Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Выяснение #946;-1,3-глюканаза и пероксидаза физико-химических свойств защитного механизма клеточной стенки пшеницы против заражения Diuraphis noxia

1.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/66903

⸱

26 июля 2024 г.

 ,  ,  , 
1Carbohydrates and Enzymology Laboratory (CHEM-LAB), Department of Plant Sciences, University of the Free State, 2Faculty of Natural and Agricultural Sciences, Department of Plant Science, Botany, Plant Biochemistry and Physiology, University of the Free State, 3Agricultural Research Council - Small Grain Institute

В этой статье

Краткое содержание

В настоящем протоколе описаны процедуры, используемые для изучения и характеристики ферментов, связанных с клеточной стенкой, главным образом β-1,3-глюканазы и пероксидазы, в растениях пшеницы. Уровень их активности увеличивается во время взаимодействия пшеницы и RWA и участвует в защитной реакции растений через укрепление клеточной стенки, что препятствует питанию тлей.

Аннотация

Растения пшеницы, зараженные российской пшеничной тлей (RWA), вызывают каскад защитных реакций, включая гиперчувствительные реакции (HR) и индукцию белков, связанных с патогенезом (PR), таких как β-1,3-глюканаза и пероксидаза (POD). Целью данного исследования является характеристика физико-химических свойств ассоциированных с клеточной стенкой POD и β-1,3-глюканазы и определение их синергизма на модификацию клеточной стенки при взаимодействии RWASA2-пшеницы. Восприимчивые сорта Tugela, умеренно устойчивые Tugela-Dn1 и устойчивые Tugela-Dn5 были предварительно проращены и высажены в тепличных условиях, удобрены через 14 дней после посадки и орошены каждые 3 дня. Растения были заражены 20 партеногенетическими особями того же клона RWASA2 на стадии 3 листьев, а листья были собраны через 1-14 дней после заражения. Межклеточную промывочную жидкость (IWF) экстрагировали с помощью вакуумной фильтрации и хранили при температуре -20 °C. Остатки листьев измельчали в порошок и использовали в качестве компонентов клеточной стенки. Активность и характеристика POD определяли с использованием субстрата гваякола 5 мМ и H2O2, отслеживая изменение абсорбции при длине волны 470 нм. Активность β-1,3-глюканазы, рН и оптимальные температурные условия были продемонстрированы путем измерения общего редуцирующих сахаров в гидролизате реагентом DNS с использованием субстратов β-1,3-глюкана и β-1,3-1,4-глюкана, измерения абсорбции при 540 нм и использования стандартной кривой глюкозы. Оптимум pH определяли в диапазоне от pH 4 до 9, температурный оптимум от 25 до 50 °C и термостабильность в диапазоне от 30 °C до 70 °C. Специфичность субстрата β-1,3-глюканазы определяли при 25 °C и 40 °C с использованием субстратов из творожного и ячменного β-1,3-1,4-глюкана. Кроме того, определяли механизм действия β-1,3-глюканазы с помощью ламинарибиозы к ламинарипентаозе. Картины продуктов гидролиза олигосахаридов были качественно проанализированы с помощью тонкослойной хроматографии (ТСХ) и количественно проанализированы с помощью ВЭЖХ. Метод, представленный в данном исследовании, демонстрирует надежный подход к заражению пшеницы RWA, экстракцию пероксидазы и β-1,3-глюканазы из области клеточной стенки и их всестороннюю биохимическую характеристику.

Введение

Российская пшеничная тля (RWA) поражает пшеницу и ячмень, вызывая значительные потери урожая или снижение качества зерна. Пшеница реагирует на заражение, вызывая несколько защитных реакций, включая повышение уровня активности β-1,3-глюканазы и пероксидазы у устойчивых сортов, в то время как восприимчивые сорта снижают активность этих ферментов в ранний период заражения 1,2,3,4. Ключевыми функциями β-1,3-глюканазы и POD в растении пшеницы являлись регулирование накопления каллозы в устойчивых сортах и гашение активных форм кислорода (АФК) в клеточной стенке и апопластических областях при заражении RWA 1,3,5,6,7. Mafa et al.6 продемонстрировали, что существует сильная корреляция между повышенной активностью POD и повышенным содержанием лигнина в устойчивом сорте пшеницы при заражении RWASA2. Кроме того, повышенное содержание лигнина указывало на то, что клеточная стенка зараженного устойчивого сорта пшеницы была усилена, что привело к снижению питания RWA.

Большинство исследовательских групп экстрагировали и изучали апопластическую β-1,3-глюканазу и POD во время взаимодействия пшеницы/ячменя и RWA; Кроме того, в большинстве этих исследований утверждалось, что эти ферменты влияют на клеточную стенку растения пшеницы, зараженного RWA, без измерения присутствия фермента в области клеточной стенки. Только в нескольких исследованиях использовались микроскопические методы, чтобы показать, что уровни активности β-1,3-глюканазы были связаны с регуляцией каллозы 7,8,9, или экстрагировались основные компоненты клеточной стенки, чтобы продемонстрировать корреляцию между активностью POD и модификацией клеточной стенки у резистентных 6,10. Отсутствие зондирования связи β-1,3-глюканазы и POD с клеточной стенкой указывает на необходимость разработки методов, позволяющих исследователям измерять непосредственно ферменты, связанные с клеточной стенкой.

