Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Системы AAV и мышиные модели для исследования эктопической экспрессии Neurod1 в трансдуцированных клетках при подостром и хроническом периоде постишемического инсульта

1.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/66965

⸱

29 ноября 2024 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, Division of Anatomy, University of Toronto, 2Institute of Medical Science, University of Toronto, 3Institute of Biomedical Engineering, University of Toronto, 4Donnelly Centre for Cellular and Biomedical Research, University of Toronto

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол описывает вирус-опосредованную эктопическую экспрессию Neurod1 после кортикального ишемического инсульта. Neurod1 доставляется (1) с помощью системы Cre-Flex AAV мышам дикого типа во время подострой фазы после инсульта (7 дней) и (2) с использованием одного вектора AAV у мышей условного репортера во время хронической фазы после инсульта (21 день).

Аннотация

Эктопическая экспрессия нейрогенных факторов in vivo стала многообещающим подходом для замены утраченных нейронов в моделях заболеваний. Широко сообщалось об использовании нейронных основных факторов транскрипции спираль-петля-спираль (bHLH) через нераспространяющиеся вирусоподобные системы частиц, включая ретровирус, лентивирус и аденоассоциированный вирус (AAV). Для экспериментов in vivo AAV все чаще используются из-за их низкой патогенности и потенциала для перевода. Этот протокол описывает две системы AAV для исследования эктопической экспрессии факторов транскрипции в трансдуцированных клетках после ишемического инсульта. В обеих системах экспрессия Neurod1 контролируется коротким промотором GFAP (gfaABC(1)D), который активируется в реактивных астроцитах после инсульта, а также в эндогенных нейронах в сочетании с экспрессией нейрогенного фактора. В описанной модели ишемического инсульта фокальная ишемия индуцируется путем введения эндотелина-1 (ET-1) в моторную кору головного мозга мышей, создавая поражение, окруженное реактивными GFAP-экспрессирующими астроцитами и выжившими нейронами. Внутримозговые инъекции AAV проводятся для эктопического индуцирования экспрессии Neurod1 в подострой (7 дней) и хронической (21 день) фазах после инсульта. В течение нескольких недель после инъекции AAV у мышей, эктопически экспрессирующих Neurod1, было выявлено значительно большее количество нейронов среди трансдуцированных клеток, по сравнению с мышами, получавшими контрольные вирусы AAV. Используемые стратегии на основе AAV воспроизводили наблюдаемые исходы увеличения числа нейронов, экспрессирующих репортерный ген в модели коркового инсульта легкой и умеренной степени. Этот протокол создает стандартную платформу для изучения эффектов эктопической экспрессии транскрипционных факторов, доставляемых с помощью систем на основе AAV, способствуя пониманию экспрессии нейрогенных факторов в контексте инсульта.

Введение

Инсульт является одной из основных причин инвалидности во всем мире1. Инсульт случается, когда нарушается приток крови к мозгу. Это может произойти либо через геморрагический инсульт (~15% случаев), когда кровеносный сосуд в мозге лопается, либо через ишемический инсульт, когда приток крови к мозгу блокируется1. Наиболее распространены ишемические инсульты, на долю которых приходится ~85% случаев инсульта1. Инсульт снижает доставку глюкозы и кислорода в мозг, что приводит к быстрой гибели нейронных клеток и нарушению нервной функции.

Ишемический инсульт приводит к потере клеток в течение нескольких минут в центре поражения из-за механизмов эксайтотоксичности, окислительного и нитрозативного стресса, дисрегуляции кальция, деполяризации коры головного мозга, отека, нарушения гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) и воспаления 2,3. Клетки в периинфарктных областях подвергаются апоптотической гибели клеток в течение нескольких часов, а в течение нескольких дней после инсульта4. Периинфарктная среда подвергается воздействию про- и противовоспалительных сигналов, которые приводят к активации микроглии и астроцитов («реактивных» астроцитов), которые играют различные роли после травмы 5,6,7,8. Реактивные астроциты претерпевают ряд фенотипических изменений, которые включают в себя повышение регуляции глиального фибриллярного кислого белка (GFAP) и образование границы вокруг поражения в течение нескольких дней после инсульта, что помогает ограничить степень поражения, а также влияет на нейропластичность в поврежденной ткани 8,9,10.

