Методическая статья

Использование изолированной модели рабочего сердца крысы для тестирования стратегий сохранения донорского сердца

1.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/66910

⸱

4 октября 2024 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Cardiac Physiology and Transplantation, Victor Chang Cardiac Research Institute, 2St Vincent's Healthcare Clinical Campus, University of New South Wales, 3Heart and Lung Transplant Unit, St Vincent's Hospital, 4Faculty of Medicine, University of New South Wales

В этой статье

Краткое содержание

Мы описываем протокол ex vivo изолированного рабочего сердца крысы для тестирования стратегий сохранения сердца донора. В данной статье описан протокол использования в статическом холодильном хранении донорских сердец грызунов; Тем не менее, протокол также может быть использован для донорских сердец, полученных после донорства после смерти кровообращения и мозга.

Аннотация

Оптимизация решений по сохранению донорского сердца сыграла ключевую роль в снижении ишемии-реперфузионного повреждения в сердцах доноров во время извлечения, транспортировки и трансплантации органов. Предыдущая работа нашей лаборатории показала, что добавление глицерилтринитрата и эритропоэтина в решения для сохранения сердца донора может значительно улучшить функциональное восстановление сердца после длительного хранения в холоде и при донорстве после сердечно-сосудистой смерти. Этот протокол приема добавок был внедрен в клиническую практику в трансплантационных отделениях в Австралии, Бельгии и Великобритании. В этой статье мы описываем протокол тестирования стратегий приема добавок с использованием изолированного контура перфузии рабочего сердца крысы (IWRH) ex vivo . Используя эту методологию, стратегии приема добавок могут быть протестированы в контексте длительного хранения статического электричества на холоде, донорства после смерти мозга и донорского сердца после сердечной смерти. Функциональное восстановление сердца, измеряемое аортальным потоком, коронарным кровотоком, сердечным выбросом, пульсовым давлением и частотой сердечных сокращений, может быть использовано для определения того, может ли конкретная стратегия сохранения свести к минимуму ишемическое реперфузионное повреждение донорского сердца.

Введение

На успех пересадки сердца в значительной степени может повлиять метод консервации, используемый для донорского сердца. Донорские сердца подвергаются ишемическим повреждениям на протяжении всего процесса извлечения, транспортировки и трансплантации органов. Степень ишемического повреждения донорского органа может быть снижена путем выбора подходящей стратегии сохранения донорского сердца. Холодное статическое хранение (CSS) остается наиболее целесообразным и распространенным методом сохранения сердца донора; однако CSS не обязательно может быть лучшим вариантом для всех путей донорства сердца. Например, сердца, полученные по пути донорства после смерти от кровообращения (DCD), поддерживаются и оцениваются на жизнеспособность с помощью нормотермической машинной перфузии, в то время как сердца, полученные по пути донорства после смерти мозга (DBD), могут быть сохранены с помощью CSS или гипотермической машинной перфузии. Другим важным фактором, определяющим используемую стратегию сохранения, является количество теплой ишемии (при ДКБ) или холодной ишемии (при ДБД), которым подвергается сердце во время забора и транспортировки органов.

Многие центры используют дополнительные фармакологические добавки раствора для сохранения сердца для повышения толерантности к ишемии и улучшения функции сердца после трансплантации. Исследования на грызунах, проведенные в нашей лаборатории, показали, что добавки кардиоплегии эритропоэтином и глицерилтринитратом способны значительно улучшить функциональное восстановление сердца после длительного хранения донорского сердцав холоде 1,2. Эти исследования затем перешли в исследования сохранения донорского сердца на свиньях и обеспечили доклиническую основу, которая привела к включению эритропоэтина и глицерилтринитрата в раствор кардиоплегии сердца, полученный через DCD-путь с использованием нормотермической машинной перфузии 3,4,5. В настоящее время добавки эритропоэтина и глицерилтринитрата также используются в австралийских трансплантационных отделениях для клинического извлечения сердца DBD с использованием CSS. Общая цель протокола перфузии изолированного рабочего сердца крысы (IWRH), описанного ниже, заключается в том, чтобы проверить стратегии сохранения донорского сердца в лабораторных условиях и проверить их эффективность для сохранения функции донорского сердца после реперфузии. Описанный протокол изолированного рабочего сердца крысы использовался в течение более двух десятилетий в нашей лаборатории и оказался чрезвычайно полезным для скрининга потенциальных добавок и/или стратегий, которые могут улучшить сохранение донорского сердца 2,7,8,9.

