):116-31.
  5. Aviram N, Schuldiner M. Targeting and translocation of proteins to the endoplasmic reticulum at a glance. J Cell Sci. 2017;130(24):4079-85.
  6. Dahan N, et al. Peroxisome function relies on organelle-associated mRNA translation. Sci Adv. 2022;8(2):eabk2141.
  7. Koppers M, et al. Receptor-specific interactome as a hub for rapid cue-induced selective translation in axons. Elife. 2019;8:e48718.
  8. Hafner AS, et al. Local protein synthesis is a ubiquitous feature of neuronal pre- and postsynaptic compartments. Science. 2019;364(6441):eaau3644.
  9. Biever A, et al. Monosomes actively translate synaptic mRNAs in neuronal processes. Science. 2020;367(6477):eaay4991.
  10. Williams CC, Jan CH, Weissman JS. Targeting and plasticity of mitochondrial proteins revealed by proximity-specific ribosome profiling. Science. 2014;346(6210):748-51.
  11. Lesnik C, et al. OM14 is a mitochondrial receptor for cytosolic ribosomes that supports co-translational import into mitochondria. Nat Commun. 2014;5:5711.
  12. Gold VA, Chroscicki P, Bragoszewski P, Chacinska A. Visualization of cytosolic ribosomes on the surface of mitochondria by electron cryo-tomography. EMBO Rep. 2017;18(10):1786-800.
  13. Simsek D, et al. The mammalian ribo-interactome reveals ribosome functional diversity and heterogeneity. Cell. 2017;169(6):1051-65.e18.
  14. Kondrashov N, et al. Ribosome-mediated specificity in Hox mRNA translation and vertebrate tissue patterning. Cell. 2011;145(3):383-97.
  15. Shi Z, et al. Heterogeneous ribosomes preferentially translate distinct subpools of mRNAs genome-wide. Mol Cell. 2017;67(1):71-83.e7.
  16. Genuth NR, et al. A stem cell roadmap of ribosome heterogeneity reveals a function for RPL10A in mesoderm production. Nat Commun. 2022;13(1):5491.
  17. Li H, et al. A male germ-cell-specific ribosome controls male fertility. Nature. 2022;612(7941):725-31.
  18. Milenkovic I, et al. Dynamic interplay between RPL3- and RPL3L-containing ribosomes modulates mitochondrial activity in the mammalian heart. Nucleic Acids Res. 2023;51(11):5301-24.
  19. Sloan KE, et al. Tuning the ribosome: the influence of rRNA modification on eukaryotic ribosome biogenesis and function. RNA Biol. 2017;14(9):1138-52.
  20. Simsek D, Barna M. An emerging role for the ribosome as a nexus for post-translational modifications. Curr Opin Cell Biol. 2017;45:92-101.
  21. Baghirova S, Hughes BG, Hendzel MJ, Schulz R. Sequential fractionation and isolation of subcellular proteins from tissue or cultured cells. MethodsX. 2015;2:440-5.
  22. Jagannathan S, Nwosu C, Nicchitta CV. Analyzing mRNA localization to the endoplasmic reticulum via cell fractionation. Methods Mol Biol. 2011;714:301-21.
  23. Fairhead M, Howarth M. Site-specific biotinylation of purified proteins using BirA. Methods Mol Biol. 2015;1266:171-84.
  24. Jan CH, Williams CC, Weissman JS. Principles of ER cotranslational translocation revealed by proximity-specific ribosome profiling. Science. 2014;346(6210):1257521.
  25. Dakshinamurti K, Chalifour L, Bhullar RP. Requirement for biotin and the function of biotin in cells in culture. Ann N Y Acad Sci. 1985;447:38-55.
  26. Roux KJ, Kim DI, Raida M, Burke B. A promiscuous biotin ligase fusion protein identifies proximal and interacting proteins in mammalian cells. J Cell Biol. 2012;196(6):801-10.
  27. Branon TC, et al. Efficient proximity labeling in living cells and organisms with TurboID. Nat Biotechnol. 2018;36(9):880-7.
  28. Rhee HW, et al. Proteomic mapping of mitochondria in living cells via spatially restricted enzymatic tagging. Science. 2013;339(6125):1328-31.
  29. Benedetti L, et al. Optimized Vivid-derived Magnets photodimerizers for subcellular optogenetics in mammalian cells. Elife. 2020;9:e63230.
  30. Zhang Z, et al. A subcellular map of translational machinery composition and regulation at the single-molecule level. Science. 2025;387(6738):eadn2623.
  31. Weinberg BH, et al. High-performance chemical- and light-inducible recombinases in mammalian cells and mice. Nat Commun. 2019;10(1):4845.
  32. Goldman A, Harper S, Speicher DW. Detection of proteins on blot membranes. Curr Protoc Protein Sci. 2016;86:10.8.1-10.8.11.
  33. Gravel P. Protein blotting by the semidry method. In: Walker JM, editor. The protein protocols handbook. 2nd ed. Totowa, NJ: Humana Press; 2002. p. 321-34.
  34. Kirkeby S, Moe D, Bog-Hansen TC, Van Noorden CJ. Biotin carboxylases in mitochondria and the cytosol from skeletal and cardiac muscle as detected by avidin binding. Histochemistry. 1993;100(6):415-21.
  35. Chandler CS, Ballard FJ. Multiple biotin-containing proteins in 3T3-L1 cells. Biochem J. 1986;237(1):123-30.
  36. Jaaro H, Rubinfeld H, Hanoch T, Seger R. Nuclear translocation of mitogen-activated protein kinase kinase (MEK1) in response to mitogenic stimulation. Proc Natl Acad Sci U S A. 1997;94(8):3742-7.
  37. Dang CV, Lee WM. Identification of the human c-myc protein nuclear translocation signal. Mol Cell Biol. 1988;8(10):4048-54.
  38. Snaar S, et al. Mutational analysis of fibrillarin and its mobility in living human cells. J Cell Biol. 2000;151(3):653-62.
  39. Shibata Y, et al. The reticulon and DP1/Yop1p proteins form immobile oligomers in the tubular endoplasmic reticulum. J Biol Chem. 2008;283(27):18892-904.
  40. Palmer AE, et al. Ca2+ indicators based on computationally redesigned calmodulin-peptide pairs. Chem Biol. 2006;13(5):521-30.
  41. Seth RB, Sun L, Ea CK, Chen ZJ. Identification and characterization of MAVS, a mitochondrial antiviral signaling protein that activates NF-kappaB and IRF3. Cell. 2005;122(5):669-82.
  42. Collins JC, et al. Biotin-dependent expression of the asialoglycoprotein receptor in HepG2. J Biol Chem. 1988;263(23):11280-3.
  43. Moskowitz M, Cheng DK, Moscatello DK, Otsuka H. Growth stimulation of BHK cells in culture by free biotin in serum. J Natl Cancer Inst. 1980;64(3):539-44.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

233233JoVE

Похожие статьи