Прямое клеточное перепрограммирование позволяет преобразовывать один тип зрелых клеток в другой тип зрелых клеток, не переходя в плюрипотентное состояние11. Превращение резидентных клеток мозга в новые нейроны для замены тех, которые были утрачены из-за травмы, представляет собой привлекательный путь для восстановления мозга. Инсульт является идеальной мишенью для клеточного лечения, учитывая необходимость терапевтических методов для замены утраченных нейронов, расширения терапевтических временных рамок и, в конечном итоге, содействия функциональному восстановлению. С этой целью было опубликовано множество работ, демонстрирующих перепрограммирование астроцитов в нейроны (AtN) in vitro и in vivo с использованием различных нейрогенных транскрипционных факторов базовой спирали-петли-спирали (bHLH), включая Ascl1, Neurog2, Neurod1 и более поздние мутировавшие версии Ascl1 (Ascl1-SA6), которые продемонстрировали улучшенную эффективность перепрограммирования 11,12,13,14. Важно учитывать множество факторов дизайна эксперимента, которые могут повлиять на результаты, интерпретацию и сравнение между исследованиями. Ghazale et al. продемонстрировали, что эффективность перепрограммирования AtN варьирует между различными линиями мышей, серотипами AAV и промоторами при использовании одного и того же фактора транскрипции bHLH14. Другие факторы, такие как модель травмы, область мозга, дозировка вируса, время доставки генов, фактор перепрограммирования и способ доставки, будут влиять на результаты. Недавние исследования показали, что ранее существовавшие трансдуцированные нейроны были неверно интерпретированы как перепрограммированные нейроны15,16. Несмотря на то, что отчеты не обязательно отрицают факт конверсии AtN, эти исследования подчеркнули важность хорошо контролируемых экспериментов, и в нескольких работах были предложены рекомендации по следующим шагамв этой области. Из литературы очевидно, что эктопическая экспрессия факторов транскрипции bHLH может улучшить функциональные результаты в различных животных моделях нейродегенеративных заболеваний/травм 13,20,21,22,23,24.

В настоящем описании этот протокол Neurod1, представляющий интерес фактор транскрипции, эктопически экспрессируется в трансдуцированных клетках13,22. Использована хорошо зарекомендовавшая себя модель эндотелина-1 (ЭТ-1) ишемического инсульта в сенсомоторную кору головного мозга у взрослых мышей. Введение ЭТ-1 приводит к локальной вазоконстрикции, имитирующей патофизиологию ишемического инсульта, включая функциональные нарушения 22,23,25. Обычно используемый промотор короткого GFAP (gfaABC(1)D) используется для управления эктопической экспрессией Neurod1 в месте повреждения и перилезионной области с использованием двух вирусных стратегий: (1) доставка AAV5-CAG-Flex::GFP+AAV5-GFAP-Neurod1-Cre у мышей дикого типа и (2) доставка AAV5-GFAP-Neurod1-Cre у мышей-репортеров tdTom-Cre. Чтобы лучше понять потенциал эктопической экспрессии Neurod1 в мозге, пострадавшем от инсульта, AAV были введены в подострой фазе (7 дней) или в хронической фазе (21 день) после инсульта. В обеих парадигмах значительно больше меченых нейронов было обнаружено в течение нескольких недель после эктопической экспрессии Neurod1.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Этот протокол был одобрен Комитетом по уходу за животными Университета Торонто и соответствует Руководству по уходу и использованию экспериментальных животных (2-е издание, Канадский совет по уходу за животными, 2017 г.). Для данного исследования были разработаны репортеры дикого типа (C57BL/6J) и трансгенные tdTom-Cre reporter (B6. Использовали мышиные штаммы Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J)22 . Мышам было 7-9 недель, среди них были как самцы, так и самки. Подробная информация об используемых реагентах и оборудовании приведена в Таблице материалов.

1. Хирургия инсульта эндотелина-1

ПРИМЕЧАНИЕ: Все хирургические инструменты и материалы стерилизуются автоклавом перед операцией. Стереотаксическая рама стерилизуется с помощью PREempt. Перед операцией шприцы стерилизуются 70% спиртом PREempt и заполняются стерильным PBS. Эндотелин-1 (ЭТ-1) хранится на льду на протяжении всей операции.

