Методическая статья

Оптимизация сбора слезы у мышей для анализа мРНК и белка

2.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/66955

⸱

19 июля 2024 г.

 ,  ,  ,  , 
1Departamento de Farmacobiología, Centro de Investigación sobre el Envejecimiento, CINVESTAV Sede Sur

В этой статье

Краткое содержание

Идентификация биомаркеров РНК и белков из разрывов на мышиных моделях имеет большие перспективы для ранней диагностики различных заболеваний. В данной рукописи представлен комплексный протокол для оптимизации эффективности и результативности выделения мРНК и белков из слез мышей.

Аннотация

Слезная пленка представляет собой высокодинамичную биожидкость, способную отражать связанные с патологией молекулярные изменения не только на поверхности глаза, но и в других тканях и органах. Молекулярный анализ этой биожидкости предлагает неинвазивный способ диагностики или мониторинга заболеваний, оценки эффективности медицинского лечения и выявления возможных биомаркеров. Из-за ограниченного объема образца сбор отрывных образцов требует определенных навыков и соответствующих инструментов для обеспечения высокого качества и максимальной эффективности. В исследованиях на людях были описаны различные методологии отбора проб слез. В этой статье представлено всестороннее описание оптимизированного протокола, специально предназначенного для извлечения информации о белках, связанных со слезами, из экспериментальных моделей животных, особенно мышей. Этот метод включает в себя фармакологическую стимуляцию выработки слезы у 2-месячных мышей с последующим сбором образцов с помощью полосок Ширмера и оценкой эффективности и результативности протокола с помощью стандартных процедур, SDS-PAGE, количественной ПЦР и цифровой ПЦР (дПЦР). Этот протокол может быть легко адаптирован для исследования сигнатуры белка слезы в различных экспериментальных парадигмах. Путем создания доступного, стандартизированного и оптимизированного протокола отбора проб слез для животных моделей цель состояла в том, чтобы преодолеть разрыв между исследованиями на людях и животных, способствуя трансляционным исследованиям и ускоряя прогресс в области исследований глазных и системных заболеваний.

Введение

Слезы считаются ультрафильтратом плазмы, а также описываются как промежуточная жидкость между сывороткой плазмы и спинномозговой жидкостью из-за значительного перекрытия биомолекул, которые они разделяют1. Сообщалось, что слезы человека содержат белки, слезные липиды, метаболиты иэлектролиты2. В последнее время также были идентифицированы другие биомолекулы, такие как мРНК, микроРНК и внеклеточные везикулы 3,4,5,6,7.

У человека базальные слезы расположены в слезной пленке, которая состоит из трех слоев: внешнего липидного слоя, который поддерживает поверхность слезы гладкой, чтобы мы могли видеть сквозь нее и предотвращать испарение слезы; средний водный слой, который поддерживает увлажнение глаза, отталкивает бактерии, защищает роговицу и составляет 90% слезной пленки; и, наконец, слой муцина, семейство высокомолекулярных белков, которые контактируют с роговицей и позволяют слезе прилипатьк глазу. Распределение слезы по поверхности глаза начинается с выделения из слезной железы. Затем эта жидкость направляется через слезные протоки, чтобы пройти по поверхности глаза и попасть в дренажные каналы. Каждое моргание позволяет слезам равномерно распределиться по всему глазу, сохраняя его влажным9.

Слезная пленка представляет собой высокодинамичную биожидкость, способную отражать молекулярные изменения, происходящие не только на поверхности глаза, но и в других тканях и органах. Анализ дифференциальной экспрессии в этой биожидкости представляет собой многообещающий подход к открытию биомаркеров при заболеваниях человека10,11. Использование слезной пленки в качестве источника биомаркеров для ранней диагностики при различных патологиях в значительной степени облегчается наличием неинвазивных методов сбора. Наиболее распространенным методом сбора слез в медицинских и ветеринарных клиниках является мембранная поддержка (полоска Ширмера), которая действует по принципу капиллярного действия, позволяя воде в слезах перемещаться по длине бумажной тест-полоски или капиллярных трубок, помещенных в нижний конъюнктивальный мешок субъекта 12,13,14. Несмотря на присущие этому методу ограничения получения небольшого объема образца, биохимический анализ состава слезы с использованием различных чувствительных методов облегчил идентификацию потенциальных молекул-биомаркеров11,15. Протоколы оптимизации и оценки элюирования слезных белков из полосок и капилляров Ширмера у пациентов хорошо задокументированы16,17. Тем не менее, полные описания оптимизированных протоколов, специально разработанных для извлечения молекулярной информации, связанной со слезами, из экспериментальных животных моделей, доступны, но редки. Существующие методы, такие как индукция слезы путем прямой стимуляции слезной железы18, хотя и позволяют собирать большие объемы, являются инвазивными и могут вызывать дискомфорт у животных. Неинвазивные методы, такие как сбор слез с поверхности глаза, были описаны как способ выделения ДНК и микроРНК19,21.

