Немедленное частичное удаление кумулюс-ооцитарных комплексов: усовершенствованный подход к быстрому наблюдению за экстракорпоральным оплодотворением

Краткое содержание

В данной работе мы представляем оптимизированный метод оперативного удаления порции кумулус-ооцитарных комплексов после забора яйцеклетки, чтобы ускорить процесс наблюдения за ЭКО, сократить время, необходимое для удаления гранулезных клеток, свести к минимуму воздействие на ооциты внешних элементов и не препятствовать развитию эмбриона, что в конечном итоге повышает эффективность лабораторных процедур ЭКО.

Аннотация

Несмотря на стремительное развитие клинических и лабораторных технологий экстракорпорального оплодотворения (ЭКО), значительная часть (10-15%) пациенток продолжает испытывать нарушения оплодотворения, что приводит к низким показателям оплодотворения и производству нежизнеспособных эмбрионов. Краткосрочное оплодотворение включает в себя раннее удаление гранулезных клеток для наблюдения за экструзией второго полярного тела, что позволяет оценить оплодотворение и принять ранние корректирующие меры для решения проблемы низкой интенсивности оплодотворения и полной неудачи оплодотворения. Тем не менее, наблюдение за краткосрочным оплодотворением при ЭКО затруднено такими проблемами, как чрезмерно большие необработанные кластеры кумулюс-ооцитарных комплексов и адгезия между яйцеклетками, что требует сложных внешних процедур для удаления гранулезных клеток, а также длительная продолжительность наблюдения. Чтобы решить эту проблему, в данном исследовании предлагается метод немедленного частичного удаления гранулезных клеток после извлечения яйцеклеток. Такой подход оптимизирует последующие этапы краткосрочного оплодотворения и мониторинга традиционного оплодотворения, сокращает время, необходимое для экструзии ооцитов, минимизирует вероятность воздействия внешней среды на ооциты и снижает риск пропуска критического окна наблюдения за оплодотворением. Следовательно, исследование дает новые клинические данные, направленные на повышение операционной эффективности эмбриональных лабораторий при ЭКО.

Введение

В области экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов (ЭКО-ЭТ) типичный уровень оплодотворения находится в диапазоне от 60% до 80%¹. Тем не менее, примерно от 4% до 16% случаев сталкиваются либо с полным неудачным оплодотворением, либо с низким уровнем оплодотворения, что создает проблемы для прогнозирования ^2,3. Для улучшения клинических исходов беременности и снижения частоты полного и низкого оплодотворения использование краткосрочного оплодотворения в процедурах ЭКО находится на подъеме⁴. Этот подход влечет за собой оперативное удаление гранулезных клеток для мониторинга экструзии второго полярного тельца, оценки статуса оплодотворения и, возможно, проведения лечебной интрацитоплазматической инъекции сперматозоида (ИКСИ). Связь между комплексом кучевых клеток ооцита (OCCC) и ооцитом сильнее во время краткосрочного оплодотворения по сравнению с традиционным ночным оплодотворением, что увеличивает сложность удаления OCCC⁵. Такие факторы, как избыток количества ооцитов, большие комплексы OCCC или межооцитарные спайки, могут привести к увеличению времени удаления гранулезных клеток во время кратковременного оплодотворения, тем самым продлевая период, в течение которого яйцеклетки остаются вне инкубатора⁴. Для оптимизации периода наблюдения за оплодотворением разработан модифицированный подход к забору яйцеклеток после яйцеклетки, предполагающий частичное иссечение гранулезных клеток из ооцитов со значительными комплексами OCCC. Этот метод помогает сохранить гранулезные клетки, окружающие ооциты, сохраняя целостность ранней структуры ооцитов⁶ и позволяя этим клеткам продолжать поставлять жизненно важные факторы для созревания ооцитов и последующего связывания эмбрионов при оплодотворении⁷.