Современный метод предполагает, что перед экстракцией ферментов, связанных с клеточной стенкой, необходимо удалить апопластическую жидкость из ткани листа. Процедура экстракции апопластической жидкости должна быть выполнена дважды из ткани листа, которая используется для извлечения ферментов, связанных с клеточной стенкой. Этот процесс уменьшает загрязнение и путаницу апопластических ферментов с ферментами, обнаруженными в областях клеточной стенки. Таким образом, в данном исследовании мы экстрагировали связанный с клеточной стенкой POD, β-1,3-глюканазу и MLG-специфичную β-глюканазу и выполнили их биохимическую характеристику.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Исследование проводилось с одобрения и разрешения Комитета по этике исследований в области окружающей среды и биобезопасности Университета Фри-Стейт (UFS-ESD2022/0131/22). Подробная информация о реагентах и оборудовании здесь указана в Таблице материалов.

1. Условия роста растений

  1. Прорастите по 250 семян каждого сорта пшеницы, т.е. восприимчивой Tugela, умеренно устойчивой Tugela-Dn1 и устойчивой Tugela-Dn5, в отдельных чашках Петри.
  2. Добавьте 5 мл дистиллированной воды в каждую чашку Петри, запечатайте парафиновой пленкой и выдерживайте в камере для проращивания при температуре 25 °C в течение 2 дней.
  3. Пересадите пророщенные семена каждого сорта в горшки 15 см с почвой 1:1 и торфяным мхом (15 растений в горшке) в контролируемых тепличных условиях.
  4. Установите температурные режимы на уровне 18 °C и 24 °C днем и ночью соответственно.
  5. Орошайте растения каждые 3 дня водопроводной водой и снабжайте их 2 г/л удобрениями через 14 дней после появления всходов.
  6. Поместите растения в клетки, заключенные в сетки, и дайте им вырасти до стадии третьего листа 2,6 (с четырьмя биологическими репликами каждого сорта).

2. Зараженность сортов пшеницы препаратом RWASA2

  1. Заражайте сорта пшеницы Tugela, Tugela-Dn1 и Tugela-Dn5 RWASA2 по данным Jimoh et al.11 и Mohase and Taiwe12.
  2. Держите растения в двух отдельных наборах в клетках; Засейте один набор 20 партеногенетическими особями одного и того же клона RWASA2 на растение в каждом горшке в камерах роста, накрытых сетками. Еще один набор растений пшеницы держите в отдельном помещении под камерой выращивания с чистыми сетками и обращайтесь с ними как с контрольными.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Храните две обработки в разных комнатах и накрывайте растения клетками, заключенными в сетки. Кроме того, в случае, когда в исследовании используются два разных биотипа RWA, держите растения, зараженные одним биотипом RWA, от тех, которые заражены вторым биотипом, насколько это возможно, или в отдельных помещениях под камерами выращивания, накрытыми сетками, чтобы избежать любого возможного перекрестного заражения RWASA2.
  3. Для сбора урожая выберите второй и третий листы в два разных временных режима: краткосрочный период подкормки (1, 2 и 3 дня) и длительный период подкормки (7 и 14 дней), и заверните их во влажные бумажные полотенца.
  4. Немедленно переложите собранные листья в коробку со льдом, чтобы уменьшить метаболизм листьев перед экстракцией межклеточной промывочной жидкости (IWF).

3. Экстракция межклеточной промывочной жидкости (IWF) из апопласта

  1. Разрежьте собранные листья примерно трех сортов пшеницы на кусочки по 7 см.
  2. Дважды промойте кусочки листьев в дистиллированной воде, чтобы удалить цитозольное загрязнение с обрезанных концов 6,13.
  3. Поместите кусочки листьев в толстостенную стеклянную трубку и погрузите образцы в экстракционный буфер (50 мМ Tris-HCl, pH 7,8).
  4. Примените вакуумную инфильтрацию в течение 5 минут с помощью водоструйного насоса, чтобы пропитать листья экстракционным буфером.
  5. После этого извлеките кусочки листьев из стеклянной трубки и промокните их насухо бумажным полотенцем.
  6. Поместите высушенные кусочки листьев вертикально в предварительно охлажденные центрифужные пробирки с перфорированными дисками и центрифугируйте при температуре 500 x g в течение 10 минут при 4 °C.
  7. Используйте пипетку объемом 100 мкл для сбора надосадочной жидкости в предварительно охлажденные микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл.
  8. Повторите всю процедуру экстракции с тем же листовым материалом.
  9. Соедините собранную надосадочную жидкость и храните при температуре −20°С.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Аликвоты надосадочной жидкости рассматриваются как источник содержания апопластов или IWF. IWF не использовался в данном исследовании, но было важно удалить его из тканей листа до того, как мы извлекли связанные с клеточной стенкой β-1,3-глюканазу и пероксидазу (POD).

4. Экстракция клеточной стенки-ассоциированной β-1,3-глюканазы и POD

ПРИМЕЧАНИЕ: Остатки листьев, оставшиеся после экстракции IWF, были использованы для извлечения общего белка клеточной стенки.

