Методическая статья

Методика интраназального введения агрегатов α-синуклеина

1.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/66943

⸱

8 ноября 2024 г.

 , 
1Department of Neurology, Graduate School of Medicine, Kyoto University

В этой статье

Краткое содержание

В настоящем протоколе описан способ интраназального введения агрегатов α-синуклеина. Этот метод дает представление о распространении α-синуклеина от обонятельной слизистой оболочки к обонятельной луковице при болезни Паркинсона.

Аннотация

Болезнь Паркинсона (БП) — нейродегенеративное заболевание, характеризующееся наличием телец Леви, которые представляют собой агрегаты α-синуклеина (α-Syn). Недавно было высказано предположение, что болезнь развивается и прогрессирует за счет прионоподобного размножения агрегатов α-Syn из обонятельной луковицы (OB) или дорсального ядра блуждающего нерва. Хотя происхождение агрегатов α-Syn в OB остается неясным, недавно было высказано предположение об их распространении из обонятельной слизистой оболочки. Ранее мы показали, что интраназальное введение агрегатов α-Syn на мышиной модели индуцировало патологию α-Syn в OB мышей. В данном исследовании мы представляем способ интраназального введения агрегатов α-Syn, индуцировавших патологию α-Syn в ОВС мышей. Интраназальное введение агрегатов α-Syn является очень простым и понятным методом, и мы считаем, что он будет полезным инструментом в исследованиях для выяснения происхождения патологии α-Syn в OB и пути распространения α-Syn через обонятельную систему.

Введение

Болезнь Паркинсона (БП), которая характеризуется двигательными симптомами, такими как брадикинезия, тремор в покое и ригидность мышц, является вторым по распространенности нейродегенеративным расстройством1. БП также проявляется немоторными симптомами, включая обонятельную дисфункцию, когнитивные нарушения, депрессию, галлюцинации, запоры и ортостатическую гипотензию. Его патологическими признаками являются гибель дофаминергических клеток в черной субстанции и наличие агрегатов α-синуклеина (α-Syn), называемых тельцами Леви2.

Следует отметить, что α-Syn представляет собой белок из 140 аминокислот, который существует в форме растворимого мономера (или тетрамера) в нормальных условиях. Однако в аномальных условиях растворимый мономер превращается в нерастворимые высокомолекулярные агрегаты, включая олигомеры и фибриллы. Сообщается, что переход α-Syn в олигомеры и фибриллы связан с клеточнойтоксичностью3.

Недавние исследования показали прионоподобное распространение агрегатов α-Syn между нейронами. Основываясь на многочисленных посмертных исследованиях, Braak et al. в 2003 году выдвинули гипотезу о том, что патология тельца Леви постепенно распространяется в мозге несколько стереотипным образом (гипотеза Браака)4,5. В 2008 году патологоанатомическое исследование пациентов с БП, перенесших трансплантацию среднего мозга плода, выявило тельца Леви в дофаминергических нейронах, полученных из тканей плода 6,7. Эти исследования показали, что агрегаты α-Syn могут распространяться от больного мозга к трансплантатам, что подтверждает гипотезу Браака.

После этих наблюдений эксперименты с использованием первичных нейронных культур и внутримозговой инъекции агрегатов α-Syn у мышей воспроизвели распространение агрегатов, подобных тельцу Леви, что является еще одним доказательством распространения α-Syn прионоподобным образом 8,9.

Braak et al. показали, что патология тельца Леви при БП начинается в обонятельной луковице (OB) и/или дорсальном ядре блуждающего нерва (dmX)4. Основываясь на гипотезе Браака, в нескольких исследованиях сообщалось о введении агрегатов α-Syn или экстрактов телец Леви из мозга пациентов с болезнью Паркинсона в OB и желудочно-кишечный тракт экспериментальных животных 10,11,12. В 2018 году исследование показало, что введение агрегатов α-Syn в OB мышей дикого типа индуцировало распространение патологии α-Syn по обонятельному пути, что приводило к обонятельной дисфункции13. Ранее мы инокулировали агрегаты α-Syn в OB трансгенных мышей α-Syn и обнаружили, что это приводит к атрофии гиппокампа и ухудшениюпамяти.