Следовательно, данное исследование сосредоточено на пациентах, проходящих лечение ЭКО-ЭТ в центре репродуктивной медицины в качестве участников исследования, целью которого является изучение влияния метода механического иссечения клеток частичной гранулезы на продолжительность процедур как краткосрочного оплодотворения, так и мониторинга ночного оплодотворения, а также оценки результатов нормального оплодотворения и поздней стадии развития. Это исследование призвано дать ценную информацию для улучшения лабораторных процедур эмбрионов при ЭКО.

Протокол

Все процедуры проводились в соответствии со стандартными операционными процедурами отделения репродуктивной медицины Народной больницы Мэйчжоу и подлежали рассмотрению Комитетом по этике того же отделения. Письменное информированное согласие было получено от каждой участвующей пары. В исследование были включены участники, прошедшие первый цикл ЭКО с переносом эмбрионов на стадии расщепления или бластоцисты, а также женщины в возрасте от 20 до 45 лет. Критерии исключения включали использование донорских яйцеклеток/сперматозоидов и специфические состояния, такие как врожденные или вторичные аномалии матки (например, перегородка матки, однорогая матка, дидельфис матки), аденомиоз, подслизистая миома матки или толщина эндометрия менее 7 мм в день переноса эмбрионов. В общей сложности 115 пациентов, зарегистрированных в период с декабря 2023 года по февраль 2024 года, были стратифицированы на две группы в зависимости от того, было ли выполнено немедленное частичное удаление OCCC.

1. Подготовка перед забором ооцитов

1. Поместите чашки для сбора ооцитов (Table of Materials) в инкубатор при температуре 37 °C на ночь.
2. Инкубируйте 12 мл среды для манипуляций с фолликулами (Таблица материалов) в 14 мл пробирок с круглым дном при температуре 37 °C в течение ночи. Перенесите пробирки на предварительно разогретую штатив для пробирок за 30 минут до забора ооцитов.
3. Подготовьте среду для работы с фолликулами: добавьте 9 мл среды для манипуляций с фолликулами в пробирку с круглым дном объемом 14 мл (Таблица материалов) и инкубируйте при 37 °C в течение ночи. В день забора ооцитов перенесите 4,5 мл среды в предварительно инкубированную чашку для сбора ооцитов (Table of Materials), покрытую 2 мл 100% парафинового масла.
4. Приготовьте промывочный раствор OCCC: добавьте 4,5 мл среды для удобрения (Таблица материалов) в чашку для сбора ооцитов и инкубируйте при 37 °C в течение ночи.
5. Приготовьте среду для удобрения: Добавьте 1 мл среды для удобрения в посуду диаметром 6 см, покрытую 100% парафиновым маслом (Таблица материалов) и выдерживайте при температуре 37 °C в течение ночи.
6. Подготовьте стеклянные пипетки Пастера (Таблица материалов): Аккуратно затупите и закруглите кончики, обжигая их на спиртовой лампе в течение примерно 5 секунд (Рисунок 1). Прикрепите всасывающую головку к кончику пипеток Пастера, следя за тем, чтобы она могла касаться дна посуды, не царапая. Ополосните стеклянные пипетки Пастера и 10 см посуду средством для манипуляций с фолликулами.

2. Забор ооцитов и немедленное частичное удаление OCCC

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте стереомикроскоп во время процедур выделения ооцитов и удаления OCCC. Для достижения оптимальных результатов все процедуры следует проводить на нагревательном столе с контролем температуры (37 °C), а все оборудование должно быть предварительно разогрето за 30 минут до забора ооцитов.

