Методическая статья

Количественная оценка уровня 8-оксо-dG с помощью ИФА-анализа для оценки окислительного повреждения ДНК в клетках MCF-7

DOI:

10.3791/66888

⸱

24 мая 2024 г.

 ,  ,  , 
1Suzhou Key Laboratory of Medical Biotechnology, Suzhou Vocational Health College, 2Department of Chemistry and Life Sciences, Suzhou University of Science and Technology, 3Department of Thyroid and Breast Surgery, Wuzhong People’s Hospital of Suzhou City

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает эффективный метод количественного обнаружения окислительного повреждения ДНК в клетках MCF-7 с помощью технологии ИФА.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Основание 8-оксо-7,8-дигидро-2'-дезоксигуанозина (8-оксо-dG) является преобладающей формой часто наблюдаемого окислительного повреждения ДНК. Нарушение ДНК глубоко влияет на экспрессию генов и служит ключевым фактором в стимулировании нейродегенеративных расстройств, рака и старения. Таким образом, точное количественное определение 8-oxoG имеет клиническое значение при исследовании методологий обнаружения повреждений ДНК. Тем не менее, в настоящее время существующие подходы к обнаружению 8-oxoG создают проблемы с точки зрения удобства, целесообразности, доступности и повышенной чувствительности. Мы использовали метод иммуноферментного анализа (ИФА), высокоэффективный и быстрый колориметрический метод, для выявления вариаций содержания 8-оксо-dG в образцах клеток MCF-7, стимулированных различными концентрациями перекиси водорода (H2O2). Мы определили концентрациюH2,O2 , которая индуцировала окислительное повреждение в клетках MCF-7, обнаружив значение IC50 в клетках MCF-7. Впоследствии мы обрабатывали клетки MCF-7 0, 0,25 и 0,75 мМН2О2 в течение 12 ч и извлекали из клеток 8-оксо-dG. Наконец, образцы были подвергнуты ИФА. После ряда этапов, включая раскладывание планшетов, промывку, инкубацию, развитие цвета, окончание реакции и сбор данных, мы успешно обнаружили изменения в содержании 8-оксо-dG в клетках MCF-7, индуцированные H2O2. С помощью таких усилий мы стремимся создать метод оценки степени окислительного повреждения ДНК в образцах клеток и, таким образом, продвинуть разработку более целесообразных и удобных подходов к обнаружению повреждений ДНК. Это начинание призвано внести значимый вклад в изучение ассоциативного анализа между окислительным повреждением ДНК и различными областями, включая клинические исследования заболеваний и обнаружение токсичных веществ.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Окислительное повреждение ДНК является следствием дисбаланса между образованием активных форм кислорода (АФК) и клеточной системой антиоксидантной защиты1. В первую очередь он включает в себя окисление ДНК пуриновых и пиримидиновых оснований 2,3. Эта окислительная модификация оснований ДНК не только нарушает целостность генома, но и охватывает широкий спектр патологических проблем, включая рак, нейродегенеративные заболевания и сердечно-сосудистыезаболевания. Основание гуанина в ДНК имеет самый низкий восстановительный потенциал и наиболее подвержено окислению6. Таким образом, 8-оксо-7,8-дигидро-2'-дезоксигуанозин (8-оксо-dG) служит первичным маркером для оценки степени окислительного повреждения ДНК 7,8. Точное количественное определение 8-оксо-dG стало критически важным вопросом при рассмотрении различных аспектов возникновения, прогрессирования заболевания и оценки многофакторной окислительной нагрузки9.

Традиционные методы детектирования 8-оксо-дГ, такие как высокоэффективная жидкостная хроматография с электрохимическим детектированием (ВЭЖХ-ЭКД), масс-спектрометрия и связанные с ней методы с использованием дефиса, обладают высокой чувствительностью и специфичностью 10,11,12. Однако эти методы часто имеют сложные эксплуатационные требования и высокую стоимость, что препятствует их широкому применению и практичности при анализе образцов с высокой пропускной способностью. С непрерывным развитием науки и техники появилось множество новых, эффективных и точных методов. Применение этих новых технологий позволяет нам более точно количественно определять уровень 8-оксо-dG и предоставляет более мощные инструменты для углубленного изучения связи между окислительным стрессом и болезнями. Например, исследователи применили технологию нанопор для количественного обнаружения и секвенирования ДНК13, идентификации типов повреждений ДНК с помощью стратегии секвенирования кода14 одним щелчком мыши, разработки методов высокопроизводительного секвенирования и создания биосенсоров на основе 8-оксоG путем интеграции биотин-стрептавидина с ИФА15. Среди них ИФА, с ее признанными преимуществами с точки зрения специфичности, высокой пропускной способности скрининга и стоимости, является одним из идеальных решений для обнаружения 8-оксо-dG. Поэтому крайне важно разработать высокопроизводительный, высокочувствительный, удобный и быстрый метод обнаружения 8-оксо-дГ.