В 2022 году мы инокулировали агрегаты α-Syn в OB мартышек, небольшого нечеловекообразного примата; это приводило к распространению патологии α-Syn по обонятельному пути, атрофии OB и распространенному гипометаболизму глюкозы в головноммозге10.

Однако, если распространение агрегатов α-Syn происходит из OB, то возникает критический вопрос: по какому механизму первоначально появляются агрегаты α-Syn? Saito et al. ранее сообщали о наличии телец Леви в слизистой оболочке носа15. Наличие агрегатов α-Syn было обнаружено в слизистой оболочке носа пациентов с БП и множественной системной атрофией (МСА) с помощью анализа конверсии, индуцированной дрожанием в реальном времени (RT-QUIC)16. Примечательно, что анализ образцов слизистой оболочки носа у пациентов с расстройством поведения во сне с быстрым движением глаз (RBD), которое считается продромальной стадией БП, выявил повышение уровня α-Syn17. Это исследование показало, что патология α-Syn может существовать в слизистой оболочке носа даже в продромальной фазе БП.

Хотя эти результаты предполагают потенциальный путь от слизистой оболочки носа к акушерскому отделению, существуют ограниченные экспериментальные данные, подтверждающие этот сценарий. Чтобы восполнить этот пробел, мы вводили агрегаты α-Syn в носовую полость мышей и исследовали распространение патологии α-Syn от слизистой оболочки носа к акушерскому отделению. Наш экспериментальный подход показал, что однократное интраназальное введение агрегатов α-Syn мышам дикого типа индуцировало патологию α-Syn в OB, что дало экспериментальные доказательства пути распространения от слизистой оболочки носа к OB.

Протокол

Для исследования были использованы мыши-самцы C57BL/6J в возрасте 2 месяцев. Все экспериментальные процедуры проводились в соответствии с национальными рекомендациями. Комитет по исследованиям на животных Киотского университета предоставил этическое одобрение и разрешение на проведение этого исследования (MedKyo 23,544).

