Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Модель острого повреждения легких после висцеральной ишемии-реперфузии путем пережатия надцелиакической аорты у крыс

922 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/66896

⸱

15 августа 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Vascular Surgery, Rouen University Hospital, 2INSERM U1096, FHU REMOD-VHF, Rouen University Hospital

В этой статье

Краткое содержание

В этом исследовании описана модель острого повреждения легких после висцеральной ишемии-реперфузии во время пережатия надцелиакической аорты с помощью лапаротомии у крыс. Это позволяет исследовать как клинические, так и биологические эффекты пережатия аорты, а также влияние ишемии-реперфузии на подлежащие органы и отдаленные повреждения легких.

Аннотация

Открытая хирургия аневризм брюшной аорты требует временного прерывания кровообращения, что приводит к ишемии-реперфузии нижестоящих органов. Могут быть вовлечены почечные, брыжеечные и спланхнические артерии. Ни одна терапия не доказала свою эффективность в предотвращении отдаленного повреждения легких, вызванного ишемией-реперфузией после надцелиакного пережатия аорты. Для изучения патофизиологических путей острого повреждения легких и фармакологического лечения была разработана экспериментальная модель пережатия аорты на крысах.

Перед процедурой вводят подкожную анальгезию бупренорфином (0,05 мг/кг). Общая анестезия со спонтанной вентиляцией легких вводится с помощью газообразного галогена (изофлуран 2,5%) через маску. Ксифо-лобковая лапаротомия проводится на подогреваемом столе (температура контролируется внутриректально). Желудочно-селезеночный блок и кишечник втягиваются к правому флангу, а печень мобилизуется к верхней части живота. Диафрагма и ее опоры идентифицированы таким образом, чтобы обеспечить поэтапное освобождение надцелиакной аорты от ее внутридиафрагмального прохода. Рассечение выполняется мягко для достижения контроля окружности аорты между столбами диафрагмы. Подлежащий червеный ствол и верхняя брыжеечная артерия тщательно идентифицируются. Микрососудистый зажим может быть использован для окклюзии аорты над висцеральными артериями. О правильном пережатии свидетельствует отсутствие пульсации аорты, связанной с бледностью тонкой кишки. Крыса остается под наркозом на протяжении всей ишемии. По окончании длительности ишемии снимают микрозажим и проверяют пульсацию аорты, а также изменение цвета кишечника. Брюшная стенка закрывается швом с последующим закрытием кожи крысы. По окончании периода реперфузии животное обезболивают таким же образом. Его усыпляют путем обескровливания во время забора крови, после чего можно собрать легкое. Повреждение легких может быть оценено с помощью анализа газов крови, гравиметрии легких и гистологического исследования. Образцы легких также могут быть использованы для анализа ОТ-ПЦР и вестерн-блоттинга.

Введение

Аневризма аорты — это очаговое и постоянное расширение аорты1. Развитие аневризмы имеет тенденцию к разрыву, связанному с массивным кровоизлиянием, которое несет значительную смертность2. Поэтому основное внимание в лечении лежит на профилактике этого драматического осложнения. Аневризмы аорты чаще всего являются инфраренальными и поддаются лечению с помощью эндопротеза аорты. Аорто-би-подвздошный эндотрансплантат представляет собой покрытый раздвоенный стент, который вводится минимально инвазивным способом через бедренные артерии с использованием чрескожного доступа. Эта методика не требует пережатия аорты и позволяет избежать возникновения висцеральной ишемии. Она может проводиться под местной анестезией. Напротив, более обширные аневризмы аорты, такие как торакоабдоминальные аневризмы и сложные аневризмы брюшной аорты, сложнее поддаются лечению с помощью эндоваскулярных методов. Это связано с вовлечением почечных артерий, верхней брыжеечной артерии и чревного ствола в пределах аневризматического сегмента (Рисунок 1). Эти основные висцеральные артерии должны быть реконструированы в дополнение к самой аорте. Таким образом, эндоваскулярный, минимально инвазивный подход требует более сложной процедуры, включающей использование фенестрированных и/или разветвленных эндотрансплантатов для реконструкции висцеральной артерии. Основным ограничением этих эндотрансплантатов является длительный срок изготовления, часто несколько месяцев, что делает их непригодными для экстренного лечения. В таких случаях традиционная открытая хирургическая коррекция остается возможным и надежным вариантом.

Лечение методом открытой пластики требует лапаротомии и надвисцерального пережатия, т.е. временной висцеральной ишемии. Частота осложнений при лечении этих торакоабдоминальных аневризм высока. Смертность колеблется от 5 до 15%3. Легочные осложнения встречаются в 60% случаев, а почечные осложнения — в 40%4. Эти осложнения, связанные с системной воспалительной реакцией, могут прогрессировать до множественной висцеральной недостаточности5. Эта смертность является многофакторной и включает в себя хирургическую агрессию, анестезию, анальгезию, гемодинамические изменения, геморрагический шок и феномен ишемии-реперфузии. Хирургическая агрессия способствует проявлению осложнений, независимо от того, включает ли подход торакотомию, френотомию, люмботомию или лапаротомию, путем изменения механики вентиляции, в частности, нарушения диафрагмальнойфункции.