  1. Остатки листьев измельчить в мелкий порошок с помощью жидкого азота с помощью ступки и пестика.
  2. Перенесите приблизительно 200 мг измельченной в порошок ткани листа в ступку, содержащую 4 мл экстракционного буфера (50 мМ фосфата натрия с 1% (масс./об.) поливинилполипирролидона (ПВПП); рН 5,0) с последующим растиранием пестиком до получения гладкой пасты, которую затем переложите в микроцентрифужные пробирки.
  3. Инкубируйте смесь в микроцентрифужных пробирках в течение 3 минут на льду, а затем центрифугируйте при 10 000 x g в течение 15 минут при 4 °C.
  4. Соберите надосадочную жидкость (экстракты общего белка) в микроцентрифужные пробирки (аликвоты по 2 мл) и используйте его в качестве источника β-1,3-глюканазы и POD в течение всего исследования.

5. Определение нормы белка

  1. Определяют общую концентрацию белка в экстрактах по методу Брэдфорда14.
  2. Для получения стандарта белка готовят растворы бычьего сывороточного альбумина (БСА) в концентрациях 0,0 мг/мл, 0,1 мг/мл, 0,2 мг/мл, 0,3 мг/мл, 0,4 мг/мл, 0,5 мг/мл, 0,6 мг/мл, 0,7 мг/мл, 0,8 мг/мл, 0,9 мг/мл и 1,0 мг/мл, растворенные в 50 мМ натрий-фосфатном буфере.
  3. Приготовьте стандарт, добавив по 10 мкл каждого раствора БСА в 96-луночный микропланшет с 190 мкл (0,25% v/v) реагента Брэдфорда (см. Таблицу материалов).
  4. Инкубируйте при 25 °C в течение 20 мин и измерьте абсорбцию при 595 нм с помощью считывателя микропланшетов и используйте значения абсорбции для подготовки стандартной кривой для количественной оценки концентрации белка.
  5. Количественное определение концентрации белка
    1. Добавьте 10 мкл экстрагированного фермента (этап 4) в 96-луночный микропланшет со 190 мкл (0,25% v/v) реагента Брэдфорда в трех экземплярах.
    2. Инкубировать при комнатной температуре (25 °C) в течение 20 минут.
    3. Измерьте поглощение на длине волны 595 нм с помощью спектрофотометра с микропланшетным ридером и используйте значения поглощения для определения концентрации белка с использованием BSA в качестве стандарта белка (приготовлено на шаге 5.4).

6. Приготовьте стандартную глюкозу для активности β-1,3-глюканазы

  1. Стандартные растворы готовят в концентрациях от 0,00 мг/мл до 1,0 мг/мл (0,0 мг/мл, 0,1 мг/мл, 0,2 мг/мл, 0,3 мг/мл, 0,4 мг/мл, 0,5 мг/мл, 0,6 мг/мл, 0,7 мг/мл, 0,8 мг/мл, 0,9 мг/мл, 1,0 мг/мл) с растворенной в дистиллированной воде глюкозой.
  2. Добавьте по 300 мкл каждого раствора глюкозы и 600 мкл реагента 3,5-динитросалициловой кислоты (DNS) в соотношении 1:2 в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл и инкубируйте реакции при 100 °C в течение 5 мин (см. Таблицу материалов для реагентов DNS) (Miller et al.15).
  3. Дайте смеси остыть при комнатной температуре перед измерением поглощения на длине волны 540 нм с помощью спектрофотометра.
  4. Используйте средние значения абсорбции для построения стандартной кривой для определения активности фермента β-1,3-глюканазы.

7. Определение активности β-1,3-глюканазы

Примечание: Ферментативная активность связанной с клеточной стенкой β-1,3-глюканазы, экстрагированной из Tugela, Tugela-Dn1 и Tugela-Dn5, определялась количеством высвобождаемых редуцирующих сахаров, высвобождаемых при гидролизе 0,5% (w/v) смешанных связанных β-1,3-1,4-глюкана (MLG) и 0,4% (w/v) β-1,3-глюкановых субстратов с использованием модифицированного метода, описанного Miller et al.15. Всегда держите трубочки с белковыми аликвотами на льду. Если образцы были заморожены, разморозьте их на льду и приступайте сразу после размораживания.

  1. Добавьте 200 мкл экстракта фермента (поддерживайте концентрацию белка в диапазоне от 20 мкг/мл до 90 мкг/мл во всех реакциях, если не указано иное) и 300 мкл субстрата, растворенного в 50 мМ буфере цитрата натрия (pH 5,0) в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Запустите реакцию параллельного бланка без ферментного экстракта для всех субстратов (первый бланк), и ферментный бланк будет состоять из ферментного экстракта без субстрата (второй бланк). Как субстрат, так и экстракт фермента были заменены буфером в первом и втором черных цветах соответственно.
  2. Инкубировать реакции при 37 °С в течение 24 ч и завершить реакцию нагреванием до 100 °С в течение 5 мин, затем центрифугировать при 10 000 х г в течение 10 мин при 4 °С.
  3. Смешать 300 мкл надосадочной жидкости с 600 мкл реагента DNS (соотношение 1:2) в новых микроцентрифужных пробирках объемом 1,5 мл и кипятить при 100 °C в течение 5 минут.
  4. Дайте раствору остыть до комнатной температуры и измерьте поглощение на длине волны 540 нм с помощью спектрофотометра.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если концентрация общих редуцирующих сахаров в смеси высока, это приведет к образованию темно-коричневого раствора, который трудно прочитать с помощью спектрофотометра. Поэтому перед считыванием абсорбции необходимо дальнейшее разбавление образцов.
  5. Используйте стандартную кривую глюкозы, разработанную на шаге 6.4 выше, для определения активности фермента в единицах СИ стандартной кривой.
  6. Чтобы преобразовать активность в определенную активность, выраженную в μмоль глюкозы/ч/мг белка, используйте уравнение ниже:
    Удельная активность = [(активность фермента/180,16)*1000]/время/концентрация белка
    ПРИМЕЧАНИЕ: Преобразуйте активность фермента в мг/мл в г/мл; 180,16 г/моль – молекулярная масса глюкозы, 1000 – фактор, превращающий М в микромоли, время – период реакции, а концентрация белкового экстракта представлена в мг/мл. Одна единица активности β-1,3-глюканазы определяется как 1 мкм глюкозы, высвобождаемой из субстрата в течение 1 ч реакционного периода.