1. Интраназальное введение преформированных фибрилл α-Syn

  1. Приготовьте раствор мышиного α-Syn фибрилла в PBS (4 мг/мл) в соответствии с ранее описанными методами11. Оберните трубку прозрачной пленкой, чтобы предотвратить загрязнение.
  2. Ультразвуком 200 мкл раствора α-Syn фибрилл для получения предварительно сформированных фибрилл (PFF) α-Syn с помощью ультразвуковой обработки на водяной бане (Таблица материалов). Наполните ультразвуковую ванну водой и добавьте кубики льда для охлаждения до 4 °C для ультразвуковой обработки. Обрабатывайте фибриллы ультразвуком в течение 5 минут, каждый цикл состоит из 30 секунд ультразвуковой обработки с последующим интервалом 30 секунд (всего пять циклов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте средства индивидуальной защиты, такие как одноразовые перчатки, маска и защитные очки, чтобы предотвратить воздействие α-Syn.
  3. Подготовьте пипетку P10 (Таблица материалов) с наконечником для пипетки объемом 10 мкл. Обезболите каждую мышь комбинацией медетомидина гидрохлорида, мидазолама и буторфанола (MMB) путем внутрибрюшинного (внутримышечно) введения. Комбинированный анестетик MMB содержал мидазолам (0,3 мг/кг), медетомидин (4 мг/кг) и тартрат буторфанола (5 мг/кг). Используйте 0,005 мл/г внутримышечно при смешивании мидазолама (1 мг/мл) 0,3 мл, медетомидина (5 мг/мл) 0,8 мл, буторфанола тартрата (5 мг/мл) 1 мл и физиологического раствора 2,9 мл.
  4. Подождите 10 минут, чтобы убедиться, что мыши полностью обезболились. Правильная анестезия может быть подтверждена, если мышь находится в боковом положении и не может встать на ноги. После обезболивания нанесите офтальмологическую мазь с помощью стерильного ватного аппликатора, чтобы предотвратить высыхание глаз.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Без анестезии, при введении назальных доз, трудно удерживать мышей в положении лежа на спине и правильно вводить раствор α-Syn, когда мыши чихают. По этим причинам была необходима седация.
  5. Поместите мышь под наркозом в положение лежа на спине. Подложите под тело бумажное полотенце или аналогичный материал, обеспечив небольшой наклон головы вниз (рисунок 1А, В). Такое положение препятствует быстрому поступлению введенного раствора α-Syn в легкие или пищевод, способствуя его задержке в носовой полости. Ноздри показаны на рисунке 1C.
  6. Наберите 1 мкл раствора α-Syn (4 мг/мл) в пипетку P10 и поместите наконечник пипетки рядом с носом мыши. Медленно сформируйте круглую каплю и держите ее на конце наконечника пипетки (рисунок 1D, красная стрелка). Интраназальное введение проводится для односторонней ноздри, используйте контралатеральную сторону в качестве контрольной.
  7. Поднесите каплю ближе к одной стороне ноздрей мыши и позвольте мыши вдохнуть ее естественным образом. Наблюдайте за вдохом и подождите от 30 с до 1 минуты (рисунок 1E).
  8. Повторите шаги 1.6.-1.7. до введения общего объема 20 мкл раствора α-Syn. После всех процедур выбросьте перчатки и протрите скамейку покупными моющими средствами, если поверхность загрязнена α-Syn
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вся процедура должна проводиться в защитном шкафу, чтобы предотвратить вдыхание α-Syn фибрилл персоналом, выполняющим процедуру. Предыдущее исследование показало, что объем 25 мкл является наиболее эффективным для введения лекарств через нос в мозг18. В настоящем исследовании мы использовали аналогичный объем 20 μл. Мы также используем ту же концентрацию PFF, что и для инъекции в OB в предыдущем отчете10, что близко к 400 мкМ (5,6 мг/мл) PFF19.
  9. Применяют атипамезол (3 мг/кг; Таблица материалов) Путем внутримышечного введения для обратного обращения медетомидина и облегчения выздоровления. Используйте 0,005 мл/г внутримышечно при смешивании атипамезола (5 мг/мл) 0,6 мл и физиологического раствора 4,4 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Проводите обезболивание, потому что не до конца понятно, насколько стрессовым будет интраназальное введение α-Syn.
  10. Не оставляйте мышь без присмотра до тех пор, пока она не придет в сознание, достаточное для поддержания лежачего положения на грудине. После полного восстановления верните мышь в клетку.

2. Подготовка образцов

  1. Умерщвляйте обработанных мышей через 1, 3, 6 и 12 месяцев после интраназального введения преформированных фибрилл α-Syn.
    1. Поместите мышей в индукционный бокс, введите севофлуран (>6,5%) и продолжайте до тех пор, пока не произойдет остановка дыхания в течение > 60 с. Удалите мышей и проведите быстрое обескровливание путем разреза правого предсердия, чтобы обеспечить эвтаназию.
  2. Введите иглу 25G (Таблица материалов) в верхушку сердца. Перфузируйте мышь со скоростью 4 мл/мин 15 мл PBS, а затем 15 мл 4% PFA в PBS.
  3. Ножницами отрежьте голову и скальпелем сделайте надрез на волосистой части головы в 2 см. Надрежьте черепную кость ножницами с боковой стороны снизу к носу (рисунок 2А, Б). Чтобы получить OB, полностью удалите черепную кость на OB (Рисунок 2B, желтый круг).
  4. Переверните голову, разрежьте нервы мозга, а затем осторожно удалите мозг щипцами (рисунок 2В, Г). Получите мозг с интактными OB (рис. 2E). Чтобы получить неповрежденные OB, осторожно перережьте обонятельные нервы щипцами, поскольку OB прикрепляются к кости черепа (Рисунок 2D, желтый круг).
  5. Поместите образцы мозга в 4% PFA в PBS на ночь при температуре 4 °C. Не оставляйте образцы мозга более чем на 24 часа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чрезмерная фиксация уменьшит иммуногистохимическое окрашивание. Если требуется длительное хранение, храните образцы мозга в 70% этаноле или PBS, содержащем 0,1% азида натрия для поддержания стерильности.

