Методическая статья

Митохондриальный перенос с помощью туннельных нанотрубок между мезенхимальными стволовыми клетками и пигментным эпителием сетчатки in vitro

1.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/66917

⸱

4 октября 2024 г.

 , 
1Beijing Institute of Ophthalmology, Beijing Tongren Eye Center, Beijing Tongren Hospital, Capital Medical University

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем протокол, включающий митохондриальную трассировку, процедуры прямого совместного культивирования мезенхимальных стволовых клеток (МСК) и клеток пигментного эпителия сетчатки (ARPE19), а также методы наблюдения и статистического анализа образования туннельных нанотрубок (TNT) и митохондриального переноса для характеристики митохондриального обмена через TNT между МСК и клетками ARPE19.

Аннотация

Митохондриальный перенос является нормальным физиологическим явлением, которое широко распространено среди различных типов клеток. В исследовании на сегодняшний день наиболее важным путем для митохондриального транспорта является туннельирование нанотрубок (ТНТ). Было проведено много исследований, в которых сообщалось, что мезенхимальные стволовые клетки (МСК) могут переносить митохондрии в другие клетки с помощью тротила. Тем не менее, немногие исследования продемонстрировали феномен двунаправленного митохондриального переноса. В нашем протоколе описывается экспериментальный подход к изучению феномена митохондриального переноса между МСК и пигментными эпителиальными клетками сетчатки in vitro с помощью двух методов митохондриального отслеживания.

Мы совместно культивировали мито-GFP-трансфицированные МСК с мито-RFP-трансфицированными клетками ARPE19 (линия пигментных эпителиальных клеток сетчатки) в течение 24 ч. Затем все клетки окрашивали фаллоидином и визуализировали с помощью конфокальной микроскопии. Мы наблюдали митохондрии с зеленой флуоресценцией в клетках ARPE19 и митохондрии с красной флуоресценцией в МСК, что указывает на двунаправленный митохондриальный перенос между МСК и клетками ARPE19. Это явление говорит о том, что митохондриальный транспорт является нормальным физиологическим явлением, которое также происходит между МСК и клетками ARPE19, а перенос митохондрий от МСК к клеткам ARPE19 происходит гораздо чаще, чем наоборот. Наши результаты указывают на то, что МСК могут переносить митохондрии в пигментный эпителий сетчатки, а также предсказывают, что МСК могут реализовать свой терапевтический потенциал через митохондриальный транспорт в пигментном эпителии сетчатки в будущем. Кроме того, перенос митохондрий от клеток ARPE19 к МСК еще предстоит дополнительно изучить.

Введение

Митохондрии служат основным источником энергии для большинства типов клеток, при этом митохондриальная дисфункция особенно влияет на ткани с высокими требованиями к энергии, такие как сетчатка1. Метаболические изменения в сетчатке могут вызвать биоэнергетический кризис, в конечном итоге приводящий к гибели фоторецепторов и/или клеток РПЭ2. Методы лечения на основе мезенхимальных стволовых клеток (МСК) продемонстрировали эффективность в лечении дегенерации глаз, и одним из точных механизмов, лежащих в основе благотворного воздействия МСК на ткани сетчатки, может быть отнесен к функциональному митохондриальному переносу 3,4,5,6. В 2004 году Rustom et al. впервые сообщили о феномене митохондриального переноса через новое межклеточное взаимодействие, облегчаемое туннельными нанотрубками (TNT)7.

В 2D-культуре туннельные нанотрубки (ТНТ) идентифицируются по их тонким (20-700 нм) мембранным выступам длиной от десятков до сотен нанометров, которые подвешены над подложкой и могут непосредственно устанавливать связи между двумя или более гомотипическими и гетеротипическими клетками. Эти структуры значительно обогащены F-актином и облегчают транспортировку грузов, таких как митохондрии, между клетками. Кроме того, тротилы обладают отверстиями на обоих концах, что обеспечивает непрерывность цитоплазматического содержимого между взаимосвязаннымиклетками8.

Трудно обнаружить TNT-опосредованный митохондриальный перенос in vivo из-за плотного клеточного расположения и проблем с отслеживанием митохондрий. Эксперименты in vitro с использованием методов кокультивирования клеток и митохондриального отслеживания позволяют наблюдать за образованием тротила и переносом митохондрий 8,9. Мы также наблюдали феномен TNT-опосредованного митохондриального переноса путем совместного культивирования МСК и клеток пигментного эпителия сетчатки in vitro10.

