В данной статье описана идентификация пироптотических клеток с помощью проточной цитометрии после двойного окрашивания антителами против N-концевого фрагмента куриного GSDME (chGSDME-NT) и йодида пропидия (PI).
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Исследование пироптоза методом проточной цитометрии
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Пироптоз — это воспалительный тип запрограммированной гибели клеток, вызванный преимущественно образованием пор плазматической мембраны N-концом, образованным из расщепленных белков семейства Gasdermin (GSDM). Исследование прикрепленного к мембране GSDM-NT методом вестерн-блоттинга является наиболее часто используемым методом оценки пироптоза. Однако дифференцировать клетки с пироптозом от других форм клеточной гибели с помощью этого метода сложно. В этом исследовании клетки DF-1, инфицированные вирусом инфекционной бурсальной болезни (IBDV), были использованы в качестве модели для количественной оценки доли клеток, подвергающихся пироптозу, с помощью проточной цитометрии с использованием специфических антител против N-концевого фрагмента куриного GSDME (chGSDME-NT) и окрашивания йодидом пропидия (PI). ChGSDME-NT-положительные клетки были легко обнаруживаемы с помощью проточной цитометрии с использованием меченых Alexa Fluor 647 антител против chGSDME-NT. Более того, доля двойных положительных клеток chGSDME-NT/PI в клетках, инфицированных IBDV (около 33%), была значительно выше, чем в контрольной группе с фиктивным инфицированием (P < 0,001). Эти результаты указывают на то, что исследование мембраносвязанного chGSDME-NT с помощью проточной цитометрии является эффективным подходом для определения пироптотических клеток среди клеток, подвергающихся клеточной гибели.
Введение
Пироптоз является воспалительным типом запрограммированной гибели клеток, который в основном зависит от образования пор плазматической мембраны газдермином (GSDM) D у млекопитающих 1,2,3. Из-за генетической недостаточности GSDMD у цыплят 4,5 механизм пироптоза у цыплят остается неуловимым. Семейство Gasdermin включает консервативные белки, включая GSDMA, GSDMB, GSDMC, GSDMD, GSDME и DFNB59 3,6. Исследования показали, что GSDME из костистых рыб и уток расщепляется каспазой-1/3/7 или каспазой-3/7, вызывая гибель пироптотических клеток 7,8. Тем не менее, роль GSDME-опосредованного пироптоза в ответе хозяина на патогенные инфекции у цыплят еще предстоит выяснить.
Инфекционная бурсальная болезнь (ВЗК) — это острое, высококонтагиозное и иммуносупрессивное заболевание домашней птицы, вызываемое ВЗК9. IBDV, безоболочечный двухцепочечный РНК-вирус, принадлежит к роду Avibirnavirus семейства Birnaviridae10. Предыдущие исследования, проведенные другими организациями и нашей лабораторией, показали, что инфекция ВЗК вызывает гибель клеток хозяина различными путями 11,12,13,14. Предыдущие результаты показали, что инфекция IBDV вызывает высвобождение лактатдегидрогеназы (LDH), показателя гибели литических клеток 6,15, что позволяет предположить, что инфекция IBDV вызывает гибель литических клеток в клетках-хозяевах. Кроме того, данные показывают, что клетки, инфицированные IBDV, демонстрируют морфологические особенности пироптотической гибели клеток, включая набухание клеток с крупными пузырьками, выдувающимися из плазматической мембраны, и положительное окрашивание пропидида йодидом (PI), что позволяет предположить, что инфекция IBDV вызывает пироптоз в клетках.
Учитывая, что образование мембранных пор в пироптотических клетках N-концевым фрагментом расщепленного GSDM (GSDM-NT) является отличительной чертой пироптоза, теоретически пироптотические клетки могут быть обнаружены методом проточной цитометрии путем исследования GSDM-NT на клеточной мембране с использованием специфических антител. В пироптотических клетках птиц N-концевой фрагмент куриного гасдермина Е (chGSDME-NT) образует мембранные поры, позволяя йодиду пропидия (PI) проходить через ДНК и связываться с ней. Таким образом, долю пироптотических клеток можно определить с помощью проточной цитометрии, тем самым отличая пироптоз от других форм гибели клеток, таких как апоптоз и некроз. Однако о методе исследования пироптотических клеток методом проточной цитометрии не сообщалось. В этом исследовании клетки DF-1 были инфицированы IBDV, и была проведена проточная цитометрия для изучения пироптотических клеток с использованием моноклональных антител (MCAB) против фрагмента chGSDME-NT (мембранно-связанного) и окрашивания PI. Удивительно, но пироптотические клетки были эффективно обнаружены с помощью проточной цитометрии. Кроме того, можно количественно определить долю пироптотических клеток. Эти результаты являются мощным и эффективным средством для определения пироптоза.