Этот протокол направлен на создание экономически эффективного и оптимизированного метода сбора и обработки слез у мышей. Метод отдает приоритет неинвазивности при получении достаточных объемов слез, пригодных для молекулярного анализа, с помощью таких методов, как SDS-PAGE, qPCR и dPCR. Информация о содержании экстрагированного белка и мРНК может быть затем использована для идентификации потенциальных биомаркеров в существующих экспериментальных моделях заболеваний.

Протокол

Все описанные здесь процедуры были одобрены Комитетом по этике животных Cinvestav (CICUAL, # 0354/23). Лабораторные животные лечились и обрабатывались в строгом соответствии с рекомендациями журнала по использованию животных и в соответствии с Заявлением Ассоциации исследований в области зрения и офтальмологии (ARVO) для использования животных в офтальмических исследованиях и исследованиях зрения. Здоровье глаз до и после процедур оценивалось путем оценки глазных выделений, опухших век, глазных аномалий и изменений в поведении.

1. Животные и подготовка реагентов

  1. Для процедуры используйте трех 2-месячных мышей C57BL/6 самцов на одну репликацию со стартовым весом ~25 г (Рисунок 1). Обрабатывайте каждую мышь по отдельности и положите ее на грелку, чтобы сохранить тепло.
  2. Чтобы вызвать выделение слезы, приготовьте исходный раствор пилокарпина в концентрации 20 мг/мл с использованием стерильной воды.
  3. Разрежьте тест-полоски Ширмера до 5 мм в длину и согните каждую полоску в выемке под углом 90°.
  4. Приготовьте 250 мкл стерильной воды с ингибитором протеазы (1 таблетка на 50 мл, согласно инструкции производителя).

2. Стимуляция и сбор слез

  1. Взвесьте каждую мышь индивидуально, чтобы рассчитать подходящую дозировку обработок.
  2. Чтобы стимулировать выработку слезы, введите 30 мг/кг пилокарпина внутрибрюшинно с помощью инсулинового шприца 6 мм (рис. 1B). Подождите 2 минуты после введения препарата, чтобы его эффект проявился.
    Примечание: Данные от нестимулированных животных не могли быть получены из-за ограниченной доступности слезной жидкости.
  3. Соберите слезы, поместив конец каждого фрагмента полоски Ширмера над центром нижнего века с помощью пинцета, и удерживайте его на месте, пока разрыв не достигнет предела полоски (рисунок 1C). Затем замените полоску. Последовательно поместите по 2 полоски Ширмера в каждый глаз с интервалом в 2 минуты между полосками для сбора. Для процесса сбора разрыва требуется около четырех фрагментов полоски в течение 10 минут на одну мышь.
  4. Поместите фрагменты полоски Ширмера в стерильные пробирки на лед, чтобы избежать разложения компонентов. Как только сбор закончится, приступайте к обработке разрыва.

3. Выделение белка

  1. Поместите фрагменты полоски в микроцентрифужную пробирку объемом 600 мкл, содержащую 20 мкл стерильной воды с ингибитором протеазы, и центрифугируйте в течение 1 ч при 600 x g при 4 °C, как показано ранее17 (рис. 1D).
  2. Сделайте прокол с помощью инъекторной иглы из нержавеющей стали диаметром 7,5 см на кончике пробирки объемом 600 мкл, содержащей образец (рис. 1E). Затем перенесите эту проколотую пробирку в новую стерилизованную пробирку объемом 1,5 мл и центрифугируйте образцы при 12 000 x g в течение 10 минут при 4 °C, как сообщалось ранее17, чтобы восстановить объем разбавленных слез. Объем слезной пленки (надосадочная жидкость) будет находиться на дне пробирки.
  3. Создайте белковый пул, объединив надосадочную жидкость, извлеченную из всех образцов. В этом эксперименте был получен общий объем около 200 μл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выработка слез может длиться более 1 часа. За это время еще можно собрать слезы.
  4. Количественно измерьте общее содержание белка в слезном бассейне с использованием стандартного метода Брэдфорда22.