Во многих предыдущих исследованиях наблюдался только однонаправленный перенос митохондрий от МСК к другим клеткам 3,4,5,6. Ранее мы также пытались проанализировать двунаправленный митохондриальный перенос с использованием двух видов клеток, помеченных зеленым и красным мито-трекером соответственно, но перекрестные помехи красителей мешали экспериментальным результатам. Для более точного изучения митохондриального двунаправленного переноса мы сконструировали две клеточные линии с разной митохондриальной флуоресценцией с помощью техники лентивирусной трансфекции, а затем наблюдали и анализировали явления образования тротила и двунаправленного митохондриального переноса путем прямого совместного культивирования in vitro.

Вкратце, здесь описан пошаговый и действенный протокол, позволяющий отслеживать митохондрии, совместно культивировать МСК с клетками ARPE19, а также анализировать образование тротила и перенос митохондрий. Результаты этого эксперимента продемонстрировали TNT-опосредованный двунаправленный митохондриальный перенос, что не только доказало, что митохондриальный транспорт является распространенным физиологическим явлением, но и показало потенциальную терапевтическую способность МСК к клеткам сетчатки.

Протокол

1. Генерация клеточных линий MSC-mito-GFP и ARPE19-mito-RFP

  1. Культура клеток
    ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве примера здесь используются только MSC.
    1. Культивируют человеческие МСК в 6-луночном планшете в среде hMSC с 1% пенициллином и стрептомицином (см. Таблицу материалов) до тех пор, пока плотность клеток не достигнет 80%-90%. В зависимости от плотности роста клеток меняйте среду один раз в 2-3 дня.
      1. Удалите исходную среду и промойте клетки фосфатно-солевым буфером (DPBS) (см. Таблицу материалов). Добавьте 1 мл смеси трипсин-ЭДТА-ДПБС (0,05% Трипсин-ЭДТА: 0,25% Трипсин-ЭДТА, разведенный с помощью ДПБС в соотношении 1:5; см. Таблицу материалов) и инкубируйте в течение 3-4 мин (в зависимости от клеток) в инкубаторе при температуре 37 °С.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Наблюдайте за перевариванием клеток под микроскопом и остановите переваривание, если большинство клеток округлые и отделенные.
      2. Осторожно постучите по 6-луночной пластине, чтобы отделить прилипшие к поверхности клетки, а затем добавьте 1 мл свежей готовой среды, чтобы завершить переваривание.
      3. Аккуратно ресуспендируйте все клетки с помощью пистолета-пипетки, а затем перенесите все собранные клетки в центрифужную пробирку объемом 15 мл.
      4. Центрифугируйте клетки при 200 × г в течение 5 минут.
      5. Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки, добавив 1 мл свежей среды. Возьмите 10 мкл клеточной суспензии для подсчета клеток.
      6. За 18-24 ч до лентивирусной трансфекции высевают МСК клетки плотностью 1 × 105 клеток на лунку в 6-луночные планшеты, гарантируя, что плотность клеток на момент трансфекции составляет примерно 50%.
  2. Трансфекция лентивируса
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все операции, связанные с лентивирусной трансфекцией, должны выполняться в шкафу биобезопасности.
    1. На следующий день замените исходную среду 2 мл свежей среды и добавьте 25 мкл суспензии лентивируса (5,00E+08 TU/мл) с адъювантами с последующей инкубацией при 37 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Упаковка лентивируса была выполнена с использованием плазмиды Mito-GFP (pCT-Mito-copGFP) (см. Таблицу материалов и дополнительный рисунок S1) компанией.
    2. Через 6 ч инкубации замените вируссодержащую среду 2 мл свежей среды. Продолжайте инкубацию и меняйте среду один раз в день.
      Значительная экспрессия митохондриальной флуоресценции наблюдается в МСК через 48 ч после трансфекции, с дальнейшим усилением, заметным через 72 ч.
    3. Скрининг успешно трансфицированных клеток путем добавления в культуральную среду пуромицина (1 мкг/мл) через 2 дня после трансфекции. Одновременно добавьте эквивалентную концентрацию пуромицина к мезенхимальным стволовым клеткам, не имеющим вирусной трансфекции, в качестве контроля.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вирусный вектор mito-GFP спроектирован таким образом, чтобы включать в себя ген устойчивости к пуромицину.
    4. Ежедневно меняйте среду с введением пуромицина (1 мкг/мл). Прекратите прием пуромицина после почти полной гибели клеток в контрольной группе.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Среда не содержит этой концентрации пуромицина. Добавление пуромицина требуется только при добавлении среды в 6-луночный планшет.
    5. Продолжайте культивирование без пуромицина, пока клетки не пройдут и не заморозятся. Назовите этот тип ячейки MSC-mito-GFP.
      Примечание: Клетки ARPE19 были получены из банка клеток ATCC и культивировались в DMEM/F12, содержащем 10% FBS и 1% пенициллина и стрептомицина (см. Таблицу материалов), а методы их расщепления и пассажа такие же, как и у МСК. Плазмида Mito-RFP была модифицирована из Mito-GFP компанией. Наконец, мы назвали успешно трансфицированные клетки как ARPE19-mito-RFP.