В данной статье описан метод исследования пироптоза в клетках, инфицированных IBDV, методом проточной цитометрии с использованием окрашивания анти-chGSDME-NT McAb и PI. Этот метод также может быть распространен на другие клетки, инфицированные патогенами, и применен для исследования различных типов клеток с пироптозом, отличая их от других форм клеточной смерти.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Подробная информация о реагентах и оборудовании, использованном в исследовании, приведена в Таблице материалов.
1. Подготовка образцов ячеек
- Культивирование клеток DF-1 (бессмертных фибробластов куриного эмбриона) в шестилуночных планшетах (5 x 105 клеток на лунку) с модифицированной средой Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS) в инкубаторе с 5% содержаниемCO2 при 38 °C.
- Когда клетки достигнут 80% конфлюенции, выбросьте содержащую сыворотку среду для клеточных культур, трижды промойте клетки фосфатно-солевым буфером (PBS), а затем добавьте по 2 мл бессывороточной среды для клеточных культур в каждую лунку.
- Добавьте в каждую лунку вирусный раствор IBDV (содержащий рассчитанный MOI) и настройте фиктивный инфекционный контроль, добавив объем DMEM, равный объему вирусного раствора.
- После 1 ч адсорбции вируса выбросьте питательную среду, трижды промойте клетки PBS, добавьте в каждую лунку по 2 мл DMEM с добавлением 2% FBS и продолжайте культивирование клеток в течение 24 ч.
- Через 24 ч после инфекции ВЗК провести лечение трипсином (500 мкл на лунку) в течение 1 мин и затем нейтрализовать ДМЭМ с добавлением 10% FBS (2 мл на лунку). После этого клетки должны быть собраны для приготовления суспензий одиночных клеток для проточной цитометрии.
- Центрифугируйте ячейки при 400 x g в течение 5 мин при 2-8 °C. Выбросьте надосадочную жидкость с помощью пипетки.
- Повторно суспендируйте клеточную гранулу в PBS и аккуратно закрутите трубки в течение 3 с.
- Центрифугируйте ячейки, как описано на шаге 1.6 (400 x g в течение 5 мин при 2-8 °C).
- Повторите промывку ячеек, как описано в шаге 1.7 и шаге 1.8.
- Проведите подсчет клеток с помощью гемоцитометра под микроскопом. Затем ресуспендируйте клетки в соответствующем объеме буфера для окрашивания проточной цитометрией (так, чтобы конечная концентрация клеток составляла 1 x 107 клеток/мл). Аккуратно закрутите суспензии.
2. Окрашивание клеток для проточной цитометрии
- Добавьте 100 мкл одноклеточных суспензий из стадии 1,10 в 5 мл полистирольных пробирок с круглым дном (12 мм × 75 мм). Подготовьте фиктивные клетки и клетки, инфицированные IBDV, для окрашивания антителами к chGSDME-NT/CT и используйте нормальный мышиный IgG в качестве контроля изотипа. Тем временем подготовьте холостые контрольные и одиночные окрашенные пробирки с клетками, инфицированными IBDV.
- Добавьте 1 г либо меченного Alexa Fluor 647 анти-chGSDME-NT MCAB, либо анти-chGSDME-CT McAb или нормального мышиного IgG (в качестве изотипа контроля) в пробирки, инфицированные IBDV, и фиктивные контрольные пробирки соответственно. Впоследствии аккуратно проведите по трубкам вихрь в течение 3 с.
- Окрашенные клетки инкубировать при температуре 2-8 °C или на льду в течение 30 минут в темноте. Осторожно перекручивайте трубки каждые 10 минут.
- Промойте клетки 1 мл буфера для окрашивания проточной цитометрией центрифугированием при 400 x g в течение 5 мин при 2-8 °C. Выбросьте надосадочную жидкость с помощью пипетки.