Протокол

Все животные получили гуманный уход в соответствии с рекомендациями Национального совета по здравоохранению и медицинским исследованиям (Австралия). Все процедуры на животных были одобрены Комитетом по этике животных Института медицинских исследований Гарвана (Сидней, Австралия).

1. Приготовление буфера Krebs-Henseleit (KH)

  1. Приготовьте 2 л 20-кратного стокового раствора буфера KH, содержащего 2,36 М NaCl, 0,094 М KCl, 0,024 М MgSO4, 0,024 М KH2PO4. Аликвот в пробирки объемом 50 мл и хранить при температуре -20 °C.
  2. Перед началом эксперимента приготовьте две колбы Эрленмайера объемом 2 л 1x KH буфера, содержащего 1900 мл деионизированной воды, 100 мл 20x стокового буфера KH, 4,20 г NaHCO3 (25 мМ) и 3,96 г глюкозы (11 мМ).
    1. Поместите буферные колбы в водяную баню при температуре 37 °C и отравите раствор карбогеном (95% кислорода, 5% углекислого газа, расход 2 л/мин) с помощью воздушных камней (входной фильтр) в течение 5 минут, затем добавьте 2,8 мл 1 М CaCl2 (1,4 мМ). Продолжайте барботирование раствора в течение как минимум 1 ч до начала эксперимента. Использование воздушного камня способствует равномерной аэрации буфера.
    2. Поместите небольшой объем (~50 мл) буфера в круглую металлическую посуду при температуре -20 °C, чтобы он охладился и образовал слой ледяного буфера.

2. Подготовка контура перфузии

  1. Убедитесь, что все трубки и стеклянная посуда чистые, без видимого роста / загрязнения.
  2. Установите высоту стеклянных камер в соответствии с требуемым перфузионным давлением из расчета 1 смН2О, что эквивалентно 1,36 мм рт.ст.: Лангендорф к сердцу 100 см (приблизительно 75 мм рт.ст.), рабочая сторона к сердцу с предварительной нагрузкой 15 см (приблизительно 11 мм рт.ст.), камера от сердца до вспомогательной нагрузки 100 см (приблизительно 75 мм рт.ст.).
  3. Начните циркуляцию горячей воды вокруг контура не менее чем за 10 минут до перфузии сердца.
  4. Поместите фильтры из микрофибры (1,2 мкм) в держатели фильтров и плотно зафиксируйте их.
  5. Загрунтуйте контур буфером KH, убедившись, что весь воздух удален, и используйте зажим для трубки с регулированием потока для регулировки потока для регулировки расхода со стороны Лангендорфа (рис. 1A, B) до ~50 мл/мин. Более медленный поток облегчает канюляцию аорты и предотвращает смещение сердца перед перевязкой. Поместите термометр в контур с помощью Т-образного трубочного соединителя, чтобы контролировать температуру буфера на уровне ~37 °C.

3. Настройка программного обеспечения Lab Chart (анализ данных)

  1. Перед открытием программного обеспечения для анализа данных убедитесь, что Powerlab (система сбора данных) и расходомер включены и подключены к компьютеру.
  2. Откройте новый файл.
  3. Настройте сбор данных, выбрав раскрывающееся меню Настройки и выбрав Настройки канала. Выберите давление в аорте, поток в аорте и частоту сердечных сокращений (рисунок 2A).
  4. Настройте каждый канал в соответствии с настройками, показанными на рисунке 2B.

4. Подготовка животного к изоляции сердца крысы

ПРИМЕЧАНИЕ: Методология изоляции и перфузии сердца крысы для сердец без DBD и без DCD для холодного статического хранения изложена ниже. Методы включения сердца в контур перфузии относительно схожи независимо от того, какой метод донорства используется. Различия в протоколе донорства сердца крыс с помощью DBD и DCD в первую очередь проявляются с момента начала действия анестезии на животном до момента удаления сердца у животного.