2. Прямая кокультура клеток МСК и ARPE19

ПРИМЕЧАНИЕ: В этой системе совместного культивирования клетки MSC-mito-GFP будут служить донорскими клетками, в то время как клетки ARPE19-mito-RFP будут функционировать как клетки-реципиенты. Чтобы различить донорские и реципиентные клетки, мы проследили клетки реципиента.

  1. Пометьте клетки ARPE19-mito-RFP CellTrace Violet (см. Таблицу материалов) в цитоплазматической мембране.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Возбуждение и излучение красителя CellTrace violet составляют 405 нм и 450 нм соответственно.
    1. Приготовьте исходный раствор CellTrace Violet (см. Таблицу материалов), добавив 20 мкл диметилсульфоксида (ДМСО) во флакон реагента CellTrace Violet и хорошо перемешайте непосредственно перед использованием.
    2. Вырастите ячейки ARPE19-mito-RFP до желаемой плотности 80%-90%.
    3. Разбавьте стоковый раствор CellTrace Violet в предварительно подогретом (37 °C) DPBS до желаемой рабочей концентрации (1:1 000). Это решение для погрузки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Разведение CellTrace Violet должно проводиться с помощью DPBS и не может быть заменено питательной средой, так как это приведет к очень плохим результатам окрашивания.
    4. Удалите питательную среду и замените ее 1 мл загрузочного раствора. Инкубируйте клетки в течение 10 минут при 37 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если позволяют условия, окрашивание можно наблюдать под флуоресцентным микроскопом уже через 5 минут. Окрашивание можно прекратить, как только будут достигнуты желаемые результаты, так как некоторые клетки могут не переносить длительного воздействия DPBS.
    5. Удалите загрузочный раствор, промойте ячейки 2 раза DPBS и замените 2 мл свежей готовой среды. Инкубируйте клетки в течение не менее 10 минут после окрашивания, чтобы CellTrace Violet подвергся гидролизу ацетата.
      Примечание: Этот шаг необходим для того, чтобы клетки вернулись в свое оптимальное состояние и не мешали последующим экспериментам.
  2. Приготовьте планшет на 24 лунки, добавив в каждую лунку по 50 μл DPBS. Затем вставьте покровное стекло (с указанным диаметром 15 мм) (см. Таблицу материалов) в пластину и дайте ему отстояться в течение 1 минуты. Извлеките DPBS из лунок, используя отрицательное давление, чтобы убедиться, что заслонка крышки находится близко к дну чашки.
  3. Трипсинизируйте донорские МСК и реципиентные клетки ARPE19, как описано в шаге 1.1.1.
  4. Подсчет ячеек
    1. Поместите 10 мкл клеточной суспензии на счетную пластину для подсчета.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если плотность клеток слишком высока, их можно разбавить средой в 10 раз, а затем действовать, как описано выше.
    2. Засейте 10 000 МСК и 10 000 клеток ARPE19 в 500 мкл среды на лунку 24-луночного планшета. Хорошо перемешайте ячейки перед добавлением их в 24-луночный планшет. Смотрите расчеты, показанные ниже, с учетом количества МСК А/мл и количества клеток ARPE19 В/мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для 4 лунок требуется 40 000 МСК и 40 000 элементов ARPE19 в 2 мл среды.
      Объем суспензии МСК (С), содержащей 40 000 МСК = 40 000/А μл
      Объем суспензии ARPE19 (D), содержащей 40 000 МСК = 40 000/B μл
      Дополните объем до 2 мл 2 - (C + D) мл среды.
  5. Понаблюдайте за клетками под микроскопом, встряхните планшет до равномерного распределения клеток, а затем инкубируйте их в культуре в течение 24 ч.

3. Непрямая кокультура клеток МСК и ARPE19 в трансвелл-системе

  1. Выполните культивирование клеток, мечение, расщепление и подсчет, как описано в шагах с 2.1 по 2.4.1.
  2. Засейте 20 000 клеток ARPE19 в 1 мл среды на лунку 24-луночного планшета.
    Примечание: В этом эксперименте мы использовали клетки ARPE19 без меченых митохондрий.
  3. Поместите вставку в лунку, в которую была засеяна ячейка.
  4. Засейте 10 000 МСК в 100 мкл среды в верхней камере ячейки на лунку.
  5. Повторите шаг 2.5.