- Повторите промывку ячеек, как описано в шаге 2.4.
- Ресуспендируйте гранулу в 100 мкл буфера для окрашивания проточной цитометрией.
- Окрашивают клетки группы, инфицированной IBDV, и псевдоинфицированной группы, а также PI-одинарно окрашенных пробирок 10 мкг/мл PI в течение 10 мин при комнатной температуре с последующим добавлением 400 мкл буфера для окрашивания проточной цитометрией для анализа проточной цитометрии.
3. Проведение анализа проточной цитометрии
- Включите проточный цитометр для инициализации прибора и запустите программное обеспечение.
- Начните с запуска пустой контрольной трубки, за которой последуют одиночные окрашенные трубки для регулировки напряжения и компенсационных параметров проточного цитометра. Используйте флуоресцентные каналы FL3 и FL4, которые излучают на длине волны 635 нм, для обнаружения флуорофоров PI и Alexa Fluor 647 соответственно.
- После настройки всех параметров последовательно запустите все сэмплы.
4. Анализ данных проточной цитометрии
- Проанализируйте окрашивание Alexa Fluor 647 каждого образца на гистограмме канала FL4.
- Чтобы оценить долю двойных положительных клеток в каждом образце, используйте четырехквадрантную точечную диаграмму FL3/FL4.
- Установите положительные пороговые значения на основе образцов с двойным окрашиванием IgG/PI с контролем изотипа, гарантируя, что доля двойных положительных клеток остается ниже 1%. Такой подход позволяет измерить долю двойных положительных клеток во всех образцах.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
chGSDME-NT на мембране клеток DF-1 с инфекцией IBDV может быть легко обнаружен с помощью проточной цитометрии
Одной из наиболее важных особенностей пироптотических клеток является образование мембранных пор фрагментами GSDM-NT, образующимися в результате расщепления Gasdermin. Таким образом, пироптотические клетки теоретически могут быть обнаружены с помощью проточной цитометрии путем исследования GSDM-NT на клеточных мембранах с использованием специфических антител.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В данной статье описан эффективный метод исследования пироптоза с помощью проточной цитометрии, полученный путем двойного окрашивания инфицированных клеток мечеными Alexa Fluor 647 анти-chGSDME-NT McAb и PI. Этот подход также может быть применен к различным типам клеток для дифференциации пироптоза от других типов клеточной гибели, таких как апоптоз и некроз.
Пироптоз, воспалительный тип запрограммированной гибели клеток, в первую очередь зависящий от образования D-индуцированных Ga...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Мы хотели бы поблагодарить доктора Цзюэ Лю за его любезную помощь. Данное исследование было поддержано грантами Национальной программы ключевых исследований и разработок Китая (No 2022YFD1800300), Национального фонда естественных наук Китая (No 32130105) и Целевого фонда современной системы исследований в области агропромышленных технологий (No 2022YFD1800300), Национального фонда естественных наук Китая (No ) и Целевого фонда современной системы исследований в области агропромышленных технологий (No 2022YFD1800300). CARS-40), Китай.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Полистирольная трубка с круглым дном объемом 5 мл (12 & 75 мм) | Corning Falcon | 352052 | |
| 6 лунок Cell Culture Plate | Corning 3516 | ||
| Alexa Fluor 647 наборы для мечения антител | Thermo Fisher Scientific | A20186 | |
| Anti-chGSDME-CT McAb | SAE Biomedical Tech Company (Чжуншань, Китай) | EU0228 | |
| Anti-chGSDME-NT McAb | SAE Biomedical Tech Company (Чжуншань, Китай) | EU0227 | |
| Программное обеспечение CellQuest | BD Biosciences | ||
| CO2 | инкубатор Thermo Fisher Scientific | 3100 | |
| Криогенная замораживающая центрифуга | Eppendorf | 5810R | |
| Модифицированная орлиная среда Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco by Life Technologies | C11995500BT | |
| Фетальная сыворотка крупного рогатого скота (FBS) | Sigma-Aldrich | F0193-500ML | |
| Проточный цитометр | BD Biosciences | FACSКалибур | |
| Проточная цитометрия Окрашивающий буфер | Thermo Fisher Scientific | 00-4222-26 | |
| Гемоцитометр | Цю-цзин Биохимический реактив и Instrument Company (Шанхай, Китай) | YX-JSB52 | |
| штамм IBDV Lx штамм | IBDV Lx был любезно предоставлен доктором Цзюэ Лю, Пекинская академия сельского и лесного хозяйства, Пекин, Китай | ||
| Инвертированный микроскоп | Chongqing Photoelectric Instrument Company | XDS-1B | |
| Нормальная мышь IgG | Santa Cruz Biotechnology | sc-2025 | |
| Фосфатный буферный раствор (PBS) | Слияния и поглощения С Генная технология | CC017 | |
| Пропидид йодид(ПИ) | Сигма-Олдрич | P4170 | |
| Трипсин-ЭДТА, 0,25% | M& С Генотехника | CC008 | |
| Вихревой генератор | MIULAB | MIX-28+ |
Ссылки
- He, W. T., et al. Gasdermin D is an executor of pyroptosis and is required for interleukin-1β secretion. Cell Res. 25 (12), 1285-1298 (2015).
