Выделение капилляров сетчатки мыши и субэндотелиального матрикса для измерения жесткости с помощью атомно-силовой микроскопии

Краткое содержание

Недавно мы определили ригидность капилляров сетчатки как новую парадигму дисфункции сетчатки, связанной с диабетом. В этом протоколе подробно описаны этапы выделения капилляров сетчатки и субэндотелиального матрикса мыши из эндотелиальных культур сетчатки с последующим описанием методики измерения жесткости с помощью атомно-силовой микроскопии.

Аннотация

Капиллярная дегенерация сетчатки является клиническим признаком ранних стадий диабетической ретинопатии (ДР). Наши недавние исследования показали, что индуцированное диабетом ригидность капилляров сетчатки играет решающую и ранее непризнанную причинно-следственную роль в воспалительной дегенерации капилляров сетчатки. Увеличение жесткости капилляров сетчатки происходит в результате гиперэкспрессии лизилоксидазы, фермента, который сшивает и укрепляет субэндотелиальный матрикс. Поскольку ожидается, что борьба с ДР на ранней стадии предотвратит или замедлит прогрессирование ДР и связанную с ней потерю зрения, субэндотелиальный матрикс и жесткость капилляров представляют собой актуальные и новые терапевтические мишени для раннего лечения ДР. Кроме того, прямое измерение жесткости капилляров сетчатки может послужить важным этапом доклинической валидации для разработки новых методов визуализации для неинвазивной оценки жесткости капилляров сетчатки у животных и людей. Учитывая эту точку зрения, мы представляем подробный протокол для изоляции и измерения жесткости капилляров сетчатки и субэндотелиального матрикса мыши с помощью атомно-силовой микроскопии.

Введение

Капилляры сетчатки необходимы для поддержания гомеостаза сетчатки и зрительной функции. Действительно, их дегенерация на ранних стадиях диабета тесно связана с развитием угрожающих зрению осложнений диабетической ретинопатии (ДР), микрососудистого заболевания, которое поражает почти 40% всех людей с диабетом¹. Воспаление сосудов вносит значительный вклад в капиллярную дегенерацию сетчатки при ДР. Прошлые исследования продемонстрировали важную роль аберрантных молекулярных и биохимических сигналов в воспалении сосудов сетчатки, вызванном диабетом ^2,3. Тем не менее, недавняя работа представила новую парадигму патогенеза DR, которая определяет ригидность капилляров сетчатки как ключевую, но ранее непризнанную детерминанту воспаления и дегенерации сосудов сетчатки ^4,5,6.

В частности, вызванное диабетом увеличение жесткости капилляров сетчатки вызвано повышением активности фермента поперечной сшивки коллагена лизилоксидазы (LOX) в эндотелиальных клетках сетчатки (ЭК), что делает субэндотелиальный матрикс (базальную мембрану) более жестким.4,5,6. Жесткость матрицы, в свою очередь, делает более жесткими вышележащие ЭК сетчатки (за счет механической взаимности), что приводит к общему увеличению жесткости капилляров сетчатки⁴. Важно отметить, что это вызванное диабетом ригидность капилляров сетчатки сама по себе может способствовать активации ЭК сетчатки и опосредованной воспалением смерти ЭК. Эта механическая регуляция дефектов ЭК сетчатки может быть связана с измененной эндотелиальной механотрансдукцией, процессом, посредством которого механические сигналы преобразуются в биохимические сигналы для создания биологической реакции ^7,8,9. Важно отметить, что измененные механические сигналы ЭК и структура субэндотелиального матрикса также были вовлечены в сосудистую дегенерацию хориоидеи, связанную с ранней возрастной макулярной дегенерацией (ВМД)10,11,12, что свидетельствует о более широком применении сосудистой механобиологии при дегенеративных заболеваниях сетчатки.

Примечательно, что ригидность капилляров сетчатки происходит на ранних стадиях сахарного диабета, что совпадает с началом воспаления сетчатки. Таким образом, увеличение жесткости капилляров сетчатки может служить как терапевтической мишенью, так и ранним диагностическим маркером ДР. С этой целью важно получить надежные и прямые измерения жесткости капилляров сетчатки и субэндотелиального матрикса. Это может быть достигнуто с помощью атомно-силового микроскопа (АСМ), который предлагает уникальный, чувствительный, точный и надежный метод прямого измерения жесткости клеток, внеклеточного матрикса и^{тканей.} АСМ прикладывает к образцу мельчайшую (наноньютоновскую) силу вдавливания на образец, жесткость которого определяет степень изгиба кантилевера с вдавливанием АСМ - чем жестче образец, тем сильнее изгибается кантилевер, и наоборот. Мы широко использовали АСМ для измерения жесткости культивируемых эндотелиальных клеток, субэндотелиальных матриц и изолированных капилляров сетчатки мыши 4,5,6,11,12. Эти измерения жесткости АСМ помогли определить, что эндотелиальная механобиология является ключевым фактором, определяющим патогенез ДР и ВМД. Чтобы помочь расширить область применения механобиологии в исследованиях зрения, здесь мы приводим пошаговое руководство по использованию АСМ для измерения жесткости изолированных капилляров сетчатки и субэндотелиального матрикса мыши.

Протокол

Все процедуры на животных были выполнены в соответствии с Заявлением Ассоциации исследований в области зрения и офтальмологии (ARVO) об использовании животных в офтальмологических исследованиях и исследованиях зрения и одобрены Институциональными комитетами по использованию животных и ухода за ними (IACUC; номер протокола ARC-2020-030) в Калифорнийском университете в Лос-Анджелесе (номер A3196-01 учреждения OLAW по обеспечению благополучия животных). Следующий протокол был выполнен с использованием капилляров сетчатки, выделенных от взрослых (20-недельных) самцов мышей C57BL/6J весом ~25 г (мыши с диабетом) и ~32 г (мыши без диабета; Лаборатория Джексона).

1. Выделение капилляров сетчатки мыши для измерения жесткости АСМ (1-4 дни)

Примечание: В этом протоколе, представленном в^{недавнем исследовании4}, подробно описывается энуклеация и мягкая фиксация мышиного глаза, изоляция сетчатки и расщепление трипсина, а также последующее наложение полученной сосудистой сети сетчатки на предметные стекла микроскопии для измерения жесткости АСМ.