3. Иммуногистохимическое окрашивание OB

  1. Парафинизируйте образцы с помощью автоматического тканевого процессора (Таблица материалов), как описано ниже.
    1. Погрузите в 70% этанол на 120 минут, а затем погрузите в 100% этанол в 8 раз на 60 минут. Затем погрузите в 100% ксилол на 3 раза на 120 минут.
    2. Погрузить в парафин при температуре 60 °C на 120 мин с последующим погружением в парафин при 60 °C на 240 мин.
  2. Залейте образцы в парафин, как описано ниже.
    1. Погрузите образцы в парафин при температуре 60 °C с помощью модульного центра заделки тканей (Таблица материалов). Остудите их на льду.
  3. Разрежьте образцы на участки толщиной 8 мкм с помощью микротома (Таблица материалов)18.
  4. Выполните депарафинизацию, как описано ниже.
    1. Погрузите в 100% ксилол на 2x на 5 минут, а затем погрузите в 100% этанол на 2x на 3 минуты.
    2. Погрузить в 70% этанол на 3 мин. Постирать в PBS в течение 3 мин.
  5. Проведите забор антигена, как описано ниже.
    1. Погрузить в 100% муравьиную кислоту на 15 минут. Промойте в фосфатно-солевом буфере (PBS) в течение 2 минут.
    2. Автоклав при 120 °C в течение 10 мин. Дайте ему остыть естественным образом.
  6. Погрузить в 1% перекись водорода в метанол на 10 мин. Стирать в PBS в течение 5 минут.
  7. Добавьте 500 μл 5% обезжиренного молока в PBS на предметных стеклах и инкубируйте их в течение 30 минут при комнатной температуре.
  8. Поместите 500 мкл антифосфорилированного антитела α-Syn (p-α-Syn, 1/10000) в PBS на предметные стекла и инкубируйте их в течение ночи при 4 °C. Промыть 2 раза с PBS по 5 минут каждый.
  9. Инкубировать с универсальным полимером иммунопероксидазы, анти-Rabbit (Таблица материалов) в течение 1 ч при 25 °C. Промыть 2 раза с PBS по 5 минут каждый.
  10. Проявите с помощью набора для окрашивания 3,3'-диаминобензидином (DAB) (Таблица материалов) в течение 5 мин в соответствии с инструкциями производителя.
  11. Погрузить в раствор гематоксилина на 1 мин (Таблица материалов). Обесцвечивать в проточной воде в течение 10 минут.
  12. Выполните монтаж, как описано ниже.
    1. Погрузить в 70% этанол на 5 минут. Погрузите в 100% этанол на 2 раза на 5 минут.
    2. Погрузить в 100% ксилол на 2x на 5 минут. Монтаж осуществляется с помощью закладного носителя (Table of Materials). Нанесите на предметные стекла 100 μл закладной среды и накройте стеклянным покровным стеклом.
  13. Получение изображений с помощью микроскопа «Все в одном» с 20-кратным и 40-кратным увеличением (Таблица материалов).

Результаты

На рисунке 3 показано несколько примеров агрегатов α-Syn в OB. В настоящем исследовании мы вводили агрегаты α-Syn в одностороннюю ноздрю. Две носовые полости разделены носовой перегородкой, и каждый акушер проецирует обонятельные сенсорные нейроны в каждую носовую полость отдельно. Поэтому ОБ на контралатеральной стороне можно использовать в качестве контрольного.

Патология P-α-Syn не наблюдалась у акушера на стороне лечения через 1 и 3 месяца (рис. 3А, В). Неврит-подобные агрегаты p-α-Syn Леви наблюдались в клубочках на стороне лечения через 6 и 12 месяцев. (Рисунок 3C, D, F, G). Эти агрегаты не наблюдались в OB на контрольной стороне (рисунок 3E).