4. Анализ SDS-PAGE

  1. Нагрейте образцы белка при температуре 99 °C в течение 4 минут, чтобы денатурировать белки. Кратковременно смешайте образцы с помощью вихря, чтобы смешать компоненты.
  2. Загрузите 30 г количественно определенного содержания белка из каждого образца в 10% гель SDS-PAGE (Таблица 1) и запустите образцы при напряжении 90 В в течение 2 ч, используя стандартный метод23.
  3. После электрофореза покрыть гель раствором для окрашивания (Таблица 1) и инкубировать в течение 30 минут для окрашивания белков.
  4. Смойте гель раствором для снятия краски несколько раз, пока фон не станет ясным и не будут видны белковые полосы.
  5. Получение изображений с помощью системы документирования геля.

5. Выделение мРНК для количественной ПЦР и цифровой ПЦР

  1. Поместите полоски в микроцентрифужную пробирку объемом 600 мкл, содержащую 20 мкл стерильной воды. Сделайте прокол на кончике пробирки, содержащей образец, поместите его в новую стерилизованную пробирку объемом 1,5 мл и центрифугируйте, как сообщалось ранее в статье «Слезы человека»3, в течение 20 минут при температуре 2000 x g при 4 °C (рисунок 1E-H).
  2. Создайте пул из всех образцов. Восстановленный объем этого эксперимента составил примерно 22 мкл надосадочной жидкости на каждую мышь, т.е. 66 мкл общего объема. Поместите пробирки на сухой лед, чтобы избежать деградации биомолекул.
  3. Добавьте 200 мкл монофазного раствора фенола и изотиоцианата гуанидиния (коммерчески полученного) и гомогенизируйте пипетированием. Дать постоять 5 минут при комнатной температуре. На этом этапе образцы могут храниться при температуре -20 °C в течение нескольких недель или при -70 °C в течение нескольких месяцев.
  4. Добавьте 40 μл хлороформа и перемешайте в вихре в течение 15 с. Дать постоять 2 минуты при комнатной температуре. Центрифуга при 10 000 x g в течение 15 мин при 4°C.
  5. Осторожно перенесите водную фазу (не беря интерфазу) в новую пробирку объемом 1,5 мл.
  6. Добавьте 0,5 мкл гликогена (0,05 мкг/мкл) к 100 мкл изопропанола и перемешайте с помощью пипетирования. Гликоген осаждается совместно с РНК и не препятствует последующим этапам.
  7. Дать постоять 10 минут при температуре -20 °C. Центрифуга при давлении 10 000 x g в течение 10 мин при 4 °C. Быстро сцедите надосадочную жидкость.
  8. Добавьте 200 μл холодного 75% этанола и ресуспендируйте РНК-гранулу путем вортексирования. Центрифугируйте при 8 000 x g в течение 5 минут при 4 °C.
  9. Сцедите этанол. Не переворачивая трубку, дайте ей высохнуть на воздухе в течение 20-30 минут. Добавьте 20 μл воды, не содержащей РНКазы, и восстановите.
  10. Продолжайте считывать оптическую плотность в микрообъемном спектрофотометре на длинах волн 260 нм и 280 нм для оценки чистоты РНК. Образцы должны находиться на льду.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рибосомные полосы 28S и 18S не могут наблюдаться с использованием агарозного геля из-за особенностей образца. Присутствие других РНК, таких как микроРНК или мРНК, может быть проанализировано с помощью биоанализатора, как показано ранее18.
  11. Синтезируйте кДНК из РНК слез с помощью коммерческого набора в соответствии с протоколом производителя.
    1. Начните с входной РНК в диапазоне от 10 нг до 5000 нг; В зависимости от используемого набора смешайте его с 1 μL Oligo (dT) и до 12 μL воды, не содержащей РНКазы. Вращайте его при температуре 500 x g в течение 30 секунд и инкубируйте при температуре 65 °C в течение 5 минут.
    2. Добавьте в смесительную пробирку 4 мкл 5x реакционного буфера, 1 мкл ингибитора РНКазы, 2 мкл смеси dNTP и 1 мкл обратной транскриптазы.
    3. Вращайте трубку при давлении 500 x g в течение 30 с, чтобы вытянуть смесь вниз. Затем инкубируйте пробирку при температуре 42 °C в течение 60 минут. Завершите реакцию, инкубируя пробирку при 70 °C в течение 10 минут.
  12. Из-за низкой концентрации мРНК в слезах рекомендуется использовать неразбавленную кДНК для кПЦР24. Для этого эксперимента было использовано 150 нг кДНК. Проведите кПЦР с использованием праймеров DNMT3a :
    Вперед: GCCGAATTGTGTGTCTTGGTGGATGACA, обратно: CCTGGTGGAATGCACTGCAGAAGGA и грунтовки GAPDH :
    Вперед: ACTGGCATGGCCTTCCGTGTCTTA, задний ход: TCAGTGTAGCCCAAGATGCCCTTC в соответствии с инструкциями производителей и процедурами работы оборудования.
    1. Для цикла количественной ПЦР используйте следующую программу: Начальная денатурация: 95 °C в течение 10 мин, затем 45 циклов C 95°C - 15 с, 60 °C - 30 с и 72 °C - 30 с, заканчиваются окончательным продлением при 72 °C в течение 5 мин.
    2. Выполните анализ кривой расплава, чтобы оценить наличие димеров праймера или неспецифических ампликонов в реакции. Температурное нарастание начиналось от 50 °C до конечных 99 °C, с начальным удержанием 90 с для первого шага и удержанием 5 с между каждым шагом.
    3. Для дПЦР25 выполните серийные разведения, чтобы оптимизировать количество кДНК, необходимое для обнаружения интересующей мРНК. В этом эксперименте используются следующие разведения кДНК в воде, не содержащей нуклеаз: 150 нг, 75 нг, 37,5 нг и 18,75 нг кДНК. Использовались ранее упомянутые грунтовки для DNMT3a . Для цикла дПЦР используйте следующую программу: начальная денатурация: 95 °C в течение 2 мин, затем 40 циклов 95 °C - 15 с и 60 °C - 30 с.