1. Энуклеация и легкая фиксация (день 1)
   1. После усыпления мыши с воздействием углекислого газа с последующим вывихом шейки матки вставьте микрощипцы за глазное яблоко, возьмитесь за мышечное крепление и осторожно вытащите глаз, не сжимая микрощипцы слишком сильно, что может привести к разрыву зрительного нерва.
   2. Поместите энуклеированный глаз в 5% (v/v) формалина в PBS на 24 ч при 4 °C для мягкой фиксации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Исходя из опыта⁴, нефиксированные или более слабо зафиксированные глаза дают хрупкие капилляры, которые фрагментируются во время подготовки образцов АСМ и измерения жесткости.
2. Изоляция сетчатки (день 2)
   1. Поместите неподвижный глаз на лист вощеной бумаги под препарирующим микроскопом. Далее, с помощью микрощипцов, удерживайте остатки мышцы и зрительного нерва, прикрепленные к внешней стороне заднего глаза, и ориентируйте глаз так, чтобы роговица была обращена в одну сторону (рисунок 1).
   2. С помощью хирургического лезвия сделайте разрез на 1-2 мм позади и параллельно лимбу (соединение роговицы и склеры). Затем, удерживая глаз на месте с помощью микрощипцов, приложите усилие лезвием вниз и продолжайте надавливать до тех пор, пока передний сегмент глаза полностью не отделится от заднего конца (Рисунок 1). Выбросьте передний сегмент и хрусталик. Не пилите вперед и назад, так как это может привести к повреждению сетчатки.
   3. Перенесите задний сегмент (склеру, сосудистую оболочку и сетчатку) в чашку размером 6 см, наполненную PBS (pH 7,4).
   4. С помощью микрошпателя и одновременно аккуратно удерживая зрительный нерв микрощипцами, вычерпните сетчатку. Храните сетчатку в микроцентрифужной пробирке объемом 2 мл, содержащей PBS, при температуре 4 °C до капиллярной изоляции.
       
3. Ополаскиватели для сетчатки глаза
   1. Чтобы промыть одну сетчатку, заполните шесть лунок 12-луночного планшета 1 мл двойной дистилляции H₂O (ddH₂O). Далее с помощью перевернутой пипетки Пастера перенесите сетчатку из микроцентрифужной пробирки объемом 2 мл в первую лунку.
   2. Промойте сетчатку на орбитальном шейкере при 120 об/мин в течение 30 минут при комнатной температуре (RT).
   3. С помощью пипетки P1000 осторожно нагнетайте воду вверх и вниз по сетчатке, выдувая воду на сетчатку, чтобы вызвать легкое возбуждение.
   4. С помощью пипетки из перевернутого стекла перенесите сетчатку во вторую лунку и повторите шаги 1.3.2 и 1.3.3 4 раза, при этом каждое полоскание выполняется в свежей (ddH₂O-содержащей) лунке.
   5. Наконец, перенесите сетчатку в шестую лунку и промойте ее на ночь (O/N) в режиме ЛТ на орбитальном шейкере, установленном на 100 об/мин, чтобы облегчить отделение нейроглии сетчатки от кровеносных сосудов во время расщепления трипсина.
4. Усвоение трипсина сетчатки (День 3)
   1. Приготовьте 10% (масс./об.) раствор трипсина, растворив порошок трипсина 1:250 в буфере Tris (pH 8; 0,1 M). Осторожно перемешивайте, несколько раз перевернув коническую трубку, чтобы свести к минимуму образование пузырьков, что затрудняет подтверждение растворимости трипсина.
   2. Уравновесить 10% раствор трипсина на водяной бане при температуре 37 °C в течение 10-15 минут. Как только порошок трипсина полностью растворится, отфильтруйте раствор с помощью шприцевого фильтра 0,2 мкм.
   3. В 12-луночный планшет добавьте 2 мл/лунку/сетчатку отфильтрованного 10% раствора трипсина. Добавьте немного дополнительного раствора трипсина в соседнюю лунку (чтобы уравновесить стеклянные стенки пипетки для последующих этапов).
   4. Добавьте 3 мл ddH₂O в три лунки 6-луночного планшета (выделите эти три лунки для одной сетчатки).
   5. В коническую пробирку объемом 15 мл вставьте наконечник P200 перед добавлением 4 мл отфильтрованного 10% раствора трипсина. Перенесите эту коническую трубку в ванну с температурой 37 °C, чтобы наконечник пропитался трипсином на 2-3 минуты, так как это помогает предотвратить прилипание сетчатки к стенкам кончика на последних этапах.
   6. После промывания сетчатки с помощью O/N (из шага 1.3.5) с помощью пипетки P1000 осторожно проводите пипеткой воду вверх и вниз по прилегающей к сетчатке, разбрызгивая воду на сетчатку, чтобы вызвать легкое возбуждение.
   7. С помощью пипетки из перевернутого стекла перенесите промытую сетчатку в трипсинсодержащую лунку 12-луночного планшета (из шага 1.4.3). Убедитесь, что сетчатка переносится с минимальным количеством остаточного_ddH2O, чтобы не разбавлять раствор трипсина значительно. Выдерживать в течение 3 ч при 37 °C.
   8. Центрируя пропитанный трипсином наконечник P200 (из шага 1.4.5) в области зрительного нерва, аккуратно пипетируйте всю сосудистую сеть вверх и вниз, чтобы диссоциировать несосудистую ткань¹⁴.
   9. С помощью пипетки из перевернутого стекла, предварительно промытой в трипсине (путем пипетирования трипсина вверх и вниз 5 раз), перенесите сосудистую сеть сетчатки в первую_ddH2O-содержащую лунку 6-луночного планшета (с шага 1.4.4).
   10. Вращайте пластину и пипеткой сосудистую сеть вверх и вниз с помощью перевернутой стеклянной пипетки, ополаскиваемой трипсином, чтобы удалить остатки несосудистой ткани.
   11. С помощью стеклянной пипетки перенесите сосудистую сеть сетчатки во вторую ddH2O-содержащую лунку 6-луночного планшета и храните при температуре 4 °C до установки на предметное стекло для измерения жесткости АСМ.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Гидратированная сосудистая сеть сетчатки (при PBS) структурно неповреждена при 4 °C в течение 2 недель. Тем не менее, рутинные измерения жесткости должны проводиться из свежевыделенных капилляров.
5. Монтаж сосудистой сети сетчатки для измерения жесткости АСМ (4-й день)
   1. С помощью перевернутой стеклянной пипетки, ополаскиваемой трипсином, перенесите сосудистую сеть сетчатки в третью_ddH2O-содержащую лунку 6-луночного планшета, чтобы удалить остаточный раствор трипсина.
   2. Тщательно очистите (с помощью ddH_{, 2}O и салфетки салфетки) предметное стекло для микроскопии заряженной поверхности, которое будет использоваться для монтажа сосудистой сетки для измерения жесткости АСМ.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Заряженная поверхность предметного стекла обеспечивает прочное связывание сосудистой сетки во время измерения АСМ.
   3. Подпишите предметное стекло и нарисуйте гидрофобной ручкой круглую область размером 4-5 см вокруг центра, чтобы избежать пролития воды на последующих этапах.
   4. С помощью перевернутой стеклянной пипетки, ополаскиваемой трипсином, осторожно перенесите сосудистую сеть сетчатки к центру отмеченной области.
   5. С помощью пипетки P200 осторожно удалите как можно больше лишней воды с одного края, чтобы случайно не аспирировать сосудистую сеть в наконечник.
   6. Поместите предметное стекло в шкаф биобезопасности (вытяжка BSL-2) ближе к лицевой стороне (фильтрованная сетка) и дайте остаточной воде испариться.
   7. Когда сосудистая сеть станет почти сухой, под помощью фазово-контрастного микроскопа (4-кратное увеличение) осторожно регидратируйте сосудистую сеть, медленно добавляя ddH₂O с помощью пипетки P200 на одну сторону помеченной области. Добавление ddH₂O непосредственно в сосудистую сеть приводит к ее отделению.
   8. Сделайте фазово-контрастные изображения регидратированной сосудистой сети с 4-кратным и 20-кратным увеличением, чтобы убедиться, что она имеет хорошую структурную целостность и правильно распределена (не складывается на себя) и прикреплена к предметному стеклу, что является важным критерием для надежного измерения жесткости АСМ.