Метод иммуноферментного анализа (ИФА), разработанный в 1971-16 гг., быстро развивался в течение последних 50 лет и в настоящее время стал одним из наиболее часто используемых методов обнаружения в области биологии и медицины 17,18,19. Технология ИФА обладает высокой чувствительностью и специфичностью, коротким временем реакции и простотой в использовании, что делает ее широко признанным выбором для тестирования крупномасштабных образцов и высокопроизводительного анализа20. В результате, ИФА широко используется для количественного или полуколичественного анализа соединений, белков, антител или молекул в клетках 21,22,23. Например, он был использован для обнаружения биомаркеров, связанных с различными заболеваниями, остатками лекарств и биомолекулами24. ИФА можно разделить на четыре основных типа в зависимости от плана эксперимента и принципов25. К таким методам относятся прямой ИФА, непрямой ИФА, сэндвич-ИФА и конкурентный ИФА 26,27. Среди них для исследования в данной статье был выбран сэндвич-ИФА, в котором используются два специфических антитела, одно из которых предназначено для захвата молекулы-мишени, а другое – для детектирования. Экспериментальный принцип сэндвич-ИФА заключается в следующем: сначала специфическое антитело иммобилизуется в лунках микропланшета для захвата интересующего аналита. После добавления стандарта или образца целевой аналит связывается с иммобилизованным антителом. Затем добавляется меченое антитело, которое распознает другой эпитоп на антигене, образуя сэндвич-структуру. После удаления несвязанных антител добавляют субстрат. Под каталитическим действием вторичного антитела происходит цветовая реакция, причем интенсивность цвета положительно коррелирует с концентрацией целевого аналита в образце. Наконец, измеряли оптическую плотность (OD) для определения концентрации образца. Сэндвич ИФА обладает преимуществами повышенной чувствительности и специфичности для целевых образцов, что делает его пригодным для детектирования низких концентраций целевых аналитов и сложных образцов28. Кроме того, полученные результаты могут быть количественно оценены для дальнейшего анализа. Эти факторы делают сэндвич-ИФА широко используемым методом обнаружения как в научных исследованиях, так и в клинических лабораториях29.

Данное исследование было направлено на количественное обнаружение 8-оксо-dG в клетках MCF-7 для определения степени окислительного повреждения ДНК в клетках. Данное исследование состоит из двух основных частей: построения модели окислительного повреждения ДНК клеток MCF-7 и детектирования 8-оксо-dG с помощью ИФА. Во-первых, клетки MCF-7 культивировали in vitro и обрабатывали различными концентрациямиH2O2в течение разного времени. Жизнеспособность клеток оценивали с помощью анализа CCK-8 для определения полумаксимальной ингибирующей концентрации (IC50) H2O2 в клетках MCF-7. На основе значений IC50 были выбраны подходящее время обработки H2O2 и индукционная концентрация. Для извлечения образцов поврежденных окислением клеток MCF-7 были получены образцы клеток и надосадочной жидкости, которые были добавлены в ферментные лунки, ранее покрытые антителами 8-oxo-dG. 8-оксо-dG, присутствующий в образце, будет связываться с антителами, связанными с твердофазным носителем. Затем добавляли антитела 8-оксо-dG, меченные пероксидазой хрена. Реакционную смесь инкубировали при постоянной температуре, чтобы обеспечить полное связывание образца и антитела. Несвязанный фермент удаляли путем промывки, а затем добавляли колориметрическую подложку, которая давала синий цвет. Под действием кислоты раствор становился желтым. Наконец, значение наружного диаметра образцов из реакционной лунки измеряли на длине волны 450 нм, а концентрация 8-оксо-dG в образце была пропорциональна значению наружного диаметра. С помощью стандартной кривой можно рассчитать концентрацию 8-оксо-dG в образце.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Построениемодели H2O2 -индуцированного окислительного повреждения ДНК в клетках MCF-7