  1. Взвесьте животное, следя за тем, чтобы его вес составлял >330 г. Идеальный диапазон веса для самцов крыс составляет 330-420 г.
  2. Введите внутрибрюшинную инъекцию кетамина (80 мг/кг) и ксилазина (10 мг/кг). Обеспечить адекватную хирургическую плоскость анестезии на основе отсутствия педального рефлекса (рефлекса пальцев ног) и рефлекса моргания глаз.
  3. Расположите животное в лежачем положении, закрепив конечности скотчем. Подавайте кислород животному через носовой конус.
  4. Имейте буферный металлический контейнер для льда и слякоти KH и небольшой металлический контейнер со льдом на станции вскрытия. Смочите марлю размером 7,5 см х 7,5 см в буфере КН и положите ее на емкость со льдом.
  5. Как только будет подтверждена адекватная хирургическая плоскость анестезии, побрейте кожу в месте хирургического разреза и очистите кожу асептическими средствами, такими как бетадин или 70% спирт. Сделайте боковой разрез поперек брюшной полости (лапаротомия) и сдвиньте желудок и кишечник в сторону, чтобы обеспечить доступ к левой почечной вене. Введите 1500 МЕ гепарина и надавите на место инъекции до тех пор, пока кровотечение не остановится. Подождите 1-2 минуты для циркуляции гепарина, прежде чем продолжить забор сердца.
  6. Откройте грудную полость, разрезав грудную клетку с любой стороны и разрезав диафрагму. Осторожно удерживайте и поднимайте блок сердца-легких во время разрезания вдоль нисходящей аорты, следя за тем, чтобы дуга аорты оставалась неповрежденной. Это позволит сохранить достаточную длину аорты для канюляции.
  7. Крысу усыпляют путем удаления сердца и легких, пока она находится под наркозом. Погрузите блок сердца и легких в буферную ледяную жижу KH, чтобы позволить сердцу остановиться.

5. Канюлирование сердца на изолированный рабочий контур перфузии сердца

  1. Перенесите блок сердца и легких в марлю на льду. Рассеките лишний жир вокруг аорты, обрежьте аорту так, чтобы оставить длину 3-5 мм для канюляции, и сделайте небольшой разрез ~1-2 мм в легочной артерии. Это позволит проложить путь для коронарного стока.
  2. Поместите обрезанный блок сердца и легких (еще находясь на льду) прямо под канюли. Отрегулируйте поток со стороны Лангендорфа с помощью зажима для трубки с контролем потока, чтобы облегчить канюляцию аорты. Осторожно наденьте аорту на левую канюлю, удерживайте ее черным зажимом и завяжите шелковым швом 2-0.
  3. Увеличьте расход за счет перфузии Лангендорфа, полностью открыв зажим трубки для регулирования потока. Откройте зажим для последующей нагрузки. Обеспечьте непрерывный поток из камеры Лангендорфа. Начните следить за сердечной деятельностью с помощью программного обеспечения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: если значение аортального потока на дисплее флоуметра составляет <10 мл/мин, убедитесь, что легочная артериотомия имеет достаточный размер. Низкий след/значение аортального потока также может указывать на то, что аортальная канюля была вставлена слишком далеко.
  4. Отрегулируйте блок сердца и легких так, чтобы передняя поверхность легких была обращена к оператору. Перевяжите левую долю легкого шелковым швом 2-0 и отрежьте лишнюю левую легочную ткань. Завяжите оставшиеся доли легких одним махом шелковым швом 2-0 и разрежьте ткань. Поверните сердце так, чтобы перевязанные легкие были направлены к задней части.
  5. С помощью маленьких ножниц Ваннас отрежьте край левого предсердного придатка на 2-3 мм, следя за тем, чтобы было достигнуто небольшое отверстие в предсердии. Осторожно канюлейте ушок левого предсердия к левой канюле, зажмите его черным зажимом и завяжите шелковым швом 2-0. На рисунке 3А показано расположение обеих канюль.
  6. Отрегулируйте водяную рубашку камеры сердца так, чтобы сердце находилось в центре камеры.
  7. Откройте датчик давления на воздух и обнулите датчик давления в программном обеспечении, выбрав раскрывающееся меню «Давление в аорте» > Bridge Amp > Zero. Нажмите OK.
  8. Перфузируйте сердце в режиме Лангендорфа в течение 10 минут. Убедитесь, что скорость потока в аорте по Лангендоффу измеряется в пределах 10-20 мл/мин (идеальный показатель 20 мл/мин).
  9. Перед переключением рабочего режима убедитесь, что воздушный камень (надвижной входной фильтр) из буферного резервуара Langendorff KH находится в рабочем буферном резервуаре KH.
  10. Переключите сердце в рабочий режим, закрыв большой зажим, ведущий к аортальной канюле, и открыв поток, ведущий к ушку левого предсердия. Откройте трехходовой кран, ведущий от рабочего перфузата. Перенесите общую возвратную трубку (отводящую буфер KH обратно в резервуар) из резервуара Лангендорфа в рабочий резервуар.
  11. Перфузируйте сердце в рабочем режиме в течение 15 мин. Значения потока в аорте в идеале должны составлять >30 мл/мин в конце 15-минутной перфузии. Как только состояние сердца стабилизируется, начните записывать данные в программное обеспечение для анализа данных.
  12. Измеряйте коронарный сток (коронарный поток) через 1 мин, 5 мин, 10 мин и 15 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Значения коронарного кровотока должны быть в пределах 10-20 мл/мин. Коронарный кровоток более 22 мл/мин обычно указывает на утечку, происходящую из неперевязанного легочного сосуда. Частота сердечных сокращений должна быть в пределах 200-300 уд/мин. Коронарные стоки могут быть собраны для последующего анализа маркеров повреждения тканей (например, тропонина-I, высвобождения лактатдегидрогеназы).