Временная реперфузия висцеральной ишемии поражает нижестоящие органы, включая пищеварительный тракт, спланхническую систему, почки и нижние конечности7. Легочные осложнения являются наиболее частыми нежелательными явлениями после торакоабдоминальной хирургии аорты. Их происхождение является многофакторным. Пережатие наднадглазной аорты напрямую не вызывает ишемию легочной артерии-реперфузии. Тем не менее, ишемия-реперфузия нижележащих висцеральных органов вызывает серьезную системную воспалительную реакцию. Гипотеза о причинно-следственной связи между висцеральной ишемией-реперфузией и возникновением отдаленных повреждений, в частности повреждений легких, хорошо обоснована. Дисфункция легочного эндотелия, критический компонент альвеолярно-капиллярной мембраны, по-видимому, играет центральную роль в развитии острого повреждения легких (ОПЛ). Массивная системная воспалительная реакция и активация нейтрофилов играют ключевую роль в этом процессе.

ОПЛ часто определяется на основе гистологических критериев, а не клинической картины. ОПЛ относится к острому воспалительному расстройству, характеризующемуся нарушением легочного эндотелиального и эпителиального барьеров. Альвеолярно-капиллярная мембрана, функциональная единица легкого, состоит из трех компонентов: микрососудистого эндотелия, интерстициального пространства и альвеолярного эпителия.

Отличительной чертой ОПЛ является повышенная проницаемость этого барьера, обусловленная инфильтрацией нейтрофилов и высвобождением цитотоксических провоспалительных медиаторов. Повреждение альвеолярного эпителия затрагивает пневмоциты как I, так и II типа. Клетки I типа, которые покрывают 95% альвеолярной поверхности, очень восприимчивы к повреждениям и играют ключевую роль в газообмене. Клетки типа II, более многочисленные, но занимающие меньшую площадь, необходимы для производства поверхностно-активных веществ, восстановления эпителия и транспорта ионов. После травмы клетки II типа способствуют восстановлению целостности альвеол за счет своей регенеративной способности и дифференцировки в клетки I типа.

Множественные пути гибели клеток были вовлечены в повреждение эпителия во время ОПЛ, причем клетки I типа были особенно уязвимы. ОПЛ обычно оценивается путем оценки отека легких, с измерением или без измерения проницаемости микрососудов для отражения эндотелиальной дисфункции.

Целью данной модели является исследование связи между висцеральной ишемией-реперфузией и развитием отдаленного повреждения легких, как на метаболическом, так и на механистическом уровнях, как показано на рисунке 2. Эта конкретная связь остается понятой лишь частично. Наша модель пережатия аорты представляет собой сценарий висцеральной ишемии-реперфузии на здоровой аорте, без наличия аневризмы брюшной аорты у крыс. Над чревным стволом нет крупных ветвей ни у человека, ни у крыс. Аорта выше этого уровня соответствует надцелиакальной аорте, которая дает начало только небольшим париетальным ветвям, снабжающим грудную стенку. Таким образом, существенной разницы в сосудистой анатомии магистральных сосудов на этом уровне между человеком и крысами нет.

Использование этой модели позволяет проводить обширные исследования. Он поможет выявить ранние биомаркеры в развитии удаленного повреждения тканей. Кроме того, эта модель позволяет изучать потенциальные ингибиторы, в том числе ингибиторы циркулирующих медиаторов или ингибиторы конкретных повреждений отдаленных органов.

Для изучения отдаленных повреждений используются другие модели ишемии-реперфузии. Модели ишемии и реперфузии головного мозга, кишечника и почек широко представлены 8,9,10. Существуют обширные исследования повреждения легких после ишемии-реперфузии кишечника из-за транзиторной окклюзии верхней брыжеечной артерии (СМА)11,12,13. Продолжительность ишемии и реперфузии крайне варьирует, от минут до нескольких часов 14,15. Обоснование продолжительности ишемии заключается в том, чтобы вызвать достаточную агрессию, чтобы вызвать значительную реакцию, ведущую к возникновению отдаленных травм. Слишком короткая продолжительность ишемии может не привести к значительному изменению изучаемого метаболического пути. Что касается продолжительности реперфузии, то обоснование заключается в раннем начале отдаленных повреждений и потенциально преходящем характере патофизиологических изменений. Идеальная продолжительность реперфузии не должна быть слишком ранней или слишком поздней, чтобы адекватно охарактеризовать метаболические нарушения.

Модели в основном у грызунов. К преимуществам грызунов относятся их небольшие размеры, простота в уходе, короткий жизненный цикл и богатые генетические ресурсы16. Использование крупных животных, таких как свиньи, собаки или приматы, не кажется оправданным в отсутствие дополнительных преимуществ, что согласуется с этическими правилами экспериментов на животных в отношении утонченности. Кроме того, благодаря своему анатомическому, физиологическому и генетическому сходству с человеком, грызуны допускают трансляционныеисследования.