  1. Восстановление клеток MCF-7
    1. Быстро перенесите криогенную пробирку для клеточной культуры, которая содержит 3,5 x 106 клеток MCF-7 и хранится в холодильнике при температуре -80°C, в пенопластовую коробку, содержащую жидкий азот. Извлеките трубку с помощью щипцов и поместите ее в водяную баню с постоянной температурой 37 °C примерно на 1 минуту, чтобы разморозить сохраненные клетки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Во время процесса размораживания на водяной бане периодически встряхивайте ячейки, чтобы обеспечить равномерный прогрев криоцентра.
    2. Поместите криоциал в центрифугу и центрифугу при комнатной температуре при 150 х г в течение 5 минут.
    3. С помощью пипетки удалите надосадочную жидкость из криогенной пробирки для хранения и добавьте 1 мл готовой питательной среды. Хорошо перемешайте и переложите в чашку для культуры толщиной 10 мм, добавьте еще 7 мл готовой питательной среды.
    4. Встряхивайте чашку для культивирования крест-накрест, чтобы обеспечить равномерное перемешивание, и выращивайте в инкубаторе сCO2 при температуре 37 °C и 5%CO2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Полная питательная среда состоит из питательной среды DMEM с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки, 1% пенициллина и стрептомицина.
  2. Оценка жизнеспособности клеток
    1. Выберите для эксперимента клетки MCF-7 в логарифмической фазе роста с хорошим клеточным статусом. Во время логарифмической фазы роста клетки обычно демонстрируют более короткий цикл деления и высокую частоту деления.
      1. Наблюдайте за морфологией и скоростью роста клеток MCF с помощью электронного микроскопа. Когда клетки имеют однородную и плотно упакованную монослойную морфологию и пролиферацию клеток очевидна, можно определить, что клетки по существу находятся в логарифмической фазе роста.
    2. Промывка клеток: С помощью пипетки удалите питательную среду из чашки для культивирования, добавьте 1 мл буфера PBS для промывки клеток, затем выбросьте PBS.
    3. Отрыв клеток: Добавьте 1 мл трипсина для промывания клеток, подождите около 1 минуты, пока трипсин полностью отделит клетки от чашки для культивирования. Аккуратно постучите по тарелке для культивирования; наблюдение за движением клеток
      в листах указывает на тщательное отслоение клеток.
    4. Прекращение отслойки клеток и подсчет клеток: Добавьте 8 мл полной питательной среды для прекращения отслойки, осторожно пипетируйте клетки и определите концентрацию клеточной суспензии с помощью устройства для подсчета клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перед подсчетом убедитесь, что клеточная суспензия однородна, осторожно пипетируя вверх и вниз.
    5. Посев клеток: Отрегулируйте разбавленную клеточную суспензию до достижения плотности клеток 5 000 клеток на 100 мкл. Инокулируйте клеточную суспензию в 21 лунку 96-луночного планшета с помощью пистолета-пипетки, дозируя по 100 мкл в каждую лунку. Добавьте 100 мкл буфера PBS в окружающие лунки засеянных лунок для предотвращения чрезмерного испарения питательной среды.
    6. Приготовление среды, содержащей H2O2: Выберите 9 лунок на 12-луночном планшете для культивирования клеток и назначьте метки на основе градиента концентраций H2O2 (0, 0,25, 0,50, 0,75, 1,0, 1,5, 2,0 мМ). Добавьте 720 мкл полной среды в лунки, обозначенные как 2,0 мМ и 1,5 мМ, и добавьте 360 мкл полной среды в остальные лунки.
      1. С помощью пипетки введите 1,63 мкл и 1,22 мкл 3% реагента H2O2 в лунки, помеченные как 2,0 мМ и 1,5 мМ соответственно. Тщательно перемешайте раствор. С помощью пипетки переведите 360 мкл 2,0 мМ Н2О2 в лунку с маркировкой 1,0 мМ и перемешайте; затем перенесите 360 мкл 1,0 мМН2О2 в лунку с маркировкой 0,5 мМ и перемешайте; и, наконец, переведите 360 мкл 0,5 мМН2О2 в лунку с маркировкой 0,25 мМ. Пипетку 360 мкл 1,5 мМН2О2 в лунку с маркировкой 0,75 мМ для разбавления и достижения желаемой концентрации. (Рисунок 1).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что исходный раствор H2O2 в пипетке полностью перенесен в лунки, чтобы избежать остаточного раствора. Прежде чем приступить к разбавлению, убедитесь в тщательном перемешивании растворов.
    7. Инкубация: Примерно через 24 часа после посева клеток используйте пипетку для удаления питательной среды из 96-луночного планшета после того, как клетки прилипнут к поверхности. В зависимости от градиента концентрации добавьте в каждую лунку соответствующую среду, содержащую H2O2. Верните пластину в инкубатор на 12 ч.
    8. Добавление реагента CCK-8: После назначенного 12-часового периода обработки с помощью пипетки удалите питательную среду из 96-луночного планшета, добавьте 100 μL полной питательной среды и 10 μL реагента CCK-8 в каждую лунку и включите три пустые контрольные лунки. Инкубируйте планшет при 37 °C в течение 2 часов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В процессе добавления образцов избегайте образования пузырьков, чтобы предотвратить любое вмешательство в показания значения наружного диаметра.
    9. Измерение абсорбции: Извлеките 96-луночный планшет из инкубатора, измерьте абсорбцию на длине волны 450 нм с помощью считывателя микропланшетов и запишите результаты.
    10. Согласно формуле расчета IC50 ,
      скорость ингибирования (%) = (ОД экспериментальной группы препарата - средний ОД отверстия для контроля препарата)/ (средний ОР отверстия для контроля клеток-средний ОД отверстия для контроля препарата) x 100%
      Рассчитайте результаты в процентах поглощения в контрольных культурах.
    11. Импортируйте обработанные экспериментальные данные в программу статистического анализа, выберите тип анализа Нелинейная регрессия, постройте четырехпараметрическую логистическую модель и нажмите кнопку Подогнать кривую для подгонки кривой. После процесса подгонки программное обеспечение автоматически вычислит значение IC50 .
  3. Эксперимент по окислению клеток H2O 2-индуцированным MCF-7
    1. Извлекайте клетки MCF-7 в логарифмической фазе роста с хорошим состоянием клеток для экспериментов.
    2. Промойте, выполните отслоение клеток, прекратите отслоение и подсчитайте клетки (конкретные методы см. в шаге 1.2).
    3. Посев клеток: Отрегулируйте плотность клеточной суспензии до 1 x 106 клеток на чашку, при этом 4 мл суспензии приходится на чашку диаметром 6 см.
    4. Пометьте две микроцентрифужные пробирки объемом 5 мл как 0,25 мМ и 0,75 мМ 3% H2O2. Добавьте 4 мл полной среды в каждую пробирку, затем добавьте 1,13 мкл и 3,40 мкл 3% H2O2 соответственно. Осторожно встряхните трубки, чтобы обеспечить тщательное перемешивание. Замените питательную среду в трех чашках полной средой, содержащейконцентрации Н2О20, 0,25 и 0,75 мМ.
    5. Инкубируйте культуры: верните посуду в инкубатор на 12 ч.