Мы можем оценить патологию α-Syn путем подсчета агрегатов α-Syn или изучения размера и т. д. с помощью ImageJ (Table of Materials). Например, ранее мы подсчитывали и сообщали количество агрегатов α-Syn в этой модели20. При ПТ на стороне лечения нейритоподобные агрегаты Леви в ПТС достоверно увеличивались в течение 12 месяцев (односторонний ANOVA, за которым следовал тест Даннетта, p < 0,01; Рисунок 3H). В OB на стороне управления имеется несколько агрегатов α-Syn.

Предыдущее исследование показало, что введенные PFF в мозг мыши деградировали в течение недели, а эндогенный мышиный α-Syn превращался в агрегаты α-Syn19. В настоящем исследовании увеличение патологии α-Syn с течением времени указывает на то, что эндогенный мышиный α-Syn был преобразован в агрегаты α-Syn путем однократного интраназального введения PFF. Эти результаты указывают на то, что патология α-Syn может распространяться от обонятельной слизистой оболочки к акушерству.

figure-results-1
Рисунок 1: Метод введения в носовую полость мыши. (A) Мышь располагается в положении лежа на спине, голова слегка наклонена вниз. (B) Ноздри мыши обозначены желтыми наконечниками стрелок. (С, Г) Раствор фибрилла α-Syn капают в ноздрю мыши (С, красная стрелка) и быстро вдыхают (D, красные стрелки). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2: Схема шагов по получению неповрежденных обонятельных луковиц. (А) С помощью ножниц надрежьте черепную кость сагиттально и латерально (желтая пунктирная линия). (B) Полностью удалите черепную кость на обонятельных луковицах (OB). (В) Переверните голову и осторожно удалите мозг. Разорвите нервы мозга. (D) Перережьте обонятельные нервы, прикрепленные к черепной кости. (E) Весь мозг с интактными OBs. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-3
Рисунок 3: P-α-Syn агрегирует в клубочках обонятельной луковицы. (A-G) P -α-Syn (EP1536Y) иммуногистохимический анализ OB на (A-D) обработанной стороне через 1, 3, 6 и 12 месяцев (1 м, 3 м, 6 м и 12 м соответственно) после интраназального введения и (E) на контрольной стороне через 12 месяцев после интраназального введения. (С, Г) Вокруг клубочков появляются нитевидные агрегаты α-Syn Леви. (Ф, Г) Увеличенные изображения представляют собой изображения нейритоподобного p-α-Syn Леви с высоким увеличением через 6 месяцев и через 12 месяцев после интраназального введения. (H) Количество нейрит-подобного отложения p-α-Syn Леви в OB на обработанной и контрольной сторонах (n = 4-5). Графики показывают среднее значение ± SEM. Односторонний ANOVA с последующим тестом Даннетта; **<0.01. Эта цифра была изменена по сравнению с предыдущим отчетом20. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Обсуждение

В предыдущем исследовании введение агрегатов α-Syn в носовую полость макак вызывало гибель дофаминергических клеток и отложение железа в черной субстанции, хотя агрегатов α-Syn не наблюдалось21. Сообщалось, что ежедневное введение агрегатов A53T человеческого α-Syn в носовую полость трансгенных мышей с промотором прионов α-Syn (мышами M83) в течение 28 дней вызывало патологию α-Syn в мозге и двигательные симптомы у мышей19,22. В настоящем исследовании мы продемонстрировали, что однократное введение α-Syn агрегатов в носовую полость мышей дикого типа индуцировало патологию α-Syn в OB. Этот простой метод можно считать ценным для исследования распространения α-Syn от слизистой оболочки носа к акушерскому отделению.