6. Введение кардиоплегии для холодового статического хранения сердца

  1. Заполните камеру кардиоплегии (расположенную на высоте 60 см для обеспечения перфузионного давления около 40 мм рт.ст.) 50 мл специального раствора для сохранения сердца (с добавкой или без нее).
  2. Опустите водяную рубашку и закройте трехсторонний кран со стороны режима работы.
  3. Остановите поток в направлении левой предсердной канюли, закрыв зажим.
  4. Откройте поток к канюле аорты.
  5. Закройте хомут со стороны Лангендоффа и на концевой нагрузке.
  6. Откройте зажим от линии кардиоплегии и смойте 15 мл кардиоплегии из линии давления. Закройте кран на напорной линии.
  7. Дайте сердцу промыться с помощью кардиоплегии через аортальную канюлю и соберите коронарные стоки. Запустите кардиоплегию в течение 3 минут и запишите объем введенной кардиоплегии.
  8. Остановите запись данных в программном обеспечении и сохраните файл.
  9. Через 3 минуты закройте кардиоплегический зажим и маленький синий зажим, ведущий к аортальной канюле.
  10. Поместите бульдожий зажим на аортальную канюлю и второй бульдожий зажим на левую канюлю. Отсоедините блок сердечной канюли от цепи и поместите его в стакан с кардиоплегией в холодильнике (рис. 3B, C).
  11. Храните сердце в холодильнике в течение 6 часов (или желаемого времени хранения в холодильнике).

7. Реперфузия сердца после хранения холодного статического электричества

  1. Подготовьте буфер KH в соответствии с разделом 1.
  2. Подготовьте контур перфузии в соответствии с разделом 2.
  3. Откройте сохраненный файл из базовой перфузии.
  4. Осторожно извлеките блок сердечной канюли из холодильника и закрепите его на контуре перфузии. Перед повторным подключением аортальной канюли используйте шприц с тупым концом 18 G, наполненный буфером KH, чтобы удалить воздух из канюли. Сначала подсоедините канюлю аорты, откройте зажим трубки со стороны Лангендорфа и убедитесь, что зажим трубки после нагрузки открыт.
  5. Повторно подключите канюлю левого предсердия, убедившись, что воздух был удален из канюли перед подключением к контуру перфузии. Держите зажим рабочей стороны закрытым до тех пор, пока не придет время переключиться с Лангендорфа на рабочий режим.
  6. Перфузируйте сердце в режиме Лангендорфа в течение 15 мин. Обязательно начните запись данных в начале реперфузии Лангендорфа.
  7. Перед переходом в рабочий режим поместите оба пузырьковых камня в буфер KH, откройте 3-ходовой кран с рабочей стороны и перенесите общие возвратные трубки в рабочий резервуар.
  8. Закройте белый зажим Лангендорфа, откройте белый рабочий боковой зажим и перфузируйте сердце на 30 минут. Измеряйте и собирайте коронарные стоки в определенные моменты времени для последующего анализа (например, маркеры сердечного повреждения). Обязательно остановите или перезапустите запись программного обеспечения, чтобы начать новый сегмент (или добавьте комментарий).
  9. Примерно через 15 минут работы реперфузии закройте трехсторонний кран.
  10. По окончании реперфузии сохраните файл с данными, остановите поток по цепи и отсоедините сердечную блокаду. Соберите образцы левого желудочка для гистологической обработки и/или заморозьте их для будущих исследований (например, экстракция белка для исследований вестерн-блоттинга).
  11. Снимите фильтры с держателей фильтров, слейте воду из буфера из контура и дважды промойте 5 л дистиллированной воды.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя это и не обязательно, полезно предварительно подогреть дистиллированную воду в большой емкости на водяной бане.