2. Подготовка клеточных образцов и подготовка реагентов ИФА

  1. Сбор образцов клеточных экстрактов
    1. Сбор образца: Выбросьте надосадочную жидкость клеточной культуры MCF-7, промойте, выполните отслойку клеток, прекратите отслойку и соберите клетки. Перенесите клеточную суспензию в центрифужную пробирку объемом 15 мл.
    2. Центрифугирование: Центрифугируйте при 800 x g в течение 5 минут для сбора клеточной гранулы. Добавьте 200 мкл PBS для ресуспендирования каждого образца клетки и разрушения клеток с помощью повторяющихся циклов замораживания-размораживания. Центрифугируйте клеточный лизат при давлении 1500 x g в течение 10 минут и с помощью пипетки собирайте надосадочную жидкость для анализа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Когда количество клеток невелико, уменьшите объем PBS, используемый для ресуспензии. Образцы могут храниться при температуре 4 °C до 1 недели, если немедленный анализ невозможен. Для длительного хранения образцы следует использовать в зависимости от одноразовых количеств и хранить при температуре -80 °C, чтобы избежать повторных циклов замораживания-размораживания.
  2. Приготовление реагентов методом ИФА
    1. Размораживание реагентов: Дайте реагентам ИФА, включая пленки для уплотнений, планшеты с предварительно нанесенным покрытием, стандарты, разбавитель образца, антитела к обнаружению HRP, хромогенный субстрат, стоп-раствор, концентрированный буфер для промывки (20x) и испытуемые образцы до комнатной температуры (18-25 °C) в течение 20 минут перед началом анализа. Предварительно откройте считыватель ИФА за 15 минут до использования.
    2. Приготовление буфера для промывки: Рассчитайте необходимый объем разбавленного буфера для промывки, а затем разбавьте 20x концентрированный буфер для промывки дистиллированной или деионизированной водой в 1x рабочий раствор. Верните неиспользованный концентрированный буфер для стирки в холодильник при температуре 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер для стирки должен быть подготовлен свежим перед использованием. Если кристаллы присутствуют в концентрированном буфере для стирки, хранящемся в холодильнике, дайте ему нагреться до комнатной температуры и осторожно встряхните его до полного растворения кристаллов перед утилизацией.
    3. Подготовка стандарта
      1. Готовят рабочие растворы стандартных образцов с концентрациями 1,25, 2,5, 5, 10, 20 и 40 нг/мл соответственно. Чтобы обеспечить точность экспериментальных результатов, тщательно перемешайте стандартные образцы вверх и вниз перед использованием, чтобы избежать образования пузырьков в процессе растворения.