8. Определение активности пероксидазы (POD)

ПРИМЕЧАНИЕ: Активность связанной с клеточными стенками пероксидазы сортов пшеницы Tugela, Tugela-Dn1 и Tugela-Dn5 определяли путем количественного определения образования тетра-гваякола, полученного в единицу времени из гваякола16.

  1. Добавьте 30 мкл экстракта фермента, 30 мкл 1% (v/v) H2O2 и 970 мкл 5 мМ гваякола в кюветы при температуре 25 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Проведите реакцию холостого типа без ферментного экстракта (первый бланк), а другой бланк для образцов фермента без субстрата (второй бланк). Образцы фермента или субстрата заменяли 50 мМ буфером фосфата натрия в первой и второй заготовках соответственно.
  2. Используйте кинетический режим спектрофотометра для отслеживания изменения поглощения на длине волны 470 нм.
  3. Определите наклон, на котором график был линейным, и используйте его в качестве значения поглощения.
  4. Рассчитайте среднее поглощение и используйте его для расчета активности POD.
  5. Рассчитайте активность пероксидазы с использованием молярного коэффициента экстинкции гваякола (26,6 мМ-1 см-1) и экспрессируйте активность в μмоль тетра-гваякол/мин/мг белка.
  6. Рассчитайте активность POD с помощью уравнения, используемого Mafa et al.6:
    АКТИВНОСТЬ POD = [(ΔABS × DF) ÷ Концентрация белка] × 26,6 мМ-1 см-1 × 1 см
    ПРИМЕЧАНИЕ: Где ΔABS = среднее поглощение; DF = коэффициент разбавления; 26,6 мМ-1 см-1 = гваякольный коэффициент экстинкции.

9. Определение характеристик POD

ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ характеристик POD проводили с использованием экстрактов ферментов Tugela, Tugela-Dn1 и Tugela-Dn5 через 3 дня после заражения (dpi) в соответствии с аналогичными методами, описанными на шаге 8, с незначительными изменениями в реакционных буферах и температурах. Образцы ферментов всегда держали на льду во время проведения экспериментов. Запускайте реакции в четверках с параллельной реакцией бланка.

  1. Для оптимального определения pH выполните следующие шаги.
    1. Растворите субстрат гваякола в буферах с массой 50 мМ (цитрат натрия, pH 4 и 5), фосфат натрия (pH 6 и 7) и Tris-HCl (pH 8 и 9) (см. Таблицу материалов).
    2. Запустите реакцию при температуре 25 °C, как описано в шаге 8.
  2. Для проведения оптимальных температурных анализов выполните следующие шаги.
    1. Запускайте реакции при температуре 25 °C, 30 °C, 40 °C и 50 °C соответственно.
    2. Используйте субстрат из гваякола, растворенный в буфере pH 5 (оптимальный pH) и запустите реакцию, как описано в шаге 8.
  3. Для проведения анализов термостабильности выполните следующие действия.
    1. Перед началом реакции фермент инкубируют при 37 °C, 50 °C и 70 °C в течение 30 минут.
    2. Запускайте реакции в соответствии с методами, описанными в шаге 8, с использованием буфера цитрата натрия 50 мМ (pH 5) и при 40 °C (оптимальная температура).

10. Характеристика β-1,3-глюканазы

ПРИМЕЧАНИЕ: Проведите анализы характеризации в соответствии с методом, описанным на шаге 7, с использованием экстрактов ферментов с разрешением 3 точки на дюйм с некоторыми изменениями в реакционных буферах и температурах. Запускайте реакции в четыре раза, с параллельной реакцией холостого листа для каждой подложки.

  1. Для оптимального определения pH действуйте следующим образом:
    1. Растворите субстраты MLG и β-1,3-глюкана в буферах по 50 мМ (цитрат натрия, pH 4 и 5), фосфат натрия (pH 6 и 7) и Tris-HCl (pH 8 и 9).
    2. Запустите реакцию, как описано в шаге 7.
  2. Для проведения оптимальных температурных анализов действуйте следующим образом:
    1. Запускайте реакции при температуре 25 °C, 30 °C, 40 °C и 50 °C соответственно.
    2. Используйте субстраты MLG и β-1,3-глюканов, растворенные в 50 мМ буфере цитрата натрия (pH 5) с оптимальным pH (полученным на шаге 10.1) и запустите реакцию, как описано на шаге 7.
  3. Для проведения анализов термостабильности действуют следующим образом:
    1. Перед началом реакции фермент инкубируют при 37 °C, 50 °C и 70 °C в течение 30 минут.
    2. Проведите реакции с использованием субстратов, растворенных в 50 мМ буфере цитрата натрия (pH 5), и инкубируйте при 25 °C и 40 °C в течение 24 часов.