  1. Перед началом операции обустройте зону восстановления, поместив чистую клетку на грелку, установленную на 37 °C. В качестве альтернативы, если используется нагревательная лампа, поместите под тепло только половину клетки.
    1. Чтобы обезболить мышей с помощью изофлурана, следуйте протоколу, утвержденному Комитетом по уходу за животными. Поместите мышь в камеру индукции анестетика и включите кислород до 1-1,5 л/мин, затем отрегулируйте испаритель изофлурана на 3%-5%, чтобы начать анестезию.
  2. Выньте животное из камеры, как только оно ляжет на бок и больше не сможет стоять, и положите его на чистую поверхность. Убедитесь, что животное адекватно обезболито, подтвердив отсутствие рефлекса щипкового рефлекса до и во время операции.
    1. Закрепите на животном носовой конус, выдвинутый из наркозного аппарата, и отрегулируйте изофлуран до 1%-2% для поддержания. Сведите к минимуму воздействие изофлурана (5 мин при 3%-5% для индукции и оставшееся время при 1%-2%), так как процедура может занять до 40 мин.
  3. Используйте триммеры для удаления шерсти животных с шеи / за ушами до носа животного, чтобы обнажить кожу на черепе для операции.
  4. Взвесьте животное и введите соответствующую дозу предоперационного анальгетика подкожно (Мелоксикам (2,0 мг/кг)) в зависимости от веса.
  5. Нанесите мазь-смазку для глаз на каждый глаз мыши, чтобы предотвратить высыхание роговицы во время анестезии.
  6. Простерилизуйте участок кожи, подстриженный шерстью (шаг 1.3) 70% этанолом, а затем дважды добавьте хлоргексидиновый спирт для формирования хирургического поля.
  7. Перенесите мышь на стереотаксическую рамку мыши, сначала поместив ее нос в стереотаксический носовой конус, а затем стабилизируйте череп с помощью ушных планок. Держите мышь на грелке, установленной на 37 °C для тепловой поддержки на протяжении всей процедуры операции. Поддерживайте изофлуран на уровне 1%-2%, чтобы мышь демонстрировала частоту дыхания 1 вдох/с.
  8. При необходимости повторите нанесение смазки для глаз, чтобы предотвратить высыхание роговицы во время процедуры. Наложите стерильную хирургическую простыню на тело мыши, ниже ушей, чтобы увеличить размер стерильного поля.
  9. Сделайте вертикальный разрез параллельно сагиттальной плоскости животного из-за средней точки глаз до затылка (теменной кости) лезвием скальпеля #10. Обнажите череп, осторожно втягивая кожу к бокам.
  10. Используйте ватную палочку, чтобы разрушить фасцию на черепе и дать черепу высохнуть, чтобы обнажить брегму.
  11. Установите манипуляторы с держателем дрели, несущим высокоскоростную стереотаксическую дрель с сверлом калибра .018 дюйма.
  12. Просверлите 3 отверстия для заусенцев (диаметр 0,018 дюйма) высокоскоростным стереотаксическим сверлом в координатах в правой сенсомоторной коре на расстоянии 2,25 мм латерально к брегме и +0,0 мм рострально, +1,0 мм рострально и -1,0 мм каудально к брегме.
  13. Замените дрель шприцем 26 г с иглой длиной 0,375 дюйма.
  14. Загрузите в шприц 1,5 мкл 400 мкМ ЭТ-1, растворенного в стерильном PBS. Чтобы обеспечить хороший поток, выпустите небольшой объем ET-1 до тех пор, пока на кончике иглы не будет наблюдаться капля. Используйте стерильную ватную палочку, чтобы стереть излишки перед выполнением инъекции.
  15. Опустите кончик иглы мимо черепа в среднее отверстие для заусенцев (в правой сенсомоторной коре на +0,0 спереди и 2,25 мм латерально к брегме), не прокалывая твердую мозговую оболочку. После выравнивания опустите иглу на 1 мм в мозг.
  16. Введите 1 мкл ET-1, дозируя 0,1 мкл за один раз. Протолкните поршень шприца Hamilton вперед, чтобы выдать 0,1 μл, и подождите минуту, прежде чем вводить следующие 0,1 μл, вводите, пока не будет выдан 1 μл.
    1. После того, как последние 0,1 мкл были выданы (0,1 мкл x 10 инъекций = 1 мкл всего), удерживайте иглу на месте в течение 10 минут, чтобы предотвратить обратный поток, а затем медленно отведите иглу вверх, чтобы извлечь шприц.
  17. Чтобы игла не засорилась во время инъекции, отпустите небольшой объем ET-1 до тех пор, пока на кончике иглы не будет наблюдаться капля. Используйте стерильную ватную палочку, чтобы стереть излишки перед выполнением инъекции. Стерилизуйте шприцы перед введением следующему животному препарата PREempt, затем 70% спирта, а затем стерильного PBS.
  18. Чтобы закрыть рану, сшите вышележащую кожу на черепе вместе с помощью стерильного шва из полисорба из полиэстера 4-0.
  19. Вводите мазь с антибиотиком с помощью ватного тампона на зашитую область для профилактики послеоперационной инфекции.
  20. Извлеките мышь из стереотаксической рамки и перенесите ее в чистую, предварительно нагретую клетку для животных в зоне восстановления. Выключите испаритель изофлурана и кислород.
  21. Держите клетку на грелке в течение всего времени восстановления после анестезии. В качестве альтернативы, если вы используете нагревательную лампу, поместите мышь сбоку клетки под лампой, чтобы мышь могла переместиться на холодную сторону клетки, когда она просыпается от анестезии, чтобы предотвратить перегрев. Следите за мышью, как она выйдет из наркоза в течение следующих 5-10 минут.
  22. Наблюдайте за мышью в течение следующих 3 дней (контроль веса), обеспечивайте послеоперационный уход (влажное пюре для обеспечения гидратации) и обезболивающие средства (2 мг/кг мелоксикама, 2 раза в день подкожно, в течение 2-3 дней) в соответствии с правилами, установленными местным комитетом по уходу за животными.