3. Эксперимент ИФА

  1. Покрытие пластин: Заранее спроектируйте общее количество лунок для стандартов, образцов и заготовок/элементов управления и удалите необходимые полосы пластин. Добавьте в реакционные лунки 50 мкл стандартного рабочего раствора и детектирующих проб с различной концентрацией. Выполнять нормативы в трех экземплярах и воздерживаться от добавления каких-либо проб в глухие/контрольные лунки25.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Экспериментальные этапы анализа методом ИФА схематически показаны на рисунке 2. Если концентрация образца превышает диапазон обнаружения, образец следует разбавить разбавителем образца перед отбором пробы. При добавлении образцов добавляйте их на дно пластины, избегая касания стенок лунки, аккуратно встряхивайте для перемешивания, не допуская образования пузырьков. Чтобы обеспечить точность эксперимента, добавление каждого образца должно быть завершено в течение 10 минут.
  2. Инкубация: За исключением глухих лунок, добавьте 100 мкл конъюгированного антитела для обнаружения пероксидазы хрена (HRP) в каждую реакционную лунку, запечатайте лунки пломбой и инкубируйте при 37 °C в течение 60 мин в инкубаторе с постоянной температурой.
  3. Промывка: Слейте жидкость, стряхните жидкость в лунках пластины, промокните насухо на впитывающей бумаге, добавьте 350 мкл буфера для промывки в каждую реакционную лунку, дайте постоять 1-2 минуты, затем выбросьте буфер для промывки. Повторите процесс стирки 5 раз.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Тщательная промывка имеет решающее значение, поскольку она напрямую влияет на точность результатов эксперимента. Следите за тем, чтобы буфер для стирки полностью стряхивался после каждой стирки. Тщательно сотрите остатки на нижней части пластины после мытья, чтобы не повлиять на измерение абсорбции.
  4. Цветовая реакция: Добавьте 50 μL субстрата A и 50 μL субстрата B в каждую реакционную лунку, запечатайте планшет и инкубируйте при 37 °C в темноте в течение 15 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После добавления цветного реагента немедленно наблюдайте за изменением цвета в реакционных лунках. Если цвет слишком темный, добавьте стоп-раствор, чтобы завершить реакцию раньше.
  5. Завершите реакцию и измерьте поглощение: добавьте 50 мкл стоп-раствора в каждую реакционную лунку и немедленно измерьте значение OD на длине волны 450 нм с помощью считывателя ELISA (в течение 15 минут).
  6. Анализ данных: Импортируйте обработанные экспериментальные данные в программу статистического анализа, выберите тип анализа Линейная регрессия. Постройте калибровочную кривую, построив график концентрации эталонов по оси X относительно значений оптической плотности (OD) по оси Y. Используйте установленную калибровочную кривую для определения концентрации 8-оксо-dG, присутствующей в образцах. Постройте логистическую математическую модель и нажмите кнопку «Подогнать кривую » для подгонки кривой. После процесса подгонки программное обеспечение автоматически рассчитывает стандартную кривую и P-значение.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Стандартная кривая не может быть использована повторно и должна быть определена заново для каждого эксперимента.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Как показано на рисунке 3, ось X обозначает концентрацию H2O2 в клетках MCF-7, в то время как ось Y указывает на жизнеспособность клеток. Обработка 0,75 мМ в течение 12 ч снижала жизнеспособность клеток MCF-7 до 67%. Одновременно с повышением концентрации наблюдалось значительное снижение жизнеспособности клеток MCF-7, особенно при концентрации 1,5 мМ, где жизнеспособность снизилась до уровня ниже 3% (табл. 1). Результаты эксперимента показали, что IC50 составляет 0,7655 мМ для клеток MCF-7.

В этой серии экспериментов мы использовали усовершенствованный метод ИФА для количественной оценки уровней 8-oxo-dG. С помощью анализа данных уравнение регрессии стандартной кривой выглядит следующим образом:

Y = 23,66 × X + 0,07038.

Как показано на рисунке 4А, калибровочная кривая продемонстрировала высокую линейность (R²=0,978), а на рисунке 4В показано, что взаимосвязь между измеренными концентрациями 8-оксо-dG в образцах и соответствующими добавленными ими количествами сильно коррелировала, что указывает на хорошую точность (коэффициент вариации составил менее 5%). Более того, согласованность полученных результатов по множеству повторений свидетельствует о надежности и воспроизводимости экспериментального метода.

Таким образом, экспериментальные данные указывают на то, что наш оптимизированный метод ИФА способен успешно обнаруживать колебания уровней 8-оксо-dG в хорошо контролируемых условиях. Это имеет значительные последствия для будущего применения данного метода в более широком диапазоне типов образцов для мониторинга повреждений ДНК, вызванных окислительным стрессом. Несмотря на определенные ограничения, перспективы применения метода представляются многообещающими при оптимизации условий эксперимента.