Результаты

Протокол, описанный в данной статье, представляет собой простой и доступный метод получения молекулярной информации из слезной жидкости с использованием методов, обычно доступных в большинстве лабораторий молекулярной биологии. Кроме того, протокол может быть масштабирован за счет использования высокочувствительных методов, таких как ИФА для обнаружения ферментативной активности.

После этих процедур общий выход белка составил примерно 3-4 мкг/мкл. Анализ общих белковых экстрактов, окрашенных Кумасси, показал закономерности экспрессии белка в общей сетчатке и слезах (Рисунок 2A).

Изолированная РНК имела коэффициент поглощения УФ-излучения 260/280 от 1,9 до 2,0. Средний выход составил 134,8 нг/мкл. КПЦР проводили с использованием наборов праймеров для гена хозяйствования (глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа, GAPDH)3 и предполагаемого гена биомаркера (ДНК-метилтрансфераза 3a, DNMT3a)26. Использовали неразбавленный образец кДНК 1:1 (150 нг).

Был проведен анализ кривой плавления и рассчитаны скорости Ct в программном обеспечении для количественной ПЦР. Все эксперименты проводились в двух экземплярах. Анализ показал значения Ct от 20 до 24, что является подходящим диапазоном начального количества целевой мРНК в образце (рис. 2B). Тем не менее, анализ кривой расплава на рисунке 2C свидетельствует о низком присутствии мРНК-мишени. Тем не менее, 2% агарозный гель подтвердил присутствие ампликонов в ожидаемом размере (Рисунок 2D).