2. Получение субэндотелиального матрикса из культур микрососудистых эндотелиальных клеток (РЭК) сетчатки (1-17 дни)

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол, адаптированный из Beacham et al.¹⁵ и сообщается в последних исследованиях ^4,5,6, описывается культивирование REC на модифицированных стеклянных покровных стеклах с последующей децеллюляризацией для получения субэндотелиального матрикса для последующего измерения жесткости АСМ.

1. Приготовление покровных покрытий из стекла с желатиновым покрытием и ячеистое покрытие (День 1)
   ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните нанесение желатинового покрытия и последующие этапы промывки PBS⁺⁺ в шкафу для культуры тканей перед перемещением в вытяжной шкаф для химических веществ для последующих этапов обработки глутаральдегидом и этаноламином.
   1. Поместите одну автоклавную круглую стеклянную покровную крышку диаметром 12 мм в лунку стерильного 24-луночного планшета и добавьте 500 μл предварительно подогретого стерильного 0,2% (по объему) желатина (разбавленного в PBS, содержащем кальций и магний; PBS⁺⁺) в каждую лунку, содержащую покровное стекло. Выдерживать в течение 1 ч при 37 °C.
   2. Отсадите желатиновый раствор, промойте покровные стекла один раз стерильным PBS⁺⁺ и сшивайте покрытый желатин, добавив 500 мкл 1% (v/v) глутаральдегида в течение 30 минут при RT.
   3. Соберите и правильно утилизируйте (в соответствии с рекомендациями учреждения) раствор глутарового альдегида перед промыванием покровных стекол PBS⁺⁺ в течение 5 минут на орбитальном шейкере при 100 об/мин в режиме RT. Повторите этот этап промывки 5 раз. Во время первых трех полосканий поднимите покровные стекла с помощью стерильного пинцета, чтобы обеспечить тщательное смывание глутаральдегида. Любое остаточное количество может снизить жизнеспособность клеток.
   4. Добавьте 800 мкл 1 М этаноламина, в желатиновый сшитый покровный лист на 30 мин при RT, чтобы погасить любые оставшиеся следы глутаральдегида в лунке.
   5. Соберите и правильно утилизируйте (в соответствии с рекомендациями учреждения) раствор этаноламина, а затем промойте покровные стекла 5 раз PBS⁺⁺ в течение 5 минут на орбитальном шейкере при 100 об/мин в режиме RT. Во время первых трех полосканий поднимите покровные стекла с помощью стерильного пинцета, чтобы обеспечить тщательное промывание этаноламина. Любое остаточное количество может снизить жизнеспособность клеток.
   6. Теперь сшитые покровные стекла готовы к нанесению покрытия ячеек.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Несмотря на то, что мы обычно помещаем пластинчатые клетки сразу после подготовки покровного стекла, возможно, имеет смысл сравнить покрытие ячеек на сшитых желатиновых покровных стеклах, хранящихся в PBS⁺⁺ при 4 °C в течение 1-2 дней.
   7. В стерильных условиях в тканевом культуральном колпаке пластинчатые микрососудистые эндотелиальные клетки (REC) сетчатки в среде/лунке объемом 500 мкл с плотностью, обеспечивающей 100% слияние в течение 24 ч, что подтверждено фазово-контрастной микроскопией.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Достижение слияния в течение 24 часов важно, так как результирующее покое REC увеличивает способность клеток секретировать матрикс (см. следующий шаг). По нашему опыту работы с человеческими REC, плотность покрытия 4 x 10^{4 клеток} /^см2 достаточна для достижения слияния в течение 24 часов. Однако, поскольку размер REC варьируется в зависимости от вида (например, мышиные REC значительно меньше), может потребоваться оптимизация исходной плотности покрытия.
2. Продукция субэндотелиального матрикса с помощью культуры REC (день 2-16)
   1. После того, как клетки достигнут слияния (~24 ч), замените питательную среду свежей средой с добавлением стерильно отфильтрованной аскорбиновой кислоты (конечная концентрация 200 мкг/мл).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Любое лечение REC с факторами риска заболевания (например, высоким уровнем глюкозы, конечными продуктами гликирования и т.д.) или фармакологическими препаратами можно начинать сейчас, наряду с лечением аскорбиновой кислотой.
   2. Меняйте питательную среду с добавлением аскорбиновой кислоты через день в течение 15 дней.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Аскорбиновая кислота нестабильна в растворе. Готовьте свежий 100Х стоковый раствор через день для средней добавки.
3. Децеллюляризация культур REC с получением субэндотелиального матрикса (16-й день)
   1. После 15 дней обработки аскорбиновой кислотой удалите среду и промойте клетки PBS, не содержащим кальция и магния.
   2. Децеллюляризируйте культуры REC путем добавления 250 мкл/лунка теплого буфера для децеллюляризации (20 мМ гидроксида аммония и 0,5% Triton X-100 в PBS) в течение ~2-3 мин. Подтвердите удаление клеток под фазово-контрастным микроскопом (10-кратное увеличение).
   3. Аккуратно удалите буфер для децеллюляризации, не нарушая секретируемый REC субэндотелиальный матрикс, и добавьте по 0,5 мл PBS в каждую лунку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы убедиться, что субэндотелиальный матрикс не отсоединится во время этого и последующих этапов промывания, выполняйте осторожное промывание только с помощью пипетки P1000. Не проводите вакуумную аспирацию.
   4. Храните пластины при температуре 4 °C в течение ночи для стабилизации матрицы, секретируемой REC.
4. ДНКазная обработка субэндотелиального матрикса для удаления клеточного мусора (17-й день)
   1. Промойте субэндотелиальный матрикс с шага 2.3.4 800 мкл PBS/лунку.
   2. Аккуратно извлеките PBS и инкубируйте матрицу с 200 мкл свободной от РНКазы DNазы I (30 тыс. единиц) при 37 °C в течение 30 минут, чтобы удалить все следы клеточного мусора. Проверьте эффективность ДНКазного лечения, тщательно изучив клеточный мусор под фазово-контрастным микроскопом.
   3. Аккуратно удалите раствор ДНКазы I и дважды промойте субэндотелиальный матрикс 800 мкл PBS/лунка.
   4. Убедитесь, что макромасштабный фиброзный субэндотелиальный матрикс виден под фазово-контрастным микроскопом (10-кратное увеличение). Для визуализации более тонких наноразмерных матричных волокон требуется топографическое сканирование с помощью АСМ или конфокальная визуализация с высоким разрешением иммунометированных матричных белков при 100-кратном увеличении.
   5. Немедленно используйте свежий (нефиксированный) субэндотелиальный матрикс для измерения жесткости АСМ.
   6. После измерения АСМ зафиксировать образцы матрицы 1% (v/v) параформальдегида (15 мин при комнатной температуре) и хранить при температуре 4 °C для иммуномечения антителами против белков субэндотелиального матрикса и/или сшивающих ферментов.