figure-results-1
Рисунок 1: Приготовление разведений H2O2. На принципиальной схеме описан способ получения разведений перекиси водорода (Н2О2), включающий тщательное комбинирование растворов и точный переносразличных концентраций Н2О2в пробирки, помеченные как 1,0 мМ, 0,5 мМ и 0,25 мМ соответственно. Целевая концентрация достигается путем переноса 1,5 мМН2О2 в пробирку, обозначенную как 0,75 мМ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2: Иммуноферментный анализ (ИФА) для обнаружения антигенов. На этой схематической иллюстрации изображены последовательные этапы иммуноферментного анализа (ИФА) для обнаружения антигена: добавление образца и подготовка заготовки; инкубация меченых HRP антигенов; мойка и подготовка плит; добавление субстрата и инкубация; Измерение окончания реакции и оптической плотности (OD). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-3
Рисунок 3: H2O2 ингибировал пролиферацию клеток MCF-7. Жизнеспособность клеток оценивали с помощью анализа CCK-8, обработанного различными концентрациямиH2O2 (0, 0,25, 0,50, 0,75, 1,0, 1,5 или 2,0 мМ) в течение 12 ч и рассчитывали IC50 для указанного состояния. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-4
Рисунок 4: Количественный анализ 8-оксо-dG в клетках MCF-7 после обработки H2O2. (А) Стандартная кривая ИФА для 8-оксо-дГ. Отображает взаимосвязь между известными концентрациями 8-оксо-dG (1,25, 2,5, 5, 10, 20 и 40 нг/мл) и их соответствующими значениями поглощения. Уравнение регрессии стандартной кривой: Y = 23,66 × X + 0,07038. (n=3, R2=0,978). (B) Концентрация 8-оксо-dG в клетках MCF-7, обработанных H2O2. На графике представлены уровни 8-оксо-dG в клетках MCF-7, подвергшихся воздействию различных концентрацийH2O2 (0, 0,25 и 0,75 мМ). Каждая точка данных представляет собой среднее значение ± SE (стандартная ошибка) из трех независимых экспериментов (n=3), иллюстрирующих влияние окислительного стресса на повреждение ДНК. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Параметр
Концентрация H2O2 , мМ00.250.50.7512
Жизнеспособность клеток MCF-7, %10082.881.3761.0713.42.77

Таблица 1: Жизнеспособность клеток MCF-7, обработанных H2O2.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Развитие методов ИФА имеет большое значение как для существующих, так и для новых методик обнаружения повреждений ДНК. По сравнению с традиционными методами ВЭЖХ и масс-спектрометрии, этот подход не только удобен в использовании, но и обладает высокой чувствительностью и отвечает требованиям высокопроизводительногоскрининга. Это позволяет проводить мониторинг 8-oxo-dG в крупномасштабных скрининговых исследованиях заболеваний, способствуя более глубокому пониманию корреляции между этим биомаркером и различными заболеваниями.

Во время экспериментальных процедур необходимо выполнить несколько критических шагов для обеспечения надежности и воспроизводимости результатов. Первоначально в эксперименте квалифицированно оценивали чувствительность клеток MCF-7 к H2O2 со значением IC50 0,7655 мМ через 12 ч, подчеркивая уровень толерантности клеток MCF-7. Этот результат имеет большое научное значение для понимания механизмов антиоксидантной защиты клеток MCF-7 и их выживания в условиях окислительного стресса, обеспечивая при этом важный референтный индикатор для будущего скрининга антиоксидантных препаратов илисвязанных с ними механизмов лечения. Кроме того, выбор и спаривание антител 8-oxo-dG имеет жизненно важное значение для обнаружения ИФА и напрямую влияет на специфичность и чувствительность системы обнаружения ИФА. Кроме того, оптимизация стратегии усиления сигнала и этапов обработки выборки являются важными факторами, влияющими на точность обнаружения. Мы обнаружили, что использование стабильной системы реакции на подложке может уменьшить фоновые ошибки и увеличить диапазон чувствительности детектирования.

В процессе эксперимента могут возникать технические проблемы, такие как нестабильные антитела, колебания сигнала и перекрестная реактивность реагентов. Чтобы решить эти проблемы, мы приняли более стабильный экспериментальный протокол, который включал использование стабильных растворителей антител для улучшения стабильности антител, а также оптимизации и корректировки условий эксперимента. Кроме того, чтобы устранить ошибку, вызванную флуктуациями сигнала, мы стандартизировали эксперимент с использованием стандартных образцов 8-oxo-dG для обеспечения согласованности результатов.

Что касается ограничений экспериментального метода, то, несмотря на то, что ИФА обеспечивает высокопроизводительный подход, он все же может быть ограничен специфическим покрытием антител и неизбежной перекрестной реактивностью субстрата32. Поэтому для сложных образцов могут потребоваться дополнительные этапы очистки или предварительной обработки образцов. Кроме того, обнаружение образцов с более низкими концентрациями может потребовать дальнейшей оптимизации активности антител для удовлетворения требований исследования.