8. Анализ функционального восстановления

  1. Откройте файл LabChart.
  2. Выделите область записи продолжительностью не менее 30 с, затем нажмите «Команда» > «Добавить выбор данных» ИЛИ «Многократное добавление к данным». Это добавит желаемые параметры в файл DataPad в программном обеспечении.
  3. Выберите выпадающее меню «Окно » > DataPad.
  4. Выделите и скопируйте значения восстановления из DataPad в электронную таблицу для функционального анализа восстановления. Рассчитайте функциональное восстановление в процентах от соответствующего базового значения 1,6,7.

Результаты

Результаты исходной перфузии определят, был ли первоначальный эксперимент (предварительное хранение) успешным. Отток в аорте, отображаемый в режиме Лангендорфа, должен составлять от 14 до 22 мл/мин. Поток Лангендорфа отображается на расходомере в виде отрицательного значения из-за ретроградной перфузии аорты. Пример приемлемой кривой Лангендорфа показан на рисунке 4A.

После перевода в рабочий режим поток в аорте должен составлять не менее 30 мл/мин после того, как сердце успокоится. Нормально, что скорость кровотока первоначально увеличивается примерно до 50 мл/мин, затем снижается примерно до 25 мл/мин, прежде чем снова увеличивается до стабильного исходного уровня аортального потока. Как только исходные параметры становятся удовлетворительными (ФП > 30 мл/мин, CF 10-20 мл/мин, HR 200-300 уд/мин), сердце может быть сохранено. Пример хорошей трассировки базовой линии показан на рисунке 4B.

В зависимости от тестируемого раствора для консервации, некоторые сердечки не дают хорошего восстановления после длительного холодного статического хранения, несмотря на наличие отличного исходного уровня. Пример трассировки, указывающей на плохое восстановление в рабочем режиме, показан на рисунке 4C.

Окончательное функциональное восстановление аортального кровотока может быть рассчитано на основе итоговых показаний аортального кровотока в процентах от исходного значения. Например, если исходная ФП сердца составляла 40 мл/мин, а ФП в конце реперфузии после холодного статического хранения составляла 20 мл/мин, восстановление ФП для этого сердца составило 50%. Пример представления таких данных показан на рисунке 5.

figure-results-1
Рисунок 1: Перфузионная цепь работающего сердца. (A) Фотография изолированной рабочей перфузионной цепи сердца крысы. Красным прямоугольником указано, где расположено изолированное сердце. (B) Схема изолированной рабочей перфузионной цепи сердца с указанием направления потока буфера KH через цепь для перфузии Лангендорфа (пунктирная линия) и рабочего режима (сплошная линия). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2: Настройка программного обеспечения LabChart. (А) Настройка параметров канала для давления в аорте, потока в аорте и частоты сердечных сокращений. (B) Пример шаблона LabChart с тремя каналами. В окнах справа отображается каждый отдельный настроенный канал. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-3
Рисунок 3: Канюляция и кардиоплегия. (A) Канюляция сердца перед помещением в камеру с водяной рубашкой. Левая канюля вводится в аорту, а правая канюля вводится в левый желудочек через придаток левого предсердия. Легочные сосуды перевязаны, а легочная ткань рассечена. (В) После проведения кардиоплегии сердце помещают в стакан, содержащий раствор кардиоплегии. Канюли были зажаты бульдожьими зажимами перед отсоединением от установки. (C) Пример сердец, помещенных в холодильник для длительного хранения в холодильнике. Здесь два сердца были сохранены для реперфузии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-4
Рисунок 4: Примеры трассировок LabChart. Кривые давления (красный график), аортального потока (синий график) и частоты сердечных сокращений (зеленый график) для сердца с (А) хорошей кривой Лангендорфа, (В) хорошим восстановлением во время реперфузии рабочего режима, (В) плохим восстановлением во время реперфузии рабочего режима. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-5
Рисунок 5: Репрезентативные графики функционального восстановления. (A) аортальный поток, (B) коронарный поток, (C) сердечный выброс и (D) частота сердечных сокращений. Этот рисунок был повторно использован с разрешения Gao et al.8. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Обсуждение