3. Измерение жесткости АСМ

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол, адаптированный из стандартного руководства пользователя АСМ и представленный в недавних исследованиях ^4,5, подробно описывает сбор и анализ данных о жесткости из капилляров сетчатки и субэндотелиального матрикса с использованием АСМ и программного обеспечения для анализа данных. Несмотря на то, что описанные ниже шаги основаны на конкретной модели АСМ (см. Таблицу материалов), основные принципы в целом применимы ко всем моделям АСМ.

1. Выбор консольного преобразователя
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для мягких биологических образцов требуются мягкие консоли, которые могут изгибаться при вдавливании образца, в то время как размеры зонда подбираются в соответствии с размерами образца.
   1. Для измерения жесткости сосудов сетчатки мыши диаметром 5-8 мкм используют консольный зонд радиусом 1 мкм с пружинной постоянной (k) 0,2-0,3 Н/м. Для измерения жесткости субэндотелиального матрикса, состоящего из наноразмерных волокон, используют консольный зонд радиусом 70 нм с пружинной постоянной (k) 0,06-0,1 Н/м.
2. Консольный монтаж
   1. На компьютере АСМ откройте программное обеспечение, управляющее блоком АСМ и камерой, прикрепленной к фазово-контрастному микроскопу, который используется для визуализации кантилевера и образца.
   2. Закрепите держатель кантилевера на подставке для смены кантилевера и установите выбранный кантилевер на держатель с помощью щипцов часовщика под стереоскопом, не повреждая консоль. Затяните винт на держателе, чтобы зафиксировать консоль.
   3. Установите и зафиксируйте держатель консольного крепления на головке АСМ, которая лежит на подставке.
   4. Используя функцию шагового двигателя в программном обеспечении АСМ, отведите головку АСМ в самую высокую точку и установите это положение в качестве нулевой точки в программном обеспечении. Этот шаг предотвращает случайное попадание кантилевера АСМ в предметный столик во время монтажа головки АСМ (следующий шаг).
   5. Осторожно поднимите головку АСМ со стойки и установите ее на предметный столик АСМ, поместив ножки в соответствующие пазы.
3. Лазерная юстировка
   ПРИМЕЧАНИЕ: Первоначальная юстировка лазера выполняется без какого-либо образца (т.е. в воздушном режиме), так как она обеспечивает более точное выравнивание лазерного луча на кончике кантилевера (предотвращая лазерное преломление в жидкости). Однако, поскольку биологические образцы погружаются в среду, которая имеет другой показатель преломления, чем воздух, важно перенастроить лазер в среде перед измерением жесткости.
   1. Для юстировки лазера в воздухе поместите головку АСМ на предметный столик и используйте объектив с 10-кратным увеличением и прикрепленную камеру для визуализации кантилевера на мониторе в режиме реального времени. Инфракрасный лазер скрыт от глаз пользователя, но виден с помощью ПЗС-камеры.
   2. Выберите функцию силовой спектроскопии контактного режима в программном обеспечении и откройте окно под названием Лазерная юстировка.
   3. С помощью двух винтов, отмеченных лазерной боковой направленностью на головке АСМ, сфокусируйте лазерный луч на консоль таким образом, чтобы значение SUM в окне лазерной юстировки было максимальным. Для этого сфокусируйте лазер в центре кантилевера или вокруг него.
   4. С помощью регулировочных винтов Детектор настройте фотоприемник так, чтобы лазерное пятно находилось в центре окна лазерной юстировки.
   5. С помощью винта регулировки зеркала отрегулируйте зеркало так, чтобы значение SUM было максимально возможным.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Высокое значение SUM обеспечивает чувствительную и точную оценку жесткости образца. Таким образом, для получения наибольшего значения СУММ необходимо выполнить как лазерную юстировку, так и юстировку зеркала.
   6. Затем для лазерного выравнивания в жидкости добавьте нужную питательную среду в чашку и надежно закрепите ее на столике, чтобы предотвратить вибрацию или дрейф, которые создают артефакты измерения во время вдавливания образца.
   7. Глядя на прямую трансляцию с камеры, сфокусированной на консоли, опустите ее в жидкость с помощью функции шагового двигателя.
   8. Повторите шаги 3.3.4 и 3.3.5, чтобы убедиться, что значение SUM остается максимальным, а лазерное пятно находится в центре окна лазерной юстировки.
4. Калибровка постоянной консольной пружины
   ПРИМЕЧАНИЕ: Несмотря на то, что консольные щупы поставляются с откалиброванной производителем пружинной постоянной (k), рекомендуется самостоятельно проверить ее значение (в жидкости) перед началом измерения. Используйте чистую стеклянную поверхность, которая сводит к минимуму взаимодействие между консольным щупом и стеклянной поверхностью.
   1. Заданное усилие, прилагаемое консолью, устанавливает максимальное отклонение лазера от консоли, которое допускается для силового отступа. Установите его изначально на 1,5 В. Если консоль не может приблизиться с заданным заданным значением силы, увеличивайте ее постепенно, пока образец не углубится и не создаст кривую вдавливания.
   2. Длина Z означает максимальное расстояние, на которое Z-пьезо отступает после того, как консоль достигнет заданного значения во время вдавливания образца. Длина Z должна быть по крайней мере достаточной для обеспечения четкого отделения консольного зонда от образца. Для калибровки постоянной пружины на стеклянной поверхности установите длину Z на 1 мкм.