11. Оценка механизма действия β-1,3-глюканазы на различные субстраты глюкана

Примечание: Субстраты глюкана содержат один и тот же остаток глюкозы в своей основе, но гликозидные связи между единицами глюкопиранозы разнообразны и могут принимать α или β ориентацию. Гликозидные связи могут образовываться между несколькими атомами углерода молекул глюкозы, определяющими их химическую структуру, например, β-1,3-глюкан, β-1,4-глюкан и смешанный связанный β-1,3-1,4-глюкан (MLG)18,19,20. Механизм действия β-1,3-глюканазы определяли с использованием зараженных RWASA2 образцов Tugela, Tugela-Dn1 и Tugela-Dn 5 (источники ферментов) и субстратов β-1,3-глюкан (CM-курдлан), MLG (из ячменя) и β-1,4-глюкан (AZO-CM-целлюлоза). Механизм действия определяют при оптимальных условиях анализа (25 °C и 40 °C, pH 5,0) с использованием 0,1% (w/v) β-1,4-глюкан, 0,4% (w/v) β-1,3-глюкан или 0,5% (w/v) субстратов MLG.

  1. Растворите субстраты в 50 мМ буфере цитрата натрия (pH 5).
  2. Добавьте 200 мкл ферментного экстракта и 300 мкл субстрата в пробирки для микроцентрифуг объемом 1,5 мл.
  3. Инкубируйте реакции при двух разных температурах, 25 °C и 40 °C в течение 8 часов.
  4. Прекращение реакций нагреванием до 100 °C.
  5. Центрифугируйте реакционную смесь β-1,3-глюкана и MLG при 10 000 x g в течение 10 мин при 4 °C и действуйте, как описано на шаге 7.3.
  6. Для β-1,4-глюкана, после завершения реакции при 100 °С, разбавить смесь 800 мкл абсолютного этанола и центрифугировать при 4 °С в течение 10 мин при 10 000 х г.
  7. Перенесите надосадочную жидкость в кривые, измерьте абсорбцию на длине волны 590 нм с помощью спектрофотометра и рассчитайте активность β-1,3-глюканазы на β-1,4-глюкане по методике производителя (см. Таблицу материалов) и выразите активность в белках в единицах/мг.

12. Определение механизма действия β-1,3-глюканазы

ПРИМЕЧАНИЕ: Зараженный RWASA2 механизм действия Tugela, Tugela-Dn1 и Tugela-Dn5, индуцированный β-1,3-глюканазой, определяли с помощью ламинарин-олигосахаридов (ЛАМ) со степенью полимеризации (ДП) от 5 до 2. Используйте тонкослойную хроматографию (ТСХ), жидкостную хромато-масс-спектрометрию (ЖХ-МС) и набор для пероксидазы глюкозы (GOPOD) для определения ДП, необходимого для β-1,3-глюканазы для гидролиза субстрата. Для качественного анализа использовали ТСХ, а для количественного анализа – ЖХ-МС, который определил концентрацию олигосахаридов в гидролизате после реакции21.