Учитывая чувствительный характер базовой функции сердца, необходимо позаботиться о том, чтобы перфузионная установка содержалась в чистоте и с совместимыми компонентами. Например, необходимо использовать правильную трубку из ПВХ. Некоторые материалы трубок, такие как силикон, могут способствовать снижению кровотока в аорте и сократительной способности, что может быть связано с потерей кислорода через трубку. Несмотря на то, что коммерчески доступны изолированные рабочие схемы перфузии сердца крыс, большинство из них в основном используются только для перфузии Лангендорфа. Как правило, функциональные измерения могут быть получены в модели перфузии Лангендоффа путем введения баллонного катетера в левый желудочек для получения измерений диастолического давления левого желудочка (LVDP). Тем не менее, возможность измерения исходного потока в аорте и сердечного выброса в перфузионной системе Лангендоффа невозможна. Основным преимуществом протокола IWRH является возможность получения функциональных измерений аортального кровотока и сердечного выброса без необходимости проведения дополнительных вмешательств на сердце (т.е. баллонного катетера). Существуют коммерческие варианты работающей системы перфузии сердца крысы, и хотя они могут быть настроены в соответствии с индивидуальными требованиями исследования, эти системы могут быть дорогостоящими.

В протоколе есть критические шаги для обеспечения оптимальной исходной функции сердца грызуна во время перфузии. Приготовление буферных исходных растворов KHB должно быть не старше 4 недель. Контур перфузии должен быть свободен от пузырьков воздуха во время грунтовки. Необходимо соблюдать осторожность при канюлировании ушка левого предсердия. Чрезмерная работа с тканью может увеличить риск разрыва, а также может усилить функциональную раздражительность сердца.

Качество работы перфузионной схемы IWRH обычно можно определить по исходным показаниям, полученным в сердцах (ФП > 30 мл/мин, CF ~20 мл/мин). Дальнейшее тестирование контроля качества в модели CSS может быть выполнено путем остановки и хранения сердца в растворе для консервации Цельсиора с добавлением 1 мкмоль/л зонипорида плюс 0,1 мг/мл глицерилтринитрата. Остановка сердца с помощью Цельсиора с добавлением глицерилтринитрата плюс зонипорид гарантирует немедленное восстановление реперфузии по Лангендорфузии и окончательное функциональное восстановление на 40-60% после 6 часов хранения в холоде. Если вы сомневаетесь в том, хорошо ли работает буровой станок, полезно протестировать эту добавку для контроля качества.

Методы использования сердец грызунов, полученных путем донорства после смерти от кровообращения, были описаны ранее10,11. Вкратце, крыс обезболивают, канюлируют сонную артерию и измеряют давление. Гепарин (500 МЕ) вводится через канюлю сонной артерии. Трахея перевязывается, чтобы инициировать прекращение жизнеобеспечения. Как только будет достигнуто необходимое время теплой ишемии, сердце может быть иссечено и подключено к перфузионному контуру. Для введения консервирующего раствора в сердце DCD 60 мл консервационного раствора промывают через аорту (~20 мл/мин) через напорную линию на контуре. Легочные сосуды перевязываются, легкие рассекаются, вводится левая канюля, а затем через напорную линию промывается 40 мл консервационного раствора. Затем сердце перфузируется в соответствии с приведенным выше протоколом. Функциональное восстановление принимается в качестве исходного значения функциональной гемодинамики, а статистический анализ выполняется путем сравнения значений с теми сердцами, которые были искусственно прооперированы (однако DCD не промывался на буровой установке).

Методы использования сердец грызунов, полученных после смерти мозга, были описаны ранее12. Вкратце, животные обезболиваются, интубируются и вентилируются с гемодинамическим мониторингом в соответствии с протоколом DCD для грызунов. В височно-теменной части черепа выполняется отверстие для заусенцев, а субдурально устанавливается катетер для эмболэктомии 3F. Фиктивные элементы управления имеют отверстия для заусенцев, но не вводят катетер. Баллон надувают 0,3 мл воды в течение 2 минут и держат надутым в течение 1 часа. После 1 ч гемодинамического наблюдения сердца эксплантируют и помещают в изолированный рабочий контур перфузии сердца, записывают исходные измерения, проводят кардиоплегию и хранят сердца в холоде, как описано выше.

Основным ограничением использования перфузионного контура IWRH является невозможность использования перфузионного буфера на основе крови для циркуляции по системе. Было бы невозможно получить достаточное количество крови грызунов, чтобы добавить ее в перфузат; Таким образом, перфузия на основе крови невозможна. Альтернативные модели, такие как гетеротопическая трансплантация сердца грызунов или исследования ортотопической трансплантации сердца крупным животным, вероятно, потребуются для проверки влияния перфузии на основе крови. Тем не менее, эти альтернативные методы требуют знаний в области микрохирургии и/или хирургических учреждений для крупных животных, а также опытных анестезиологов, перфузиологов и кардиоторакальных хирургов.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Благодарности