   3. Скорость Z относится к скорости, с которой z-пьезо перемещает консоль вертикально вниз к образцу во время силового вдавливания. Она должна быть оптимизирована, потому что очень низкая скорость в первую очередь отражает вязкие свойства образца, в то время как очень высокая скорость в первую очередь отражает упругие свойства. Ожидается, что оптимальная скорость позволит зафиксировать истинную вязкоупругую природу биологических образцов. Установите скорость Z равной 2 мкм/с для вязкоупругих биологических образцов.
   4. Высота цели в диапазоне Z указывает приблизительное расстояние от образца, на котором находится z-пьезо после измерения кривой силы и перед перемещением в другое место на образце. Целевая высота диапазона Z должна быть больше, чем высота образцовых объектов. Установите высоту цели в диапазоне Z на уровне 7,5 мкм.
   5. Используя функцию Step Motor , поднесите кантилевер достаточно близко к поверхности образца (судя по фокусу на фазово-контрастном изображении при 10-кратном увеличении) перед выбором функции Approach в окне силовой спектроскопии контактного режима, чтобы опустить кантилевер с меньшим шагом 15 мкм.
   6. Нажмите кнопку Захватить, чтобы захватить силовую кривую.
   7. Выберите кривую силы, откройте ее в окне диспетчера калибровки и выберите Контактный режим в разделе метода.
   8. С помощью функции "Выбрать диапазон втягивания " выберите кривую втягивания кантилевера для подгонки линейной кривой. Затем установите флажок Sensitivity Check , чтобы преобразовать единицу силы из V в N.
   9. Поднимите консоль на 100-200 мкм в жидкости и выберите функцию Thermal Noise (Тепловой шум ). Опять же, используя Select Fit Range, подгоньте колоколообразную кривую теплового шума под кривую Лоренца. После подгонки кривой выберите поле Постоянная пружины (k). Убедитесь, что постоянная пружины (k) близка к значению производителя, и запишите его для использования в будущем. После калибровки единица измерения для заданного значения изменится с мВ на нН.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Тепловой шум — это собственная частота кантилевера при определенной температуре. Для точного измерения постоянной пружины требуется поправка на тепловой шум.
5. Получение кривых сила-расстояние
   1. Поместите образец на предметном стекле (сосуды сетчатки или субэндотелиальный матрикс) на столик АСМ и выберите «Контактный режим: силовая спектроскопия » в разделе экспериментов программного обеспечения.
   2. Установите уставку силы на 0,5 нН и нажмите кнопку Approach, которая значительно выше, чем тепловое отклонение кантилеверов SAA-SPH 1 мкм и PFQNM-LC-A 70 нм, что обеспечивает плавный подход кантилевера к образцу.
   3. После того как консоль обнаружит поверхность и вернется на заданную высоту в состоянии покоя, установите заданное значение на 0,2 нН для более жесткого консольного зонда SAA-SPH 1 мкм или 0,1 нН для более мягкого консольного зонда PFQNM-LC-A 70 нм. Такая регулировка заданного значения гарантирует, что как жесткие, так и мягкие консоли легко изгибаются во время вдавливания образца (см. раздел 3.1).
   4. Установите длину Z на ~2,5 мкм, чтобы обеспечить чистое отделение кантилевера от биологических образцов во время втягивания (см. шаг 3.4.2) и скорость Z на уровне 2 мкм/с (см. шаг 3.4.3).
   5. С помощью винтов на столике АСМ осторожно расположите консольный зонд в нужном месте образца.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку капилляры не всегда распространяются горизонтально на предметном стекле, перед перемещением предметного столика можно безопасно отвести консоль еще на 10-20 мкм от целевой высоты в состоянии покоя.
   6. Нажмите кнопку Подход, чтобы сначала приблизить консоль к образцу, а затем нажмите кнопку Захватить, чтобы захватить силовые кривые для нужных местоположений. Сохраните все силовые кривые для анализа.
6. Анализ данных
   1. Откройте кривую силы в программном обеспечении для обработки данных.
   2. Выберите кривую силы втягивания для анализа данных (аналогично шагу 3.4.8).
   3. С помощью функции сглаживания данных сгладьте силовую кривую с помощью фильтра Гаусса, чтобы удалить нежелательный шум в полученных данных.
   4. Используя функцию вычитания Базовая линия, установите значение наклона и величину (бесконтактной) базовой части силовой кривой на ноль.
   5. Нажмите на функцию « Точка контакта », чтобы автоматически привести точку контакта силовой кривой к координатам (0,0) по осям X и Y.
   6. С помощью функции Vertical Tip Position (Положение вертикального наконечника ) рассчитайте фактическое вертикальное положение кантилевера по оси Y с поправкой на отступ образца.
   7. На обработанной силовой кривой примените функцию Упругость при подгонке , сначала выбрав форму и радиус наконечника (на основе выбранного консольного преобразователя), а затем подогнав силовую кривую с помощью модели Герца/Снеддона.
      1. Если отступ матрицы на пробнике радиусом 70 нм превышает 70 нм, что обычно имеет место, выберите форму наконечника Paraboloid . Для измерения капиллярной жесткости вдавливание образца с помощью зонда радиусом 1 μм никогда не превышает 1 μм, поэтому выберите форму зонда Sphere . Кроме того, если точка контакта подогнанной кривой не совпадает с точкой контакта фактической кривой втягивания, установите флажок Кривая сдвига .
   8. Запишите и сохраните значение модуля Юнга (жесткости).