4. Окрашивание цитоскелета

ПРИМЕЧАНИЕ: Беречь от света на протяжении всего эксперимента.

  1. Удалите среду из 24-луночных планшетов. Промойте все клетки один раз 500 мкл 4% полиформальдегида (PFA), добавьте 500 мкл свежего 4% PFA и зафиксируйте образцы на 20 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вставки трансвелл-системы отбраковываются.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку нанотрубки очень хрупкие, мы промыли клетки непосредственно 4% PFA вместо DPBS, чтобы максимизировать сохранение неповрежденных нанотрубок.
  2. Снимите фиксатор и промойте образцы в течение 3 x 10 минут с помощью DPBS.
  3. Добавьте 500 л/лунку блокирующего раствора, состоящего из 0,5% Triton X-100 (см. Таблицу материалов) и 4% бычьего сывороточного альбумина (BSA) (см. Таблицу материалов) и инкубируйте в течение 1 ч при комнатной температуре.
  4. Удалите блокирующий раствор и промойте образцы в течение 3 x 10 минут с помощью DPBS.
  5. Приготовление окрашивающего раствора фаллоидина (см. Таблицу материалов)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Возбуждение и излучение фаллоидина составляют 650 нм и 668 нм соответственно.
    1. Приготовьте исходные растворы, растворив содержимое флакона в 150 μл безводного ДМСО, чтобы получить 400-кратный исходный раствор.
    2. Приготовьте раствор для окрашивания, разбавив накопительный раствор 400x до 1x с DPBS. Это раствор для окрашивания фаллоидином.
  6. Добавьте в каждую лунку по 200 μл раствора для окрашивания фаллоидина и инкубируйте в течение 1 ч при комнатной температуре.
  7. Восстановите раствор для окрашивания и промойте образец 3 x 10 мин с помощью DPBS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При промывке клеток с помощью DPBS пластину лучше оставить на шейкере.
  8. Выньте покровное стекло иглой для шприца и дайте ему высохнуть на воздухе.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальным считается состояние, в котором на покровном стекле не видно видимой жидкости, но оно также не является сухим.
  9. Нанесите небольшое количество монтажного материала (см. Таблицу материалов) на предметное стекло и осторожно переверните защитное стекло на предметном стекле, чтобы убедиться, что средство равномерно покрывает всю поверхность. Заклейте края лаком для ногтей.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подождите несколько минут, чтобы лак для ногтей высох.
  10. Сделайте конфокальный снимок быстро или перенесите его в коробку для среза и храните при температуре 4 °C в течение короткого времени.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Идеальное время хранения - 2 недели. Если это время будет превышено, эффект визуализации может ухудшиться.

5. Конфокальная визуализация

ПРИМЕЧАНИЕ: Конфокальная визуализация выполняется в соответствии с руководством по эксплуатации и может различаться в зависимости от микроскопа. Здесь мы приведем лишь некоторые из ключевых шагов.

  1. Запустите конфокальный микроскоп и откройте четыре лазерных канала (405, 488, 561, 640) в соответствии с инструкцией по эксплуатации.
  2. Получите доступ к программному обеспечению на компьютере и выполните предварительную параметризацию программного обеспечения.
    1. Добавьте флуоресцентные каналы CF-405, CF-488, CF-561 и CF-640 в панель управления процессами .
    2. Отрегулируйте время экспозиции каждого флуоресцентного канала на 200 мс и установите интенсивность усиления на 2 на панели управления камерой .
    3. Отрегулируйте сумматор лазер/светодиод на значение 80.
  3. Манипулируйте внешней панелью управления микроскопа, чтобы отрегулировать линзу объектива до 20-кратного увеличения и убедиться, что объектив установлен на самом низком уровне.
  4. Расположите слайд в перевернутом положении на несущем столе.
  5. Активируйте лазер с длиной волны 405 нм и управляйте фокусировкой с помощью спиралей грубой и тонкой фокусировки. Наблюдайте за образцом под окуляром до тех пор, пока не станут видны синие флуоресцентные клетки.
  6. Выберите Live Imaging (Визуализация в реальном времени ) в программном интерфейсе компьютера, переключитесь на канал CF-405 и отрегулируйте тонкую фокусировочную спираль до тех пор, пока на экране компьютера не появится отчетливое изображение клеток с синей флуоресценцией.
  7. Отрегулируйте объектив до 40-кратного увеличения и перейдите в режим CF-640, затем тщательно отрегулируйте фокус до тех пор, пока не станет видна отчетливая структура ячеистых микронитей.
  8. Поддержание постоянного фокусного расстояния позволяет последовательно переключаться на каналы CF-405, CF-488 и CF-561 и изменять параметры оптимального времени экспозиции, интенсивности усиления и сумматора лазер/светодиод для получения изображений в каждом канале, по мере необходимости.
  9. Активируйте функцию Z Image Stack и определите начальную и конечную точки оси Z, манипулируя фокусным расстоянием для захвата изображения с глубиной с помощью оси Z.
  10. Нажмите кнопку « Старт » на панели «Управление процессами », чтобы сделать снимок.
  11. Выберите 10 полей просмотра случайным образом для каждого среза.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не должно быть перекрытия между любыми двумя полями зрения.
  12. Активируйте функцию интервальной съемки, указав общую продолжительность изображения 24 часа и интервал фотосъемки 5 минут после определения желаемого поля зрения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы захватить последовательность покадровой съемки, необходимо инокулировать клетки в чашке со стеклянным дном и поместить их в вентилируемую коробку, содержащую 5% газаCO2 .
  13. Сохраняйте и экспортируйте все изображения.
    Примечание: Для более тщательного изучения тротила и митохондриального переноса была использована визуализация сверхвысокого разрешения. Визуализация со сверхвысоким разрешением была выполнена с помощью коммерциализированной HIS-SIM, получившей название HIS-SIM (High Intelligent and Sensitive SIM), предоставленной компанией. Изображения были получены с помощью масляного иммерсионного объектива 100x/1.5 NA.