Описанные здесь исследования были профинансированы за счет грантов, предоставленных.С. Макдональду от Национального совета по здравоохранению и медицинским исследованиям Австралии, Фонда клиники Святого Винсента и гранта старшего исследователя NSW Health Health Cardiovascular Research Capacity.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1,5 мл бесцветная трубка Eppendorff, 1000 в коробкеBio Strategy Pty Ltd0030.125.150
15 мл цент/трубки (S) Втулка/25 PP ctn/500Sigma-aldrich Pty LtdCLS430791-500ea
BP Преобразователь/кабель КомплектADInstrumentsMLT1199
Data Acquisition BridgeAmp ADInstrumentsFE221Data Acquisition
Carbogen 555G2BOCBOC002
Термометр Checktemp1Hanna InstrumentsHI98509Зажим для строительства буровой установки
Зажим 1/4-7/16 PK 12Thomas Scientific2848Y40Зажим для строительства буровой установки
с удлинителем стебля Med.Thomas Scientific8847T08Зажим для строительства буровой установки
с удлинительным штоком см.Thomas Scientific8847T02Монтажная установка
Строительные зажимы, сосуд, 60 г ДавлениеCoherent Scientific14121Хирургическое оборудование
Закрытый соединительThomas Scientific8847E25Конструкция буровой установки
Covidien Sofsilk 2-0 черный предварительно разрезанный 45 см коробка из 24специализированных медицинских принадлежностейS195Хирургические расходные материалы
Изготовленный на заказ Дегазатор с оболочкой 250 млИзготовленная на заказ выдувная стеклянная посуда Pty LtdN/AСтроительство буровой установки
на заказ Изготовленный на заказ резервуар объемом 750 млИзготовленная на заказ выдувная стеклянная посуда Pty LtdN/AКонструкция буровой установки
D-(+)-глюкоза безводная SigmaUltraSigma-aldrich Pty LtdG7528-1KgДля изготовления двухканальной консоли Krebs Buffer
TS402Data Acquisition
Erlenmyer flasks 2 L 
Фильтр Микрофибра тип GF/C стекловолокно 47 мм, 100Bio-strategy Pty Ltd1822047
Щипцы, 15 см, 0,3 мм, CRVDCoherent Scientific14114Хирургическое оборудование
Четырехзубые зажимы с рукой длиной 9 мм x 115 мм для удержания предметов диаметром 2-70 мм. Циркуляционный циркуляционный насос с виниловым покрытиемMet-App Australia Pty Ltd1352Буровая установка для строительства
термостата. Цифровое твердотельное управление. (1020 Вт/240 Вольт)Thermoline ScientificTU3Rig Construction
Heparin 5000 U/5 мл бокс 50 Pfizer 02112115Clffird Hallam Healthcare Pty Ltd1258693препараты
Ilium Xylazil 20 inj 50 млCenvet Australia Pty LtdX5010Анестетик
Johns Hopkins Bulldog ClampCoherent Scientific CS-WPI-14117
Кетамин 100 мг/50 млProvet (NSW) Pty LtdKETAI1Анестетик
сульфата магния гептагидрат AR 500 г ChemsupplyBio Strategy Pty LtdMA048-500gДля изготовления буфера Krebs
Папа/Мама Шарнирный адаптерThomas Scientific8847V08Буровая установка
Masterflex L/S Легкая нагрузочная головка для прецизионных трубок, PPS, роторCRSJohn Morris1015164Rig Construction
Ножницы Метценбаума, 11,5 см изогнутыеCoherent ScientificWPI-501748Хирургическое оборудование
Ножницы Метценбаума, 14,5 см прямыеCoherent ScientificWPI-501252Крепежные приспособления для хирургического оборудования
F/2-HEADS SSJohn Morris1014414Крепежные винты для головок насосов
Открытый соединительThomas Scientific8847E05Буровая установка
ПараформадегидSigma-AldrichP6148-500GОбработка образцов
Хлорид калия (AnalaR NORMAPUR) 500 гVWR Chemicals 26764.26Для изготовления буфера Krebs
Фосфат калия одноосновный Sigma-Aldrich Pty LtdP5379-500gДля изготовления буфера Krebs
Powerlab 2/26, 2-канальный рекордер + программное обеспечение Labchart программное обеспечениеADInstrumentsML826Компьютерное оборудование и программное обеспечение
Precision XN Встроенный датчик расхода, 3,2 мм (1/8")ID ME4PXN-KR37 XFADInstrumentsME4PXNRig Construction
Скальпель с ручкой одноразовый #11 pkt/10BSN Medical (Aust) Pty Ltd73252-36
Силиконовая прокладка для Swinnex 47 мм 5/PKMerck MilliporeSX0004701Rig Construction
Силиконовое уплотнительное кольцо 5-329 10/PKMerck MilliporeXX1104707Rig Construction
Single Buret ClampThomas Scientific8847T32Rig Construction
Съемное входное отверстие Фильтр размер пор 10 &; m (bubbler)Sigma-aldrich59277Rig Construction
Sm. 360 Вращательный соединительThomas Scientific8847E35Rig Construction
Бикарбонат натрияSigma-Aldrich PtyLtd S6297 - 250gДля изготовления буфера Krebs
Swinnex Filter Holder, 47 ммMerck MilliporeSX0004700Rig Construction
шприцы 1 мл коробка/100Becton Dickinson Pty Ltd302100
Трехзубцовые зажимы с диаметром 9 мм x длиной 125 мм и двойным винтом для удержания 5-80 ммMet-App Australia Pty Ltd1356Модуль
расходомера трубок TS410ADInstrumentsTS410Трубка для сбора данных
ПВХ 6,35 мм ID x 9,52 мм Наружный диаметр 50 футов Рулон 15,24 м, прозрачный, без фталатов DEHP, пищевой соответствует REACThermo FisherNAL 8701-0600Строительство буровой установки
Трубка ПВХ 7,94 мм ID x 11,1 мм Наружный диаметр 50 футов Рулон 15,24 м, прозрачный, DEHP без фталатов, пищевой сорт соответствует REACThermo FisherNAL 8701-0900Буровая
конструкция Трубка ПВХ 9,52 мм ID x 12,7 мм Наружный диаметр 100 футов РулонThermo FisherNAL 8701-4120Буровая установка Ванна
ножницы, 8,5 см, прямые, 7 мм лезвияCoherent ScientificWPI-500-086Хирургическое оборудование
Водяная баня 30 литров с подвесным поддономThermoline ScientificTLWB-30Rig Construction