Результаты

Капилляры сетчатки мыши
Измерение жесткости АСМ изолированных капилляров сетчатки включает в себя этапы обработки образцов, которые потенциально могут повредить их механоструктурную целостность. Чтобы предотвратить это и тем самым обеспечить осуществимость, надежность и воспроизводимость измерений с помощью АСМ, энуклеированные глаза фиксируют в 5% формалине в течение ночи при 4 °C перед выделением сосудов. Этот мягкий протокол фиксации со сниженной концентрацией формалина, низкой температурой фиксации, ограниченным временем фиксации и отсутствием пункции роговицы был разработан для минимизации любых потенциальных артефактов сшивки/жесткости, вызванных химической фиксацией. Как показано на рисунке 2B, C, эта относительно мягкая фиксация гарантирует, что изолированная сосудистая сеть сетчатки является структурно прочной и достаточно долговечной для измерения с помощью АСМ. Напротив, сосуды сетчатки, выделенные из нефиксированных глаз (с помощью гипотонического метода)⁴ или кратковременно неподвижных глаз (в течение 8 ч), фрагментируются или коллапсируются, что делает их непригодными для измерения АСМ (рис. 2Б).

Субэндотелиальный матрикс сетчатки
Жесткость сосудов отражает совокупную жесткость сосудистых клеток и базальной мембраны (субэндотелиального матрикса)⁴. Поскольку клетки приспосабливаются к жесткости матрикса, претерпевая аналогичное изменение своей собственной жесткости, процесс, называемый механической взаимностью⁹, жесткость субэндотелиального матрикса, становится важным фактором, определяющим общую жесткость сосудов. Для измерения жесткости матрицы важно получить однородно плотный субэндотелиальный матрикс. Для ЭК сетчатки человека, выращенных в питательной среде с добавлением аскорбиновой кислоты, это обычно занимает 10-15 дней (Рисунок 3A)^4,5,6. Эта разница в периоде культивирования может быть обусловлена различиями между партиями в коммерчески доступных первичных ЭК сетчатки. Кроме того, мы в целом обнаруживаем, что коммерчески доступные ЭК сетчатки от мышей C57BL/6 откладывают более плотную матрицу по сравнению с первичной культурой ЭК сетчатки человека, что указывает на видоспецифичные различия. Как показано на рисунке 3A, фазово-контрастные изображения обеспечивают только общее представление матрицы в макромасштабе. Тем не менее, более тонкая фибриллярная структура в нано- и микромасштабе становится очевидной на конфокальных флуоресцентных изображениях матрицы с высоким разрешением, иммуномеченной антителами против структурных белков матрицы коллагена IV и фибронектина (рис. 3B). Следует отметить, что эти матричные белки также дают инструктивные сигналы эндотелиальным клеткам, связываясь со специфическими интегриновыми рецепторами⁹.

Измерение жесткости АСМ
Выбор подходящей жесткости кантилевера (постоянная пружины, k) и размера зонда имеет важное значение для надежных и чувствительных измерений. Эти параметры следует выбирать таким образом, чтобы они соответствовали жесткости и габаритам биологического образца. После того, как выбранный консоль был установлен на АСМ, инфракрасный лазерный луч должен быть сфокусирован на кончике консоли, а отраженное лазерное пятно должно быть центрировано на фотоприемнике. Такая лазерная юстировка обеспечивает точное и чувствительное обнаружение прогиба кантилевера и, следовательно, измерение жесткости. Измерение жесткости АСМ начинается с того, что z-пьезо перемещает консоль вертикально вниз к образцу. В это время отсутствует прогиб кантилевера, что приводит к образованию плоской базовой линии кривой приближения (Рисунок 4A). Когда кантилеверный зонд соприкасается с образцом и вдавливается в него, кантилевер изгибается, вызывая лазерное отклонение фотоприемника, которое выражается в вертикальном отклонении кривой приближения. После приложения к образцу заданного усилия вдавливания (заданного значения) консоль отводится в исходное положение (целевая высота Z) в сторону от образца. Затем кривая отклоненного втягивания подгоняется к модели Герца/Снеддона для расчета модуля Юнга (жесткости) образца.

Из репрезентативного измерения силового вдавливания, показанного на рисунке 4, ясно, что кривые приближения и втягивания, полученные из капилляра сетчатки, выделенного у мыши с диабетом (рисунок 4B), значительно круче, чем у мыши, не страдающей диабетом (рисунок 4A). Более крутой наклон кривых вдавливания силы указывает на больший прогиб кантилевера, вызванный более высоким сопротивлением образца силовому вдавливанию, что отражает более высокую жесткость образца¹³. Действительно, последующий анализ данных множественных кривых индентирования показал, что капилляры сетчатки мыши становятся значительно жестче при диабете⁴. Следует также отметить, что контакт между консольным зондом и биологическими образцами часто вызывает неспецифическую поверхностную адгезию, которая приводит к отрицательному отклонению кантилевера во время втягивания, что видно по выходу кривой втягивания за пределы исходной линии (рис. 4B). Кроме того, биологические образцы, такие как клетки, матрикс и кровеносные сосуды, являются вязкоупругими по своей природе и, таким образом, могут подвергаться некоторой остаточной деформации и/или изменению видимой жесткости после силового вдавливания. Если это так, то это будет выражаться в смещении кривых подхода и втягивания (гистерезис). Действительно, сравнение рисунков 4А и 4В подтверждает ожидаемую тенденцию, когда силовое углубление более мягких капилляров у мышей без диабета вызывает больший гистерезис, чем у их более жестких собратьев. Как^{сообщалось ранее 5,6}, жесткость (модуль Юнга) субэндотелиальных матриц, полученных из культур ЭК сетчатки, также рассчитывается вышеупомянутым способом.