Достаточная ультразвуковая обработка фибрилл α-Syn в этом методе имеет решающее значение, поскольку предыдущие исследования показали, что малый размер фрагментированных агрегатов α-Syn является наиболее эффективным для запуска патологии α-Syn23,24. Недостаточная ультразвуковая обработка фибрилл α-Syn приведет к небольшому распространению в OB. Поскольку разные ультразвуковые аппараты имеют разную мощность ультразвуковой обработки, необходима оптимизация этого процесса. Положение мыши на спине при введении раствора α-Syn в ноздри мыши также имеет решающее значение. Если голова мыши поднята, раствор α-Syn будет поступать в легкие и пищевод. Неправильная поза может привести к неожиданной смерти или недостаточному размножению α-Syn.

В настоящем исследовании и.. использовал комбинированный анестетик MMB для анестезии. Сообщалось, что комбинированная анестезия MMB обеспечивает хороший седативный эффект и анальгезию, а ее эффект может быть быстро обращен на нет с помощью атипамезола23. Поскольку ингаляционная анестезия требует закрытия ноздрей маской для поддержания анестезии, вводить раствор α-Syn интраназально сложнее. Кроме того, модель ротенона была широко изучена и является очень полезной моделью25. Тем не менее, это лекарственно-индуцированная модель, и она может иметь другие патомеханизмы, чем идиопатическая болезнь Паркинсона (ИБП)25. Поскольку эта модель индуцировала распространение α-Syn, мы считаем, что она ближе к iPD.

Наше исследование также показало, что экзогенные агрегаты α-Syn могут передаваться через слизистую оболочку носа. Поэтому, когда исследователи проводят эксперименты с использованием агрегатов α-Syn, следует соблюдать меры предосторожности, чтобы избежать вдыхания агрегатов α-Syn. Например, аэрозоли α-Syn могут образовываться на этапе ультразвуковой обработки. Мы рекомендуем использовать ультразвуковой аппарат герметичного типа или ультразвуковую обработку в безопасном шкафу. Кроме того, мыши могут чихать, потенциально образуя аэрозоли α-Syn. Чтобы снизить этот риск, все операции должны выполняться в защитном шкафу. Кроме того, исследователи должны использовать средства индивидуальной защиты, такие как одноразовые перчатки, маски и защитные очки, чтобы предотвратить воздействие α-Syn. После всех процедур исследователям необходимо протереть скамейку коммерческими моющими средствами, если поверхность загрязнена α-Syn. Предыдущие отчеты показали, что как коммерческие моющие средства, так и SDS отделяют заполнители от загрязненных поверхностей26,27.

В данном исследовании для оценки патологии α-Syn в OB использовались парафиновые срезы, так как небольшая структура OB лучше сохраняется в парафиновых срезах по сравнению с замороженными срезами. Это исследование показало, что патология α-Syn индуцирована у акушера; однако наблюдаемая патология α-Syn была легкой и ограниченной и в основном была представлена нитевидными агрегатами, известными как невриты Леви в клубочках.

Следует отметить, что явных изменений в поведении подопытных мышей в настоящем исследовании не наблюдалось. Индуцированная этим методом патология α-Syn может быть недостаточной для того, чтобы вызвать изменения в фенотипе поведения. Необходимы дальнейшие исследования для выяснения конкретных состояний, приводящих к тяжелой патологии и поведенческим изменениям. В будущем, если мы сможем установить более эффективный способ распространения от слизистой оболочки носа к акушерскому отделению, этот простой метод обеспечит альтернативный способ оценки распространения α-Syn без хирургического вмешательства.

Кроме того, мы использовали OB на контралатеральной стороне у обработанных мышей в качестве контроля. Тем не менее, ретроградное распространение от переднего обонятельного ядра или грушевидной коры к контралатеральной OB может произойти при более долгосрочном наблюдении. В этом случае в качестве контроля использовались мыши, не получавшие лечения.