2. Доставка аденоассоциированного вируса (AAV) (7 дней - подострая модель или 21 день - хроническая модель) после инсульта

ВНИМАНИЕ: Обратитесь к институциональным рекомендациям по биобезопасности для работы с AAV. В соответствии с рекомендациями Университета Торонто, эта операция проводится в шкафу биобезопасности уровня 2.

ПРИМЕЧАНИЕ: Все хирургические инструменты и материалы стерилизуются автоклавом перед операцией. Стереотаксическая рама стерилизуется с помощью PREempt. Шприцы стерилизуются PREempt, 70% спиртом, и грунтуются стерильным PBS. AAV хранятся на льду на протяжении всей операции.

  1. Перед началом операции обустройте зону восстановления, поместив чистую клетку на грелку, установленную на 37 °C. В качестве альтернативы, если используется нагревательная лампа, поместите под тепло только половину клетки.
    1. Чтобы обезболить мышей с помощью изофлурана, поместите мышь в камеру индукции анестетика и включите кислород до 1-1,5 л/мин, затем отрегулируйте испаритель изофлурана на 3-5% для начала анестезии (в соответствии с утвержденными институцией протоколами).
  2. Извлеките животное из камеры, как только оно ляжет на бок и больше не сможет стоять на чистой поверхности. Убедитесь, что животное адекватно обезболито, подтвердив отсутствие рефлекса щипкового рефлекса до и во время операции.
    1. Закрепите на животном носовой конус, выдвинутый из наркозного аппарата, и отрегулируйте изофлуран до 1%-2% для поддержания. Сведите к минимуму воздействие изофлурана (5 мин при 3%-5% для индукции и оставшееся время при 1%-2%), так как процедура может занять до 40 мин.
  3. Взвесьте животное и введите соответствующую дозу предоперационного анальгетика подкожно (Мелоксикам (2,0 мг/кг)) в зависимости от веса.
  4. Нанесите мазь-смазку для глаз на каждый глаз мыши, чтобы предотвратить высыхание роговицы под анестезией.
  5. Простерилизуйте участок кожи, подстриженный мехом, 70% этанолом, а затем дважды добавьте хлоргексидиновый спирт, чтобы сформировать хирургическое поле.
  6. Перенесите мышь на стереотаксическую рамку мыши, сначала поместив ее нос в стереотаксический носовой конус, а затем стабилизируйте череп с помощью ушных планок. Держите мышь на грелке, установленной на 37 °C для тепловой поддержки на протяжении всей процедуры операции. Поддерживайте изофлуран на уровне 1-2%, чтобы мышь демонстрировала частоту дыхания 1 вдох/с.
  7. При необходимости повторите нанесение смазки для глаз, чтобы предотвратить высыхание роговицы во время процедуры. Наложите стерильную хирургическую простыню на тело мыши, ниже ушей, чтобы увеличить размер стерильного поля.
  8. Если они все еще присутствуют, разрежьте швы хирургическими ножницами и удалите струп с помощью щипцов. Втяните кожу, чтобы обнажить череп.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для хронической модели может потребоваться иссечение кожи с помощью лезвия скальпеля #10.
  9. Используйте стерильную ватную палочку, чтобы высушить череп и найти отверстия от заусенцев.
  10. Установите манипуляторы стереотаксического аппарата с иглодержателем, несущим шприц 26 г с иглой длиной 0,375 дюйма.
  11. Загрузите в шприц 3,4 мкл AAV (1 x 109 копий генома(GC)/мкл для острого исследования; 1 x10 10 GC/мкл для хронического исследования). Чтобы обеспечить хороший поток, выпустите небольшой объем AAV до тех пор, пока на кончике иглы не будет наблюдаться капля. Используйте стерильную ватную палочку, чтобы стереть излишки перед выполнением инъекции.
  12. Опустите кончик иглы мимо черепа в первое отверстие для заусенцев, используемое для ET-1 (в правой сенсомоторной коре на + 0,0 спереди и 2,25 мм латеральнее брегмы), не прокалывая твердую мозговую оболочку. После выравнивания опустите иглу на 1 мм в мозг. (0 AP, +2.25 ML, −1.0 DV от bregma).
  13. Введите 1 мкл AAV (1 x 109 GC/μL для исследования в острой ситуации; 1 x10 10 GC/μL для исследования в условиях хронической болезни) по 0,1 мкл за один раз. Толкните поршень шприца Гамильтона вперед, чтобы выдать 0,1 μл, и подождите минуту, прежде чем вводить следующие 0,1 μл; вводите до тех пор, пока не будет выдан 1 μл. После того, как последние 0,1 мкл были выданы (0,1 мкл x 10 инъекций = 1 мкл всего), удерживайте иглу на месте в течение 10 минут, чтобы предотвратить обратный поток, а затем медленно отведите иглу вверх, чтобы извлечь шприц.
  14. Чтобы игла не засорилась во время инъекции, выпустите небольшой объем AAV до тех пор, пока на кончике иглы не будет наблюдаться капля. Используйте стерильную ватную палочку, чтобы стереть излишки перед выполнением инъекции.
  15. Повторите шаги 2.11-2.14 для инъекций AAV в два оставшихся отверстия заусенцев (в правой сенсомоторной коре при +1 AP, +2,25 ML, −1,0 DV; и −1 AP, +2,25 ML, −1,0 DV мм от брегмы). Стерилизуйте шприцы перед введением следующему животному PREempt, затем 70% спиртом и, наконец, стерильным PBS.
  16. Чтобы закрыть рану, сшите вышележащую кожу на черепе вместе с помощью стерильного шва из полисорба из полиэстера 4-0.
  17. Вводите мазь с антибиотиком с помощью ватного тампона на зашитую область для предотвращения послеоперационной инфекции.
  18. Извлеките мышь из стереотаксической рамки и перенесите ее в чистую, предварительно нагретую клетку для животных в зоне восстановления. Выключите испаритель изофлурана и кислород.
  19. Держите мышь внутри клетки и простерилизуйте внешнюю сторону клетки с помощью PREempt и 70% спирта, прежде чем положить ее на грелку для восстановления после анестезии.
    1. В качестве альтернативы, если вы используете нагревательную лампу, поместите мышь на боковой стороне клетки под лампой, чтобы мышь могла переместиться на холодную сторону клетки, когда она просыпается от анестезии, чтобы предотвратить перегрев. Следите за мышью, как она выйдет из наркоза в течение следующих 5-10 минут.
  20. Наблюдайте за мышью в течение следующих 3 дней (контроль веса), обеспечивайте послеоперационный уход (влажное пюре для обеспечения гидратации) и обезболивающие средства (2 мг/кг мелоксикама, 2 раза в день подкожно, в течение 2-3 дней) в соответствии с правилами, установленными местным комитетом по уходу за животными.