Одним из основных ограничений моделей зажима СМА является то, что в клинической практике начало периода ишемии кишечника не может быть определено. Это делает экстраполяцию на клинические ситуации человека более неопределенной. Напротив, при сложной хирургии аорты четко идентифицируются периоды ишемии и реперфузии различных органов. Более того, при надцелиакическом пережатии аорты все нижележащие внутренние органы находятся в ишемическом периоде (пищеварительный тракт, печень, селезенка, почки, органы малого таза и нижние конечности). Все эти органы подвергаются феномену ишемии-реперфузии. И наоборот, менее изучены модели ишемии-реперфузии, сфокусированной на конкретном органе (кишечнике, почках, печени и т.д.), модели пережатия аорты и, следовательно, ишемии-реперфузии множественных органов с метаболической патофизиологией. Аналогичным образом, отдаленные травмы, такие как легочные поражения после пережатия аорты, плохо изучены с точки зрения метаболизма17,18.

Существующие модели пережатия аорты в первую очередь ориентированы на пережатие брюшной аорты ниже почечных артерий. Ограничением этой модели является то, что она не индуцирует висцеральную ишемию-реперфузию. Таким образом, это не позволяет продемонстрировать связь между висцеральной ишемией-реперфузией и потенциальными отдаленными повреждениями18,19. Кроме того, не существует модели in vitro, позволяющей изучать ишемию-реперфузию через пережатие аорты, поэтому анализ с использованием моделей in vivo остается необходимым.

Таким образом, эта экспериментальная модель надцелиакического пережатия аорты у крыс способствует всестороннему исследованию патофизиологических механизмов и фармакологических вмешательств, направленных на отдаленные повреждения легких.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Создание этой модели соответствует рекомендациям по уходу за животными и экспериментам, а также французскому и европейскому законодательству. Эта модель была проверена в экспериментальном исследовании на животных, которое было одобрено Региональным комитетом по этике университета в Нормандии, Руан, Франция (номер APAFIS: #18974).

1. Животная модель и акклиматизация

  1. Адаптационный период на животных моделях
    ПРИМЕЧАНИЕ: Модель придерживается принципов доработки.
    1. Размещение животных в непереполненных помещениях в течение одной недели, чтобы дать им адаптацию перед операцией.
    2. Содержать по две крысы в клетке с ограниченным доступом к воде и пище, которые будут ежедневно проверяться опытным персоналом.
    3. Ежедневно проверяйте чистоту постельных принадлежностей (бумажных полосок) и систематически меняйте их опытным персоналом два раза в неделю или чаще, если это необходимо.
    4. После недельного периода акклиматизации, в течение которого они будут иметь ежедневный контакт с экспериментатором и подвергаться воздействию 12-часовых циклов освещения, процедуры будут проходить в отдельной, тихой комнате с тем же экспериментатором.
  2. Животные модельные виды
    1. Используйте самцов крыс Wistar или Sprague Dawley, чтобы избежать гормонального воздействия, такого как эстрадиол, при анализе висцеральной ишемии-реперфузионной физиопатологии из аккредитованного и сертифицированного племенного центра11,20.
    2. Заранее определите экспериментальные группы и количество животных в группе.
    3. Выбирайте возраст, рекомендуется к применению 6-10-недельные крысы (350 г).

2. Анестезия и анальгезия

  1. Обезболивание
    1. Взвесьте каждое животное в день проведения процедуры.
    2. Бупренорфин (0,05 мг/кг) вводят подкожно на уровне кожи спины крысы за 1 ч до процедуры с обезболивающими целями иглой 25-G и шприцем 2 мл.
    3. Нанести гель Лидокаина гидрохлорида 1% на кожу живота на уровне будущего разреза кожи. Регулярно (не реже двух раз в день) повторно оценивайте боль после операции с использованием шкалы для оценки выражения боли на лице у крысы21.
    4. Применять в течение первых 24 ч систематически подкожно вводить бупренорфин (от 0,01 до 0,05 мг/кг) каждые 8 ч.
    5. Затем вводят инъекции бупренорфина (от 0,01 до 0,05 мг/кг) на основе шкалы боли в лице Национального центра замены, совершенствования и сокращения численности животных в исследованиях и повторяют каждые 8 ч при необходимости21.
  2. Общая анестезия
    1. Используйте галогенированные газы (изофлуран) для общей анестезии22.
    2. Используйте вентилируемую камеру с изофлураном (5 %) со скоростью потока воздуха 2 л/мин в течение 2 мин для фазы индукции.
    3. Для поддержания анестезии переложите крысу на специально подобранную маску для спонтанной вентиляции с изофлураном (2-2,5%) со скоростью воздушного потока 2 л/мин на протяжении всей операции.
    4. Очистите верхние дыхательные пути, выведя язык из полости рта, чтобы обеспечить вентиляцию через маску.
    5. Постоянно контролируйте глубину анестезии во время процедуры и при необходимости корректируйте концентрацию изофлурана.

3. Размещение крысы во время процедуры

  1. Поместите крысу в положение лежа на спине, обездвижив передние и задние конечности с помощью клейкой ленты, соблюдая при этом физиологический диапазон движений суставов крысы.
  2. Поместите крысу на грелку, установленную при температуре 37 °С, с контролем ректальной температуры.
  3. Защитите глаза, нанеся дакриогель. Сбрейте шерсть на животе и тщательно продезинфицируйте живот раствором повидон-йода.