- Kayagaki, N., et al. Caspase-11 cleaves Gasdermin D for non-canonical inflammasome signalling. Nature. 526 (7575), 666-671 (2015).
- Shi, J., et al. Cleavage of GSDMD by inflammatory caspases determines pyroptotic cell death. Nature. 526 (7575), 660-665 (2015).
- Angosto-Bazarra, D., et al. Evolutionary analyses of the Dasdermin family suggest conserved roles in infection response despite loss of pore-forming functionality. BMC Biol. 20 (1), 9(2022).
- De Schutter, E., et al. Punching holes in cellular membranes: Biology and evolution of gasdermins. Trends Cell Biol. 31 (6), 500-513 (2021).
- Kovacs, S. B., Miao, E. A. Gasdermins: Effectors of pyroptosis. Trends Cell Biol. 27 (9), 673-684 (2017).
- Jiang, S., Gu, H., Zhao, Y., Sun, L. Teleost gasdermin E is cleaved by caspase 1, 3, and 7 and induces pyroptosis. J Immunol. 203 (5), 1369-1382 (2019).
- Li, H., et al. Duck gasdermin E is a substrate of caspase-3/-7 and an executioner of pyroptosis. Front Immunol. 13, 1078526(2022).
- Müller, H., Islam, M. R., Raue, R. Research on infectious bursal disease-the past, the present and the future. Vet Microbiol. 97 (1), 153-165 (2003).
- Müller, H., Scholtissek, C., Becht, H. The genome of infectious bursal disease virus consists of two segments of double-stranded RNA. J Virol. 31 (3), 584-589 (1979).
- Cubas-Gaona, L. L., Diaz-Beneitez, E., Ciscar, M., Rodríguez, J. F., Rodríguez, D. Exacerbated apoptosis of cells infected with infectious bursal disease virus upon exposure to interferon alpha. J Virol. 92 (11), (2018).
- Duan, X., et al. Epigenetic upregulation of chicken microRNA-16-5p expression in DF-1 cells following infection with infectious bursal disease virus (IBDV) enhances IBDV-induced apoptosis and viral replication. J Virol. 94 (2), e01724(2020).
- Li, Z., et al. Critical role for voltage-dependent anion channel 2 in infectious bursal disease virus-induced apoptosis in host cells via interaction with VP5. J Virol. 86 (3), 1328-1338 (2012).
- Rodríguez-Lecompte, J. C., Niño-Fong, R., Lopez, A., Frederick Markham, R. J., Kibenge, F. S. Infectious bursal disease virus (IBDV) induces apoptosis in chicken B cells. Comp Immunol Microbiol Infect Dis. 28 (4), 321-337 (2005).
- Wang, S., Liu, Y., Zhang, L., Sun, Z. Methods for monitoring cancer cell pyroptosis. Cancer Biol Med. 19 (4), 398-414 (2021).
- Zhang, Y., Chen, X., Gueydan, C., Han, J. Plasma membrane changes during programmed cell deaths. Cell Research. 28 (1), 9-21 (2018).
- Chen, X., et al. Pyroptosis is driven by non-selective gasdermin-d pore and its morphology is different from mlkl channel-mediated necroptosis. Cell Research. 26 (9), 1007-1020 (2016).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