  1. Готовят реакции β-1,3-глюканазы по способу действия
    ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте концентрированный белковый экстракт с помощью центрифугового концентрационного мембранного фильтра с массой 10 кДа, и таким образом получите концентрированные и неконцентрированные белковые экстракты RWASA2 для эксперимента.
    1. Для концентрирования ферментов, извлеченных из каждого сорта, перенесите 5 мл экстрактов в центрифужные мембранные фильтры с центрифугой 10 кДа.
    2. Центрифугируйте мембранные фильтрующие трубки, содержащие экстракт, при концентрации 15 000 x g в течение 30 минут при 4 °C.
    3. Растворите ламинарипентаозу (LAM5), ламинаритетраозу (LAM4), ламинаритриозу (LAM3) и ламинарибиозу (LAM2) (см. Таблицу материалов) в 50 мМ цитрате натрия (pH 5) с получением 10 мг/мл.
    4. Чтобы начать реакцию, добавьте 20 μL белкового экстракта и 40 μL Laminaripentaose (LAM5), Laminaritetraose (LAM4), Laminaritriose (LAM3) и Laminaribiose (LAM2).
    5. Инкубировать реакцию при 40 °C в течение 16 часов и закончить кипячением при 100 °C в течение 5 минут.
  2. Проведение тонкослойной хроматографии (ТСХ)
    1. Разрежьте 4 пластины из кремнезема на 10 см2 части и проведите одну линию по поверхности пластины, оставляя пространство 1 см от нижней части одного края.
    2. Отметьте точки над линией и отметьте их в соответствии с различными сортами и DP ламинарин-олигосахаридов, на расстоянии 1 см друг от друга. Возьмите 2 пластины с диоксидом кремния для концентрированного белкового экстракта и 2 другие для неконцентрированных экстрактов.
    3. Добавьте 3 мкл реакционных смесей от 3 до 5 раз на соответствующие отмеченные пятна на пластине с кремнеземом и дайте пятнам на пластине полностью высохнуть, прежде чем повторять процесс.
    4. Аккуратно поместите пластины с кремнеземом в резервуар TLC, содержащий подвижную фазу н-бутанол: уксусная кислота: вода (2:1:1 v/v/v) стороной, содержащей пятна образцов на дне.
    5. Позвольте подвижной фазе переместиться снизу вверх пластины.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг может занять примерно 2 часа. Не перемещайте и не тревожьте резервуар во время отделения образцов.
    6. Снимите пластины с подвижной фазы и дайте им высохнуть при комнатной температуре.
    7. Добавьте раствор для окрашивания в небольшую емкость, осторожно погрузите пластину с кремнеземом в раствор для окрашивания 0,3% (v/v) нафтола в 95% (v/v) этанола с использованием 5% (v/v) серной кислоты на 5 с, удалите его, а затем дайте высохнуть при комнатной температуре.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом шаге включите нагревательный блок/духовку и установите температуру на 100 °C.
    8. Положите высушенные пластины с кремнеземом на нагревательный блок и нагревайте при 100 °C в течение 7-10 минут или до появления сине-фиолетовых пятен. Сфотографируйте пластины с кремнеземом, на которых видны сине-фиолетовые пятна, и задокументируйте их.
  3. Количественно определить концентрацию гидролизатов ламинарина-олигосахаридов
    ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация гидролизатов LAM будет количественно определена как для концентрированных, так и для неконцентрированных белковых экстрактов21.
    1. Добавьте 20 мкл каждого образца в колонку C18 (углеводы 4,6 × 250 мм) и дайте отделить со скоростью потока 500 мкл/мин с помощью градиента воды (растворитель А) и ацетонитрила (растворитель В) от 100% В до 60% В в течение 10 мин с последующими этапами повторного уравновешивания колонки с общим временем выполнения 20 мин для обеспечения повторного уравновешивания колонки.
    2. Ионизируйте элюирующие аналиты в режиме отрицательного электрораспыления в масс-спектрометрическом источнике ионов с температурой нагревателя 400 °C для испарения избытка растворителя, небулайзерного газа 30 фунтов на квадратный дюйм, нагревательного газа с давлением 30 фунтов на квадратный дюйм и газа для завесы 20 фунтов на квадратный дюйм.
    3. Установите потенциал декластеризации на 350 В.
    4. Анализируйте элюирующие аналиты на масс-спектрометре в режиме сканирования Q1 в диапазоне от 150 Да до 1000 Да с временем выдержки 3 с.
    5. Запишите концентрации аналитов в таблицу.
  4. Количественное определение концентрации глюкозы
    1. Анализировать концентрацию глюкозы, полученную при гидролизе ламинарина с использованием реагента GOPOD, следуя инструкциям производителя22,23.
    2. Измерьте поглощение на длине волны 510 нм в фиксированном режиме спектрофотометра.

13. Сбор и анализ данных

  1. Рандомизируйте все эксперименты, чтобы избежать систематической ошибки во время заражения или сбора образцов, и проводите анализ в четверных количествах.
  2. Если не указано иное, используйте средства ± стандартного отклонения для представления значений на графиках и в таблицах, сгенерированных на основе собранных экспериментальных данных.
  3. Используйте Microsoft Excel для анализа всех данных и создания графиков.
  4. Выполняйте статистический анализ с помощью совместимого программного обеспечения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Проведите многофакторный дисперсионный анализ (ANOVA) для проверки значимости между курсами лечения и ЛСД Фишера для проверки однородных групп при альфа-значении 0,05.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Четыре биологических репликатора сортов пшеницы (Tugela, Tugela-Dn1 и Tugela-Dn5) были заражены RWASA2 на стадии роста трех листьев. После заражения листья собирали при 1-, 2-, 3-, 7- и 14 dpi. Контрольные обработки не были заражены RWASA2, что сделало результаты эксперимента сопоставимыми с растениями пшеницы, не подвергавшимися стрессу. Эксперименты проводились в четверных величинах, а результаты были представлены в виде средних значений.

Концентрации белка как в зараженных...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Пшеница и ячмень – зерновые культуры, часто зараженные видами тлей, в том числе русской пшеничной тлей (Diuraphis noxia)7,24. Устойчивые растения пшеницы индуцируют повышение активности POD и β-1,3-глюканазы в качестве защитных реакций на протяжении всего периода заражения для изменения клеточной стенки путем регуляции накопления каллозы и лигнина 6,25,26,27.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов, связанного с данной работой.