Хотя этот простой метод дает ценную информацию о распространении α-Syn от слизистой оболочки носа к акушерскому отделению, необходимы дальнейшие исследования, чтобы всесторонне понять механизмы, лежащие в основе БП.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Благодарности

Все эксперименты проводились при поддержке Риэ Хикавы. Мы выражаем нашу благодарность Ясуко Мацудзаве за оформление документов. Это исследование было поддержано JSPS KAKENHI (M.S., No. JP19K23779, JP20K16493 и JP20H00663).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Флуоресцентный микроскоп "все в одном" BZ-X710KEYENCEN/AУниверсальный микроскоп
Ампициллин Натриевая сольNacalai tesque02739-32
Bioruptor IISonicbioBR2006AУльтразвуковой аппарат водяной бани.
Тартрат буторфанолаMeiji Seika PharmaWAK-52850
Целлюлозная трубкаMISUMIUC20-32-100
DeepWellMaximizerTAITECMBR-022UPШейкер
DynaCompetent Cells Zip BL21(DE3)BioDynamics Laboratory Inc.DS255Компетентная клетка
EntellanSigma-Aldrich107961Быстросъемный монтажный материал для микроскопии
Graefe Extra Fine Щипцы изогнутые зубчатыеFST11152-10 щипцы
Закаленные тонкие ножницыFST14090-09ножницы
Histofine Простое окрашивание мыши MAX-PO (R)Nichirei Bioscience414341Универсальный полимер иммунопероксидазы, анти-кролик
ImageJ ver 1.52pNANAhttps://imagej.net/
innova4200Нью-Брансуик научный9105085Шейкер инкубатора
Изопропил-&бета;- D-тиогалактопиранозидNacalai tesque19742-94
LB бульон, LennoxNacalai tesque20066-24
Leica EG 1150 HLeica14 0388 86 108Модульный центр встраивания тканей
Leica TP 1020Leica14 0422 85108Автоматический обработчик тканей 
МедетомидинFuji Film135-17473
Microm HM325 Rotary MicrotomeThermo Scientific902100
MidazolamMaruishi Seiyaku4987-211-76210-0
Новый гематоксилин тип GMuto65-9197-38Раствор гематоксилина
Обычная крылатая игла для вен типа D, 25GTERUMONN2332Rигла 25G
Ультрацентрифуга Optima TLXBeckman Couler8043-30-1197Ультрацентрифуга
P10 пипеткаGilsonFA10002P
парафиномLeica39601095
параформальдегидомNacalai tesque30525-89-4
Пероксидаза Stain DAB KitNacalai tesque25985-50
Pirece BCA Protein Straits Наборы для анализа белкаThermo Scientific23225Анализ BCA
pRK172Addgene#134504Плазмида
Q-сефароза Fast Flow. Цитива17051001Ионообменная смола