1. Соберите преовуляторную фолликулярную жидкость во время забора ооцитов в соответствии с рекомендациями ESHRE⁸.
   1. Вкратце, используйте иглу 17 G для извлечения ооцитов под трансвагинальным ультразвуковым контролем. Соответствующее отрицательное давление колеблется в пределах 120-140 мм рт.ст.
   2. Налейте фолликулярную жидкость, собранную в пробирке с круглым дном объемом 14 мл, в чашку диаметром 10 см (Таблица материалов), поддерживая глубину жидкости менее 0,5 см. Поставьте блюдо на платформу с постоянной температурой (37 °C).
2. Наблюдайте за OCCC под стереомикроскопом, чтобы подтвердить наличие ооцитов и оценить их зрелость.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Зрелость ОООС оценивается на основе морфологии кучевых клеток и видимости определенных структур ооцитов⁹.
3. Аспирируйте OCCC с помощью пипетки Пастера с тупым концом. Наклоняем посуду на 10 см примерно на 15 градусов и разкладываем все крупные OCCC. Избегайте аспирации ооцита и окружающих гранулезных клеток в радиусе 2500 мкм. Разрежьте лишние гранулезные клетки с помощью пастеровской пипетки вдоль продольной оси (рисунок 2). Подробные шаги следующие:
   1. Наблюдайте невооруженным глазом, чтобы увидеть, есть ли в фолликулярной жидкости сероватая полупрозрачная мукоидная масса. Если не найдено, быстро отыщите сероватую полупрозрачную слизистую массу, вращая по часовой стрелке снаружи внутрь под стереомикроскопом OCCC.
   2. Подтвердите наличие ооцитов в OCCC и проведите предварительную оценку зрелости ооцитов.
   3. Затем предварительно приготовьте силиконовую аспирационную пипетку с круглой отполированной пламенем пипеткой Пастера, аспирируйте OCCC и одновременно аккуратно поднимите чашку для культуры в положении 9-10 часов левым безымянным пальцем руки, держащей чашку длиной 10 см, слегка наклонив чашку для культуры примерно на 15° влево (размещение безымянного пальца под чашкой примерно на необходимый угол).
   4. Выплевывая аспирированный OCCC в положении «11 часов» блюда, слегка удлините его горизонтально вправо. Затем наблюдайте за размером гранулезных клеток вокруг расширенного OCCC. Впоследствии, в подходящем положении горизонтально вытянутого OCCC, с помощью пастеровской пипетки сделайте быстрый и аккуратный нисходящий разрез на избыточных гранулезных клетках сверху вниз.
4. Переложите нарезанный OCCC в сборную чашку с промывочным раствором OCCC. Перелейте оставшуюся фолликулярную жидкость в стерильную емкость для образца (Таблица материалов). Повторяйте эти действия до тех пор, пока не соберутся все комплексы.

3. Подготовка спермы и экстракорпоральная инсеминация

1. Соберите образцы спермы с помощью эякуляции утром в день забора ооцитов. Оцените концентрацию, подвижность и морфологию сперматозоидов под световым микроскопом в соответствии с критериями Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ, 2010)¹⁰. Затем переложите сперматозоидную гранулу в новую центрифужную пробирку и дважды промойте ее в удобряющей среде¹¹. Инкубируйте их при 6%_CO2 и 37 °C до тех пор, пока это не понадобится.
2. Осемените OCCC 1 x 10⁵ до 3 x 10⁵ подвижных сперматозоидов на миллилитр в одной капле примерно через 2-3 часа после извлечения в чашке для оплодотворения (Таблица материалов). Добавьте в чашку для удобрения 6-8 OCCC и 1 мл среды для удобрения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: После промывки липких OCCC они переносятся в чашку для удобрения с помощью пипетки Пастера. Выпускайте по одному OCCC за раз, осторожно отрывая пипетку от поверхности жидкости, прежде чем выпустить следующий, следя за тем, чтобы каждый OCCC был размещен в чашке по отдельности, чтобы предотвратить скопление.

4. Удаление кумулюсных клеток

1. Для кратковременного внесения удобрений выполните описанные ниже действия.
   1. Коинкубируйте OCCC со сперматозоидами в течение 4-6 ч. После инкубации механически удалите кумулюсные клетки, окружающие ооциты.
   2. Аспирируйте ооциты с помощью пипетки с внутренним диаметром немного меньше ооцитов, чтобы обеспечить полное удаление кучевых клеток.
   3. Подтвердите оплодотворение, наблюдая за наличием двух полярных тел. Ооциты, показывающие второе полярное тельце, считаются оплодотворенными.
   4. Определите те случаи, которые не показывают второе полярное тельце, как неудачи в оплодотворении, требующие спасательного ИКСИ.
2. Для регулярного оплодотворения, после 18-20 ч совместной инкубации, удалите кумулюсные клетки с помощью пипеток для оценки оплодотворения.