Благодарности

М. Мафа получил финансирование от NRF-Thuthuka (номер заявки: TTK2204102938). С.Н. Зондо получил стипендию Национального исследовательского фонда для аспирантуры для получения степени магистра. Авторы выражают благодарность Институту Совета по сельскохозяйственным исследованиям - Малого зерна (ARC-SG) за предоставленные семена, использованные в этом исследовании. Любые мнения, выводы и рекомендации, выраженные в этом материале, принадлежат автору (авторам), и поэтому спонсоры не несут никакой ответственности в связи с этим.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Центрифуга 10 кДа Центрифуга концентрационная мембранаSigma-AldrichR1NB84206Только для исследовательского использования. Не для использования в диагностических процедурах. Для концентрирования и очистки биологических растворов.
2 г ламинарибиозымегазим (Уиклоу, Ирландия)O-LAM2Ламинарибиоза высокой чистоты для использования в исследованиях, анализах биохимических ферментов и диагностическом анализе in vitro.
3 г ламинаритриозымегазима (Уиклоу, Ирландия)O-LAM3Ламинаритриозы высокой чистоты для использования в исследованиях, анализах биохимических ферментов и диагностическом анализе in vitro.
3,5 Динитро салициловая кислотаSigma-AldrichD0550Используется при колориметрическом определении редуцирующих сахаров
4 г Ламинаритетраозы Megazyme (Уиклоу, Ирландия)O-LAM4Ламинаритетраоза высокой чистоты для использования в исследованиях, анализах биохимических ферментов и диагностическом анализе in vitro.
5 г ламинарипентаозымегазим (Уиклоу, Ирландия)O-LAM5Ламинарипентаоз высокой чистоты для использования в исследованиях, биохимических анализах ферментов и диагностическом анализе in vitro.
95% абсолютный этанолSigma-Aldrich107017абсолютный этанол для анализа
уксусная кислотаSigma-AldrichB00063Acetc кислота ледяная 100% для анализа (содержит уксусную кислоту)
Azo-CM-CelluloseMegazyme (Уиклоу, Ирландия)S-ACMCПолисахарид окрашивается Remazolbrilliant Blue R в количестве примерно одной молекулы красителя на 20 остатков сахара.
Бета-глюкан (ячмень) Megazyme (Уиклоу, Ирландия)G6513Порошкообразный субстрат, менее растворимый в воде. Используется для определения активности β-1,3-глюканазы.
Bio-Rad Protein Assay DyeBio-Rad Laboratories, Южная Африка500-0006Колориметрический краситель для анализа, концентрат, для использования с наборами Bio-Rad Protein Assay Kit I и II 
Бычий сывороточный альбумин (BSA)Gibco Europe810-1018Для лабораторного использования только
Цитратная кислотаSigma-AldrichC0759Только для исследований в области медико-биологических наук. Не для использования в диагностических процедурах.
CM-curdlan Megazyme (Уиклоу, Ирландия)P-CMCURПорошкообразный субстрат для определения активности β-1,3-глюканазы. Нерастворим в воде.
D-глюкозаSigma-AldrichG8270Только для исследований в области медико-биологических наук. Не для использования в диагностических процедурах.
GuaiacolSigma-AldrichG5502. Используется для определения активности пероксидазы.
Перекись водородаBDH Laboratory Supplies, Англия10366Мощный окислитель.
Mikskaar Professional SubstarteMikskaar (Эстония)NIсубстрат на основе торфяного мха.
Multifeed Удобрение (5.2.4 (43))MultifeedClassicB1908248Водорастворимое удобрение для молодых развивающихся растений и рассады с высоким содержанием фосфора (P) для обеспечения оптимального развития корней.
NaphtholMerck, ГерманияN2780Подвергается гидрогенации в присутствии катализатора.
ФенолСигма-Олдрич33517светочувствительный. Для R& D только для использования. Не для лекарственных, бытовых или других целей. Доступный SDS
Тетрагидрат тартрата калия натрия (соль Рошели)Sigma-AldrichS2377используется при приготовлении раствора 3,5-динитрозалициловой кислоты, используемого при определении редуцирующего сахара.
Силикагель (TLC Силикагель 60 F254)Sigma-Aldrich60778-25EAМатрица силикагеля, с флуоресцентным индикатором 254 нм
Гидроксид натрияSigma-AldrichS8045Для R& D только для использования. Не для лекарственных, бытовых или других целей.
Метабисульфит натрияSigma-Aldrich31448Добавляется в качестве антиоксиданта при приготовлении растворов 3,5-динитрозалициловой кислоты.
Двухосновной гептагидрат фосфата натрияSigma-AldrichS9390Используется в качестве буферного раствора в биологических исследованиях для поддержания постоянного pH.
Одноосновной гептагидрат фосфатанатрия Sigma-Aldrich71500Неорганическое соединение, которое растворяется в воде. Используется в качестве реагента при разработке затирок на силикатной основе.
Программное обеспечение для статистического анализаTIBCO Statisticaверсия 13.1
Серная кислотаMerck, Дармштадт, Германия30743Серная кислота 95-97% для анализа ртути, реагент ACS.
Tris-HClSigma-Aldrich10812846001Буферный агент в инкубационных смесях. Он также используется в качестве компонента лизиса и буфера TE (Tris-EDTA). Только для медико-биологических исследований. Не для использования в диагностических процедурах.
УФ&ндаш; Спектрофотометр видимого диапазонаGENESYS 120 
  NI = не идентифицирован.
Индикатор окисления

