Методическая статья

Применение штрихкодирования ДНК для идентификации лекарственных растений

2.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/66925

⸱

1 ноября 2024 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1School of Pharmacy, Guizhou University of Traditional Chinese Medicine, 2School of Pharmacy/School of Modern Chinese Medicine Industry, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 3Institute of Herbgenomics, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

В этой статье

Краткое содержание

Настоящий протокол описывает использование технологии штрих-кодирования ДНК для аутентификации лекарственных материалов растительного происхождения, а также лекарственного растения Angelica sinensis (Oliv.) В качестве примера был приведен Дильс.

Аннотация

Лекарственные растения являются ценным ресурсом во всем мире и используются во всем мире для поддержания здоровья и лечения болезней; Однако наличие фальсификаций препятствует их развитию. Штрихкодирование ДНК, метод идентификации видов по стандартным участкам ДНК, способствует быстрой и точной идентификации традиционных лекарственных растений. Процесс штрихкодирования ДНК включает в себя шесть основных этапов: 1) обработка лекарственных растений, 2) извлечение высококачественной общей ДНК из лекарственных растений методом центробежной колонки, 3) амплификация целевого участка ДНК на внутреннем транскрибируемом спейсере 2 (ITS2) универсальными праймерами растений и выполнение секвенирования по Сэнгеру, 4) сплайсинг и выравнивание последовательности для получения целевой последовательности, 5) сопоставление последовательности штрих-кода с библиотекой штрих-кодов для идентификации, 6) выравнивание последовательности, сравнение внутривидовой и межвидовой изменчивости, построение филогенетического дерева соседства. Как показано в результатах, универсальный праймер может усиливать целевую область. Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) демонстрирует, что процент идентификации составил 100%, а дерево присоединения соседей демонстрирует, что последовательности сплайсинга были кластеризованы с кладой A. sinensis OR879715.1, а значение поддержки клады равно 100. Этот протокол дает представление о применении технологии штрих-кодирования ДНК в качестве эффективного метода идентификации лекарственных растений и примесей.

Введение

Лекарственные растения обладают широким спектром фармакологических эффектов и являются важными веществами для лечения и профилактики заболеваний. Рыночный спрос на лекарственные растения в растительных лекарственных средствах и фармацевтических продуктах огромен и продолжает расти. С ростом рынка лекарственных растений проблема фальсификации препятствует развитию лекарственных растений. В настоящее время фальсификация лекарственных растений страдает от следующих причин: 1) схожая морфология лекарственных растений затрудняет их идентификацию и правильное использование 1,2,3,4,5, 2) растущий спрос на лекарственные растения привел к недостаточному предложению на рынке 6,7, 3) лекарственные растения дороги и имеют колеблющиеся цены, а использование дешевых трав вместо экономически ценных материалов привело к фальсификации и рыночной спекуляции 8,9. Для решения задач правильной идентификации и использования лекарственных растений существует потребность в технологии, позволяющей неспециалистам идентифицировать источник10.

Существуют ограничения для правильной идентификации и использования лекарственных растений только по внешнему виду и запаху11. Для более точной идентификации и контроля качества используются физико-химические методы12. Тонкослойная хроматография (ТСХ), например, является быстрым методом идентификации лекарственных трав и включена в Китайскую фармакопею. Тем не менее, для идентификации растений требуются стандартные образцы13. Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) может выполнять как качественные, так и количественные тесты, что делает ее пригодной для тестирования качества лекарственных средств. Однако этот инструмент стоит дорого и требует специальных знаний для работы14,15. Технология штрихкодирования ДНК — это быстрая и точная технология идентификации видов, которая идентифицирует виды с помощью стабильных последовательностей ДНК для дифференциации растений со схожей морфологией. Hebert et al. предложили технологию штрих-кодирования ДНК для идентификации видов, которая использует распознанную и относительно короткую последовательность ДНК в пределах генома16, Chen et al. предложили ITS2 в качестве универсальной последовательности для молекулярной идентификации лекарственных растений и идентифицировали более 6600 растений и обнаружили высокую способность к идентификации17. Изучение лекарственных растений на основе фрагментов генов ITS2 и хлоропластов продемонстрировало способность различать виды на видовом уровне, применяя их в сферах защиты ресурсов, регулирования рынка и международной торговли 17,18,19. Применение штрих-кодирования ДНК может преодолеть ограничения традиционных методов идентификации, что полезно для обеспечения качества и безопасности лекарственных растений, предотвращения злоупотребления ресурсами и путаницы20. Он оказался полезным для изучения лекарственных растений, поддерживая устойчивый рост травяной промышленности и обеспечивая гарантию того, что потребитель использует правильное лекарство 21,22,23,24.