6. Анализ данных

  1. Для статистического анализа каждого изображения количественно определите общее количество клеток, количество нанотрубок, количество фиолетово-положительных клеток ARPE19-mito-RFE, количество фиолетово-положительных клеток, проявляющих зеленую флуоресценцию (представляющее количество клеток ARPE19 с митохондриальным переносом из МСК) и количество фиолетово-отрицательных клеток, проявляющих красную флуоресценцию (представляющее количество клеток МСК с митохондриальным переносом из клеток ARPE19).
    1. Чтобы количественно оценить образование тротила, рассчитайте отношение количества межклеточных нанотрубок к общему числу клеток.
    2. Рассчитайте скорость митохондриального переноса как отношение числа фиолетово-положительных клеток, проявляющих зеленую флуоресценцию, к общему числу фиолетово-положительных клеток (представляющее митохондриальный перенос от МСК к клеткам ARPE19) или отношение числа фиолетово-отрицательных клеток, проявляющих красную флуоресценцию, к общему числу фиолетово-отрицательных клеток (представляющее собой митохондриальный перенос из клеток ARPE19 в МСК).

Результаты

Принципиальная диаграмма, иллюстрирующая прямую кокультуру мезенхимальных стволовых клеток (МСК) и клеток ARPE19, изображена на рисунке 1. МСК, сконструированные для экспрессии mito-GFP, в качестве донорских клеток и клеток ARPE19-mito-RFP с цитоплазматическими мембранами, меченными фиолетовым цветом, в качестве клеток-реципиентов были совместно культивированы в соотношении 1:1. После 24-часового периода совместного культивирования клетки были окрашены на фаллоидин и исследованы с помощью конфокальной микроскопии. Полученные клеточные популяции включали клетки MSC-mito-GFP, клетки ARPE19-mito-RFP, клетки ARPE19-mito-RFP, содержащие mito-GFP, и клетки MSC-mito-GFP, содержащие mito-RFP. Примечательно, что присутствие mito-GFP в клетках ARPE19 и mito-RFP в МСК предполагает митохондриальный двунаправленный перенос.

Конкретные детали формирования тротила представлены на рисунке 2. Эти структуры могут устанавливать межклеточные связи между клетками одного типа (рисунок 2A-C), а также между клетками разных типов (рисунок 2D). Туннельные нанотрубки (ТНТ) служат в качестве каналов, соединяющих соседние клетки, демонстрируя характерную мембранную структуру, богатую F-актином, с открытыми концами, облегчающими цитоплазматическую непрерывность и транспорт митохондрий. С помощью визуализации по оси Z очевидно, что тротилы не прочно закреплены во внеклеточном матриксе, а скорее подвешены в питательной среде, что отличает их от обычных клеточных выступов. Митохондриальный перенос очевиден на рисунке 3, где фиолетово-положительные клетки ARPE19 демонстрируют дисперсную флуоресценцию с зелеными точками, указывающую на митохондрии, происходящие из МСК (рисунок 3A). Фиолетово-отрицательные МСК, содержащие флуоресценцию с красными точками, представляют собой митохондриальный перенос из клеток ARPE19 (рис. 3B). На рисунке 4 показано формирование ТНТ и перенос митохондрий при визуализации со сверхвысоким разрешением, с помощью которой мы можем увидеть более подробную информацию о переносе митохондрий через ТНТ. На видео 1 показана динамика митохондриального транспорта через тротил.