Ссылки

  1. Mohase, L., Vander Westhuizen, A. J. Salicylic acid is involved in resistance responses in the Russian wheat aphid-wheat interaction. J Plant Physiol. 159 (6), 585-590 (2002).
  2. Mohase, L., Vander Westhuizen, A. J. Glycoproteins from Russian wheat aphid-infested wheat induce defense responses. Z Naturforsch C J Biosci. 57 (9-10), 867-873 (2002).
  3. Moloi, M. J., Vander Westhuizen, A. J. The reactive oxygen species are involved in resistance responses of wheat to the Russian wheat aphid. J Plant Physiol. 163 (11), 1118-1125 (2005).
  4. Manghwar, H., et al. Expression analysis of defense-related genes in wheat and maize against Bipolaris sorokiniana. Physiol Mol Plant Pathol. 103, 36-46 (2018).
  5. Botha, C. E., Matsiliza, B. Reduction in transport in wheat (Triticum aestivum) is caused by sustained phloem feeding by the Russian wheat aphid (Diuraphis noxia). S Afr J Bot. 70 (2), 249-254 (2004).
  6. Mafa, M. S., Rufetu, E., Alexander, O., Kemp, G., Mohase, L. Cell-wall structural carbohydrates reinforcements are part of the defense mechanisms of wheat against Russian wheat aphid (Diuraphis noxia) infestation. Plant Physiol Biochem. 179, 168-178 (2022).
  7. Walker, G. P. Sieve element occlusion: Interaction with phloem sap-feeding insects - A review. J Plant Physiol. 269, 153582(2022).
  8. Botha, A. M. Fast developing Russian wheat aphid biotypes remains an unsolved enigma. Curr Opin Insect Sci. 45, 1-11 (2020).
  9. Saheed, S. A., et al. Stronger induction of callose deposition in barley by Russian wheat aphid than bird cherry-oat aphid is not associated with differences in callose synthase or β-1,3-glucanase transcript abundance. Physiol Plant. 135 (2), 150-161 (2009).
  10. Zondo, S. N. N., Mohase, L., Tolmay, V., Mafa, M. S. Functional characterization of cell wall-associated β-1,3-glucanase and peroxidase induced during wheat-Diuraphis noxia interactions. Research Square. , (2024).
  11. Jimoh, M. A., Saheed, S. A., Botha, C. E. J. Structural damage in the vascular tissues of resistant and non-resistant barley (Hordeum Vulgare L.) by two South African biotypes of the Russian wheat aphid. NISEB J. 14 (1), 1-5 (2018).
  12. Mohase, L., Taiwe, B. Saliva fractions from South African Russian wheat aphid biotypes induce differential defense responses in wheat. S Afri J Plant Soil. 32 (4), 235-240 (2015).
  13. Vander Westhuizen, A. J., Qian, X. M., Botha, A. M. β-1,3-glucanases in wheat and resistance to the Russian wheat aphid. Physiol Plant. 103 (1), 125-131 (1998).
  14. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72 (1-2), 248-254 (1976).
  15. Miller, G. L. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Anal Chem. 31 (3), 426-428 (1959).
  16. Zieslin, N., Ben-Zaken, R. Peroxidases, phenylalanine ammonia-lyase and lignification in peduncles of rose flowers. Plant Physiol Biochem (Paris). 29 (2), 147-151 (1991).
  17. Damager, I., et al. First principles insight into the α-glucan structures of starch: Their synthesis, conformation, and hydration. Chemical Rev. 110 (4), 2049-2080 (2010).
  18. Nakashima, J., Laosinchai, W., Cui, X., Brown Jr, M. New insight into the mechanism and biosynthesis: proteases may regulate callose biosynthesis upon wounding. Cellulose. 10, 269-289 (2003).
  19. Cierlik, I. Regulation of callose and β-1,3-glucanases during aphid infestation on barley cv. Clipper. Master thesis in Molecular Cell Biology. , Sodertorn University College. Stockholm. (2008).
  20. Rahar, S., Swami, G., Nagpal, N., Nagpal, M. A., Singh, G. S. Preparation, characterization, and biological properties of β-glucans. J Adv Pharm Technol Res. 2 (2), 94(2011).
  21. Mafa, M. S., et al. Accumulation of complex oligosaccharides and CAZymes activity under acid conditions constitute the Thatcher + Lr9 defense responses to Puccinia triticina. Biologia. 78, 1929-1941 (2023).
  22. Megazyme. GOPOD reagent enzymes: Assay procedure. Megazyme. , 1-4 (2019).
  23. Hlahla, J. M., et al. The photosynthetic efficiency and carbohydrates responses of six edamame (Glycine max. L. Merrill) cultivars under draught stress. Plants. 11 (3), 394(2022).
  24. Botha, A. M., Li, Y., Lapitan, N. L. Cereal host interactions with Russian wheat aphid: A review. J Plant Interact. 1 (4), 211-222 (2005).
  25. Forslund, K., Pettersson, J., Bryngelsson, T., Jonsson, L. Aphid infestation induces PR-proteins differently in barley susceptible or resistant to the birdcherry-oat aphid (Rhopalosiphum padi). Physiol Plant. 110 (4), 496-502 (2000).
  26. Miedes, E., Vanholme, R., Boerjan, W., Molina, A. The role of the secondary cell wall in plant resistance to pathogens. Front Plant Sci. 5, 358(2014).
  27. Rajninec, M., et al. Basic β-1,3-glucanse from Drosera binate exhibits antifungal potential in transgenic tobacco plants. Plants. 10 (8), 1747(2021).
  28. Vander Westhuizen, A. J., Qian, X. M., Wilding, M., Botha, A. M. Purification and immunocytochemical localization of wheat β-1,3-glucanase induced by Russian wheat aphid infestation. S Afri J Sci. 98, 197-202 (2002).
  29. Cosgrove, D. J. Loosening of plant cell walls by expansins. Nature. 407 (6802), 321-326 (2000).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Бета-1пероксидазная активностьрусская пшеничная тлябелкисвязанные с патогенезомхарактеристика ферментатонкослойная хроматографиясубстратная специфичность глюканазывзаимодействие растения и вредителя
Выяснение #946;-1,3-глюканаза и пероксидаза физико-химических свойств защитного механизма клеточной стенки пшеницы против заражения Diuraphis noxia
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.