В заключение следует отметить, что метод ИФА для 8-оксо-dG имеет важное значение для конкретных областей исследований. Он имеет потенциальную прикладную ценность для мониторинга окружающей среды, оценки риска заболеваний и ранней диагностики и обеспечивает новый подход к обнаружению 8-оксо-dG в сельском хозяйстве, безопасности пищевых продуктов и скрининге лекарственных препаратов33. Например, в биомониторинге окружающей среды обнаружение стресса окислительного повреждения ДНК, вызванного токсинами окружающей среды в организмах, может помочь своевременно выявить потенциальныериски. Ожидается, что в будущем, с дальнейшей оптимизацией технологии обнаружения и ее применением во многих дисциплинах, этот метод будет играть более важную роль в исследованиях в области наук о жизни.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана Инновационной исследовательской группой по науке и технологиям Высшего учебного заведения Цзянсу (2021 г.), Программой Исследовательского центра инженерных технологий Профессионального колледжа Цзянсу (2023 г.), Ключевой технологической программой технологических проектов по обеспечению средств к существованию народа Сучжоу (SKY2021029), Открытым проектом Биобанка клинических ресурсов Цзянсу (TC2021B009), Проектом Государственной ключевой лаборатории радиационной медицины и защиты, Университет Сучжоу (GZK12023013), программы Сучжоуского профессионального медицинского колледжа (SZWZYTD202201) и проект Цин-Лань провинции Цзянсу в Китае (2021, 2022).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,25% трипсин-ЭДТА(1x)Gibco25200-072
Набор для подсчета клеток-8DojindoCK04
Пластина для подсчета клетокQiuJingXB-K-25
CO2 инкубаторThermo51032872
DMEM basic(1X)GibcoC11995500BT
FBSPANST30-3302
GraphPad Prism X9GraphPad Программное обеспечениедля статистического анализа Высокоскоростная
центрифугаThermo  9AQ2861
Человеческий 8-oxo-dG Набор ИФАZcibioZC-55410
L-1000XLS+ ПипеткиRainin17014382
L-20XLS+ ПипеткиRainin17014392
резервуар для жидкого азотаMvecryogeYDS-175-216
MCF-7 CELLBNCCBNCC100137
Multiskan FC микропланшетный фотометрThermo1410101
PBSSolarbioP1020
Раствор пенициллина-стрептомицина, 100XBeyotimeC0222
Тринокулярный микроскоп с живыми клеткамиMotic1.1001E+12
Сверхнизкотемпературный морозильникHaireV118574