5. Культивирование эмбрионов

1. Культивируют и контролируют оплодотворенные ооциты в течение 3-5 дней после забора ооцитов. Оценивайте оплодотворение через 20 ч после осеменения для определения количества пронуклеусов. Затем культивируют каждую зиготу по отдельности в средней капле и переносят эмбрионы после оплодотворения в среду для расщепления.
   Примечание: Идеальный эмбрион к третьему дню должен состоять из шести или более бластомеров одинакового размера и демонстрировать скорость фрагментации, не превышающую или равную 10%¹².
2. Решение о проведении бактериологического исследования бластоцисты зависит от предпочтений пациента и конкретных обстоятельств, таких как количество и качество эмбрионов, полученных на 3-й день. Перенесите эмбрионы 3-го дня в среду бластоцисты и оцените на 5-й день. Используйте систему оценки Гарднера для оценки бластоцист, при этом высококачественные бластоцисты имеют оценку ≥ 4 BB¹³.

6. Измерение результатов и статистический анализ

1. Непрерывные данные представляют в виде среднего значения ± стандартного отклонения, а порядковые данные — в виде пропорций. Выполните статистический анализ с помощью t-критерия Стьюдента или критерия хи-квадрат в соответствующем программном обеспечении для анализа данных (в данном случае IBM SPSS Statistics). Считать статистически значимым уровень значимости P < 0,05.

Результаты

В группе, проходящей короткие процедуры коинкубации, пациенты, получившие помощь, были исключены. Из 47 пациенток, получавших краткосрочную инсеминацию, не наблюдалось существенных различий по возрасту пациенток и количеству извлеченных ооцитов (табл. 1). Немедленное частичное удаление OCCC привело к ослаблению оставшегося OCCC вокруг ооцитов (Рисунок 3), что способствовало обнаружению второго полярного тела. Среднее время процедуры было значительно короче в группе частичного удаления OCCC (4,42 ± 1,68 мин против 9,29 ± 5,04 мин, P < 0,001) по сравнению с контрольной группой, несмотря на отсутствие существенных различий в скорости расщепления, оптимальной скорости эмбриона и оптимальной скорости бластоцисты.

В другой когорте из 68 пациенток, перенесших традиционное экстракорпоральное оплодотворение (ЭКО), где проверка оплодотворения проводилась через 18-20 ч после инсеминации, было отмечено сходство в возрасте пациенток и количестве извлеченных ооцитов между двумя группами (табл. 2). Повышенная рыхлость структуры гранулезных клеток, окружающих ооцит, наблюдалась у пациенток, которым было выполнено немедленное частичное удаление OCCC во время забора яйцеклеток (рис. 4). Несмотря на то, что в группе частичного удаления OCCC было отмечено несколько более короткое среднее время операции (4,93 ± 0,80 мин против 6,54 ± 7,77 мин, P = 0,207), статистически значимой разницы не наблюдалось. В то время как плотные спайки в некоторых случаях могут привести к длительным процедурам наблюдения, превышающим 40 минут, в целом слабые спайки OCCC в большинстве случаев после ночного хранения могут объяснять отсутствие статистической дисперсии во времени работы между двумя группами. Как и в предыдущей группе, не было выявлено существенных расхождений в скорости расщепления, оптимальной скорости эмбриона и оптимальной скорости бластоцисты.