4. Хирургическое вмешательство

  1. Состояние хирургического вмешательства
    1. Выполняйте процедуру под микрохирургической лупой, чтобы облегчить тонкие маневры, хотя она и не является незаменимой.
  2. Надрез
    1. После пальпации мечевидного отростка на верхней границе разреза разрежьте кожу в центре живота, обнажив белую линию мышц живота.
    2. Центральный разрез мышцы живота по белой линии во избежание кровотечения из мышц живота.
  3. Внутрибрюшная экспозиция
    1. Поддерживайте брюшную стенку с обеих сторон с помощью самоудерживающихся ретракторов.
    2. Убедиться в отсутствии аномалий (опухолей), мобилизовать внутренние органы, желудок, селезенку, печень к правой стороне брюшной полости, а затем обнажить надцелиакную аорту.
    3. Удерживают все внутренности внутри живота как можно дольше с помощью небольшого компресса, сложенного вдоль и смоченного в теплом (37 °С) солевом растворе.
    4. Накройте все внутренности компрессом, смоченным в солевом растворе, подогретом до 37 °C, для предотвращения переохлаждения и обезвоживания.
  4. Идентификация крупных внутрибрюшных сосудов
    1. Определите надчревную аорту по ее пульсациям и расположению между диафрагмальными столбами.
    2. Контроль аорты между диафрагмальными стойками с помощью мягкого и осторожного рассечения с помощью аппликаторов с ватными наконечниками и рассекающих щипцов для максимально атравматичного освобождения аорты.
    3. Обвяжите надчревную аорту с помощью монофиламентного шва 5-0 с рассекающим и лигатурным щипцами.
    4. Проверьте происхождение чревного ствола и нижележащей брыжеечной артерии. Продолжительность этой хирургической процедуры составляет от 10 до 15 минут на крысу.
    5. Основная идентификация субпочечной нижней полой вены легко проводится благодаря прозрачности забрюшинного пространства.
    6. Выпускают субпочечную нижнюю полую вену только на ее переднюю поверхность, что позволяет проводить прямое внутривенное введение любого фармакологического средства.
  5. Внутривенная инъекция
    1. Для этого используйте иглу 30-G для инъекции, и поместите несколько миллиметров гемостатического компресса для достижения гемостаза.
    2. При выполнении фармакологической предварительной подготовки введите инъекцию перед пережатием аорты. Для лечения после кондиционирования вводите его во время или после пережатия аорты.
    3. В этом протоколе изучалось фармакологическое прекондиционирование, поэтому вводите за 5 минут до пережатия аорты.
  6. Ишемический период
    1. Зажать чревную аорту атравматичным микрососудистым зажимом на весь 40-минутный ишемический период. Проверьте эффективность зажима по исчезновению основных пульсаций аорты и многократному обесцвечиванию внутренних органов и конечностей во время пережатия.
    2. Частично закройте живот тремя простыми плетеными рассасывающимися швами 5-0, чтобы ограничить потерю воды и тепла. Накройте хирургический разрез стерильным компрессом, смоченным в теплом физрастворе, на все время ишемии.
  7. Период реперфузии
    1. В конце ишемического периода вновь откройте брюшную полость и обнажите аорту таким же образом, как описано ранее.
    2. Снимите сосудистый зажим и проверьте возобновление основной пульсации аорты и изменение цвета внутренних органов и конечностей. Период реперфузии начинается сразу после снятия микрозажима.
  8. Закрытие брюшной полости
    1. Верните внутренности в исходное положение и закройте брюшную полость оплеточным рассасывающимся швом 5-0 на белой линии, а кожу - рассасывающимся швом из мононити 5-0.
  9. Пробуждение животных
    1. Поместите крысу в левостороннее положение пролежня, чтобы избежать сдавливания нижней полой вены висцеральной массой и контекстом гиповолемии. Поместите крысу в индивидуальную клетку с тепловой лампой, чтобы поддерживать температуру до пробуждения, примерно через 10 минут.
  10. Вторая общая анестезия
    1. По окончании 180-минутного периода реперфузии провести анестезию крысы с использованием той же газовой анестезии через вентилируемую камеру с изофлураном (5%) со скоростью потока воздуха 2 л/мин в течение 2 минут для фазы индукции.
    2. Для поддержания анестезии переложите крысу на специально подобранную маску для спонтанной вентиляции с изофлураном (2-2,5%) со скоростью потока воздуха 2 л/мин в течение всего периода сбора тканей.

5. Отбор проб

  1. Образцы крови
    1. Соберите образцы крови с помощью иглы 23-G и шприца объемом 5 мл путем прямого прокола в нижнюю полую вену ниже почечных вен.
    2. Добейтесь гемостаза после пункции, наложив небольшой кусочек кровоостанавливающего компресса.
    3. Используйте небольшую порцию (100 мкл) от общего объема крови для анализа газов и стандартного анализа крови на одной тестовой карте при комнатной температуре.
    4. Соберите оставшуюся цельную кровь в пробирку ЭДТА объемом 4 мл и центрифугируйте при 1000 × г в течение 10 минут при температуре +4 °C.
    5. Замораживают плазму в криопробирках в жидком азоте и хранят при температуре -80 °C до проведения анализа.
  2. Образцы тканей
    1. Забор образцов тканей
      1. Соберите образцы тканей (легких, кишечника, почек, печени и сердца) во время эвтаназии животного. Провести эвтаназию путем забора крови с последующим обескровливанием после общей анестезии изофлураном по тому же протоколу, о котором говорилось ранее.
      2. Через открытую брюшную полость соберите по 50 мг каждой ткани: верхнего полюса левой почки, левой печеночной доли и дистального отдела тонкой кишки за 1 см до слепой кишки.
      3. Затем быстро выполните срединную стернотомию, чтобы определить сердце и легкие.
      4. Освободите левое легкое от связки и полностью удалите его для гистологического анализа. Освободите правое многодольное легкое от связок. Отделите переднюю долю для анализа нуклеиновых кислот и белков, остальное храните в чашке с физиологической сывороткой при температуре 37 °C в течение нескольких минут для последующего выполнения гравиметрии.
      5. Извлекают сердце целым блоком с участками аорты, легочной артерии и обеих полых вен. Возьмите образец кусочка левого желудочка для анализа нуклеиновых кислот и белков, оставшуюся часть храните в чашке с физиологической сывороткой при температуре 37 °C в течение нескольких минут для последующего выполнения гравиметрии.
    2. Анализ нуклеиновых кислот
      1. Для анализа нуклеиновых кислот соберите сразу 50 г порции ткани. Заморозьте его в жидком азоте, а затем храните при температуре -80 °C до анализа.
      2. Извлеките общую РНК с помощью готового к применению реагента для выделения высококачественной общей РНК в соответствии с протоколом производителя.
      3. Определите концентрацию и чистоту РНК с помощью спектрофотометра. Измерьте концентрацию РНК с использованием 2 мкл образца с 2 мкл воды, не содержащей РНКазы, в качестве пустого образца. Используйте абсорбцию на длине волны 260 нм для определения концентрации РНК.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Приемлемая чистота РНК была определена как отношение поглощения 260/280 и 260/230 в диапазоне от 1,7 до 2,0.
      4. Используйте 1 г каждого образца РНК для обратной транскрипции.
      5. Измерьте уровни мРНК провоспалительных цитокинов (IL-1beta, TNF-alpha, IL-6) и внутреннего эталона (бета2-микроглобулина) с помощью полимеразной цепной реакции в реальном времени (ОТ-ПЦР) в быстром термоблок-амплификаторе на основе планшетов со встроенными возможностями онлайн-детектирования в режиме реального времени с использованием готовой к использованию реакционной смеси горячего запуска (праймеры перечислены в таблице 1).
      6. Рассчитайте относительный уровень мРНК методом 2-ΔΔCT.
    3. Анализ белка
      1. Для анализа белка поместите 50 мг ткани в лизирующую трубку объемом 2 мл, содержащую пятьдесят керамических шариков оксида циркония диаметром 2,8 мм. Эта лизирующая трубка содержит 1 мл буфера для лизиса радиоиммунопреципитационного анализа (RIPA) с таблеткой ингибитора протеазы и таблеткой ингибитора фосфатазы.
      2. Извлечь белок из образцов путем гомогенизации на лабораторной трубной мельнице с 3 повторениями 5-секундной проверки с последующим 10-секундным периодом покоя.
      3. Образцы центрифугируют при 10 000 г при +4 °C в течение 10 мин и хранят надосадочную жидкость в криопробирках при температуре -20 °C до анализа.
      4. Определите концентрацию белка с помощью метода Брэдфорда и держите образцы при температуре −80 °C.
      5. Отделите равное количество белков от каждого образца с помощью SDS-PAGE.
      6. Перенос разделенных белков на нитроцеллюлозные мембраны размером 0,2 мкм.
      7. После блокировки мембрану с 5% обезжиренным сухим молоком TBS-Tween в течение 1 ч с первичным антителом против конкретного белка по выбору. Например, для изучения гепараназы используйте кроличье поликлональное первичное антитело против гепараназы человека (разведение 1:2000) и контрольный белок в качестве GAPDH, используйте козье моноклональное первичное антитело против GAPDH (разведение 1:5000) в течение ночи при 4 °C.
      8. Промойте кляксы три раза с помощью TBST-Tween 0,1% буфера.
      9. Инкубировать с HRP-конъюгированным вторичным антителом, направленным против первичного антитела, при комнатной температуре (ОТ) в течение 1 ч в блокирующем растворе. Например, для изучения гепараназы используйте вторичное антитело козы против кролика (разведение 1:5000), а для изучения GAPDH используйте вторичное антитело кролика против козы (разведение 1:10000).
      10. Детектируйте иммунные комплексы с помощью усиленной системы обнаружения хемилюминесценции (ECL).
      11. Анализируйте мембраны с помощью специального программного обеспечения для определения денситометрических значений целевых полос, используя GAPDH в качестве внутреннего контроля. Проведите денситометрический анализ полосы, соответствующей гепараназе (50 кДа), и нормализуйте ее до полосы белка GAPDH (35 кДа) для определения относительной интенсивности сигнала.
    4. Гистологический анализ
      1. Для гистологического анализа берут левое унилобарное легкое в области ворот, затем вводят через левый главный бронх раствор для криоконсервации с помощью катетера 16 G. Заморозьте его в жидком азоте и храните при температуре -80 °C.
    5. Гравиметрический анализ
      1. После анализа образцов нуклеиновых кислот и белков проанализируйте оставшуюся часть сердца и правое многодольковое легкого с помощью гравиметрии с высыханием в печах при 70°C, что позволяет оценить соотношение влажного и сухого веса для оценки отека тканей.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Этот протокол был признан безопасным, с минимальными потерями животных (менее 5%) во время анестезии и хирургического вмешательства, а также эффективным для индукции острого повреждения легких. Анестезия изофлураном была безопаснее, чем кетамин в сочетании с ксилазиновой анестезией (потеря примерно 15%), с быстрым пробуждением и лучшим восстановлением крыс (данные не показаны). Все животные, находящиеся под наркозом, смогли пройти безопасное и эффективное пережатие аорты с помощью этого метода. Все животные (100%) с эффе...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Преимущество этой хирургической модели пережатия аорты заключается в том, что она позволяет проводить всесторонний анализ, как тканевый, так и плазменный, острого повреждения легких после висцеральной ишемии-реперфузии. Он также дает возможность тестировать фармакологические молекулы при внутрибрюшинном, энтеральном или внутривенном введении до или после кондиционирования.

Одним из критических этапов остается пережатие наднадглазной аорты во время операции. Ко...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,2 & микро; m нитроцеллюлозные мембраны Trans-Blot Turbo Transfert PackБио-Рад16201500,2 & микро; m нитроцеллюлозные мембраны предварительно нарезанные
Шприц 1cc Luer Slip без иглыТерумоMDSS01SEШприц 1cc Luer Slip без иглы
Шприц 2cc Luer Slip без иглыБектон ДинкинсонШприц 2cc Luer Slip без иглы
4 мл пробирка EDTA BD K3 13 мм x75 ммBD VacutainerBD3688605 мл пробирка EDTA BD K3 13 мм x 75 мм
5-0 плетеный шов / Викрил 5-0 (Этикон) или Новосин (Б. Браун)Ethicon - Джонсон и ДжонсонВ7970ЕVicryl 5-0 Игла Конус 1/2 круга 13 мм Длина 45 см
5-0 монофиламент рассасывающийся шовный материал / Monocryil PoliglecaproneEthicon - Джонсон и ДжонсонY493GИгла 3/8 круга длиной 18 дюймов
5cc Шприц Luer Slip без иглыТерумоСС-05ЛЭ15cc Шприц Luer Slip без иглы
Атравматичный микрососудистый зажим/Одноразовые сосудистые зажимы для венAROSurgicalТКФ-1-20гАтравматичный микрососудистый зажим для использования в вене с целью пережатия аорты крысы
BD Microlance 3 23 G x 1 0,6 x 25 ммBD Vacutainer300800BD Microlance 3 23 G x 1 0,6 x 25 мм
BD Microlance 3 25 G x 5/8 0,5 x 16 ммBD Vacutainer300600BD Microlance 3 25 G x 5/8 0,5 x 16 мм
BD Microlance 3 30 G x 1/2 0,3 x 13 ммBD Vacutainer304000BD Microlance 3 30 G x 1/2 0,3 x 13 мм
бета-актин ИнвитрогенКарлсбад, США15Г5А11/Э2
Метод анализа белка на основе метода БрэдфордаBiorad, Марн-ла-Кокет, Франция5000201
БупренорфинБупренорфин
Центрифугатор Сигма 3-30Sigma, Германия10375, 10376, 10377, 10378, 10379, 91276, 109014Центрифугатор для eppendorf
cOmplete MiniРош11836153001Коктейль ингибиторов протеазы 25 таблеток
Ватный тампон
Дакриогель /  Глазной гель Lubrithal 10 гВетеринарные препараты DechraКод  ACL7376464Глазной гель Lubrithal 10 г
Одноразовый скальпельПервостепенныйПДСС11Одноразовое лезвие скальпеля n° 11
ЭлектрокаутеризацияВмятинаRMedEMB/87400Шприц-ручка гемостатическая с высокой температурой
Усовершенствованная система обнаружения ECLBiorad, Геркулес, Калифорния, США1705060С
Бисерная мельница Fisherbrand 24Научный Фишер15515799Используется для  измельчение, лизис и гомогенизация биологических образцов перед молекулярной экстракцией
Марлевые тампоны Раффин.010106Марлевые тампоны 
Программное обеспечение ImageLabTMБиорадна USB-накопителе или лицензии
Изофлуран 5%Изофлуран 5%
Лидокаин Прилокаин гель 5% Aguettant, Лион, ФранцияЛидокаин Прилокаин гель 5% 
Прибор LightCycler 480Roche, Bâ le, швейцарский5015243001Термоамплификатор
Желе смазывающее стерильное K-Y 82 гРЕКИТТ БЕНКИЗЕРЖеле смазывающее стерильное K-Y 82 г
НаноДроп 2000TermoScientific, Уолтем, Массачусетс, СШАНД-2000спектрофотометр
Анатомический пенси ПехаГартман991063Анатомические плоскогубцы
ФосСТОПРош4906837001ингибитор фосфатазы 20 таблеток;
Штукатурка/клейкая лентаАнапоре135320Хирургическая клейкая лента/пластырь
Повион-йод раствор / Vé té Решение dineVé тохинолАнтисептический раствор для наружного применения
Набор для лизинга Precellys Tube Гомогенизация твердых тканей CK28, BertinСК28Набор для лизинга Precellys Tube 
Prolè Пролипропиленовый шовный материалEthicon - Джонсон и Джонсон7472HProlè ne 5-0 Игла Конус 3/8 круга 13 мм Длина 75 см
Пробирки Safe-Lock 1,5 млЭппендорф.0030120086Safe-Lock пробирки 1,5cc без цвета 1000 пробирок для центрифугирования
Пробирки Safe-Lock 2 млЭппендорф.0030120094Safe-Lock пробирки 2,0 куб. см без цвета 1000 пробирок для центрифугирования
Пробирки с безопасным замком 5 млЭппендорф.0030119401Safe-Lock пробирки 5,0 куб. см без цвета 200 пробирок для центрифугирования
Солевой раствор NaCl 0,9%Aguettant, Лион, Франция600502Солевой раствор 0,9% 500 мл
SDS-СТРАНИЦАСигма-Альрих
Катетер Surflash IV 16 гТерумоСР*FF1651
ХирургEthicon - Джонсон и ДжонсонГемостатические резорбируемые тампоны
Набор швов n° 12Гартман4701762Набор для швов стерильный с адгезиновым чемпионом, цизорами, плоскогубцами Адсона, иглодержателем
SYBR Green KIT Легкий амплификатор 480 SYBR Green I MasternРош4707516001SYBR Зеленый
TBST-Tween 0,1% буфер Сигма-Альрих
Тестовые карты Epoc 24 карты 13 параметровSiemens-Healthineers
Салфетка TEKСакура ФинетекРешение для криоконсервации 
Реагент Тризол ИнвитрогенThermo Fisher Scientific, Карлсбад, Калифорния, США15596026Реагент ТРИзол

Ссылки

  1. Johnston, K. W., Rutherford, R. B., Tilson, M. D., Shah, D. M., Hollier, L., Stanley, J. C. Suggested standards for reporting on arterial aneurysms. Subcommittee on Reporting Standards for Arterial Aneurysms, Ad Hoc Committee on Reporting Standards, Society for Vascular Surgery and North American Chapter, International Society for Cardiovascular Surgery. J Vasc Surg. 13 (3), discussion 245-247 452-458 (1991).
  2. Johansen, K., Kohler, T. R., Nicholls, S. C., Zierler, R. E., Clowes, A. W., Kazmers, A. Ruptured abdominal aortic aneurysm: the Harborview experience. J Vasc Surg. 13 (2), 245-247 (1991).
  3. Cambria, R. P., Clouse, W. D., Davison, J. K., Dunn, P. F., Corey, M., Dorer, D. Thoracoabdominal aneurysm repair: Results with 337 operations performed over a 15-year interval. Ann Surgery. 236 (4), 471-479 (2002).
  4. Feezor, R. J., et al. Genomic and proteomic determinants of outcome in patients undergoing thoracoabdominal aortic aneurysm repair. J Immunol. 172 (11), 7103-7109 (2004).
  5. Welborn, M. B., et al. The relationship between visceral ischemia, proinflammatory cytokines, and organ injury in patients undergoing thoracoabdominal aortic aneurysm repair. Crit Care Med. 28 (9), 3191-3197 (2000).
  6. Money, S. R., et al. Risk of respiratory failure after repair of thoracoabdominal aortic aneurysms. Am J Surg. 168 (2), 152-155 (1994).
  7. Collange, O., et al. Compartmentalization of inflammatory response following gut ischemia reperfusion. Eur J Vasc Endovasc Surg. 49 (1), 60-65 (2015).
  8. Shi, Y., Han, L., Zhang, X., Xie, L., Pan, P., Chen, F. Selenium alleviates cerebral ischemia/reperfusion injury by regulating oxidative stress, mitochondrial fusion and ferroptosis. Neurochem Res. 47 (10), 2992-3002 (2022).
  9. Wang, Q., et al. Empagliflozin protects against renal ischemia/reperfusion injury in mice. Sci Rep. 12 (1), 19323(2022).
  10. Wu, M. -B., Ma, B., Zhang, T. -X., Zhao, K., Cui, S. -M., He, S. -C. Propofol improves intestinal ischemia-reperfusion injury in rats through NF-κB pathway. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 24 (11), 6463-6469 (2020).
  11. Breithaupt-Faloppa, A. C., et al. Acute effects of estradiol on lung inflammation due to intestinal ischemic insult in male rats. Shock. 41 (3), 208-213 (2014).
  12. Klausner, J. M., et al. Thromboxane A2 mediates increased pulmonary microvascular permeability following limb ischemia. Circ Res. 64 (6), 1178-1189 (1989).
  13. James, I. A. O., Chen, C. -L., Huang, G., Zhang, H. -Y., Velten, M., Besner, G. E. HB-EGF protects the lungs after intestinal ischemia/reperfusion injury. J Surg Res. 163 (1), 86-95 (2010).
  14. Kannan, K. B., et al. Hypoxia-inducible factor plays a gut-injurious role in intestinal ischemia reperfusion injury. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 300 (5), G853-G861 (2011).
  15. Li, Y., et al. Enteral supplementation of alanyl-glutamine attenuates the up-regulation of beta-defensin-2 protein in lung injury induced by intestinal ischemia reperfusion in rats. Int J Surg. 12 (11), 1181-1186 (2014).
  16. Bryda, E. C. The mighty mouse: the impact of rodents on advances in biomedical research. Mo Med. 110 (3), 207-211 (2013).