Чтобы еще раз продемонстрировать, что предпосылкой для митохондриального переноса является физический контакт, такой как ТНТ, а не митохондриальная секреция и поглощение, мы использовали ранее описанный метод совместного культивирования10. Как показано на рисунке 5А, МСК и клетки ARPE19 засеивали в верхнюю и нижнюю камеры трансвелл-планшета соответственно. Они были разделены фильтром с порами 0,4 мкм, который блокировал прямой контакт между МСК и клетками ARPE19, но позволял проходить митохондриям. После 24 ч совместного культивирования были проанализированы клетки ARPE19 в нижней камере, и было обнаружено небольшое количество мито-GFP из МСК в верхней камере (рис. 5B). Эти результаты свидетельствуют о том, что митохондриальный перенос требует прямого контакта между МСК и клетками ARPE19.

В конечном счете, была проведена количественная оценка образования тротила и митохондриального переноса, соответствующие результаты представлены на рисунке 6. МСК были значительно более способны к донорству митохондрий, чем клетки ARPE19 (p = 0,0286). Эти результаты указывают на то, что МСК обладают способностью переносить митохондрии в клетки пигментного эпителия сетчатки.

figure-results-1
Рисунок 1: Схематическое изображение кокультуры МСК и клеток ARPE19. МСК, экспрессирующие mito-GFP и ARPE19-mito-RFP клетки, меченные CellTrace Violet, совместно культивируют в течение 24 ч в соотношении 1:1. Mito-GFP в фиолетовых+ клетках отмечает перенос митохондрий от МСК к клеткам ARPE19, в то время как Mito-RFP в фиолетовых клетках отмечает перенос митохондрий из клеток ARPE19 в МСК. Сокращения: GFP = зеленый флуоресцентный белок; RFP = красный флуоресцентный белок; МСК = мезенхимальные стволовые клетки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2: Образование тротила между МСК и клетками ARPE19. Белые стрелки указывают на образование тротила, зеленые стрелки указывают на митохондрии с мито-GFP, а красные стрелки указывают на митохондрии с мито-RFP. (А,Б) Образование тротила между клетками ARPE19. (C) Образование тротила между МСК. (D) Образование тротила между МСК и клетками ARPE19. Визуализация по оси Z, показывающая тротиловые вещества, взвешенные в питательной среде. Масштабные линейки = 25 μм. Сокращения: МСК = мезенхимальные стволовые клетки; ТНТ = туннельные нанотрубки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-3
Рисунок 3: Перенос митохондрий от МСК к клеткам ARPE19. (A) Белый пунктирный круг указывает на перенос митохондрий (mito-GFP) из МСК в клетки ARPE19, а (B) желтый пунктирный круг указывает на митохондриальный (mito-RFP) перенос из клеток ARPE19 в МСК. Масштабные линейки = 20 мкм. Сокращение: GFP = зеленый флуоресцентный белок; RFP = красный флуоресцентный белок; МСК = мезенхимальные стволовые клетки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-4
Рисунок 4: Образование ТНТ и митохондриальный перенос между МСК и клетками ARPE19 с помощью микроскопии сверхвысокого разрешения. (A и B) Транспорт митохондрий от МСК к клеткам ARPE19. (C) Детализация тротила при съемке со сверхвысоким разрешением. (D) Зеленые митохондрии из МСК, присутствующие в клетках ARPE19 при визуализации со сверхвысоким разрешением. Масштабная линейка = 5 мкм. Сокращения: МСК = мезенхимальные стволовые клетки; ТНТ = туннельные нанотрубки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-5
Рисунок 5: Почти неопределяемый митохондриальный перенос при непрямой кокультуре в трансвелл-системе МСК и клеток ARPE19. (А) Схематическое изображение ко-культуры МСК и клеток ARPE19 в трансвелл-системе. (B) Репрезентативные изображения клеток ARPE19 в нижней части трансвелл-планшета после непрямого совместного культивирования с МСК в течение 24 ч. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-6
Рисунок 6: Количественная оценка образования тротила и митохондриального переноса. (А) образование тротила, (Б) митохондриальный перенос. Сокращения: М = МСК = мезенхимальные стволовые клетки; A = ячейки ARPE19; ТНТ = туннельные нанотрубки; M-A = образование тротила между МСК и клетками ARPE19; M-M = образование тротила между МСК; A-A = образование тротила между клетками ARPE19. n = 4, среднее значение ± SD, U-критерий Манна-Уитни, *p < 0,05. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Дополнительный рисунок S1: Картирование плазмиды pCT-Mito-copGFP. Приобретена компания Mito-GFP (CYTO102-PA-1). Цито-индикатор митохондрий, pCT-Mito-GFP (CMV), сливается с copGFP через метку Cox8, что приводит к мечению митохондрий copGFP. Это слияние copGFP управляется промотором ЦМВ, обеспечивая устойчивую экспрессию в клеточных линиях, таких как HeLa, HEK293 и HT1080. Mito-RFP был модифицирован из mito-GFP путем замены GFP на RFP; он несет ген устойчивости к пуромицину. Лентивирусная упаковка этой плазмиды производится специализированными компаниями. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Видео 1: TNT-опосредованный митохондриальный транспорт между МСК и клетками ARPE19. Тротил образуется за счет двунаправленного движения клеток МСК и ARPE19, облегчая перенос митохондрий от клеток МСК к клеткам ARPE19. Сокращения: МСК = мезенхимальные стволовые клетки; ТНТ = туннельные нанотрубки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать это видео.

Обсуждение

Многочисленные исследования показали, что феномен тротил-опосредованного митохондриального переноса является преобладающим физиологическим процессом в различных типах клеток тканей 10,11,12,13. Функциональное донорство митохондрий из МСК клеткам с митохондриальной дисфункцией демонстрирует сильный терапевтический потенциал 3,14,15,16,17,18.

Здесь, чтобы представить TNT-опосредованный двунаправленный митохондриальный перенос между МСК и клетками ARPE19, мы построили клеточные линии MSC-mito-GFP и ARPE19-mito-RFP. Затем два вида клеток подвергались совместному культивированию в течение 24 ч, а в конце совместного культивирования проводилось окрашивание цитоскелета. С помощью конфокальной визуализации мы наблюдали и подсчитывали образование тротила и скорость митохондриального переноса. На результаты этих наблюдений могут влиять такие факторы, как доля совместно культивируемых клеток и плотность клеток. Во время совместного культивирования крайне важно тщательно перемешать два типа клеток и поддерживать их в одноклеточном состоянии, чтобы свести к минимуму образование клеточных колоний гомотипическими клетками, тем самым уменьшая частоту митохондриального переноса между двумя типами клеток.

Проточный цитометрический анализ также может быть использован для анализа скорости митохондриального переноса, и этот метод проще, чем поствизуальная статистика. Однако скорость митохондриального переноса, рассчитанная с помощью этого метода, будет несколько ниже фактического значения, поскольку небольшие объемы митохондриального переноса могут не регистрироваться. В этом протоколе подсчет результатов визуализации должен проводиться очень тщательно, чтобы избежать пропусков или неправильного подсчета флуоресцентных паразитных сигналов.

Изучение двунаправленного митохондриального переноса путем конструирования двух клеточных линий с митохондриальной флуоресценцией является инновацией этого протокола. Этот метод позволяет избежать интерференции флуоресцентных красителей и делает экспериментальные результаты более достоверными. Перенос митохондрий из клеток сетчатки в МСК заслуживает дальнейшего изучения, например, для изучения изменений в доле митохондрий, передаваемых в обоих направлениях в стрессовых условиях.

Придерживаясь экспериментальных процедур, изложенных в этом протоколе, мы смогли установить, что МСК могут переносить митохондрии к клеткам пигментного эпителия сетчатки через туннельные нанотрубки. Этот феномен может служить вероятным механизмом, лежащим в основе благоприятного воздействия МСК на ткани сетчатки, тем самым способствуя выяснению регенеративной терапии глазных тканей, основанной на МСК.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет противоречащих друг другу интересов.

Благодарности

Мы благодарим компанию Guangzhou CSR Biotech Co. Ltd за визуализацию с помощью коммерческого микроскопа со сверхвысоким разрешением (HIS-SIM), сбор данных, реконструкцию изображений SR, анализ и обсуждение. Эта работа частично поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (82125007,92368206) и Пекинским фондом естественных наук (Z200014).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,25% Трипсин-ЭДТАGibco25200-056
4% параформальдегидSolarbioP1110
6-луночный планшетNEST703001
центрифужная пробирка 15 мл BDFalcon352097
24-луночный планшетNEST702001
ARPE19 клеткиATCCCRL-2302Клеточные линии
Бычий сывороточный альбумин (БСА)BeyotimeST025
CellTrace фиолетовыйInvitrogenC34557
Предметное стеклоNEST801007
DMSOsigmaD2650
DPBSGibcoC141905005BT
DMEM/F-12-GlutaMAXGibco10565-042
Фетальный бычий Сыворотка (FBS)VivaCellC04002-500
FluorSave РеагентMillipore345789
MSCsNuwacellRC02003Клеточные линии
ncMissionShowninRP02010
Pen StrepGibco15140-122
pCT-Mito-GFPSBICYTO102-PA-1Плазмидные; Из  https://www.systembio.com/mitochondria-cyto-tracer-pct-mito-gfp-cmv
PuromycinMCEHY-B1743A
ПипеткаAxygenTF-1000-R-S
ФаллоидинInvitrogenA22287
Triton X-100SolarbioT8200
Transwell PlateCorning3470

Ссылки

  1. Caprara, C., Grimm, C. From oxygen to erythropoietin: Relevance of hypoxia for retinal development, health and disease. Prog Retin Eye Res. 31 (1), 89-119 (2012).
  2. Ferrington, D. A., Fisher, C. R., Kowluru, R. A. Mitochondrial defects drive degenerative retinal diseases. Trends Mol Med. 26 (1), 105-118 (2020).
  3. Spees, J. L., Olson, S. D., Whitney, M. J., Prockop, D. J. Mitochondrial transfer between cells can rescue aerobic respiration. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (5), 1283-1288 (2006).
  4. Wei, B., et al. Mitochondrial transfer from bone mesenchymal stem cells protects against tendinopathy both in vitro and in vivo. Stem Cell Res Ther. 14 (1), 104(2023).
  5. Borcherding, N., Brestoff, J. R. The power and potential of mitochondria transfer. Nature. 623 (7986), 283-291 (2023).
  6. Liu, D., et al. Intercellular mitochondrial transfer as a means of tissue revitalization. Signal Transduct Target Ther. 6 (1), 65(2021).
  7. Rustom, A., Saffrich, R., Markovic, I., Walther, P., Gerdes, H. H. Nanotubular highways for intercellular organelle transport. Science. 303 (5660), 1007-1010 (2004).
  8. Cordero Cervantes, D., Zurzolo, C. Peering into tunneling nanotubes-the path forward. Embo j. 40 (8), e105789(2021).
  9. Qin, Y., et al. The functions, methods, and mobility of mitochondrial transfer between cells. Front Oncol. 11, 672781(2021).
  10. Jiang, D., et al. Bioenergetic crosstalk between mesenchymal stem cells and various ocular cells through the intercellular trafficking of mitochondria. Theranostics. 10 (16), 7260-7272 (2020).
  11. Domhan, S., et al. Intercellular communication by exchange of cytoplasmic material via tunneling nano-tube like structures in primary human renal epithelial cells. PLoS One. 6 (6), e21283(2011).
  12. Zhang, J., Zhang, Y. Membrane nanotubes: Novel communication between distant cells. Sci China Life Sci. 56 (11), 994-999 (2013).
  13. Cheng, X. Y., et al. Human ipscs derived astrocytes rescue rotenone-induced mitochondrial dysfunction and dopaminergic neurodegeneration in vitro by donating functional mitochondria. Transl Neurodegener. 9 (1), 13(2020).
  14. Ahmad, T., et al. Miro1 regulates intercellular mitochondrial transport & enhances mesenchymal stem cell rescue efficacy. Embo J. 33 (9), 994-1010 (2014).
  15. Li, C. J., Chen, P. K., Sun, L. Y., Pang, C. Y. Enhancement of mitochondrial transfer by antioxidants in human mesenchymal stem cells. Oxid Med Cell Longev. 2017, 8510805(2017).
  16. Paliwal, S., Chaudhuri, R., Agrawal, A., Mohanty, S. Regenerative abilities of mesenchymal stem cells through mitochondrial transfer. J Biomed Sci. 25 (1), 31(2018).
  17. Lin, T. K., et al. Mitochondrial transfer of wharton's jelly mesenchymal stem cells eliminates mutation burden and rescues mitochondrial bioenergetics in rotenone-stressed melas fibroblasts. Oxid Med Cell Longev. 2019, 9537504(2019).
  18. Hu, X., Duan, T., Wu, Z., Xiong, Y., Cao, Z. Intercellular mitochondria transfer: A new perspective for the treatment of metabolic diseases. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 53 (7), 958-960 (2021).

Перепечатки и разрешения

Теги

Mito GFPMito RFP
Митохондриальный перенос с помощью туннельных нанотрубок между мезенхимальными стволовыми клетками и пигментным эпителием сетчатки in vitro
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.