В целом, репрезентативные результаты указывают на то, что немедленное частичное удаление OCCC значительно сокращает время операции при краткосрочных процедурах инсеминации без ущерба для ключевых результатов ЭКО, таких как скорость расщепления, оптимальная скорость эмбриона и оптимальная скорость бластоцисты. Этот метод облегчает обнаружение второго полярного тела за счет ослабления оставшегося OCCC вокруг ооцитов, что, вероятно, способствует сокращению времени работы. В контексте традиционных процедур ЭКО, несмотря на то, что наблюдалась тенденция к сокращению времени операции при немедленном частичном удалении OCCC, разница не была статистически значимой, возможно, из-за присущей вариабельности адгезии кумулюсных клеток после ночного хранения. Эти результаты свидетельствуют о том, что, хотя немедленное частичное удаление OCCC может повысить эффективность процедуры, особенно в контексте краткосрочного оплодотворения, его влияние на традиционные сроки ЭКО может быть менее выраженным.

Рисунок 1: Приготовление пипетки Пастера с помощью спиртовой горелки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Типичное изображение OCCC, которое необходимо обработать. Типичные ооциты диаметром более 2,5 мм у (А и В) двух пациентов подвергались частичному удалению по очерченной красной пунктирной линии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3: Типичные микрофотографии, отображающие морфологические особенности оплодотворения через 4-6 ч после совместной инкубации со сперматозоидами. Типичный ооцит (А) с или (В) без частичного удаления OCCC. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 4: Типичные микрофотографии, отображающие морфологические особенности оценки пронуклеусов через 18-20 ч после совместной инкубации со сперматозоидами. Типичный ооцит (А) с или (В) без частичного удаления OCCC. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

	Частичное удаление группы OCCC	Контрольная группа	p-значение
Пациенты (n)	26	21
Возраст (y)	32.04 ± 4.11	33.33 ± 3.41	0.193
Нет. извлеченных ооцитов	12.85 ± 9.02	11.38 ± 5.32	0.493
Время процедуры 4 часа (мин)	4.42 ± 1.68	9.29 ± 5.04	<0,001
Коэффициент спайности, n (%)	98.89 ± 0.04, 24	100.00 ± 0.00, 19	0.221
Оптимальная зародышевая норма, n (%)	71.38 ± 35.46, 24	72.14 ± 35.72, 19	0.945
Оптимальная норма бластоцитов, n (%)	58.13 ± 28.29, 19	65.18 ± 28.09, 12	0.504

Таблица 1: Сравнение результатов оплодотворения между двумя группами с или без немедленного частичного удаления OCCC, подвергающихся коротким процедурам совместной инкубации.

	Частичное удаление группы OCCC	Контрольная группа	p-значение
Пациенты (n)	29	39
Возраст (y)	32.21 ± 4.11	32.72 ± 4.25	0.619
Нет. извлеченных ооцитов	12.93 ± 7.00	12.44 ± 7.26	0.777
Время работы 20 ч (мин)	4,93 ± 0,80	6.54 ± 7.77	0.207
Коэффициент спайности, n (%)	98,81 ± 0,04, 28	95,93 ± 0,17,37	0.39
Оптимальная зародышевая норма, n (%)	72.07 ± 36.75, 28	72.62 ± 30.01,36	0.948
Оптимальная норма бластоцитов, n (%)	62.93 ± 28.30, 21	63.36 ± 24.61, 28	0.955

Таблица 2: Сравнение результатов оплодотворения между двумя группами с или без немедленного частичного удаления OCCC, подвергающегося традиционному экстракорпоральному оплодотворению (ЭКО).

Обсуждение

Немедленное частичное удаление гранулезных клеток может ускорить процесс раннего распада при краткосрочном оплодотворении, сократить время наблюдения за вторым полярным тельцем как при краткосрочном оплодотворении, так и при обычном ЭКО и не поставить под угрозу последующее развитие эмбриона. В настоящее время лаборатории по всему миру используют различные стратегии для смягчения нарушений оплодотворения и низких показателей успеха. Предпочтительный метод включает удаление гранулезных клеток для наблюдения за вторым полярным тельцем через 4-6 ч после кратковременного оплодотворения¹⁴. Проблемы возникают из-за плотной адгезии между ооцитами и окружающими кумулюсными клетками, что затрудняет механическое удаление с помощью пипетки. Немедленный забор и разрезание ооцитов может смягчить эту проблему за счет уменьшения адгезии и объема OCCC, что приводит к сокращению времени наблюдения. Важным шагом в протоколе является немедленное частичное удаление OCCC после забора яйцеклеток, что способствует разрыхлению оставшихся кучевых клеток вокруг ооцитов для облегчения обнаружения второго полярного тельца, что имеет решающее значение для оценки успеха оплодотворения. Быстрое удаление значительно сокращает время операции без ущерба для скорости расщепления, оптимальной скорости эмбриона или оптимальной скорости бластоцисты.