3. Препарирование тканей и диссекция

  1. Чтобы усыпить мышь, внутрибрюшинно введите мышь трибромэтанол (авертин) (конк. 12,5 мг/мл, 250 мг/масса тела (кг)) и дайте 2-3 минуты для полной индукции. Убедитесь, что животное адекватно обезболито, вытащив мышь из клетки и подтвердив отсутствие рефлекса защемления пальцев ног.
  2. В вытяжном шкафу проводят транскардиальную перфузию26 физиологическим раствором с последующим добавлением 4% параформальдегида. Опрыскайте голову усыпленного животного 70% этанолом до полного впитывания.
  3. Отрежьте голову у основания черепа с помощью больших ножниц. Разрежьте кожу по средней линии всего черепа с помощью прямых ножниц для радужной оболочки глаза размером 4-1/2 дюйма. Втяните кожу, чтобы обнажить череп.
  4. Из отверстия спинномозговой полости на шее вставьте ножницы радужной оболочки глаза и прорежьте череп по сагиттальному и межлобному шву.
  5. Затем вставьте ножницы в две глазницы и разрежьте лобно-носовой шов.
  6. Будьте особенно осторожны, чтобы не повредить мозг. Вскрывайте пластины черепа влево и вправо, пока мозг не обнажится.
  7. Перенесите мозг в сцинтилляционный флакон с 4% параформальдегидом. Держите мозг в 4% параформальдегиде при 4 °C в течение 4 ч.
  8. Затем мозг криозащищен путем замены 4% параформальдегида на 30% сахарозы. Держите мозг в 30% сахарозе при 4 °C, пока мозг не опустится на дно флакона (~12 часов).

4. Разделка замороженных мозгов

  1. Установите температуру криостатной камеры в диапазоне от -20 °C до -26 °C.
  2. Сделайте корональный разрез поперек мозжечка и прикрепите плоскую каудальную часть мозга к криостатному патрону с оптимальным температурным составом для резки (ОКТ).
  3. Поместите патрон с мозгом в держатель диска и совместите обонятельную луковицу с лезвием ножа.
  4. Разрез мозга на корональные срезы толщиной 20 мкм. Чтобы избежать разводов или царапин на разрезанных срезах мозга, поместите кусок ленты на платформу для разделки, чтобы создать небольшой зазор между пластиной, препятствующей скатыванию, и платформой. Кисть может быть использована для регулировки ориентации секции перед тем, как запечатлеть ее на положительно заряженном стеклянном предметном стекле.
  5. Храните предметные стекла, содержащие срезы мозга, при температуре -20 °C.