Ссылки

  1. Tysnes, O. B., Storstein, A. Epidemiology of Parkinson's disease. J Neural Transm (Vienna). 124 (8), 901-905 (2017).
  2. Goedert, M. Alpha-synuclein and neurodegenerative diseases. Nature Rev Neurosci. 2, 492-501 (2001).
  3. Conway, K. A., et al. Acceleration of oligomerization, not fibrillization, is a shared property of both alpha-synuclein mutations linked to early-onset Parkinson's disease: implications for pathogenesis and therapy. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (2), 571-576 (2000).
  4. Braak, H., et al. Staging of brain pathology related to sporadic Parkinson's disease. Neurobiol Aging. 24 (2), 197-211 (2003).
  5. Braak, H., Rüb, U., Gai, W. P., Del Tredici, K. Idiopathic Parkinson's disease: possible routes by which vulnerable neuronal types may be subject to neuroinvasion by an unknown pathogen. J Neural Transm (Vienna). 110 (5), 517-536 (2003).
  6. Kordower, J. H., Chu, Y., Hauser, R. A., Freeman, T., Olanow, C. W. Lewy body-like pathology in long-term embryonic nigral transplants in Parkinson's disease. Nat Med. 14 (5), 504-506 (2008).
  7. Li, J. Y., et al. Lewy bodies in grafted neurons in subjects with Parkinson's disease suggest host-to-graft disease propagation. Nat Med. 14 (5), 501-503 (2008).
  8. Luk, K. C., et al. Pathological α-synuclein transmission initiates Parkinson-like neurodegeneration in nontransgenic mice. Science. 338, 949-953 (2012).
  9. Desplats, P., et al. Inclusion formation and neuronal cell death through neuron-to-neuron transmission of alpha-synuclein. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (31), 13010-13015 (2009).
  10. Sawamura, M., et al. Lewy body disease primate model with α-Synuclein propagation from the olfactory bulb. Mov Disord. 37 (10), 2033-2044 (2022).
  11. Uemura, N., et al. Inoculation of α-synuclein preformed fibrils into the mouse gastrointestinal tract induces Lewy body-like aggregates in the brainstem via the vagus nerve. Mol Neurodegener. 13 (1), 21(2018).
  12. Rey, N. L., et al. Widespread transneuronal propagation of alpha-synucleinopathy triggered in olfactory bulb mimics prodromal Parkinson's disease. J Exp Med. 213 (9), 1759-1778 (2016).
  13. Rey, N. L., et al. Spread of aggregates after olfactory bulb injection of α-synuclein fibrils is associated with early neuronal loss and is reduced long term. Acta Neuropathol. 135 (1), 65-83 (2018).
  14. Uemura, N., et al. α-Synuclein spread from olfactory bulb causes hyposmia, anxiety, and memory loss in BAC-SNCA mice. Mov Disord. 36 (9), 2036-2047 (2021).
  15. Saito, Y., et al. Lewy body pathology involves the olfactory cells in Parkinson's disease and related disorders. Mov Disord. 31 (1), 135-138 (2016).
  16. De Luca, C. M. G., et al. Efficient RT-QuIC seeding activity for α-synuclein in olfactory mucosa samples of patients with Parkinson's disease and multiple system atrophy. Transl Neurodegener. 8, 24(2019).
  17. Stefani, A., et al. Alpha-synuclein seeds in olfactory mucosa of patients with isolated REM sleep behaviour disorder. Brain. 144 (4), 1118-1126 (2021).
  18. Ucciferri, C. C., et al. Scoring central nervous system inflammation, demyelination, and axon injury in experimental autoimmune encephalomyelitis. J Vis Exp. (204), e65738(2024).
  19. Masuda-Suzukake, M., et al. Prion-like spreading of pathological α-synuclein in brain. Brain. 136 (Pt 4), 1128-1138 (2013).
  20. Sawamura, M., et al. Single-dose intranasal administration of α-syn PFFs induce lewy neurite-like pathology in olfactory bulbs. Parkinsonism Relat Disord. 112, 105440(2023).
  21. Guo, J. J., et al. Intranasal administration of α-synuclein preformed fibrils triggers microglial iron deposition in the substantia nigra of Macaca fascicularis. Cell Death Dis. 12 (1), 81(2021).
  22. Macdonald, J. A., et al. Assembly of α-synuclein and neurodegeneration in the central nervous system of heterozygous M83 mice following the peripheral administration of α-synuclein seeds. Acta Neuropathol Commun. 9 (1), 189(2021).
  23. Abdelmotilib, H., et al. α-Synuclein fibril-induced inclusion spread in rats and mice correlates with dopaminergic Neurodegeneration. Neurobiol Dis. 105, 84-98 (2017).
  24. Tarutani, A., et al. The effect of fragmented pathogenic α-Synuclein seeds on prion-like propagation. J Biol Chem. 291 (36), 18675-18688 (2016).
  25. Taguchi, T., Ikuno, M., Yamakado, H., Takahashi, R. Animal model for prodromal Parkinson's disease. Int J Mol Sci. 21 (6), 1961(2020).
  26. Bousset, L., Brundin, P., Böckmann, A., Meier, B., Melki, R. An efficient procedure for removal and inactivation of alpha-Synuclein assemblies from laboratory materials. J Parkinsons Dis. 6 (1), 143-151 (2016).
  27. Fenyi, A., Coens, A., Bellande, T., Melki, R., Bousset, L. Assessment of the efficacy of different procedures that remove and disassemble alpha-synuclein, tau and A-beta fibrils from laboratory material and surfaces. Sci Rep. 8, 10788(2018).

Перепечатки и разрешения

Теги

Методика интраназального введения агрегатов α-синуклеина
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.