Рисунок 1: Схематическое изображение разреза, сделанного на глазу мыши для изоляции сетчатки. Используя пинцет для удержания зрительного нерва, скальпель используется для того, чтобы сделать полный разрез позади лимба, чтобы отделить сетчатку мыши от хрусталика и передней камеры. Фиолетовой пунктирной линией показано расположение вертикального разреза. Эта схема была нарисована с помощью программного обеспечения для создания научных изображений и иллюстраций. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Оптимизация протокола для выделения интактных сосудов сетчатки мыши для измерения АСМ. (A) Изображение стереоскопа показывает интактную сетчатку, изолированную от слабо зафиксированного глаза мыши до этапов изоляции капилляров. Масштабная линейка: 2 мм. (B) Репрезентативные фазово-контрастные изображения при 4-кратном увеличении показывают сосуды сетчатки мыши с использованием различных методов выделения. При сравнении структурной целостности и долговечности изолированных сосудов было обнаружено, что расщепление трипсина сетчаткой из энуклеированных глаз, зафиксированных в 5% формалине в течение 24 ч при 4 °С (красный ящик), дает наиболее подходящую сосудистую сеть сетчатки для измерения жесткости АСМ. Сосуды сетчатки, выделенные с помощью этого метода, демонстрировали четкую сосудистую сеть, которая равномерно распространялась по поверхности стекла. Масштабная линейка: 500 мкм. (C) Изображение интактной капиллярной сети сетчатки с большим увеличением (20x), аналогичное показанному на рисунке (B), подтверждает высокую структурную целостность капилляров, полученную из слабо зафиксированных глаз. Масштабная линейка: 100 μм. Эта цифра была изменена с⁴. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3: Децеллюляризованные матрицы, полученные из первичных культур REC человека и мыши. (A) Репрезентативные фазово-контрастные изображения при 20-кратном увеличении, показывающие агрегаты субэндотелиального матрикса на стеклянных покровных стеклах после децеллюляризации 10-дневных (10 дней) или 15-дневных (15 дней) культур REC человека или мыши. Масштабная линейка: 100 мкм. (B) Репрезентативные конфокальные флуоресцентные изображения децеллюляризованных матриц с высоким увеличением (100x), полученные из 15-дневных культур REC человека и помеченные антиколлагеновыми IV и антифибронектиновыми антителами, обнаруживают плотный нанофибриллярный коллаген IV и фибронектиновый матрикс. Масштабная линейка: 20 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Кривые расстояния силы по результатам измерения жесткости АСМ капилляров сетчатки мыши. Линейные графики показывают репрезентативную кривую приближения (светлый цвет) и ретракции (темный цвет) из измерения одного силового вдавливания в одном месте капилляра сетчатки мыши, выделенного у мыши, не страдающей диабетом, или (В) диабетической мыши. Силовые кривые, полученные с помощью полусферического консольного зонда SAA-SPH радиусом 1 мкм, отображают зависимость между расстоянием между консолью и образцом (контролируемым z-пьезо) и приложенной вертикальной силой, вызывающей прогиб кантилевера. (A) Желтая стрелка указывает приближение кантилевера с z-образным приводом к образцу, белая стрелка указывает точку контакта, где консольный щуп соприкасается с образцом, а зеленая стрелка указывает на отклонение кантилевера до заданного значения (пика) силы вдавливания (*). (B) Кривые приближения и ретракции, полученные из капилляра сетчатки, выделенного у мышей с диабетом, демонстрируют заметно более крутой наклон, чем у их недиабетических коллег (показано на рисунке А), что указывает на более высокую жесткость капилляров у мышей с диабетом. Стрелка указывает на провал кривой втягивания ниже базовой линии, который отражает отрицательное отклонение консольного датчика, вызванное адгезией между датчиком и образцом во время вдавливания. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Обсуждение

ОВМ широко используется для измерения связанных с заболеванием изменений жесткости крупных сосудов, таких как аорта и артерии¹⁶. Эти результаты помогли установить роль эндотелиальной механобиологии в развитии сердечно-сосудистых осложнений, таких как атеросклероз¹⁷. Основываясь на этих результатах, мы начали исследовать ранее непризнанную роль эндотелиальной механобиологии в развитии микрососудистых поражений сетчатки на ранних стадиях ДР. Успех в этом исследовании, однако, зависит от точного измерения индуцированных диабетом изменений жесткости капилляров сетчатки. Недавние исследования показали, что, как и в случае с крупными сосудами, жесткость капилляров сетчатки и ЭК-секретируемого субэндотелиального матрикса сетчатки также может быть непосредственно точно и надежно измерена с помощью АСМ ^4,5,6.

Этот подход включает в себя выделение капилляров сетчатки мыши от слабо зафиксированных глаз с помощью расщепления трипсина. Как показывает опыт, этот мягкий этап фиксации необходим, так как капилляры, выделенные из нефиксированных глаз (с помощью гипотонического метода), хрупки и фрагментируются, что делает их непригодными для измерения жесткости АСМ⁴. И наоборот, более сильная фиксация и последующая потребность в обширном расщеплении трипсина, о которой сообщалось в другом протоколе расщепления трипсина^{сетчатки 18}, также могут нарушить структурную целостность капилляров, о чем можно судить по разрушению плотных соединений. Таким образом, мягкая фиксация капилляров и щадящее переваривание трипсина, используемые здесь, помогают уменьшить артефакты жесткости, возникающие из-за чрезмерного сшивания, вызванного формалином, и обеспечить структурную целостность капилляров для надежного измерения жесткости АСМ.

В качестве альтернативного подхода в недавнем исследовании сообщалось об измерении жесткости АСМ капилляров сетчатки от слегка фиксированных плоских креплений сетчатки¹⁹. Выполняя силовые вдавливания АСМ на капилляры сетчатки в пределах интактной сетчатки, этот подход позволяет измерять жесткость in situ . Тем не менее, эти измерения жесткости капилляров, вероятно, включают жесткость внутренней пограничной мембраны. Кроме того, этот подход ограничен измерением только поверхностных капилляров, доступных на плоской сетчатке, оставляя за бортом более глубоко расположенные капиллярные сплетения, которые специфически поражаются на ранних стадиях DR²⁰. Эти проблемы можно решить с помощью этого подхода, который извлекает сосуды чисто (без остаточной ткани сетчатки) из всех слоев сетчатки. В настоящее время мы оптимизируем этот протокол для выделения сосудов хориоидеи из животных моделей ранней стадии ВМД. Тем не менее, мы понимаем, что мягкая фиксация формалином, используемая в протоколе, может вызвать связанный с сшивкой артефакт жесткости при измерениях АСМ. Таким образом, было бы целесообразно интерпретировать значения жесткости сосудов, полученные с помощью этого подхода, скорее в терминах относительных изменений жесткости (между различными экспериментальными группами), а не абсолютной жесткости.

В отличие от капилляров сетчатки, требующих мягкой фиксации, субэндотелиальный матрикс, полученный из культур ЭК сетчатки, может быть оценен без каких-либо модификаций. Во многом это связано с прочностью осажденного матрикса, которая является результатом сочетания нескольких факторов, включая добавление аскорбиновой кислоты в культуральную среду (которая усиливает синтез коллагена¹⁵), химическую модификацию стеклянных покровных стекол, предотвращающую отслоение матрицы при децеллюляризации, и увеличенную продолжительность культивирования (10-15 дней). Важно отметить, что мы показали, что индуцированное гипергликемией увеличение жесткости субэндотелиального матрикса in vitro согласуется с индуцированным диабетом увеличением жесткости капилляров сетчатки, наблюдаемым in vivo⁴. Это неудивительно, поскольку ожидается, что увеличение жесткости матрицы приведет к увеличению жесткости вышележащих ЭК сетчатки (из-за механической взаимности), которые в совокупности увеличивают общую жесткость капилляров. Действительно, недавно мы показали, что ЭК сетчатки становятся более жесткими при выращивании в условиях диабета⁴, вероятно, за счет увеличения Rho/ROCK-зависимого актинового цитоскелетного напряжения²¹. Эти результаты также подразумевают, что ригидность сосудистой оболочки ЭК, наблюдаемая в модели макак-резусов с ранней ВМД, отражает повышенную жесткость субэндотелиального матрикса хориоидеи и интактных сосудов¹², идея, которая проверяется в текущих исследованиях. В целом, тот факт, что изменения жесткости в нефиксированном субэндотелиальном матриксе сетчатки и ЭК отражают тенденцию, наблюдаемую в слабо фиксированных интактных сосудах сетчатки, свидетельствует о валидности подхода мягкой фиксации.