ДПЦР проводили с использованием той же пары наборов праймеров для DNMT3a. Разведение образцов кДНК было 1:1 (150 нг), 1:2 (75 нг), 1:4 (37,5 нг), 1:8 (18,75 нг). Все эксперименты проводились в двух экземплярах. Методом дПЦР удалось обнаружить от 1,33 копий/мкл в неразбавленном образце до 0,45 копий/мкл в 8-кратно разведенном образце (рис. 3A,3B). Таким образом, дПЦР показала повышенную чувствительность к целевой мРНК, присутствующей в слезах, по сравнению с кПЦР.

figure-results-1
Рисунок 1: Схема протокола извлечения слезы у мышей. (а) Сбор слез. Были использованы три 2-месячные мыши C57BL/6J. (B) Выработка слезы была фармакологически индуцирована внутрибрюшинным введением пилокарпина. Фотография, иллюстрирующая размещение полосы Ширмера. (c) Обработка разрыва. Затем разрывы собирали с помощью полосок Ширмера в течение 10 минут и переносили в микроцентрифужные пробирки. (D) Слезы, собранные в полосках Ширмера, центрифугировали стерильной водой и ингибиторами протеазы или просто стерильной водой. (Е, Ж) Эти пробирки были перфорированы на дне и впоследствии перенесены в новую стерилизованную пробирку объемом 1,5 мл для облегчения вытекания жидкости. (Г, Ч) Слезы собираются в 1,5 мл пробирки. (I) Репрезентативная фотография процедуры сбора слез. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2: Последующий анализ слезной пленки для молекулярного применения. (A) SDS-PAGE о слезах мыши и экстракте белка сетчатки. MW: Маркер молекулярной массы; дорожка 1: Белковые профили сетчатки (30 мкг); Дорожка 2: белковые профили слез (30 мкг). (B) количественной ПЦР для GAPDH и DNMT3a у слез мышей. Средние значения КТ и ΔКТ приведены в таблице 2. (C) Анализ кривой плавления для ПЦР-продуктов DNMT3a и GAPDH . Ось Y представляет скорость изменения флуоресценции в реакции амплификации (dF/dT), а ось x представляет температуру в °C (D) Анализ ампликона ПЦР при электрофорезе 2% агарозного геля, содержащем 0,5 мкг/мл бромида этидия. Дорожка M: 1 kb Plus DNA Ladder. Дорожка 1,2: GAPDH и DNMT3a ПЦР ампликон соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-3
Рисунок 3: Цифровая ПЦР (dPCR) для экспрессии DNMT3a в слезах мышей. (A) Результаты dPCR отображаются в виде 1D-диаграммы рассеяния, показывающей синими точками копии транскриптов DNMT3a . Черные точки — это разделы без копий транскриптов DNMT3a . (B) Был сгенерирован ряд разбавлений кДНК для определения оптимальной концентрации для количественного определения копий транскриптов DNMT3a . Полосы погрешностей представляют собой стандартное отклонение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Наименование материалаОписание
10% гель SDSНа один разделительный гель: 3,8 мл дистиллированной H2O; 2,6 мл Триса; рН 8,8; 1,5 М 3,4 мл акриламида; 100 мкл 10% SDS; 100 мкл 10% APS; 4 мкл TEMED.
На один гель для сбора: 2,72 мл дистиллированного H2O, 0,52 мл Tris; рН 6,8; 1,5 М 0,68 мл акриламида, 40 мкл 10% SDS, 40 мкл 10% APS 4 μл TEMED.
Буфер для электрофореза250 мМ трис-основание, 2 М глицин, 1% SDS
Раствор для окрашиванияВ 43 мл воды растворить следующие реагенты (хранить при комнатной температуре в янтарной бутылке): Кумасси 0,25 г; уксусная кислота 7 мл; метанол 50 мл
Раствор для удаления пятенВ 63 мл воды растворить следующие реагенты (хранить при комнатной температуре): уксусная кислота 7 мл; этанол 30 мл

Таблица 1. Настройка для SDS-Page.

Название генаСТ1СТ2Среднее с SDΔКТ
ГАПДХ20.1420.7320.44±0.17
DNMT3a24.5924.9724,78±0,074.35

Таблица 2. Ct-значения DNMT3a и GAPDH в слезах мышей.