Предлагаемые модификации и устранение неполадок в технике резки заключаются в следующем: (i) Фиксация иглой считается ненужной, так как это приведет к увеличению экстракорпорального времени. На практике это удобный подход к резке. (ii) Рекомендуется сосредоточить внимание на OCCC, сохраняя 3-4 гранулезные клетки с каждой стороны, которые соответствуют диаметру ооцита. Для двустороннего OCCC обе стороны должны быть отрезаны; Для одностороннего OCCC отрежьте сторону с помощью OCCC. Можно стремиться к симметрии, пусть и не обязательно идеальной. (iii) Чтобы предотвратить скручивание фолликулов и нарушение разложенного состояния, фолликулярная жидкость на чашке должна быть достаточно жидкой во время разрезания, чтобы предотвратить всплытие OCCC. (iv) Фолликулярная жидкость часто содержит компоненты крови во время забора ооцитов. После разреза следует своевременно перенести фолликулы в посуду для мытья, чтобы смягчить воздействие загрязнения крови и продолжить промывание после забора ооцитов.

Сохранение кумулюсных клеток после частичного удаления гарантирует, что ооциты получают необходимые вещества для раннего эмбрионального развития, такие как факторы роста и аминокислоты, способствуя развитию эмбриона¹⁵. Предыдущие исследования показали, что долгосрочное совместное культивирование может генерировать большое количество активных форм кислорода (АФК), что приводит к затвердеванию эмбриональной зоны пеллюциды и снижению потенциала эмбрионов. Немедленное частичное удаление гранулезных клеток при сохранении необходимых кучевых гранулезных клеток снижает АФК к гранулезным клеткам и расход энергии в питательных средах¹⁶. В настоящее время нет единого консенсуса относительно сроков и пропорции удаления гранулезных клеток для краткосрочного оплодотворения при ЭКО. Данные, полученные в этом исследовании, свидетельствуют о том, что немедленное удаление отобранных ооцитов до диаметра примерно 2500 мкм OCCC не препятствует последующему развитию эмбриона или процессу наблюдения за краткосрочным и обычным оплодотворением методом ЭКО.

Существенным ограничением этой методики является потенциальная вариабельность степени адгезии между ооцитами и кумулюсными клетками, что может повлиять на согласованность результатов. Кроме того, в то время как подход с немедленным частичным удалением сокращает время наблюдения, он требует точного выполнения, чтобы избежать повреждения ооцитов или поставить под угрозу последующее развитие эмбриона. Необходимы дальнейшие эксперименты, чтобы определить оптимальное количество оставшегося OCCC после резки. Например, исследование того, может ли удержание около 2000 мкм OCCC и предварительная маркировка шкалы на отборочной чашке улучшить единообразную оценку размера OCCC и диапазона резки.

В заключение следует отметить, что этот усовершенствованный метод не оказывает существенного негативного влияния на оплодотворение или развитие эмбриона, что делает его ценным методом для одобрения.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
G-IVFT PLUS	Vitrolife	10136
OVOIL	Vitrolife	10029
G-MOPS PLUS	Vitrolife	10130
Falcon 3003 тарелка	Corning	353003
Falcon 3001 тарелка	Corning	353001
Falcon 2001 туба	Corning	352001
Falcon 4013 чашка	Corning	354013
Falcon 3037 чашка	Corning	351058
пипетка Пастера	Darwin	D1150-5P