Прямое измерение жесткости капилляров сетчатки на животных моделях ДР не только помогает утвердить эндотелиальную механобиологию в качестве новой терапевтической мишени для лечения ДР, но и дает убедительное обоснование для разработки новых чувствительных методов визуализации для неинвазивной оценки жесткости капилляров сетчатки у пациентов с ДР в будущем. Такие неинвазивные методы потенциально могут обнаружить тонкие изменения в кровотоке, которые, как ожидается, возникают из-за жесткости капилляров, подобно изменениям скорости артериальной пульсовой волны, которые обычно обнаруживаются при сердечно-сосудистых заболеваниях, вызванных диабетом. Измерения жесткости АСМ капилляров сетчатки, выделенных из посмертных человеческих глаз от доноров с диабетом, обеспечат важное доказательство концепции в этом отношении. Учитывая, что жесткость капилляров сетчатки увеличивается на ранних стадиях мышиной модели (стрептозотоцина) сахарного диабета^{1 типа 4}, успешное использование АСМ для валидации методов визуализации для измерения жесткости может привести к идентификации ригидности капилляров сетчатки как клинического биомаркера раннего патогенеза DR.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
<сильная>капиллярная изоляция сетчатки
0,22 &; m Шприцевой фильтр из ПВДФ	Merck Millipore	SLGVM33RS	Низкое связывание белка Durapore
10X Фосфат Дульбекко Фосфатный буферный раствор без кальция % магния	Corning	20-031-CV	Конечная концентрация 1X, pH 7,4
12-луночный планшет	Falcon Corning	353043
центрифужная пробирка 15 мл	Corning	430791	без рназы-дназы, непирогенный
20 мл Шприц Luer-Lok TIP	BD	302830
5 3/4 дюймов Одноразовый боросиликатный стеклянный/нестерильный пипетка Пастера	FisherBrand	13-678-20A
60x15 мм Чашка для культуры тканей	Falcon Corning	353002
6-луночная пластина	Falcon Corning	353046
Aqua-Hold 2 Pap - 13 мл	Ручка Научное устройство Лаборатория	9804-02
Держатель лезвия	X-ACTO
Углеродистая сталь Хирургическое лезвие #10	Bard-Parker	371110
Стоматологический воск	Электронная микроскопия Науки	50-949-027
Препарирующий микроскоп	Am-scope
Раствор формалина, нейтральный буферный, 10%	Миллипор Sigma	HT501128-4л	Конечная концентрация 5% (v/v)
Kimwipes - салфетка для стеклоочистителя	Kimtech Science	34133
Микрошпатель	Fine Science Tools	10089-11
Орбитальный шейкер	Lab Genius	SK-O180
PELCO Economy #7 Нержавеющая сталь 115мм  Пинцет	Ted Pella, Inc.	5667
Фазово-контрастный микроскоп	Nikon TS2
Очиститель Logic+ Класс II, тип A2 Кабинет биобезопасности	Labconco	302380001
Safe-Lock микроцентрифужные пробирки 2 мл	Eppendorf	22363352
Стереоскоп	AmScope	SM-3 Zoom Тринокулярный стереомикроскоп 3.5X-90X
Предметное стекло для микроскопии Superfrost Plus - Белая вкладка - Предварительно очищенный - 25x75x1,0 мм	FisherBrand	1255015
Трис Буфер, 0,1М раствор, pH 7,4 - Биотехнологический класс	VWR	E553-500ML	pH 8 для раствора трипсина
Трипсин 1:250 порошок Культура тканей Класс	VWR	VWRV0458-25G	10 % (по массе) раствор трипсина
Вода Молекулярная биология Класс	Corning	46-000-CM
<сильный>субэндотелиальный матрикс
10X PBS	Corning	20-031-CV
1X PBS с кальцием и магнием	Thermo Fisher Scientific	14040-117	pH 7,4
Гидроксид аммония	Sigma-Aldrich	338818
аскорбиновая кислота	Sigma-Aldrich	A4034
Collagen IV антитело	Novus Biologicals	NBP1-26549
DNase I	Qiagen	79254
Этаноламин	Sigma-Aldrich	398136
Антитела к фибронектину	Sigma-Aldrich	F6140
Fluoromount	Invitrogen-Thermo Fisher Scientific	00-4958-02
Желатин	Sigma-Aldrich	G1890
Стеклянные покровные стекла (12 мм)	Fisher	12-541-000
Глутаральдегидная	электронная микроскопия Науки	16220
Эндотелиальные клетки сетчатки человека (HREC)	Cell Systems Corp	ACBRI 181
MCDB131 среда	Corning	15-100-CV
Эндотелиальные клетки сетчатки мыши (mREC)	Клеточные биологические препараты	C57-6065
Triton X-100	Thermo Fisher Scientific	BP151-100
Трипсин	Gibco-Thermo Fisher Scientific	25200-056
AFM Измерение
1 &микро; m Зонд	Bruker	SAA-SPH-1UM	Полусферический зонд высотой 19 мкм с конечным радиусом 1<бр/> мкм, пружинная постоянная 0,25 Н/м
70 нм LC-зонд	Bruker	PFQNM-LC-V2	Полусферический зонд высотой 19 мкм с конечным радиусом 70 нм,<бр/>   Постоянная пружины 0,1 Н/м
камера	семейства XCAM	Toupcam	1080P HDMI
Desktop для запуска камеры	Asus	Asus настольный	Intel i5-6600 CPU , 8 ГБ ОЗУ
Держатель тарелки для покровного стекла	Cellvis	D29-14-1.5-N	29 мм стеклянная нижняя тарелка с   14 мм микролуночный
Nanowizard 4	Bruker	Nanowizard 4	Bioscience атомно-силовой микроскоп, установленный на оптическом микроскопе для чувствительного измерения механоструктурных свойств (жесткости и рельефа) мягких биологических образцов
Фазово-контрастный микрскоп	Zeiss	Axiovert 200	Инвертированный микроскоп с 10-кратным объективом