Обсуждение

Слезная жидкость легко доступна, и определение биомаркеров в слезах может быть использовано в качестве успешного дополнительного метода для ранней диагностики различных заболеваний человека. В то время как биохимический анализ состава слезы на экспериментальных животных моделях дополняет этот подход и обещает значительный прогресс в понимании молекулярных основ заболеваний, существует нехватка доступных данных и протоколов, что привело нас к их разработке. Метод, описанный в этом отчете, технически прост в исполнении и позволяет предварительно идентифицировать дифференциальную экспрессию различных молекул-кандидатов, ассоциированных с заболеванием.

Сбор отрыва может быть достигнут с помощью различных методов, таких как капиллярные трубки и полоскиШирмера 16,17, тампоны28и губки29. Метод полосок Ширмера был выбран из-за его легкодоступности, количественных возможностей, адаптируемости при отборе проб, стоимости и простоты извлечения отрывных компонентов для лабораторной обработки. Кроме того, этот метод является экономически эффективным, малоинвазивным и не представляет риска травмирования или повреждения роговицы, благодаря составу бумажной фильтрующей полоски16,17. Важнейшие этапы этого протокола включают необходимость фармакологической стимуляции выработки слезы с помощью пилокарпина и выбор подходящего буфера для элюирования.

Пилокарпин является холинергическим агонистом, который связывается с мускариновыми рецепторами M3 и может вызывать фармакологическую стимуляцию экзокринных желез, усиливая выработку слезы, секрецию слюны и мочеиспускание. Хотя исследования на людях показали, что стимуляция слезами не изменяет осмолярность собранной жидкости30, она явно влияет на белковые профили31. Применение пилокарпина в качестве холинергического фармакологического стимулятора экзокринных желез и усилителя секреции слез было успешно описано у кроликов и мышей 19,32,33, но влияние стимуляции на содержание белка не оценивалось. Чтобы избежать этого ограничения и обеспечить точное сравнение профилей разрыва в экспериментальных условиях, крайне важно учитывать конкретные настройки коллекции. Аналогичным образом, введение этапа промывания перед сбором слезы может быть полезным, чтобы избежать предварительного загрязнения поверхности глаза. В этом протоколе использовалась концентрация пилокарпина 30 мг/кг13. Поскольку мыши оставались неподвижными и спокойными после инъекции этого препарата, слезы собирались без какой-либо анестезии, что облегчало сбор образцов.

Выбор подходящего элюирующего буфера тесно связан с выбранным методом анализа биохимического состава слезного образца и скорости извлечения биологического материала из полоски. Например, в сравнительном исследовании, посвященном удержанию белка из полосок Ширмера у пациентов, было установлено, что буфер, содержащий 100 мМ бикарбоната аммония вместе с 0,25% Nonidet P40 (NP40), дает превосходные результаты для протеомики или мультиплексного анализа методом ИФА17. В наших руках использование стерильной воды оказалось достаточным для визуализации общих белковых экстрактов в SDS-PAGE и для обнаружения мРНК интересующих генов методом ПЦР.

Чтобы оценить присутствие мРНК DNMT3a и GAPDH в слезах мышей, мы сравнили эффективность количественной ПЦР и дПЦР. Присутствие димеров праймеров, наблюдаемое на кривой плавления кПЦР, объясняется низким содержанием транскрипта DNMT3a . Как показано, дПЦР обладает значительно большей чувствительностью и эффективностью в обнаружении целевой мРНК в этих образцах в неразбавленных и разбавленных образцах. Эта возможность точного обнаружения делает dPCR предпочтительным методом анализа слезы у мышей, предлагая исследователям и клиницистам надежный инструмент для будущих исследований и потенциального клинического применения.

Разработка стандартизированного протокола для сбора образцов слезы на животных моделях представляет собой значительный прогресс в исследованиях. Этот протокол не только облегчает систематический и точный сбор образцов слезы, но и открывает широкие возможности для их применения в различных областях исследований. Возможность получения образцов слезы на животных моделях позволяет исследовать широкий спектр заболеваний и состояний, а также исследовать новые биомаркеры и потенциальные методы лечения. Кроме того, создание стандартизированного протокола способствует воспроизводимости результатов в различных исследованиях и лабораториях, тем самым способствуя достоверности и надежности исследований. В конечном счете, этот прогресс в методологии сбора образцов слезы на животных моделях может привести к важным открытиям и улучшить понимание патофизиологии различных заболеваний, открывая новые возможности для диагностики, лечения и профилактики.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана VELUX STIFTUNG [проект 1852] для M.L. и грантами для аспирантов от CONAHCYT M.B. (836810), E.J.M.C. (802436) и A.M.F (CVU 1317418). Выражаем искреннюю благодарность всем сотрудникам лаборатории, Centro de Investigación sobre el Envejecimiento и Departamento de Farmacobiología (Cinvestav) за их вклад в стимулирующие дискуссии.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
2-меркаптоэтанолGibco1985023
2x буфер LaemmliБио-Рад16-0737
Уксусная кислотаКимика Мейер64-19-7
АкриламидСигма-ОлдричА4058
Реагент БрэдфордСигма-ОлдричВ6916
ХлороформСигма-Олдрич1003045143
Кумасси Блю Р 250Биологическая наука США6104-59-2
ЭтанолКимика Рике64-17-5
GeneRuler 1kb plus DNA LadderThermofisher scientificСМ1331
ГлицеринБиологическая наука СШАГ8145
ГлицинСАНТА-КРУССК-29096
ГликогенРош10901393001
Список совместимого оборудованияКимика Рике7647-01-0
Изопропиловый спиртКимика Рике67-63-0
МетанолКимика Мейер67-56-1
Микропробирки 1,5 млАксигенMCT-150-C
Микропробирки 600 & микро; lАксигенMCT-060-C
NaClСигма-ОлдричС3014
ПЦР-пробирки и ПолосыНовасбиоПЦР 0104
ПилокарпинСигма-ОлдричП6503-10г
Ингибитор протеазыРош11873580001
QIAcuity EvaGreen PCR Kit (5 мл)Цягэн250112
QIAcuity Нанопластина 26k 24 лунки (10)Цягэн250001
Real qPlus 2x Master Mix ЗеленыйАмпликонA323402
Набор для синтеза кДНК RevertAid First StradThermofisher scientificК1622
Тест-полоски ШирмераЛаборатория СантгарSANT1553
Паспорт безопасностиСигма-ОлдричЛ3771
ТЕМЕДСигма Олдрич102560430
Реагент TRIСигма-ОлдричТ9424-200МЛМонофазный раствор фенола и изотиоцианата гуанидиния
ТрисБиологическая наука СШАТ8650
База TrisХим КрузСК-3715А