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cooke, M. S., Evans, M. D., Dizdaroglu, M., Lunec, J. Oxidative DNA damage: Mechanisms, mutation, and disease. Faseb J. 17 (10), 1195-1214 (2003).
  2. Dizdaroglu, M., Jaruga, P. Mechanisms of free radical-induced damage to DNA. Free Radic Res. 46 (4), 382-419 (2012).
  3. Cadet, J., Davies, K. J. A., Medeiros, M. H., Di Mascio, P., Wagner, J. R. Formation and repair of oxidatively generated damage in cellular DNA. Free Radic Biol Med. 107, 13-34 (2017).
  4. Jackson, S. P., Bartek, J. The DNA-damage response in human biology and disease. Nature. 461 (7267), 1071-1078 (2009).
  5. Jaruga, P., Dizdaroglu, M. Repair of products of oxidative DNA base damage in human cells. Nucleic Acids Res. 24 (8), 1389-1394 (1996).
  6. Fleming, A. M., Burrows, C. J. Chemistry of ROS-mediated oxidation to the guanine base in DNA and its biological consequences. Int J Radiat Biol. 98 (3), 452-460 (2022).
  7. Delaney, S., Jarem, D. A., Volle, C. B., Yennie, C. J. Chemical and biological consequences of oxidatively damaged guanine in DNA. Free Radic Res. 46 (4), 420-441 (2012).
  8. Wang, B., et al. Cross-sectional and longitudinal associations of acrolein exposure with pulmonary function alteration: Assessing the potential roles of oxidative DNA damage, inflammation, and pulmonary epithelium injury in a general adult population. Environ Int. 167, 107401(2022).
  9. Chiorcea-Paquim, A. M. 8-oxoguanine and 8-oxodeoxyguanosine biomarkers of oxidative DNA damage: A review on HPLC-ECD determination. Molecules. 27 (5), (2022).
  10. He, L., Liu, X. L., Zhang, J. J. Simultaneous quantification of urinary 6-sulfatoxymelatonin and 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine using liquid chromatography-tandem mass spectrometry. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 1095, 119-126 (2018).
  11. Lam, P. M., et al. Rapid measurement of 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine in human biological matrices using ultra-high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Free Radic Biol Med. 52 (10), 2057-2063 (2012).
  12. Machella, N., Regoli, F., Santella, R. M. Immunofluorescent detection of 8-oxo-DG and pah bulky adducts in fish liver and mussel digestive gland. Aquat Toxicol. 71 (4), 335-343 (2005).
  13. An, N., Fleming, A. M., White, H. S., Burrows, C. J. Nanopore detection of 8-oxoguanine in the human telomere repeat sequence. ACS Nano. 9 (4), 4296-4307 (2015).
  14. Xiao, S., Fleming, A. M., Burrows, C. J. Sequencing for oxidative DNA damage at single-nucleotide resolution with click-code-seq v2.0. Chem Commun (Camb). 59 (58), 8997-9000 (2023).
  15. Kong, W., Ji, Y., Zhu, X., Dai, X., You, C. Development and application of a chemical labeling-based biosensing assay for rapid detection of 8-oxoguanine and its repair in vitro and in human cells. Chinese J Chem. 40 (19), 2329-2334 (2022).
  16. Engvall, E., Perlmann, P. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Quantitative assay of immunoglobulin g. Immunochemistry. 8 (9), 871-874 (1971).
  17. Boguszewska, K., Szewczuk, M., Urbaniak, S., Karwowski, B. T. Review: Immunoassays in DNA damage and instability detection. Cell Mol Life Sci. 76 (23), 4689-4704 (2019).
  18. Gan, S. D., Patel, K. R. Enzyme immunoassay and enzyme-linked immunosorbent assay. J Invest Dermatol. 133 (9), e12(2013).
  19. Ahirwar, R., Bhattacharya, A., Kumar, S. Unveiling the underpinnings of various non-conventional ELISA variants: A review article. Expert Rev Mol Diagn. 22 (7), 761-774 (2022).
  20. Li, D., et al. Magnetic nanochains-based dynamic elisa for rapid and ultrasensitive detection of acute myocardial infarction biomarkers. Anal Chim Acta. 1166, 338567(2021).
  21. Tabatabaei, M. S., Islam, R., Ahmed, M. Applications of gold nanoparticles in ELISA, PCR, and immuno-pcr assays: A review. Anal Chim Acta. 1143, 250-266 (2021).
  22. Berlina, A. N., Zherdev, A. V., Dzantiev, B. B. ELISA and lateral flow immunoassay for the detection of food colorants: State of the art. Crit Rev Anal Chem. 49 (3), 209-223 (2019).
  23. Amber, K. T., Bloom, R., Hertl, M. A systematic review with pooled analysis of clinical presentation and immunodiagnostic testing in mucous membrane pemphigoid: Association of anti-laminin-332 IGG with oropharyngeal involvement and the usefulness of ELISA. J Eur Acad Dermatol Venereol. 30 (1), 72-77 (2016).
  24. Gervay, J., Mcreynolds, K. D. Utilization of elisa technology to measure biological activities of carbohydrates relevant in disease status. Curr Med Chem. 6 (2), 129-153 (1999).
  25. Tabatabaei, M. S., Ahmed, M. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Methods Mol Biol. 2508, 115-134 (2022).
  26. Aydin, S. A short history, principles, and types of ELISA, and our laboratory experience with peptide/protein analyses using ELISA. Peptides. 72, 4-15 (2015).
  27. Hayrapetyan, H., Tran, T., Tellez-Corrales, E., Madiraju, C. Enzyme-linked immunosorbent assay: Types and applications. Methods Mol Biol. 2612, 1-17 (2023).
  28. Eldahshoury, M. K., Hurley, I. P. Direct sandwich ELISA to detect the adulteration of human breast milk by cow milk. J Dairy Sci. 106 (9), 5908-5915 (2023).
  29. Tsumuraya, T., Hirama, M. Rationally designed synthetic haptens to generate anti-ciguatoxin monoclonal antibodies, and development of a practical sandwich ELISA to detect ciguatoxins. Toxins (Basel). 11 (9), 533(2019).
  30. Ito, E., Iha, K., Yoshimura, T., Nakaishi, K., Watabe, S. Early diagnosis with ultrasensitive elisa). Adv Clin Chem. 101, 121-133 (2021).
  31. Larsson, P., Parris, T. Z. Optimization of cell viability assays for drug sensitivity screens. Methods Mol Biol. 2644, 287-302 (2023).
  32. Gunawardana, C. G., Diamandis, E. P. High throughput proteomic strategies for identifying tumour-associated antigens. Cancer Lett. 249 (1), 110-119 (2007).
  33. Zhang, S., et al. Development of a das-ELISA for gyrovirus homsa1 prevalence survey in chickens and wild birds in China. Vet Sci. 10 (5), 312(2023).
  34. Li, Y., Sun, J., Shang, H. Effect of hogg1 expression level on oxidative DNA damage among workers exposed to nickel in stainless steel production environment. Zhonghua Lao Dong Wei Sheng Zhi Ye Bing Za Zhi. 32 (8), 578-581 (2014).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

8 Oxo dG

Похожие статьи