В документе изложены протоколы применения штрих-кодирования ДНК для идентификации лекарственных растений на примере A. sinensis. Штрихкодирование ДНК использует один или несколько стандартизированных коротких генетических маркеров в ДНК организма, чтобы распознать его принадлежность к определенному виду. Современные методы идентификации лекарственных растений имеют определенные ограничения. Традиционная морфологическая идентификация в значительной степени опирается на обширный опыт экспертов, на который может влиять человеческий фактор, в то время как химическая идентификация подвержена таким проблемам, как фальсификация ключевых соединений. В отличие от этого, штрихкодирование ДНК обеспечивает более точные средства идентификации видов, предлагая такие преимущества, как скорость, высокая воспроизводимость и стабильность. Кроме того, эта технология обеспечивает централизованное управление и обмен существующими данными о последовательностях видов через Интернет и информационные платформы, значительно повышая эффективность и надежность идентификации видов 11,12. Из-за схожей морфологии и лекарственных компонентов, A. sinensis часто путают с другими видами и часто неправильно используют или намеренно подменяютна рынке. Yang et al. идентифицировали A. anomala с помощью штрих-кодирования ДНК, чтобы отличить ее от ложных наркотиков26. Юань и др. собрали 23 вида дягиля и использовали штрих-кодирование ДНК для дифференциации различных видов27. Следуя процедурам, описанным в этом протоколе, пользователи смогут аутентифицировать лекарственные материалы растительного происхождения от предварительной обработки до окончательного сопоставления последовательности штрих-кодирования с базой данных штрих-кодов (Рисунок 1).

Протокол

1. Подготовка образцов

  1. В настоящем исследовании в качестве экспериментального материала использовались двухлетние растения A. sinensis с низкой температурой и длительным солнечным светом на высоте 2800 м от уезда Минь, провинция Ганьсу. Были отобраны три растения, из которых было отобрано более трех корней для экспериментов. Сначала промойте корни стерилизованной водой, а затем очистите их спиртовым распылителем или спиртовыми тампонами, чтобы предотвратить загрязнение, которое может повлиять на точность экспериментальных результатов. Разрежьте корни на кусочки размером менее 5 мм с помощью стерилизованного скальпеля и перемешайте для дальнейшего анализа. (Рисунок 2).
    ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы поместите корни в жидкий азот, чтобы они стали хрустящими, чтобы их было легче сломать. В зависимости от формы, твердости и других характеристик лекарственных растений, используйте инструменты для борьбы с ними.
  2. Подготовьте три пробирки с экспериментальными образцами для параллельных опытов. Пометьте каждый образец как AS-1, AS-2 и AS-3. Возьмите около 100 мг свежей или 20 мг сухой ткани (высушенной на воздухе) и поместите ее в центрифужную пробирку объемом 2 мл.
  3. Поместите две бусины из нержавеющей стали 5 мм в пробирки для центрифуги объемом 2 мл. Перенесите трубки в высокопроизводительную тканевую шлифовальную машину, работающую с частотой 60 Гц, в течение 60 с.

2 Экстракция ДНК из образца

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании используется набор для экстракции геномной ДНК растений, который основан на методе CTAB. Экстракция ДНК проводится в соответствии с инструкцией по эксплуатации с некоторыми изменениями, включая добавление уникального ядерного изоляционного буфера (NIB). Протокол улучшает чистоту ДНК путем отделения загрязняющих веществ от ткани, а затем добавления начальной стадии выделения ядер 28,29,30.

  1. Добавьте 800 μл предварительно охлажденного NIB и поместите образец на вихревой смеситель, вибрирующий в течение 5 минут.
  2. Поместите в центрифугу и обрабатывайте при 13 780 x g в течение 10 минут. Удалите надосадочную жидкость.
  3. Повторите шаги 2.1-2.2 еще 3 раунда.
    ПРИМЕЧАНИЕ: NIB извлекает ДНК более высокого качества, а его препарат содержит некоторые опасные химические вещества, с которыми необходимо работать в вытяжном шкафу, что затрудняет работу новичков. Однако этот шаг не является обязательным. Пользователи могут следовать этой рекомендации или пропустить эти шаги. Его подробная формулировка приведена в таблице 1.
  4. Добавьте 600 мкл буфера P1 и 5 мкл РНКазы А (10 мг/мл). Поместите образец на вихревой смеситель и перемешайте вортекс. Инкубируйте образцы на водяной бане при температуре 65 °C в течение 1,5 ч, переворачивая пробирки в 2-3 раза во время инкубации.
  5. Добавьте 200 μл буфера P2, тщательно перемешайте, поместите на лед на 15 минут, а затем центрифугируйте при 13 780 x g в течение 10 минут.
  6. Осторожно отсадите надосадочную жидкость на фильтрующую колонку AF, центрифугируйте при давлении 13 780 x g в течение 2 минут и перенесите нижний фильтрат, собранный в сборной пробирке, в новую центрифужную пробирку объемом 1,5 мл.
  7. Рассчитайте объем фильтрата, добавьте в 1,5 раза больше объема P3 и немедленно встряхните, чтобы получить смешанный раствор.
  8. Добавьте 650 мкл приготовленной смеси в адсорбционную колонну адсорбционной колонны (АС) и инкубируйте в течение 5 мин, затем центрифугируйте при 13 780 х г в течение 30-60 с.
  9. Снова добавьте фильтрат, полученный на шаге 2.8, в кондиционер, центрифугируйте и выбросьте отработанную жидкость. Повторите процедуру с оставшимся смешанным раствором из шага 2.7.
  10. Добавьте 600 μL раствора для полоскания WB, центрифугируйте при 13 780 x g в течение 30 с, выбросьте отработанный раствор и повторите процедуру 1 раз.
  11. Поместите колонку AC обратно в пустую сборную трубку, центрифугируйте при давлении 13 780 x g в течение 2 минут и оставьте при комнатной температуре для удаления остатков этанола.
  12. Возьмите адсорбентную колонку АС и поместите ее в чистую центрифужную пробирку объемом 1,5 мл. Добавьте 45 μL стерилизованной деионизированной воды (ddH2O) в середину мембраны адсорбента, которая была нагрета до 65 °C. Оставить при комнатной температуре на 5 минут. Центрифугируйте при давлении 13 780 x g в течение 2 мин.
  13. Добавьте полученный раствор обратно в колонку и центрифугируйте при давлении 13 780 x g в течение 2 минут при комнатной температуре.
  14. Соберите отфильтрованный раствор. Используйте спектрофотометр для определения концентрации ДНК; OD260 представляет собой поглощение нуклеиновых кислот. Используйте следующие критерии для стандарта определения качества ДНК: OD260/OD280=1,80-2,00, нормальный диапазон; OD260/OD280>2.00; имеется большое количество загрязнения РНК; OD260/OD280<1.80, есть белки, фенолы и другие загрязнения.

3 Усиление и обнаружение фрагментов мишени

ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите подходящие праймеры амплификации на основе предложенных растением участков штрих-кодирования ДНК; условия реакции приведены в таблице 2.

  1. Задайте условия реакции, соответствующие амплификации праймера. Используйте центрифужные пробирки объемом 0,2 мл, заполненные 9,5 мкл ddH2O, 12,5 мкл 2x PCR Master Mix и по 1 мкл прямого праймера, обратного праймера и матричной ДНК общим объемом 25 мкл. Приготовьте отрицательный контроль, заменив матрицу водой.
  2. Добавьте 20 мл 1x Tris Acetate-EDTA (TEA) буфера и 0,2 г агарозы для нагревания и приготовьте 1% агарозный гель, затем добавьте 2 мкл геля нуклеиновой кислоты (10 000x) и тщательно перемешайте. Вылейте смесь в лоток для литья геля и дайте ей застыть, чтобы получить агарозный гель. Добавьте в гель 3 мкл продукта ПЦР и 2 мкл ДНК-маркера 5000.н.
  3. Установите напряжение на 120 В, ток на 400 мА и электрофорез на 40 мин. Используйте универсальную систему анализа изображений гелей для просмотра гелей и проверки результатов.

4. Сбор и анализ данных

ПРИМЕЧАНИЕ: Существует широкий спектр программного обеспечения для сборки и анализа последовательностей; В качестве примера для иллюстрации мы используем кодон-код Aligner V11.0.1 и MEGA11.

  1. Используйте выравниватель, чтобы открыть файл секвенирования, чтобы просмотреть карту пиков и склеить файлы карты пиков двунаправленной последовательности.
    1. Выберите «Создать новый проект» и нажмите «ОК», чтобы перейти на домашнюю страницу программного обеспечения. Выберите «Добавить сэмплы » в меню «Файл», выберите «Файл , который будет обработан в формате трассировки последовательности» и импортируйте его непосредственно в программное обеспечение в качестве импортированного файла в разделе «Несобранные сэмплы».
    2. Выберите «Контиг», затем в разделе выберите «Расширенная сборка», а затем выберите «Собрать в группы». Новые пользователи, выбрав Собрать в группах, увидят следующее диалоговое окно: Выберите Определить имена. Измените Определить имя образца деталей в соответствии с именем файла и нажмите Собрать. Будет отображена выровненная последовательность.
    3. Получение полных последовательностей ITS2 в соответствии с анализом скрытой модели Маркова (HMM). Используйте последовательности 5.8s (CGAGGGCACGCCTGCCTGGGCGTCA) и 28s (CGACCCCAGGTCAGGCGGGGCCACC)31 для поиска выровненной последовательности с начала для удаления областей 5.8s и 28s.
    4. Выберите «Перейти», затем в разделе выберите «Последовательность поиска » и нажмите «ОК», чтобы получить соответствующую последовательность. Выберите Contig, выберите Delete в разделе, чтобы удалить регионы 5.8s и 28s и последовательности низкого качества, а затем программное обеспечение выведет последовательности склейки для сопоставления.
  2. Используйте для идентификации сплайсинговые последовательности, полученные на трех параллельных экспериментальных этапах, выберите поиск BLAST с использованием базы данных нуклеотидов в Национальном центре биотехнологической информации (NCBI) и выберите Species Identification Tool и Specific Primer ITS2 , соответствующие в базе данных Глобальной фармакопейной базы данных генома (GPGD).
    ПРИМЕЧАНИЕ: NCBI32 и GPGD33 включают нуклеотидные последовательности лекарственных растений и животных и признаны авторитетными базами данных. Их основными методами идентификации являются методы, основанные на сравнении последовательностей34 (BLAST). Процентная идентичность из результатов идентичности используется для определения того, является ли вид с наибольшим сходством целевым родом.
  3. Используйте MEGA11 для выравнивания последовательностей, анализа и сравнения внутривидовых и межвидовых вариаций последовательностей, а также построения филогенетического дерева соседства.
    1. Загрузите последовательности трех видов Angelica и одного вида Peucedanum praeruptorum в качестве внешней группы из NCBI. Проанализируйте эти последовательности вместе с полученной результирующей последовательностью.
    2. Нажмите «Файл», выберите «Открыть файл/сеанс», чтобы импортировать файл, и появится диалоговое окно. Выберите Align > DNA, а затем выберите Align by ClustalW для сравнения последовательностей. Выберите «Филогенетический анализ» в разделе «Данные», затем вернитесь на главную страницу. Нажмите кнопку Создать/Проверить дерево присоединения соседей в PHYLOGONEY. Программное обеспечение генерирует филогенетическое дерево.

Результаты

Качество образца ДНК

Диапазон коэффициентов поглощения OD260/OD280 составил 1,80-1,84. Количество ДНК, измеренное спектрофотометром для каждого образца, превышало 100 нг/л (табл. 3), что свидетельствует о хорошем качестве экстракции ДНК образца. Это указывает на то, что образцы не были загрязнены белком, РНК или реагентами в процессе экстракции, а также на то, что они были хорошего качества и пригодны для последующей ПЦР-амплификации.

ПЦР-анализ

Гель-электрофорез проводили на продукте ПЦР трех параллельных экспериментальных образцов. Конфигурация была следующей: маркер, образцы 1-3 (AS-1, AS-2, AS-3) и отрицательный контроль (0), как показано на рисунке 3. Размеры AS-1, AS-2 и AS-3 находятся в пределах 500.о. с одиночными, яркими, прозрачными полосами, и отсутствуют полосы в 0, что указывает на то, что извлеченная ДНК была амплифицирована до 500.о. с использованием праймеров ITS2.

Сравнение результатов секвенирования в базе данных

Результаты секвенирования идентифицировали A. sinensis со 100% сходством последовательностей путем объединения результатов идентификации BLAST из базы данных NCBI, которая совпадает с результатами идентификации видов из базы данных GPGD (табл. 4). Результат BLAST был определен с использованием наивысшего процента оценки идентичности и наименьшего e-значения. Идентификация видов считалась успешной, когда наивысший максимальный процент идентичности включал один вид и набирал >99%. Если оценка составляет ≤ 99%, проверьте качество файла секвенирования или не загрязнен ли продукт ПЦР.

Филогенетический древовидный анализ идентификации видов

Результаты показали, что в построенном филогенетическом дереве штата Нью-Джерси все четыре вида были сгруппированы в отдельные клады, а P. praeruptorum как внешняя группа была отделена от клад Angelica . Последовательности сплайсинга были сгруппированы с кладой A. sinensis OR879715.1, и значение поддержки клады (bootstrap) было равно 100, а затем два других вида, A. dahurica и A. cartilaginomarginata , были сгруппированы в отдельную кладу, тем самым доказав, что последовательности сплайсинга были A. sinensis (рис. 4).

figure-results-1
Рисунок 1: Блок-схема идентификации видов лекарственных растений. (А) обработка растений, экстракция ДНК и секвенирование лекарственных растений, (В) сравнение последовательности видов с использованием баз данных и (В) использование филогенетических деревьев для таксономической валидации с целью подтверждения филогенетических отношений между видами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2: Рабочий процесс экстракции ДНК лекарственных растений. (А) Всего 6 этапов выделения ДНК из лекарственных растений. (B) Процесс инструментальной амплификации ПЦР и циклирования ПЦР. (в) Электрофорез. (D) Секвенирование по Сэнгеру и секвенционная хроматограмма. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-3
Рисунок 3: Гель-электрофорез Angelica sinensis (Oliv.) Диелс. Используя ДНК-маркер DL5000 в качестве молекулярного маркера, AS-1, AS-2 и AS-3 используют в качестве образцов, а 0 — в качестве контрольной группы. Был проведен гель-электрофорез, и результаты показали, что образцы AS-1, AS-2 и AS-3 имели полосы на уровне 500.о., в то время как контрольная группа не показала никаких полос. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-4
Рисунок 4: Филогенетическое дерево, созданное из 13 последовательностей. В общей сложности 10 последовательностей от четырех видов растений были загружены из базы данных NCBI, и последовательности сплайсинга были сравнены для анализа и сравнения внутривидовых и межвидовых вариаций последовательностей и для построения филогенетических деревьев, присоединяющихся к соседям. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Наименование материала/оборудованиядоза
Поливинилпирролидон10 г
Трис-HCl1 М 50 мл
Этилендиаминтетрауксусная кислота0,5 М 20 мл
NaCl20,45 г
β-меркаптоэтанол10 мл
Стерилизованная деионизированная вода500 мл

Таблица 1: Реагенты для создания буфера ядерной изоляции.

ШтрихкодБукварьПоследовательность праймеров (5'-3')Секвенирование амплификации ПЦР
ИТС2R:3RGACGCTTCTCCAGACTACAAT94°C5 мин
94°C30-е годы40циклов
56°C30-е годы
Ф:2ФATGCGATACTTGGTGTGAAT72°C45с
72°C10 минут

Таблица 2: Праймеры штрих-кодов ДНК и условия реакции ПЦР.

ОбразцыЭкстракция ДНК (нг/мкл)ОД260/ОД280
АС-11241.84
АС-21841.81
АС-31641.82

Таблица 3: Angelica sinensis (Oliv.) Дильс извлек качество ДНК.

ОбразцыДлина выровненной последовательности (bp)Длина последовательности сращивания (bp)ГК (%)NCBI:Процент взрыва (%)GPGD:Процент идентификации видов (%)
АС-1500 б.н.229б.н.55.50%100%100%
АС-2504 б..229б.н.55.50%100%100%
АС-3499 б..229б.н.55.50%100%100%

Таблица 4: Сравнение результатов секвенирования в базе данных.

Обсуждение

Технологию молекулярной идентификации легче изучить и освоить, чем традиционные методы идентификации. Он преодолевает ограничения традиционной идентификации лекарственных трав, поскольку на него не влияет стадия роста растения и он не опирается на субъективное суждение или накопление специализированныхзнаний. Другие виды путают с A. sinensis из-за схожей морфологии и лекарственных компонентов, но с помощью штрих-кодирования ДНК его можно окончательно идентифицировать36.

Ключевые шаги в этом протоколе включают в себя несколько критических соображений. Во-первых, предотвращение загрязнения при работе с травами и извлечение ДНК имеет важное значение для предотвращения ухудшения результатов чужеродными ДНК или примесями. Надлежащая очистка образцов необходима для удаления внешних загрязнений, в то время как тщательное измельчение улучшает экстракцию ДНК за счет увеличения площади поверхности для взаимодействия с реагентами. Также важно использовать соответствующее количество образца, чтобы обеспечить эффективное смешивание с реагентами, что позволяет улучшить цитолиз и высвобождение ДНК. Наконец, контроль времени действия водяной бани имеет решающее значение, так как чрезмерный нагрев может привести к деградации ДНК, что повлияет на качество извлеченной ДНК. В совокупности эти этапы обеспечивают успешное извлечение высококачественной ДНК для анализа.

Лекарственные растения содержат полисахариды и полифенолы, которые влияют на экстракцию и амплификацию ДНК. Использование буфера для ядерной изоляции снижает действие этих веществ и обеспечивает лизис ядер, что приводит к лучшему извлечению высокочистой гДНК 28,29,30. В настоящее время существует три основных метода экстракции ДНК: метод центробежной колонки, метод CTAB и метод SDS. Тем не менее, в этом исследовании для экспериментов был выбран метод центробежной колонки из-за его стабильности, простоты, эффективности и способности извлекать высокие концентрации ДНК37, а нагревание элюирующего буфера может помочь элюировать ДНК с лучшим качеством. В данном исследовании были выбраны ITS2-специфичные праймеры17,38, короткая последовательность ITS2 служит эффективной таксономической последовательностью-меткой по сравнению с другими праймерами39, которые имеют высокую межвидовую изменчивость и более широкий диапазон идентификаций. Возможная причина сбоя амплификации — деградация ДНК в некоторых образцах; Другая возможность заключается в том, что пара используемых универсальных грунтовок ITS2 может не работать для определенных видов или при использовании альтернативного набора универсальных грунтовок40. Результат BLAST был определен с использованием наивысшего процента оценки идентичности и наименьшего e-значения. Идентификация видов считалась успешной, когда наивысший максимальный процент идентичности включал один вид и набирал >99%40,41, для оценки ≤99% проверяли качество файла секвенирования или загрязнение ПЦР-продукта.

Таким образом, штрихкодирование ДНК должно играть ключевую роль в контроле качества традиционной фитотерапии и международной торговли травами. В этой статье представлены некоторые сведения об извлечении ДНК растений и подробное руководство по использованию технологии штрихкодирования ДНК для идентификации лекарственных растений. В нем выделены ключевые моменты, на которые следует обратить внимание в ходе экспериментального процесса. Таким образом, эта статья предоставляет ссылки для базовой идентификации трав и помогает большему количеству людей быстро освоить эту технологию. Однако в особых случаях, когда эффективность идентификации по одному локусу штрих-кода недостаточна, она зависит от справочной библиотеки. Создание справочной библиотеки с широким охватом видов стало бы важным шагом на пути к идентификации видов с помощью штрих-кодов ДНК42, и многие исследователи предположили, что технология мультилокусного штрихкодирования может повысить эффективность43,44. Кроме того, с развитием молекулярной технологии Zheng et al. объединили технологию штрихкодирования ДНК с технологией изотермической амплификации ДНК и детектированием RPA-LFD для быстрой аутентификации ядовитых растений45, а также были разработаны некоторые готовые наборы46. База данных штрих-кодов ДНК постоянно совершенствуется, что играет важную роль в содействии обобщению, стандартизации и интернационализации методов идентификации фитотерапии.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что исследование проводилось в отсутствие каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

Данная работа была поддержана внедрением талантливого человека в рамках проекта субсидирования научных исследований Чэндуского университета традиционной китайской медицины (030040015).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
CTAB Набор для быстрой экстракции геномной ДНК растенийShanghai Huiling Biotechnology Co.NG411MПодходит для быстрого извлечения высококачественной геномной ДНК из различных тканей широкого спектра растений
DL5000 DNA MarkerNanjing vazyme Bio-technology Co.MD102-02Готовый к использованию продукт, возьмите соответствующее количество этого продукта непосредственно для электрофореза при запуске геля.
ЭлектрофорезПекинская биотехнологическая компания LiuyiDYY-6CИспользуйте дизайн с сенсорным экраном, может отображать установленное напряжение, установленный ток одновременно, параллельный выход
этилендиаминтетрауксусной кислотыBeijingpsaitongBiotechnologyCo., LtdE70015-100GЯдерная изолирующая буферная формула реагентов.
Голдвью Гель для окрашивания нуклеиновых кислот (10,000&раз;)Yisheng Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd10201ES03При использовании электрофореза в агарозном геле для обнаружения ДНК он связывается с ДНК и производит сильный флуоресцентный сигнал.
Высокоскоростная настольная центрифугаChangsha Зона высокотехнологичного промышленного развития Xiangyi Centrifuge Instrument Co.H1650Для быстрого и эффективного разделения образцов эта компактная и легкая центрифуга обеспечивает надежную безопасность
Высокопроизводительный измельчитель тканейShanghai Jingxin Industrial Development Co.Высокочастотный вибрационный прибор Tiss-48 для измельчения образцов
http://www.gpgenome.com/Институт китайской материи медики, Китайская академия китайских медицинских наук-база данных HerbGenomics включает последовательности генома, наборы генов, геномы органелл, данные генома с низким покрытием и последовательности штрих-кодов ДНК.
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Национальная медицинская библиотека США–Национальный центр биотехнологической информации способствует развитию науки и здравоохранения, предоставляя доступ к биомедицинской и геномной информации.
Kylin-BellHaimen Qilinbel Instrument Manufacturing Co.VORTEX-5Быстрое перемешивание в виде высокоскоростного вихря, скорость смешивания, равномерность, тщательность
LifeTouchHangzhou BORI Technology Co.TC-96/G/H(b)BВнедрение передовой технологии термоэлектрического охлаждения и недавно созданной технологии TAS для повышения общей производительности
Многофункциональная система анализа изображений геляЮго-западный операционный центр Shanghai Tianneng Life Science Co.Tanon-Mini Space 2000Выполняет быстрые эксперименты по амплификации генов с градиентной функцией для картирования условий амплификации и диапазоном температур градиента до 30°С; C
NaClBeijing Solarbio Science & Технологическая компания Лтд.S8210-100Реагенты для создания буфера ядерной изоляции.
Нанодроп Уан ГенесЛтд.ND ONEКоличественное определение образцов ДНК, РНК и белков за считанные секунды с помощью всего 1-2 & микро; L образца
поливинилпирролидонаShanghai yuanye Bio-Technology Co., LtdS30268-500gЯдерный изоляционный буфер рецептура реагентов.
Льдогенератор снежинокShanghai Zhixin Experimental Instrument Technology Co.ZX-60XИспользование метода ротационной экструзии льда, быстрая скорость производства льда и высокая эффективность производства льда
Бусины из нержавеющей стали для гомогенизатора тканейBeyotime Biotechnology.F6623Оборудование для измельчения и смешивания тканей и других образцов с помощью вибрационного
буфера Tris Acetate-EDTABeyotime Biotech IncST716TAE является широко используемым буфером для электрофореза ДНК, часто используемым в электрофорезе в агарозном геле.
Трис-HClПекин Соларбио Наука и Технологическая компания Лтд.T8230Реагенты для создания буфера ядерной изоляции.
Чайник с водяной банейShanghai Senxin Experimental Instrument Co.DK-8DПрецизионный термостат и регулирование температуры, точный и надежный контроль температуры
&бета;-меркаптоэтанолShanghai Eon Chemical Technology Co.R054186-100мл   Рецептура реагентов для создания буфера ядерной изоляции.

Ссылки

  1. Chen, S. L., et al. Conservation and sustainable use of medicinal plants: Problems, progress, and prospects. Chin Med. 11, 37(2016).
  2. Han, J., et al. An authenticity survey of herbal medicines from markets in China using DNA barcoding. Sci Rep. 6, 18723(2016).
  3. Zhang, W., et al. Integration of high-throughput omics technologies in medicinal plant research: The new era of natural drug discovery. Front Plant Sci. 14, 1073848(2023).
  4. Ji, C., et al. Determination of the authenticity and origin of panax notoginseng: A review. J AOAC Int. 105 (6), 1708-1718 (2022).
  5. Parveen, I., Techen, N., Khan, I. A. Identification of species in the aromatic spice family apiaceae using DNA mini-barcodes. Planta Med. 85 (2), 139-144 (2019).
  6. Techen, N., Parveen, I., Pan, Z., Khan, I. A. DNA barcoding of medicinal plant material for identification. Curr Opin Biotechnol. 25, 103-110 (2014).
  7. Xiong, Y., et al. Market access for Chinese herbal medicinal products in Europe-a ten-year review of relevant products, policies, and challenges. Phytomedicine. 103, 154237(2022).
  8. Virk, J. K., Gupta, V., Kumar, S., Singh, R., Bansal, P. Ashtawarga plants - suffering a triple standardization syndrome. J Tradit Complement Med. 7 (4), 392-399 (2017).
  9. An, Y. L., Wei, W. L., Guo, D. A. Application of analytical technologies in the discrimination and authentication of herbs from fritillaria: A review. Crit Rev Anal Chem. 54 (6), 1775-1796 (2024).
  10. Li, M., Cao, H., But, P. P. H., Shaw, P. C. Identification of herbal medicinal materials using DNA barcodes. J Systemat Evolut. 49 (3), 271-283 (2011).
  11. Khan, A., et al. Herbal spices as food and medicine: Microscopic authentication of commercial herbal spices. Plants (Basel). 13 (8), 1067(2024).
  12. Techen, N., Crockett, S. L., Khan, I. A., Scheffler, B. E. Authentication of medicinal plants using molecular biology techniques to compliment conventional methods. Curr Med Chem. 11 (11), 1391-1401 (2004).
  13. Sasidharan, S., Chen, Y., Saravanan, D., Sundram, K. M., Yoga Latha, L. Extraction, isolation and characterization of bioactive compounds from plants' extracts. Afr J Tradit Complement Altern Med. 8 (1), 1-10 (2011).
  14. Wei, Y., et al. Identification techniques and detection methods of edible fungi species. Food Chem. 374, 131803(2022).
  15. Mehle, N., Trdan, S. Traditional and modern methods for the identification of thrips (thysanoptera) species. J Pest Sci. 85 (2), 179-190 (2012).
  16. Hebert, P. D., Cywinska, A., Ball, S. L., Dewaard, J. R. Biological identifications through DNA barcodes. Proc Biol Sci. 270 (1512), 313-321 (2003).
  17. Chen, S., et al. Validation of the its2 region as a novel DNA barcode for identifying medicinal plant species. PLoS One. 5 (1), e8613(2010).
  18. Li, D. Z., et al. Comparative analysis of a large dataset indicates that internal transcribed spacer (its) should be incorporated into the core barcode for seed plants. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (49), 19641-19646 (2011).
  19. Raskoti, B. B., Ale, R. DNA barcoding of medicinal orchids in asia. Sci Rep. 11 (1), 23651(2021).
  20. Chen, S., et al. DNA barcoding in herbal medicine: Retrospective and prospective. J Pharm Anal. 13 (5), 431-441 (2023).
  21. Pei, Y., et al. Whole-genome sequencing in medicinal plants: Current progress and prospect. Sci China Life Sci. 67 (2), 258-273 (2024).
  22. Zhu, S., Liu, Q., Qiu, S., Dai, J., Gao, X. DNA barcoding: An efficient technology to authenticate plant species of traditional chinese medicine and recent advances. Chin Med. 17 (1), 112(2022).
  23. Pang, X., Shi, L., Song, J., Chen, X., Chen, S. Use of the potential DNA barcode its2 to identify herbal materials. J Nat Med. 67 (3), 571-575 (2013).
  24. Ajmal Ali, M., et al. The changing epitome of species identification - DNA barcoding. Saudi J Biol Sci. 21 (3), 204-231 (2014).
  25. Peng, H., Chen, G., Ou, L. L., Luo, M., Zhang, C. Development of a new efficient scar marker for authentication of Angelica sinensis, an important traditional Chinese medicine. Scienceasia. 47 (6), 751-757 (2021).
  26. He, Y., et al. Authentication of Angelica anomala avé-lall cultivars through DNA barcodes. Mitochondrial DNA. 23 (2), 100-105 (2012).
  27. Yuan, Q. J., et al. Identification of species and materia medica within Angelica l. (umbelliferae) based on phylogeny inferred from DNA barcodes. Mol Ecol Resour. 15 (2), 358-371 (2015).
  28. Xie, P. J., Ke, Y. T., Kuo, L. Y. Modified ctab protocols for high-molecular-weight DNA extractions from ferns. Appl Plant Sci. 11 (3), e11526(2023).
  29. Stefanova, P., Taseva, M., Georgieva, T., Gotcheva, V., Angelov, A. A modified ctab method for DNA extraction from soybean and meat products. Biotech Biotechnol Equipment. 27 (3), 3803-3810 (2013).
  30. Li, Z., Parris, S., Saski, C. A. A simple plant high-molecular-weight DNA extraction method suitable for single-molecule technologies. Plant Meth. 16, 38(2020).
  31. Keller, A., et al. 5.8s-28s rrna interaction and hmm-based its2 annotation. Gene. 430 (1-2), 50-57 (2009).
  32. Morgulis, A., et al. Database indexing for production megablast searches. Bioinformatics. 24 (16), 1757-1764 (2008).
  33. Liao, B., et al. Global pharmacopoeia genome database is an integrated and mineable genomic database for traditional medicines derived from eight international pharmacopoeias. Sci China Life Sci. 65 (4), 809-817 (2022).
  34. Ghahramanlu, A., Rezaei, M., Heidari, P., Balandari, A. Species survey of iranian barberry genotypes using ITS2 sequences and basic local alignment search tools. Erwerbs-Obstbau. 65, 2491-2499 (2023).
  35. Han, K., Wang, M., Zhang, L., Wang, C. Application of molecular methods in the identification of ingredients in Chinese herbal medicines. Molecules. 23 (10), 2728(2018).
  36. Wang, X., Liu, Y., Wang, L., Han, J., Chen, S. A nucleotide signature for the identification of Angelicae sinensis radix (danggui) and its products. Sci Rep. 6, 34940(2016).
  37. Chen, R., et al. DNA based identification of medicinal materials in Chinese patent medicines. Sci Rep. 2, 958(2012).
  38. Hou, D. Y., et al. Molecular identification of corni fructus and its adulterants by ITS/ITS2 sequences. Chin J Nat Med. 11 (2), 121-127 (2013).
  39. Han, J., et al. The short ITS2 sequence serves as an efficient taxonomic sequence tag in comparison with the full-length its. Biomed Res Int. 2013, 741476(2013).
  40. Trujillo-Argueta, S., Del Castillo, R. F., Velasco-Murguía, A. Testing the effectiveness of rbcla DNA-barcoding for species discrimination in tropical montane cloud forest vascular plants (oaxaca, mexico) using blast, genetic distance, and tree-based methods. PeerJ. 10, e13771(2022).
  41. Marizzi, C., et al. DNA barcoding brooklyn (new york): A first assessment of biodiversity in marine park by citizen scientists. PLoS One. 13 (7), e0199015(2018).
  42. Antil, S., et al. DNA barcoding, an effective tool for species identification: A review. Mol Biol Rep. 50 (1), 761-775 (2023).
  43. Pang, X., et al. Utility of the trnh-psba intergenic spacer region and its combinations as plant DNA barcodes: A meta-analysis. PLoS One. 7 (11), e48833(2012).
  44. Tripathi, A. M., et al. The internal transcribed spacer (its) region and trnh-psba [corrected] are suitable candidate loci for DNA barcoding of tropical tree species of India. PLoS One. 8 (2), e57934(2013).
  45. Zheng, X. S., An, W. L., Yao, H., Xu, J., Chen, S. L. Rapid authentication of the poisonous plant Gelsemium elegans by combining filter-paper-based DNA extraction and rpa-lfd detection. Engineering. 7 (1), 14-16 (2021).
  46. Jiang, C., et al. Barcoding melting curve analysis for rapid, sensitive, and discriminating authentication of saffron (Crocus sativus l.) from its adulterants. Biomed Res Int. 2014, 809037(2014).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

ITS2BLAST

Похожие статьи