5. Иммуногистохимия и количественная оценка

  1. Обработку срезов для иммуногистохимии с использованием первичного антитела против NeuN, паннейронального маркера, в соответствии со стандартными протоколами22,26.
  2. Разморозьте криоконсервированные срезы мозга в течение 5 минут при комнатной температуре. Промойте секции три раза 1x фосфатно-солевой буфером (PBS) в течение 5 минут каждая.
  3. Инкубируйте секции в 0,3% Triton X-100 в PBS в течение 20 минут при комнатной температуре для проникновения.
  4. Приготовьте блокирующий раствор (5% обычной козьей сыворотки и 0,3% Triton X-100 в PBS) и инкубируйте участки в блокирующем растворе в течение 1 ч при комнатной температуре.
  5. Разведите первичное антитело, кроличий анти-NeuN, в соотношении 1:500 в блокирующем растворе. Инкубируйте срезы с первичным раствором антител в течение ночи при температуре 4 °С.
  6. Промойте секции три раза с 0,3% Triton X-100 в PBS, по 5 минут каждая стирка.
  7. Разведите вторичное антитело, козье антитело против кролика 568 или 488, в соотношении 1:1000 в PBS. Инкубируйте срезы с раствором вторичного антитела в течение 1 ч при комнатной температуре, защищенном от света.
  8. Выполните три промывки с 0,3% Triton X-100 в PBS в течение 5 минут каждая. Инкубируйте секции с DAPI (1:10 000 в PBS) в течение 5 минут при комнатной температуре.
  9. Промойте секции еще три раза PBS, по 5 мин каждая. Закрепите витражные секции на предметном стекле с помощью флуоресцентного монтажного носителя и стеклянного покровного стекла. Дайте установленным предметным стеклам высохнуть в течение ночи.
  10. Изображение окрашенных слайдов с помощью 20-кратного объектива с конфокальным микроскопом для получения изображений клеток Reporter+ вокруг поражения инсульта в 3 различных корональных срезах (между анатомическими областями пересечения мозолистого тела спереди и пересечения передней спайки сзади) для каждого животного.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Расстояние распространения AAV будет варьироваться в пределах полушария. Однако, основываясь на нашем опыте и анализе клеток Reporter+ после обработки тканей, разброс AAV обычно составляет примерно от +3 мм до -3 мм от брегмы. Следует количественно определить репортер+клетки вокруг поражения после инсульта (что определяется по отсутствию/редкому окрашиванию NeuN) в области между пересечением мозолистого тела средней линией и передними соединениями спайки.
  11. Для количественного определения трансдуцированных нейронов необходимо провести колокализационный анализ. Вручную подсчитайте количество двойных положительных клеток (Reporter+NeuN+) и общее количество трансдуцированных (Reporter+) клеток в срезах мозга. Для получения результатов в данной работе подсчитывали >3 поля зрения вокруг поражения (медиальное, латеральное и нижнее) из 3 корональных срезов на мышь.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Изучить клеточные исходы экспрессии короткого промотора GFAP (gfaABC(1)D), обусловленной эктопическим Neurod1 в диком типе (C57BL/6J) и в трансгенных репортерных штаммах tdTom-Cre (в частности, B6. Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J)22 две системы на основе AAV5 были использованы у мышей, получивших инсульт ET-1 (рис. 1A-C). В подострой модели инсульта Neurod1 был упакован в систему Cre-Flex AAV и дос...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В этом протоколе подробно описаны две системы AAV и мышиные модели для исследования эктопической экспрессии Neurod1 в контексте модели коркового инсульта ET-1 в легкой и умеренной степени. Ряд критических шагов, связанных с инсультом ET-1, важно учитывать для воспроизводимости и последовательности травмы. Отверстия для заусенцев должны быть тщательно просверлены без прокола твердой мозговой оболочки, чтобы предотвратить непреднамеренную хирургическую травму. Важно использовать п...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана Фондом сердца и инсульта, Институтом регенеративной медицины Онтарио, Канадским фондом передового опыта в области исследований (Medicine by Design, MbD) и премией Connaught Innovation Award (Университет Торонто).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
#77 Сверло (.018")David Kopf Instruments8177
AAV5-GFAP(0.7)-mNeurod1-2A-iCreVector  Biolabs
Рассасывающийся шовный материал с иглой Polysorb™ Полиэстер CV-15 3/8 Круглая игла с конической точкой Размер 4 - 0 ПлетенаяCovidienGL-881
Anti-NeuN антитела (кролик) Millipore SigmaABN78 
C57BL/6 мышейCharles River027
Раствор хлоргексидинаPartnarPCH-020
Contec™   УПРЕЖДЕНИЕ и торговля; Дезинфицирующий раствор RTUFisher Scientific29-636-6212
CryostatThermo Scientific HM525 NX 
Эндотелин 1миллипор Сигма05-23-3800-0,5MG
Перо безопасная бритва Микротомные лезвияПеро12-631P
Fisherbrand  Чехол для стаканов: прямоугольникиFisher Scientific12-545M 
Флуоресцентный монтаж MediumAgilent TechnologiesS3023 
Шприц HamiltonHamilton Company7634-01
Высокоскоростная стереотаксическая дрельDavid Kopf Instruments1474
Metacam Solution (Meloxicam)Boehringer Ingelheim
O.C.T CompoundFisher Scientific23-730-571
pAAV2/5-GFAP-iCreVector BuilderP190924-1001suq
Полидермная мазь USPTARO2181908
SOMNI Scientific™   Грелка для животных FisherScientific04-777-177
Стереотаксические инструментыDavid Kopf InstrumentsМодель 902
Superfrost Plus Предметные стекла для микроскопа, белыйFisherbrand12-550-15
tdTomato Reporter Mice лабораторных животных Jackson Laboratory007914
V-1VetEquip901806
Настольная система анестезии

Ссылки

  1. GBD 2016 Stroke Collaborators. Global, regional, and national burden of stroke, 1990-2016: A systematic analysis for the global burden of disease study 2016. Lancet Neurol. 18 (5), 439-458 (2016).
  2. Iadecola, C., Buckwalter, M. S., Anrather, J. Immune responses to stroke: Mechanisms, modulation, and therapeutic potential. J Clin Invest. 130 (6), 2777-2788 (2020).
  3. Kuriakose, D., Xiao, Z. Pathophysiology and treatment of stroke: Present status and future perspectives. Int J Mol Sci. 21 (20), 7609(2020).
  4. Fifield, K. E., Vanderluit, J. L. Rapid degeneration of neurons in the penumbra region following a small, focal ischemic stroke. Eur J Neurosci. 52 (4), 3196-3214 (2020).
  5. Burda, J. E., Sofroniew, M. V. Reactive gliosis and the multicellular response to CNS damage and disease. Neuron. 81 (2), 229-248 (2014).
  6. Kowalczyk, A., Kleniewska, P., Kolodziejczyk, M., Skibska, B., Goraca, A. The role of endothelin-1 and endothelin receptor antagonists in inflammatory response and sepsis. Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 63 (1), 41-52 (2015).
  7. Silver, J. The glial scar is more than just astrocytes. Exp Neurol. 286, 147-149 (2016).
  8. Sofroniew, M. V. Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar formation. Trends Neurosci. 32 (12), 638-647 (2009).
  9. Adams, K. L., Gallo, V. The diversity and disparity of the glial scar. Nat Neurosci. 21 (1), 9-15 (2018).
  10. Buscemi, L., Price, M., Bezzi, P., Hirt, L. Spatio-temporal overview of neuroinflammation in an experimental mouse stroke model. Sci Rep. 9 (1), 507(2019).
  11. Vasan, L., Park, E., David, L. A., Fleming, T., Schuurmans, C. Direct neuronal reprogramming: Bridging the gap between basic science and clinical application. Front Cell Dev Biol. 9, 681087(2021).
  12. Berninger, B., et al. Functional properties of neurons derived from in vitro reprogrammed postnatal astroglia. J Neurosci. 27 (32), 8654-8664 (2007).
  13. Chen, Y. C., et al. A neurod1 aav-based gene therapy for functional brain repair after ischemic injury through in vivo astrocyte-to-neuron conversion. Mol Ther. 28 (1), 217-234 (2020).
  14. Ghazale, H., et al. Ascl1 phospho-site mutations enhance neuronal conversion of adult cortical astrocytes in vivo. Front Neurosci. 16, 917071(2022).
  15. Wang, L. L., et al. Revisiting astrocyte to neuron conversion with lineage tracing in vivo. Cell. 184 (21), 5465-5481.e16 (2021).
  16. Xie, Y., Zhou, J., Wang, L. L., Zhang, C. L., Chen, B. New aav tools fail to detect neurod1-mediated neuronal conversion of muller glia and astrocytes in vivo. EBioMedicine. 90, 104531(2023).
  17. Bocchi, R., Masserdotti, G., Gotz, M. Direct neuronal reprogramming: Fast forward from new concepts toward therapeutic approaches. Neuron. 110 (3), 366-393 (2022).
  18. Huang, L., et al. A promise for neuronal repair: Reprogramming astrocytes into neurons in vivo. Biosci Rep. 44 (1), BSR20231717(2024).
  19. Hickmott, J. W., Morshead, C. M. Glia-to-neuron reprogramming to the rescue. Neural Regen Res. 20 (5), 1395-1396 (2024).
  20. Gao, X., Wang, X., Xiong, W., Chen, J. In vivo reprogramming reactive glia into iPSCs to produce new neurons in the cortex following traumatic brain injury. Sci Rep. 6, 22490(2016).
  21. Guo, Z., et al. In vivo direct reprogramming of reactive glial cells into functional neurons after brain injury and in an alzheimer's disease model. Cell Stem Cell. 14 (2), 188-202 (2014).
  22. Livingston, J. M., et al. Ectopic expression of neurod1 is sufficient for functional recovery following a sensory-motor cortical stroke. Biomedicines. 12 (3), 663(2024).
  23. Tai, W., Xu, X. M., Zhang, C. L. Regeneration through in vivo cell fate reprogramming for neural repair. Front Cell Neurosci. 14, 107(2020).