Ссылки

  1. Ravishankar, P., Daily, A. Tears as the next diagnostic biofluid: A comparative study between ocular fluid and blood. Appl Sci. 12 (6), 2884(2022).
  2. Masoudi, S. Biochemistry of human tear film: A review. Exp Eye Res. 220, 109101(2022).
  3. Dara, M., et al. Novel RNA extraction method from human tears. Mol Biol Res Commun. 11 (4), 167-172 (2022).
  4. Amorim, M., et al. Putative biomarkers in tears for diabetic retinopathy diagnosis. Front Med (Lausanne). 9, 873483(2022).
  5. Arslan, M. A., et al. Expanded biochemical analyses of human tear fluid: Polyvalent faces of the Schirmer strip. Exp Eye Res. 237, 109679(2023).
  6. Liu, R., et al. Analysis of th17-associated cytokines and clinical correlations in patients with dry eye disease. PloS one. 12 (4), e0173301(2017).
  7. Cross, T., et al. Rna profiles of tear fluid extracellular vesicles in patients with dry eye-related symptoms. Int J Mol Sci. 24 (20), 15390(2023).
  8. Paranjpe, V., Phung, L., Galor, A. The tear film: Anatomy and physiology. Ocular Fluid Dyn: Anat, Physiol, Imaging Tech, and Math Model. , 329-345 (2019).
  9. Jung, J. H., et al. Proteomic analysis of human lacrimal and tear fluid in dry eye disease. Sci Rep. 7 (1), 13363(2017).
  10. Di Zazzo, A., Micera, A., De Piano, M., Cortes, M., Bonini, S. Tears and ocular surface disorders: Usefulness of biomarkers. J Cell Physiol. 234 (7), 9982-9993 (2019).
  11. Von Thun Und Hohenstein-Blaul, N., Funke, S., Grus, F. H. Tears as a source of biomarkers for ocular and systemic diseases. Exp Eye Res. 117, 126-137 (2013).
  12. Pieczynski, J., Szulc, U., Harazna, J., Szulc, A., Kiewisz, J. Tear fluid collection methods: Review of current techniques. Eur J Ophthalmol. 31 (5), 2245-2251 (2021).
  13. Shiraki, T., Shigeta, M., Tahara, N., Furukawa, H., Ohtsuka, H. A tear production assessment by using Schirmer tear test strips in mice, rats and dogs. Animal Eye Res. 24 (1-2), 1-5 (2005).
  14. Zhao, J., Nagasaki, T. Lacrimal gland as the major source of mouse tear factors that are cytotoxic to corneal keratocytes. Exp Eye Res. 77 (3), 297-304 (2003).
  15. Khanna, R. K., et al. Metabolomics and lipidomics approaches in human tears: A systematic review. Surv Ophthalmol. 67 (4), 1229-1243 (2022).
  16. Bachhuber, F., Huss, A., Senel, M., Tumani, H. Diagnostic biomarkers in tear fluid: From sampling to preanalytical processing. Sci Rep. 11 (1), 10064(2021).
  17. Koduri, M. A., et al. Optimization and evaluation of tear protein elution from Schirmer's strips in dry eye disease. Indian J Ophthalmol. 71 (4), 1413-1419 (2023).
  18. Kakan, S. S., et al. Tear miRNAs identified in a murine model of sjogren's syndrome as potential diagnostic biomarkers and indicators of disease mechanism. Front Immunol. 13, 833254(2022).
  19. Moore, M., Ma, T., Yang, B., Verkman, A. Tear secretion by lacrimal glands in transgenic mice lacking water channels aqp1, aqp3, aqp4 and aqp5. Exp Eye Res. 70 (5), 557-562 (2000).
  20. Balafas, E., et al. A noninvasive ocular (tear) sampling method for genetic ascertainment of transgenic mice and research ethics innovation. OMICS. 23 (6), 312-317 (2019).
  21. Nakagawa, A., Nakajima, T., Azuma, M. Tear miRNA expression analysis reveals mir-203 as a potential regulator of corneal epithelial cells. BMC Ophthalmol. 21 (1), 377(2021).
  22. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
  23. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning: A laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).
  24. RealQPlus2x Master Mix Green without ROX. Ampliqon. , Available from: https://ampliqon.com/en/pcr-enzymes/pcr-enzymes/real-time-pcr/realq-plus-2x-master-mix-green (2023).
  25. Qiagen. Quick-Start Protocol QIAcuity EG PCR Kit. Qiagen. , (2023).
  26. Anier, K., Malinovskaja, K., Aonurm-Helm, A., Zharkovsky, A., Kalda, A. DNA methylation regulates cocaine-induced behavioral sensitization in mice. Neuropsychopharmacology. 35 (12), 2450-2461 (2010).
  27. Hagan, S., Martin, E., Enriquez-De-Salamanca, A. Tear fluid biomarkers in ocular and systemic disease: Potential use for predictive, preventive, and personalized medicine. EPMA J. 7 (1), 15(2016).
  28. Gasparini, M. S., et al. Identification of sars-cov-2 on the ocular surface in a cohort of covid-19 patients from Brazil. Exp Biol Med. 246 (23), Maywood. 2495-2501 (2021).
  29. Sebbag, L., Harrington, D. M., Mochel, J. P. Tear fluid collection in dogs and cats using ophthalmic sponges. Vet Ophthalmol. 21, 249-254 (2018).
  30. Abusharha, A. A., et al. Analysis of basal and reflex human tear osmolarity in normal subjects: assessment of tear osmolarity. Ther Adv Ophthal. 10, 2515841418794886(2018).
  31. Fullard, R. J., Snyder, C. Protein levels in nonstimulated and stimulated tears of normal human subjects. Inves Opht Vis Sci. 31 (6), 1119-1126 (1990).
  32. Longwell, A., Birss, S., Keller, N., Moore, D. Effect of topically applied pilocarpine on tear film pH. J Pharm Sci. 65 (11), 1654-1657 (1976).
  33. Dartt, D. A. Neural regulation of lacrimal gland secretory processes: relevance in dry eye diseases. Prog Ret Eye Res. 28 (3), 155-177 (2009).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

SDS PAGE

Похожие статьи