  17. Palmier, M., et al. A supraceliac aortic cross clamping model to explore remote lung injury and the endothelial glycocalyx. Ann Vasc Surg. 93, 18-28 (2022).
  18. Ak, E., Ak, K., Ustandag, U. V., Kervancioglu-Demirci, E., Emekli-Alturfan, E., Çetinel, S. Milrinone attenuates heart and lung remote injury after abdominal aortic cross-clamping. Ann Vasc Surg. 69, 391-399 (2020).
  19. Kurt, A., Kalkan, Y., Turut, H., Cure, M. C., Tumkaya, L., Cure, E. Topiramate reduces aortic cross-clamping-induced lung injury in male rats. Acta Medica (Hradec Kralove). 61 (4), 144-149 (2018).
  20. Fantozzi, E. T., et al. Estradiol mediates the long-lasting lung inflammation induced by intestinal ischemia and reperfusion. J Surg Res. 221, 1-7 (2018).
  21. Sotocina, S. G., et al. The Rat Grimace Scale: A partially automated method for quantifying pain in the laboratory rat via facial expressions. Mol Pain. 7, 55(2011).
  22. Oh, S. S., Narver, H. L. Mouse and rat anesthesia and analgesia. Curr Protoc. 4 (2), e995(2024).
  23. Annecke, T., et al. Sevoflurane preserves the endothelial glycocalyx against ischaemia-reperfusion injury. Brit J Anaesth. 104 (4), 414-421 (2010).
  24. Pararajasingam, R., Weight, S. C., Bell, P. R. F., Nicholson, M. L., Sayers, R. D. Pulmonary nitric oxide metabolism following infrarenal aortic cross-clamp-induced ischaemia-reperfusion injury. Eur J Vasc Endovasc Surg. 19 (1), 47-51 (2000).
  25. Nielsen, V. G., Baird, M. S., McAdams, M. L., Freeman, B. A. Desflurane increases pulmonary alveolar-capillary membrane permeability after aortic occlusion-reperfusion in rabbits: evidence of oxidant-mediated lung injury. Anesthesiology. 88 (6), 1524-1534 (1998).
  26. Axon, R. N., Baird, M. S., Lang, J. D., Brix, A. E., Nielsen, V. G. PentaLyte decreases lung injury after aortic occlusion-reperfusion. Am J Respir Crit Care Med. 157 (6), 1982-1990 (1998).
  27. Fujimura, N., et al. Neutrophil elastase inhibitor improves survival rate after ischemia reperfusion injury caused by supravisceral aortic clamping in rats. J Surg Res. 180 (1), e31-e36 (2013).
  28. Spanos, K., et al. Transition from open repair to endovascular aneurysm repair for rupture aortic aneurysms throughout a 16-year period of time in a single tertiary center. Ann Vasc Surg. 100, 120-127 (2024).
  29. Hansen, L. W., et al. Sirtuin1 activator SRT1720 protects against organ injury induced by intestinal ischemia-reperfusion. Shock. 45 (4), 359-366 (2016).
  30. Thais Fantozzi, E., et al. Acute lung injury induced by intestinal ischemia and reperfusion is altered in obese female mice. Pulm Pharmacol Ther. 49, 54-59 (2018).
  31. Matute-Bello, G., et al. An official American Thoracic Society Workshop report: Features and measurements of experimental acute lung injury in animals. Am J Respir Cell Mol Biol. 44 (5), 725-738 (2011).
  32. Michel, J. -B., et al. Novel aspects of the pathogenesis of aneurysms of the abdominal aorta in humans. Cardiovasc Res. 90 (1), 18-27 (2011).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Хирургическая модель на крысахсупрацелиакальный отдел аортывоспаление легкиханализ газов кровигистология легкихотек легкихнейтрофильная инфильтрация
Модель острого повреждения легких после висцеральной ишемии-реперфузии путем пережатия надцелиакической аорты у крыс
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.