Ссылки

  1. Kwan, J. C., Gao, L., Macdonald, P. S., Hicks, M. Cardio-protective signalling by glyceryl trinitrate and cariporide in a model of donor heart preservation. Heart Lung Circ. 24 (3), 306-318 (2015).
  2. Watson, A. J., et al. Enhanced preservation of the rat heart after prolonged hypothermic ischemia with erythropoietin-supplemented Celsior solution. J Heart Lung Transplant. 32 (6), 633-640 (2013).
  3. Chew, H. C., et al. Outcomes of donation after circulatory death heart transplantation in Australia. J Am Coll Cardiol. 73 (12), 1447-1459 (2019).
  4. Dhital, K. K., et al. Adult heart transplantation with distant procurement and ex-vivo preservation of donor hearts after circulatory death: a case series. Lancet. 385 (9987), 2585-2591 (2015).
  5. Joshi, Y., et al. Heart transplantation from DCD donors in Australia: Lessons learned from the first 74 cases. Transplantation. 107 (2), 361-371 (2023).
  6. Villanueva, J. E., et al. Functional recovery after dantrolene-supplementation of cold stored hearts using an ex vivo isolated working rat heart model. PLoS One. 13 (10), e205850(2018).
  7. Villanueva, J. E., et al. The cardioprotective potential of the sodium-glucose cotransporter 2 inhibitor empagliflozin in donor heart preservation. J Heart Lung Transplant. 39 (10), 1151-1153 (2020).
  8. Gao, L., et al. Critical role of the STAT3 pathway in the cardioprotective efficacy of zoniporide in a model of myocardial preservation - the rat isolated working heart. Br J Pharmacol. 162 (3), 633-647 (2011).
  9. Cropper, J. R., Hicks, M., Ryan, J. B., Macdonald, P. S. Cardioprotection by cariporide after prolonged hypothermic storage of the isolated working rat heart. J Heart Lung Transplant. 22 (8), 929-936 (2003).
  10. Gao, L., et al. Enhanced functional recovery of the heart donated after circulatory death determination with antemortem heparin. J Heart Lung Transplant. 39 (6), 607-609 (2020).
  11. Villanueva, J. E., et al. The effect of increasing donor age on myocardial ischemic tolerance in a rodent model of donation after circulatory death. Transplant Direct. 7 (6), e699(2021).
  12. Kumarasinghe, G., et al. Improved heart function from older donors using pharmacologic conditioning strategies. J Heart Lung Transplant. 35 (5), 636-646 (2016).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи