Методическая статья

Получение и характеристика органоидов матки крысы из эпителиальных стволовых клеток эндометрия крысы

1.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/66928

⸱

2 августа 2024 г.

 ,  ,  ,  , 
1Meizhou Clinical Institute of Shantou University Medical College, 2Department of Pathology, Meizhou People's Hospital, 3Guangdong Engineering Technological Research Center of Clinical Molecular Diagnosis and Antibody Drugs, Meizhou Academy of Medical Sciences, Meizhou People's Hospital

В этой статье

Краткое содержание

В данной работе мы представляем протокол выделения и культивирования эпителиальных стволовых клеток эндометрия крысы (reESCs), генерирующих органоиды эндометрия крысы. Этот метод облегчает исследования заболеваний эндометрия in vitro , позволяя редактировать гены и проводить другие клеточные манипуляции.

Аннотация

Органоиды эндометрия дают ценную информацию о развитии и патофизиологии заболеваний эндометрия и служат платформой для тестирования лекарств. В то время как органоиды эндометрия человека и мыши были разработаны, исследования органоидов эндометрия крыс остаются ограниченными. Учитывая, что крысы могут лучше моделировать определенные патологии эндометрия, такие как внутриматочные спайки, это исследование было направлено на установление органоидов эндометрия крыс. Мы представляем подробный протокол выделения и культивирования эпителиальных стволовых клеток эндометрия крысы (reESCs) и генерации органоидов эндометрия крысы. Используя усовершенствованную среду расширения reESCs, мы успешно выделили и стабильно расширили reESCs, продемонстрировав их долгосрочный культуральный потенциал. Органоиды, полученные с помощью reESC, продемонстрировали типичные структурные и функциональные характеристики эндометрия, включая гормональную реакцию. Наши результаты показали, что органоиды эндометрия крыс можно культивировать в течение длительного времени со стабильной пролиферацией, сохраняя железистую структуру, полярность клеток и функциональные характеристики эпителия эндометрия. Эта новая модель органоида эндометрия, полученная от крыс, представляет собой ценную платформу для изучения заболеваний эндометрия и тестирования терапевтических вмешательств с потенциальными применениями на различных видах млекопитающих.

Введение

Эндометрий, универсальная и регенеративная ткань в организме человека, подвергается периодическому отслаиванию, регенерации и дифференцировке под влиянием гормонов яичников1. Аномалии эндометрия связаны с различными заболеваниями женской репродуктивной системы, такими как эндометриоз, рак эндометрия и бесплодие2. Отсутствие надежных исследовательских моделей эндометрия затрудняет углубленное изучение патогенеза, клинической диагностики и лечения этих заболеваний. В то время как клеточные линии и животные модели обычно используются для исследований эндометрия, такие проблемы, как фенотипическая нестабильность в клеточных линиях, межвидовые различия в животных моделях и другие ограничения, затрудняют воспроизведение сложной физиологической структуры и динамических функциональных изменений вэндометрии человека.

Органоиды представляют собой трехмерные структуры, образованные путем культивирования стволовых клеток во внеклеточной среде, обладающие способностями к самообновлению и самоорганизации. Они могут имитировать структуру и функцию физиологических и патологических тканей и признаны доклиническими моделями заболеваний человека4. В 2017 году было достигнуто успешное конструирование органоидов эндометрия мыши и человека путем встраивания фрагментированной свободной ткани эндометрия, полученной в результате ферментативного расщепления, во каркас внеклеточного матрикса с последующим добавлением смеси специфических факторов роста и сигнальных факторов длякультивирования. Результаты показали, что органоиды эндометрия ex vivo демонстрируют долгосрочную и стабильную пролиферативную способность, поддерживая железистую структуру, клеточную полярность и функциональные характеристики эпителия эндометрия, включая секрецию слизи и гормональный ответ6. Тем не менее, культура ex vivo взрослых стволовых клеток, образующих органоиды эндометрия, требует железистой структурной поддержки, что приводит к таким проблемам, как потеря стволовых клеток и трудности при прохождении7.

В настоящее время культивирование органоидов эндометрия основано на методе культивирования тканевого блок-пищеварения. В предыдущем исследовании наша исследовательская группа культивировала эпителиальные стволовые клетки эндометрия человека в течение длительного периода времени in vitro с использованием первичной питательной среды, состоящей в основном из Y27632, которую мы использовали для создания органоидов эндометрия8. Основываясь на этом успехе, мы выделили и культивировали эпителиальные стволовые клетки эндометрия из ткани эндометрия крысы с использованием низкомолекулярной питательной среды, создав долгосрочную систему культивирования in vitro . Кроме того, мы использовали эпителиальные стволовые клетки эндометрия крысы (reESCs) для получения органоидов эндометрия крысы. Разработка этой модели улучшит будущие исследования заболеваний эндометрия in vitro и in vivo в сочетании с моделями на крысах.

Протокол

В работе использовались шесть 7/8-недельных самок крыс породы Спрэг-Доули массой 200-250 г. Крысы содержались в помещении для животных с контролируемым климатом и ограниченным доступом к пище и воде. Все экспериментальные процедуры с участием животных проводились в соответствии с Институциональными рекомендациями по уходу за лабораторными животными и их использованию и были одобрены институциональным наблюдательным советом по экспериментам на животных при Комитете по этике исследований Народной больницы Мэйчжоу.

В следующем разделе описан процесс выделения, пропускания, замораживания и размораживания эпителиальных стволовых клеток эндометрия крысы с использованием очищенной среды расширения reESCs (REEM), состоящей в основном из Y27632, A8301 и CHIR990217 8,9. В основе рецептуры REEM лежит бессывороточный DMEM/F12, обогащенный специфическими концентрациями ключевых компонентов: 10 мкМ Y27632, 3 мкМ CHIR99021 и 0,5 мкМ A8301. Подробную информацию о компонентах можно найти в Таблице материалов. После того, как крысы были обезболены с помощью ингаляции изофлурана, следует выполнить последующие процедуры, показанные на рисунке 1.

1. Хирургическое вмешательство

  1. Обезболить крысу путем ингаляции изофлурана.
    1. Поместите крыс в индукционную камеру, наполненную 3-5% изофлураном, смешанным с кислородом. Подтвердите правильную анестезию отсутствием реакции на ущипывание пальца ноги и потерей выпрямляющего рефлекса.
    2. После обезболивания поддерживайте у крыс уровень 1-3% изофлурана с помощью носового конуса во время процедуры. Нанесите ветеринарную мазь на глаза, чтобы предотвратить сухость, пока крыса находится под анестезией.
  2. Сделайте низкий разрез по средней линии живота, чтобы обнажить рога матки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все хирургические инструменты должны быть стерилизованы перед использованием. Операционная область на крысе выбревается и дезинфицируется антисептическим раствором. Хирург носит стерильные перчатки, маску и халат. Хирургическое вмешательство проводится на стерильной простыне.
  3. Выполняйте продольные разрезы с обеих сторон матки, чтобы обнажить внутренний эндометрий. Используйте лезвие скальпеля T10, чтобы соскоблить эндометрий до тех пор, пока поверхность не станет шероховатой.
  4. После хирургической процедуры переведите крыс в стерильную и теплую зону восстановления с регулируемой температурой и уровнем влажности и внимательно наблюдайте за ними, пока они не придут в полное сознание и не смогут поддерживать себя в лежачем положении грудины. Размещайте группы из трех послеоперационных крыс отдельно в отдельных клетках. Чтобы облегчить послеоперационную боль, введите анальгетики, такие как бупренорфин (0,05-0,1 мг/кг, подкожно); Повторяйте каждые 8-12 часов в течение 48-72 часов по мере необходимости.

2. Обработка тканей

  1. Поместите все фрагменты эндометрия матки в посуду диаметром 3,5 см и промойте их 3 раза с помощью PBS.
  2. Смешайте фрагменты эндометрия матки с 3 мл 1% коллагеназы I типа (разведенной в 0,25% трипсин/1 мМ ЭДТА) при 37 °С в течение 60 мин. Отфильтруйте непереваренную ткань с помощью клеточного фильтра 100 мкм, чтобы изолировать и собрать фильтрат для дальнейшего культивирования.
  3. Собранные клетки высевать в 12-луночные планшеты в среду REEM для дальнейшего культивирования. Рассчитайте объем клеточной суспензии, необходимый для засеивания клеток в каждой лунке 12-луночного планшета для достижения желаемой плотности клеток (обычно ~1-2 × 105 клеток/лунку в 1,5 мл REEM).
  4. Промойте клетки, собранные на шаге 2.2, в 3 раза с PBS. После первичной промывки центрифугируйте ячейки при 300 × г в течение 5 минут. Выбросьте надосадочную жидкость; ресуспендировать клеточную гранулу в PBS, содержащую 1% BSA (бычьего сывороточного альбумина), чтобы свести к минимуму неспецифическое связывание, и инкубировать в течение 15-30 минут на льду.
  5. Инкубируйте клетки с первичными антителами, специфичными к различным маркерам (см. Таблицу материалов) в течение от 30 мин до 1 ч при 4 °C. Разведите антитела в PBS с 1% BSA в соответствии с инструкциями производителя.
  6. После инкубации промойте клетки 2 раза PBS, чтобы удалить все несвязанные антитела. После окончательной промывки ресуспендировать клетки в 600 мкл PBS с 1% BSA для анализа проточной цитометрии.
  7. Сконфигурируйте прибор с помощью лазеров и фильтров, подходящих для флуорофоров, используемых в эксперименте (например, FITC, PE, APC). Используйте настройки прямого рассеяния (FSC) и бокового рассеяния (SSC) для захвата активной популяции одиночных клеток, исключая мусор и агрегаты клеток. Откалибруйте проточный цитометр с помощью неокрашенного регулятора, чтобы обеспечить правильное выравнивание. Установите конкретные вентили на основе неокрашенного контроля, чтобы определить положительные популяции для каждого интересующего маркера (порог составляет 0,02%).

3. Долгосрочное культивирование эпителиальных стволовых клеток эндометрия крыс

  1. Анализ колониеобразования
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот анализ помог определить оптимальную питательную среду для reESCs.
    1. Семена P0 реЭСК помещают в 6-луночные планшеты с плотностью 1000 клеток/лунку и культивируют их в течение 14 дней либо в REEM, либо в REEM, где отсутствует A8301, Y27632 или CHIR99021.
    2. После периода культивирования клетки зафиксировать 4% параформальдегидом на 20 мин при комнатной температуре и впоследствии окрашивать их кристаллическим фиолетовым раствором еще на 20 мин.
    3. Количественно определите количество кластеров ячеек, содержащих более 50 клеток. Подбирайте питательную среду исходя из того, какая среда поддерживает рост клеточных кластеров.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Отсутствие специфических факторов в REEM привело к снижению пролиферативной способности reESCs (рис. 1B, C). На основании этих результатов REEM был выбран в качестве предпочтительной среды для культивирования reESCs с целью оптимизации условий культивирования.
  2. Меняйте REEM каждые 2 дня. Когда клетки достигнут 80-90% конфлюенции, расщепляют их 0,25% трипсина/1 мМ ЭДТА в течение 5-6 минут.
  3. Пассаж клеток в соотношении 1:3 в REEM.
  4. Пролиферационный анализ
    1. Засейте реЭСК P1, P7 и P14 в 96-луночные планшеты с плотностью 4 ×10 3 клеток/лунку в 150 мкл REEM.
    2. Добавьте по 10 мкл реагента CCK-8 в каждую лунку после 24, 48, 72 и 96 ч культивирования, после чего следует 2-часовая инкубация при 37 °C.
    3. Определите скорость пролиферации, измерив абсорбцию на длине волны 450 нм с помощью считывателя микропланшетов.
  5. Заготовка и использование замороженных бульонов
    1. Приготовьте раствор замороженного исходного материала с помощью REEM с 10% ДМСО.
    2. Соберите reESCs с 0,25% трипсина/1 мМ ЭДТА.
    3. Ресуспендировать клеточную гранулу в замороженном исходном растворе в концентрации 1 × 106 клеток/мл. Переложите клеточную суспензию в пробирки.
    4. Сначала заморозьте пробирки при температуре -80 °C, а затем перенесите их в жидкий азот в течение 24 часов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если вы планируете размораживать клетки в ближайшее время, рекомендуется хранить замороженные клетки при температуре -80 °C в течение максимум 6 месяцев.
    5. Разогрейте REEM до 37 °C.
    6. Достаньте замороженные реЭСК и погрузите их в водяную баню при температуре 37 °C на 1-2 минуты.
    7. Размороженные reESCs переложить в 6-луночные планшеты с плотностью затравки 1 × 105 клеток/лунку в REEM.
  6. Иммунофлуоресцентное окрашивание
    1. Затравите reESCs в логарифмической фазе роста на u-Slide 8-луночные планшеты с плотностью 2 × 103 клеток на лунку и культивируйте их в REEM.
    2. Когда реЭСК достигнут 90% конфлюенции, зафиксируйте их 4% параформальдегидом в течение 20 мин. Промойте reESCs PBS 2x до и после фиксации.
    3. Пермеабилизируйте клетки 0,2% Triton X-100 в течение 10 минут.
    4. Заблокируйте клетки 30% козьей сывороткой, разведенной в 5% бычьем сывороточном альбумине (БСА) в течение 30 минут при комнатной температуре. Промойте reESC PBS 2x до и после блокировки.
    5. Инкубируйте клетки с первичными антителами (анти-SSEA-1 и анти-Цитокератином) в течение 12 ч при 4 °C. Промойте reESC PBS 2x после инкубации.
    6. Инкубируйте клетки со вторичными антителами в течение 1 ч при комнатной температуре. Промойте reESC PBS 2x после инкубации.
    7. Нанесите на клетки 150 мкл DAPI, чтобы пометить все ядра.
    8. Сделайте снимки окрашенных клеток с помощью инвертированного конфокального микроскопа.

4. Получение органоидов эндометрия крысы из реЭСК

  1. Генерация органоидов
    1. Когда reESCs достигают 70% конфлюенции, расщепляют клетки с 0,25% трипсина/1 мМ ЭДТА в течение 5-6 минут.
    2. Ресуспендируйте 5 × 105 reESCs в 500 μл размороженного Matrigel и поместите в 12-луночные планшеты. Инкубируйте планшеты при температуре 37 °C в течение 20 минут, чтобы дать возможность загустеть.
    3. Как только смесь клетка и матригель застынет, добавьте 1,5 мл / лунку REEM, чтобы покрыть матригель. Меняйте REEM каждые 2-3 дня.
  2. Иммунофлуоресцентное окрашивание
    1. Отсадите REEM и добавьте 1 мл на лунку предварительно охлажденного раствора для сбора органоидов в 12-луночные планшеты. Выдерживать на льду в течение 40-60 минут.
    2. Соберите органоиды с помощью пастеровской пипетки и центрифугируйте при 300 × г в течение 3 мин при 4 °C.
    3. Промойте органоиды 2-3 раза с PBS.
    4. Зафиксируйте органоиды с помощью 4% параформальдегида на 20 минут и заблокируйте с помощью 5% BSA на 60 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мойте 2 раза с PBS до и после каждого шага.
    5. Инкубируйте органоиды в течение ночи при 4 °C с первичными антителами, разведенными в 1% BSA.
    6. Инкубируйте органоиды со вторичными антителами в течение 1 ч при комнатной температуре.
    7. Защитите органоиды 200 мкл DAPI.
    8. Делайте снимки с помощью инвертированного конфокального микроскопа.
  3. Окрашивание HE
    1. Обезвоживайте органоиды с помощью сортированного этанола: 70% этанола в течение 30 минут; 80% этанол в течение 30 мин; 95% этанол в течение 30 мин; 100% этанол в течение 2 х 30 мин. Очистите органоиды, погрузив их в ксилол на 2 х 30 минут.
    2. Погрузите очищенные органоиды в расплавленный парафин при температуре 60 °C на 1 час. Перенесите инфильтрованные парафином органоиды в формы для закладки, заполните формы расплавленным парафином и поместите формы в холодную пластину, чтобы парафин затвердел. После того как парафин застынет, выньте парафиновые блоки из форм и обрежьте излишки парафина.
    3. Установите парафиновые блоки на микротом. Вырежьте секции толщиной 5 μм и поместите их на теплую водяную баню (42-45 °C) для выравнивания. Аккуратно переложите срезы на стеклянные предметные стекла и просушите их на подогревателе для слайдов.
    4. Депарафинизируйте срезы, погрузив слайды в ксилол на 2 х 5 минут. Регидратируйте с помощью ряда сортированного этанола: 100% этанол в течение 2 x 3 минут; 95% этанол в течение 3 мин; 70% этанол в течение 3 мин; Промойте в дистиллированной воде.
    5. Окрашивать гематоксилином в течение 5 мин; Затем промойте в проточной воде из-под крана в течение 5 минут. Дифференцировать в 1% кислотном спирте в течение нескольких секунд; промыть в проточной воде из-под крана в течение 5 минут; поместить в синий цвет в 0,2% аммиачную воду на 30 с; промыть в проточной воде из-под крана в течение 5 минут; Окрашивать эозином в течение 2 мин. Обезвоживание с помощью сортированного этанола: 70% этанола в течение 1 минуты; 95% этанол в течение 1 мин; 100% этанол в течение 2 x 1 мин. Очистить в ксилоле в течение 2 х 1 мин.
    6. Добавьте каплю монтажного средства на испачканные участки. Затем наденьте покровную салфетку на участок ткани, избегая появления пузырьков воздуха. Рассмотрите окрашенные срезы под световым микроскопом.
  4. Флуоресцентное окрашивание
    1. Выполните депарафинизацию и регидратацию, как описано в шагах 4.3.1. к пункту 4.3.4.
    2. Разогрейте раствор для извлечения антигена в микроволновой печи. Поместите предметные стекла в нагретый раствор для извлечения антигена и выдержите их при температуре ниже кипения в течение 20 минут. Дайте предметным стеклам остыть в растворе для извлечения антигена в течение 40 минут. Промойте предметные стекла в деионизированной воде в течение 5 минут.
    3. Инкубируйте предметные стекла в 0,3% перекиси водорода в метаноле в течение 10 мин для подавления эндогенной активности пероксидазы. Промойте предметные стекла в течение 3 х 5 минут в PBS и инкубируйте их в блокирующем растворе в течение 1 часа при комнатной температуре в увлажненной камере. Сбивайте излишки блокирующего раствора, но не смывайте.
    4. Разведите первичное антитело в блокирующем растворе в соответствии с инструкцией производителя. Нанесите разведенное первичное антитело на срезы тканей и инкубируйте в течение ночи при 4 °C в увлажненной камере.
    5. Вымойте предметные стекла в течение 3 х 5 минут в PBS. Разведите HRP-конъюгированное вторичное антитело в блокирующем растворе в соответствии с инструкциями производителя. Разбавленное вторичное антитело нанести на участки тканей и инкубировать в течение 1 ч при комнатной температуре во увлажненной камере. Промойте предметные стекла в течение 3 х 5 минут в PBS, чтобы удалить несвязанные вторичные антитела.
    6. Приготовьте рабочий раствор Флуоресцеина Тирамида в соответствии с инструкцией набора. Нанесите рабочий раствор на срезы тканей и инкубируйте в течение 15 мин при комнатной температуре во увлажненной камере. Промойте предметные стекла в течение 3 х 5 минут в PBS.
    7. Повторите шаг 4.4.1. до 4.4.5 до тех пор, пока не будет завершено окрашивание всеми тремя антителами. Нанесите каплю флуоресцентного монтажного средства с DAPI на каждый участок ткани. Осторожно наденьте покровную салфетку на участок ткани, чтобы избежать образования пузырьков воздуха. Осмотрите предметные стекла инвертированным конфокальным микроскопом.
  5. Количественная ПЦР
    1. Соберите органоиды, как описано в шагах 4.2.1. к 4.2.3. Аспирируйте PBS и извлекайте общее количество РНК из органоидов в соответствии с инструкциями производителя.
    2. Используйте любой коммерчески доступный набор для обратной транскрипции для синтеза кДНК из 1 мкг общей РНК. Настройте реакцию q-PCR в соответствии с протоколом производителя набора. В таблице материалов приведены последовательности праймеров, используемые для q-ПЦР.

5. Долгосрочное культивирование органоидов эндометрия крыс

  1. Аспирируйте REEM и добавьте 1 мл раствора для сбора органоидов в течение 40 минут, чтобы диссоциировать органоиды. Инкубируйте на льду для поддержания целостности органоидов.
  2. После инкубации соберите органоиды с помощью пастеровской пипетки и центрифугируйте при 300 × г в течение 3 мин при 4 °C, чтобы гранулировать их для дальнейшей обработки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обрезка наконечника пипетки может быть полезна при работе с более крупными органоидами (более 500 мкм) без повреждения.
  3. Ресуспендировать гранулированные органоиды в Матригеле в соотношении 1:2 или 1:3 для встраивания и последующего культивирования в 12-луночные планшеты.
  4. Приготовьте раствор для замороженного исходного материала: REEM с 10% ДМСО.
  5. Соберите органоиды, повторно суспендируйте их в замороженном исходном растворе, а затем храните в морозильной камере при температуре -80 °C или в жидком азоте для длительного хранения.
  6. Чтобы разморозить замороженные органоиды, разогрейте REEM на водяной бане при температуре 37 °C и погрузите замороженную пробирку в водяную баню, чтобы аккуратно разморозить органоиды.
  7. После размораживания ресуспендируйте органоиды в 500 мкл Матригеля для повторного встраивания и культивирования в 12-луночный планшет. Выполните шаги 4.1.2. к пункту 4.1.3.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется хранить замороженные органоиды при температуре -80 °C в течение более короткого периода времени или переносить на жидкий азот для более длительного хранения.

6. Опционально: Перенос органоидов в адгезивную культуру

ПРИМЕЧАНИЕ: В протоколе упоминается альтернативный метод получения плоских культур reESC путем перехода органоидов в адгезивную культуру, что позволяет реструктурировать морфологию органоидов.

  1. Отсадите REEM и добавьте 1 мл раствора для сбора органоидов для диссоциации органоидов. Инкубируйте на льду для поддержания целостности органоидов.
  2. После инкубации соберите органоиды с помощью пипетки Пастера и центрифуги и гранулируйте их в дозе 300 × г в течение 3 минут при температуре 4 °C.
  3. Ресуспендируйте органоиды в 3 мл предварительно подогретого REEM и переложите ресуспендированные органоиды в чашку диаметром 3,5 см. Меняйте носитель REEM каждые 2 дня.
  4. Когда клетки достигнут 70% конфлюенции, расщепляют их с 0,25% трипсина/1 мМ ЭДТА в течение 5-6 минут.
  5. Восстановите органоиды с помощью reESCs, выполнив шаги с 4.1.1 по 4.1.3.

7. Последовательное культивирование органоидов эстрадиолом (Е2) и прогестероном (Р4)

  1. Приготовьте исходные растворы Е2 и Р4 в ДМСО. Разбавлять исходные растворы до требуемых рабочих концентраций (Е2: 10 нМ; P4: 1 мкМ) в РЗЭМ, следя за тем, чтобы конечная концентрация ДМСО не превышала 0,1% во избежание цитотоксических эффектов.
  2. Культивируйте органоиды в REEM как шаги 4.1.1. к пункту 4.1.3. на 4 дня. Замените среду на REEM с добавлением Е2 и культуру на 7 дней. Ежедневно контролируйте рост и морфологию органоидов. Меняйте средство каждые 2-3 дня.
  3. Замените среду на REEM с добавлением Е2 и Р4. Ежедневно контролируйте рост и морфологию органоидов. Меняйте средство каждые 2-3 дня. Продолжайте культивировать органоиды в течение 7 дней.

Результаты

РеЭСК и органоиды матки крыс были получены от шести самок крыс Спрэг-Доули с массой от 200 г до 250 г в соответствии с протоколом, описанным на рисунке 1. Основываясь на успехе долгосрочного культивирования эпителиальных стволовых клеток эндометрия человека, препарат REEM преимущественно состоял из Y27632, A8301 и CHIR99021. Для стабилизации reESCs in vitro мы первоначально выделили клетки эндометрия из эндометрия крысы с помощью ферментативных и механических методов. Анализ проточной цитометрии на рисунке 2А показал, что первичные клетки эндометрия на 50% состоят из эпителиальных клеток, экспрессирующих CD9 (49,8%), с низкими уровнями EpCAM (4,49%) и CD24 (2,64%). Маркер SSEA-1 для reESCs присутствовал на уровне 6,58%, в то время как эндотелиальные маркеры CD31 (30,9%) и CD45 (70,3%) были относительно высокими.

Тем не менее, культивирование в REEM привело к тому, что реЭСК P1 демонстрируют однородную мутовчатую или многогранную морфологию и образуют компактные клональные структуры (рис. 2D). Постепенное удаление отдельных факторов из РЭЭМ приводило к соответствующему снижению пролиферативной способности реЭСК. Анализ образования клонов показал критическую роль Y27632 в стабильной культуре reESCs (рис. 2B, C). К третьему пассажу reESCs продемонстрировали стабильную экспрессию SSEA-1 и Cytokeratin, что указывает на успешное расширение первичных reESCs во время культивирования (рис. 2F). Более того, reESCs сохраняли надежную и стабильную пролиферативную способность даже при поздних пассажах (рис. 2E), демонстрируя их успешную изоляцию и расширение в существующей системе REEM.

Органоидные культуры были созданы в соответствии с ранее описанной системой, полученной из стволовых клеток эндометрия человека8. В течение 3 дней reESCs продемонстрировали быструю самоорганизацию в органоидные структуры с полым центром, которые впоследствии увеличились в размерах и толщине (см. рисунок 3A). Типичные результаты окрашивания HE, иллюстрирующие образование органоидов реЭСК, представлены на рисунке 3В. Эти органоидные культуры могут поддерживаться путем пассирования, о чем свидетельствует высокая жизнеспособность клеток, на которую указывает окрашивание Ki67 после циклов прямого пассирования и замораживания-оттаивания. Кроме того, окрашивание HE было выполнено на органоидах 10-го поколения, и результаты показали, что органоидная структура может быть сохранена в неизменном виде (см. Рисунок 3E). Кроме того, результаты количественной ПЦР показали, что Nanog, Sox2 и Oct4 экспрессируются на уровнях, сопоставимых с уровнями поколения P1 (рис. 3F). Это открытие предполагает потенциал для долгосрочного культивирования органоидов в рамках существующей системы.

В нашем исследовании было проведено предварительное исследование реакции маточных структур крыс наЕ2 и Р4. Иммунофлуоресцентное окрашивание на рисунке 4А выявило наличие рецепторов эстрогена и прогестерона. После приема добавокЕ2 эти органоиды претерпели переход от полой сферической формы к более плотно заселенному внутреннему типу роста (рисунок 4C). Последующее воздействие P4 привело к снижению проницаемости плотных структур, что в конечном итоге привело к их разрушению (рис. 4B). Эти результаты свидетельствуют о том, чтоЕ2 потенциально стимулирует дальнейшую дифференцировку маточных структур крыс, в то время какР4 может запускать пути апоптоза.

figure-results-1
Рисунок 1: Процедуры, используемые для создания эпителиальных стволовых клеток эндометрия крысы и органоидов матки крысы. Сокращение: SD = Sprague-Dawley. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2: Генерация и долгосрочное культивирование эпителиальных стволовых клеток эндометрия крысы in vitro. (A) Проточный цитометрический анализ, показывающий долю положительных клеток в эндометрии крысы. (B) Окрашивание клонов в кристаллический фиолетовый цвет в REEM с A8301, Y27632 или CHIR99021 или без них соответственно. Масштабные линейки = 1 см. (C) Клонированные числа в REEM с делителями или без них. Полосы погрешностей представляют собой стандартное отклонение; n = 3 донора (***, p<0,001). (D) Световая микроскопия эпителиальных стволовых клеток эндометрия крысы P1 с окрашиванием кристаллическим фиолетовым цветом и без него. (E) Анализ CCK-8 эпителиальных стволовых клеток эндометрия крыс в пассаже 1, пассаже 7 и пассаже 14. Полосы погрешностей представляют собой стандартное отклонение, n = 3. (F) Иммунофлуоресцентные анализы, демонстрирующие экспрессию цитокератина и SSEA-1. Сокращение: REEM = среда расширения reESCs. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-3
Рисунок 3: Генерация и долгосрочное культивирование органоидов эндометрия крысы in vitro. (A) Световые микроскопические изображения органоидов эндометрия крысы P1. (B) Окрашивание H&E на органоиды P1 из эпителиальных стволовых клеток эндометрия крыс. (C) Иммунофлуоресцентные анализы, демонстрирующие экспрессию цитокератина и SSEA-1. (D) Иммунофлуоресцентные анализы, демонстрирующие экспрессию Ki67 и SSEA-1. (E) Окрашивание H&E для органоидов крыс P 10. (F) анализ количественной ПЦР на экспрессию Nanog, Sox2 и Oct-4 в органоидах эндометрия крыс P1 и P10. Экспрессия нормализована по GAPDH (n = 3, двусторонний непарный t-критерий, n.s. = незначимый). Сокращение: H&E = гематоксилин и эозин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-4
Рисунок 4: Последовательное культивирование органоидов с E2 и P4. (A) Иммунофлуоресцентные анализы, демонстрирующие экспрессию рецептора эстрогена, рецептора прогестагена и SSEA-1. (B) Обзор изображений органоидов крыс, культивированных в E2 и P4, полученных с помощью световой микроскопии. (C) Изображения световой микроскопии демонстрируют превращение полой сферы в плотную во внутренней полости органоидов после культивирования в течение 7 дней вЕ2. Сокращения: ER = рецептор эстрогена; PR = рецептор гестагена. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Обсуждение

В этом исследовании мы описали простой метод выделения и культивирования эпителиальных стволовых клеток эндометрия крысы (reESCs) и усовершенствовали ранее созданную систему ex vivo для эпителиальных стволовых клеток эндометрия человека8. В нашем подходе используется низкомолекулярная культуральная среда, содержащая Y27632, A8301 и CHIR99021 в качестве основных компонентов, для обеспечения стабильной и долгосрочной культуры ex vivo . Кроме того, мы успешно сгенерировали органоиды эндометрия крысы в режиме реального времени с использованием reESCs. Эта новая система упрощает существующие методы культивирования органоидов эндометрия, которые обычно основаны на тканевых блоках, тем самым обеспечивая большую ясность в отношении клеточной линии10. Важно отметить, что наша система облегчает редактирование генов и другие манипуляции на клеточном уровне для создания органоидов, экспрессирующих определенные гены. Кроме того, эта органоидная система обеспечивает целенаправленный нокаут или сверхэкспрессию определенных генов в эндометрии крысы, что позволяет проводить скрининг и культивирование эпителиальных стволовых клеток эндометрия для производства органоидов эндометрия. Этот комплексный исследовательский подход выясняет конкретные функции генов как с точки зрения in vivo , так и ex vivo , прокладывая путь к изучению заболеваний, связанных с эпителием эндометрия.

Скрининг на наркотики является критически важным применением органоидов. Тем не менее, современные источники и методы получения органоидов являются сложными, что приводит к значительной вариабельности между партиями, что может повлиять на результаты исследований по скринингу лекарственных средств11,12. Наша система демонстрирует, что органоиды, полученные из стабильных культивируемых клеточных линий ex vivo, могут эффективно минимизировать различия между сформированными органоидами, повышая однородность в экспериментальных установках. Кроме того, органоиды крыс, образованные reESCs, продемонстрировали способность реагировать на стимуляцию эстрогеном in vitro, что приводит к морфологическим изменениям, что позволяет предположить, что они могут быть использованы в качестве инструмента для скрининга лекарств ex vivo. reESCs могут быть легко выделены из ткани эндометрия и расширены ex vivo с меньшим количеством мелких молекул по сравнению со стволовыми клетками эпителия эндометрия человека. Эта характеристика особенно ценна для исследования свойств стволовых клеток, клеток-предшественников, процессов дифференцировки и взаимодействия микроокружения. Важно отметить, что этот подход может быть экстраполирован на другие виды млекопитающих, такие как обезьяны, свиньи и собаки, что позволяет создать системы органоидных культур эндометрия, которые служат более физиологически значимыми моделями для изучения биологии эндометрия, функции, заболеваний и реакции на лекарства. Несмотря на свои преимущества, данная методика имеет и ограничения. Одним из основных ограничений является зависимость от Матригеля, сложного и изменчивого внеклеточного матрикса, который может вносить несоответствия между экспериментами. Кроме того, в то время как модели крыс дают ценную информацию, межвидовые различия все еще существуют, и результаты могут не полностью отражаться на физиологии и патологиях эндометрия человека. Будущие исследования должны быть направлены на устранение этих ограничений, возможно, путем разработки более определенных и согласованных внеклеточных матриц и изучения применимости этой модели к другим видам.

Несмотря на свои преимущества, данная методика имеет и ограничения. Одним из основных ограничений является зависимость от Матригеля, сложного и изменчивого внеклеточного матрикса, который может вносить несоответствия между экспериментами. Поэтому ключевым методом в данном исследовании является удаление Матригеля. Использование мягкого матричного гелевого дижестанта, обеспечивающего операции на льду, и достаточное время переваривания имеют решающее значение для успеха. Благодаря большему диаметру пипетки Пастера, использование аспирации пипетки Пастера может уменьшить повреждение органоидов и ускорить переваривание матричного геля. Последующие исследования могут сравнивать различные методы культивирования геля с внеклеточным матриксом для дальнейшей оптимизации культивирования и систем пищеварения органоидов. Будущие исследования должны быть направлены на устранение этих ограничений, возможно, путем разработки более определенных и согласованных внеклеточных матриц и изучения применимости этой модели к другим видам.

В то время как в существующей литературе описаны методы культивирования эпителиальных органоидов ex vivo , это исследование представляет собой новую, простую и легко воспроизводимую систему культивирования и расширения органоидов эндометрия крыс, полученных из прозрачных клеток. Этот прогресс призван ускорить темпы исследований в области женской репродуктивной биологии.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, о котором можно было бы заявить.

Благодарности

Эта работа была поддержана Фондом фундаментальных и прикладных фундаментальных исследований GuangDong (2023A1515110760).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Анти-CD15 (SSEA-1)Abcamab135377Кролик, 1:200 (ИГХ)
Антиэстрогенный рецептор альфаAbcamab32063Кролик, 1:200 (ИГХ)
Анти-пан цитокератинAbcamab7753Мышь, 1:250 (ИГХ)
Антипрогестероновый рецепторAbcamab101688Кролик, 1:200 (ИГХ)
Анти-Ki67Abcamab279653Мышь, 1:250 (IHC)
A8301TargetMol909910-43-6
β-эстрадиолMerckE8875
Набор для подсчета клеток-8BeyotimeC0038
CD9BioLegend1098191:20 (FC), Pacific Blue
CD24BioLegend1018061:20 (FC), FITC
CD31BioLegend3031201:20 (FC), APC
CD45BioLegend3017031:20 (FC), PE
CHIR99021TargetMolCT99021
Cultrex Organoiding Harvesting SolutionR& D Systems3700-100-01
Cy3 TSA Комплект флуоресцентных системAPExBIOK1051
Cy5 TSA Комплект флуоресцентных системAPExBIOK1052
DAPISigmaD95421 μ г/мл
DMEM/F-12Invitrogen11330032
EpCAMBioLegend3698031:20 (FC), PerCP
Fluorescein TSA Fluorescence System KitAPExBIOK1050
Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 488InvitrogenA-110081:500
Goat Anti-Mouse IgG, Alexa Fluor 555InvitrogenA-214221:500
Козье антитело к кроликам IgG/HRPAPExBIObs-0295G-HRP
Замена нокаутирующей сывороткиInvitrogen10828028
MatrigelCorning356234
PrimeScript RT Master MixTakaraRR063A
ProgesteroneMerck57-83-0
Sprague-Dawley rat Shanghai JieSiJie Laboratory Animals Co., LTD, Китай
SSEA-1BioLegend3230471:20 (FC), APC
TB Green Fast qPCR MixTakaraRR820A
TriZOLInvitrogen15596026CNЭкстракция РНК
u-Slide 8-луночные планшетыIbidi80827
Y27632TargetMol146986-50-7
<сильные>qПЦР-праймеры генов-мишеней 
Genes>CompanySequences
rat GAPDH FSangon biotechGACATGCCGCCTGGAGAAAC
крыса GAPDH RSangon biotechAGCCCAGGATGCCCTTTAGT
крыса Nanog FSangon biotechGACTAGCAACGGCTGACTCA
крыса Nanog R Сангон биотекCTGCAATGGATGCTGGGATA
крыса Sox2Ф Сангон биотекATTACCCGCAAAAATGAC
крыса Sox2R Сангон биотекATCGCCCGGAGTTCTCT
крыса Окт4 ФСангон биотекCCCAGCGCCGTGAAGTTGGA
крыса Окт4 РСангон биотекACCTTTCCAAAGAGAACGCCCA
GG

Ссылки

  1. Jabbour, H. N., Kelly, R. W., Fraser, H. M., Critchley, H. O. Endocrine regulation of menstruation. Endocr Rev. 27 (1), 17-46 (2006).
  2. Garcia-Alonso, L., et al. Mapping the temporal and spatial dynamics of the human endometrium in vivo and in vitro. Nat Genet. 53 (12), 1698-1711 (2021).
  3. Li, M., Izpisua Belmonte, J. C. Organoids - preclinical models of human disease. N Engl J Med. 380 (6), 569-579 (2019).
  4. Mulaudzi, P. E., Abrahamse, H., Crous, A. Insights on three dimensional organoid studies for stem cell therapy in regenerative medicine. Stem Cell Rev Rep. 20 (2), 509-523 (2024).
  5. Boretto, M., et al. Development of organoids from mouse and human endometrium showing endometrial epithelium physiology and long-term expandability. Development. 144 (10), 1775-1786 (2017).
  6. Turco, M. Y., et al. Long-term, hormone-responsive organoid cultures of human endometrium in a chemically defined medium. Nat Cell Biol. 19 (5), 568-577 (2017).
  7. Tempest, N., Maclean, A., Hapangama, D. K. Endometrial stem cell markers: current concepts and unresolved questions. Int J Mol Sci. 19 (10), 3240(2018).
  8. He, W., et al. Long-term maintenance of human endometrial epithelial stem cells and their therapeutic effects on intrauterine adhesion. Cell Biosci. 12 (1), 175(2022).
  9. Katsuda, T., et al. Conversion of terminally committed hepatocytes to culturable bipotent progenitor cells with regenerative capacity. Cell Stem Cell. 20 (1), 41-55 (2017).
  10. Murphy, A. R., Campo, H., Kim, J. J. Strategies for modelling endometrial diseases. Nat Rev Endocrinol. 18 (12), 727-743 (2022).
  11. Boretto, M., et al. Patient-derived organoids from endometrial disease capture clinical heterogeneity and are amenable to drug screening. Nat Cell Biol. 21 (8), 1041-1051 (2019).
  12. Esfandiari, F., et al. Endometriosis organoids: prospects and challenges. Reprod Biomed Online. 45 (1), 5-9 (2022).

Перепечатки и разрешения

Теги

Matrigel
Получение и характеристика органоидов матки крысы из эпителиальных стволовых клеток эндометрия крысы
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.