  24. Wu, Z., et al. Gene therapy conversion of striatal astrocytes into gabaergic neurons in mouse models of Huntington's disease. Nat Commun. 11 (1), 1105(2020).
  25. Roome, R. B., et al. A reproducible endothelin-1 model of forelimb motor cortex stroke in the mouse. J Neurosci Methods. 233, 34-44 (2014).
  26. Islam, R., et al. Inhibition of apoptosis in a model of ischemic stroke leads to enhanced cell survival, endogenous neural precursor cell activation and improved functional outcomes. Int J Mol Sci. 25 (3), 1786(2024).
  27. Balkaya, M., Krober, J. M., Rex, A., Endres, M. Assessing post-stroke behavior in mouse models of focal ischemia. J Cereb Blood Flow Metab. 33 (3), 330-338 (2013).
  28. Guo, Y., et al. High-titer AAV disrupts cerebrovascular integrity and induces lymphocyte infiltration in adult mouse brain. Mol Ther Methods Clin Dev. 31, 101102(2023).
  29. Ortinski, P. I., et al. Selective induction of astrocytic gliosis generates deficits in neuronal inhibition. Nat Neurosci. 13 (5), 584-591 (2010).
  30. Jiang, M. Q., et al. Conversion of reactive astrocytes to induced neurons enhances neuronal repair and functional recovery after ischemic stroke. Front Aging Neurosci. 13, 612856(2021).
  31. Aschauer, D. F., Kreuz, S., Rumpel, S. Analysis of transduction efficiency, tropism and axonal transport of AAV serotypes 1, 2, 5, 6, 8 and 9 in the mouse brain. PLoS One. 8 (9), e76310(2013).
  32. Su, M., et al. Expression specificity of GFAP transgenes. Neurochem Res. 29 (11), 2075-2093 (2004).
  33. Kofoed, R. H., et al. Efficacy of gene delivery to the brain using AAV and ultrasound depends on serotypes and brain areas. J Control Release. 351, 667-680 (2022).
  34. He, T., et al. The influence of murine genetic background in adeno-associated virus transduction of the mouse brain. Hum Gene Ther Clin Dev. 30 (4), 169-181 (2019).
  35. Hu, N. Y., et al. Expression patterns of inducible cre recombinase driven by differential astrocyte-specific promoters in transgenic mouse lines. Neurosci Bull. 36 (5), 530-544 (2020).
  36. Botterill, J. J., et al. Off-target expression of cre-dependent adeno-associated viruses in wild-type c57bl/6j mice. eNeuro. 8 (6), ENEURO.0363-ENEURO.0421 (2021).
  37. Hasel, P., Rose, I. V. L., Sadick, J. S., Kim, R. D., Liddelow, S. A. Neuroinflammatory astrocyte subtypes in the mouse brain. Nat Neurosci. 24 (10), 1475-1487 (2021).
  38. Kim, R. D., et al. Temporal and spatial analysis of astrocytes following stroke identifies novel drivers of reactivity. bioRxiv. , (2023).
  39. Matias, I., Morgado, J., Gomes, F. C. A. Astrocyte heterogeneity: Impact to brain aging and disease. Front Aging Neurosci. 11, 59(2019).
  40. Miller, S. J. Astrocyte heterogeneity in the adult central nervous system. Front Cell Neurosci. 12, 401(2018).
  41. Early, A. N., Gorman, A. A., Van Eldik, L. J., Bachstetter, A. D., Morganti, J. M. Effects of advanced age upon astrocyte-specific responses to acute traumatic brain injury in mice. J Neuroinflammation. 17 (1), 115(2020).
  42. Donocoff, R. S., Teteloshvili, N., Chung, H., Shoulson, R., Creusot, R. J. Optimization of tamoxifen-induced cre activity and its effect on immune cell populations. Sci Rep. 10 (1), 15244(2020).
  43. Gresita, A., et al. Very low efficiency of direct reprogramming of astrocytes into neurons in the brains of young and aged mice after cerebral ischemia. Front Aging Neurosci. 11, 334(2019).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Экспрессия Neurod1модель ишемического инсультапромотор GFAPперепрограммирование астроцитовстереотаксическая инъекцияинъекция эндотелина-1трансдуцированные нейронымышиная модель инсульта
Системы AAV и мышиные модели для исследования эктопической экспрессии Neurod1 в трансдуцированных клетках при подостром и хроническом периоде постишемического инсульта
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.