Методическая статья

Ретровирусный CRISPR/Cas9-опосредованный генный таргетинг для изучения дифференцировки Th17 in vitro

1.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/66966

⸱

15 ноября 2024 г.

 ,  ,  ,  , 
1Shanghai Immune Therapy Institute, Renji Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 2Zhejiang University-University of Edinburgh Institute (ZJU-UoE Institute), Zhejiang University School of Medicine, Zhejiang University, 3Institute of Immunology and Department of Rheumatology, Sir Run Run Shaw Hospital, Zhejiang University School of Medicine

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Мы представляем протокол ретровирусной трансдукции направляющей РНК в первичные Т-клетки трансгенных мышей Cas9, обеспечивая эффективную альтернативу редактированию генов при изучении дифференцировки Th17.

Аннотация

Т-хелперы, которые продуцируют IL-17A, известные как клетки Th17, играют важную роль в иммунной защите и участвуют в аутоиммунных расстройствах. CD4 Т-клетки могут быть стимулированы антигенами и четко определенными цитокиновыми коктейлями in vitro для имитации дифференцировки клеток Th17 in vivo. Были проведены обширные исследования механизмов регуляции дифференцировки Th17 с использованием поляризационного анализа Th17 in vitro .

Традиционные методы поляризации Th17 обычно включают получение наивных CD4 Т-клеток от генетически модифицированных мышей для изучения влияния конкретных генов на дифференцировку и функцию Th17. Эти методы могут быть трудоемкими и дорогостоящими, и на них могут влиять внешние клеточные факторы у животных с нокаутом. Таким образом, протокол, использующий ретровирусную трансдукцию направляющей РНК для введения нокаута гена в первичные Т-клетки мыши с нокаутом CRISPR/Cas9, служит очень полезным альтернативным подходом. В данной работе представлен протокол дифференцировки наивных первичных Т-клеток в клетки Th17 после ретровирусно-опосредованного нацеливания генов, а также последующие методы анализа проточной цитометрии для определения инфекции и эффективности дифференцировки.

Введение

Клетки Th17, уникальное подмножество CD4+ Т-хелперов, жизненно важны для уничтожения внеклеточных бактерий и грибков и играют важную роль в развитии различных аутоиммунных заболеваний 1,2,3. Новые данные свидетельствуют о том, что клетки Th17 демонстрируют гетерогенность, функционируя как в патогенных, так и в непатогенных условиях, на которые влияют факторы окружающей среды и генетические факторы. Выяснение регуляторных процессов, которые контролируют дифференцировку клеток Th17, пластичность и гетерогенность, имеет решающее значение для продвижения более эффективных иммунотерапевтических стратегий.

Генетически модифицированные животные широко используются для раскрытия ключевых регуляторов дифференцировки и функций клеток Th17. Использование генетически модифицированных животных включает в себя полную манипуляцию in vivo, обеспечивая подлинность и систематическое изучение ее роли в физиологических условиях или моделях заболеваний. Тем не менее, высокопроизводительный скрининг при таком подходе в значительной степени непрактичен. Поляризационные анализы in vitro являются альтернативой для изучения дифференцировки клеток Th17. Было показано, что интерлейкин 6 (IL-6) в сочетании с трансформирующим фактором роста β1 (TGFβ1) способствует развитию непатогенных клеток Th17, в то время как IL-6, IL-1β и IL-23 участвуют в дифференцировке патогенных клеток Th17 (pTh17)4,5.

Появление технологии CRISPR/Cas9 облегчило точное редактирование генома на конкретных основаниях. В сочетании с ретровирусной трансдукцией этот подход обеспечивает мощный, эффективный и экономичный генетический метод для скрининга и функционального изучения потенциальных регуляторов в клетках Th17 6,7. В этом исследовании мы усовершенствовали процедуру ретровирусной трансдукции в поляризационной системе Th17. Используя ретровирусную систему, мы заразили предварительно экспрессирующие Cas9 активированные наивные Т-клетки от мышей. Клетки трансдуцировали с помощью конструкций направляющей РНК (гРНК), приводимых в движение промотором U6, вместе с генами, кодирующими флуоресцентные репортерные белки под контролем промотора EF1a, чтобы облегчить нокаут гена-мишени. Затем трансдуцированные Т-клетки культивировали в определенных цитокиновых условиях, чтобы индуцировать дифференцировку в клетки Th17. Примечательно, что нокаут RoRγt значительно снижал выработку Ил-17А по сравнению с контрольной группой. Эффективность этой системы зависит от оптимизированных условий производства и трансдукции ретровирусов для активированных первичных Т-клеток, что обеспечивает быстрый и практический подход к изучению специфических генов в дифференцировке и функции Th17.

Протокол

Все процедуры были одобрены Комитетом по этике благополучия экспериментальных животных, больницей Жэньцзи, Медицинской школой Шанхайского университета Цзяотун и соответствуют институциональным рекомендациям.

1. Ретровирусное производство

  1. Подготовка ретровирусной конструкции
    1. Используйте инструмент CRISPick (https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public) для создания sgРНК для нокаута RORγt8. Укажите референсный геном мыши как Mouse GRCm38, а последовательность PAM выберите как NGG (для SpyoCas9, Hsu (2013) tracrRNA) на основе направляющей системы CRISPRko. Проверьте название целевого гена или другие форматы целевых генов и отправьте действительные входные данные для получения кандидатов на sgRNA. Установив другие параметры на значения по умолчанию, установите мишень sgRNA в RORγt (Rorc, Gene ID: 19885), чтобы нарушить дифференцировку Th17, и выберите нецелевыми sgRNA (сокращённо sgNT, последовательность: GCGAGGTATTCGGCTCCGCG) из библиотек мыши GeCKO v2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот инструмент предлагает ряд кликабельных опций для конструирования направляющих РНК, что позволяет удобно настраивать их в соответствии с конкретными требованиями.
      1. Введите имя целевого гена в поле поиска в столбце «Быстрый поиск генов». Система отобразит идентификатор гена и полное название целевого гена, чтобы обеспечить точный выбор.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Доступны дополнительные опции для валидации различных форматов генов-мишеней.
    2. Выберите одну sgRNA, нацеленную на последовательность Rorc (сокращенно sgRorc) в соответствии с высоким комбинированным рангом и порядком выбора, чтобы избежать нецелевых совпадений и повысить эффективность в отношении цели (последовательность sgRorc: GTCATCTGGGATCCACTACG). Синтезируйте два олигонуклеотида для sgRorc и sgNT: для прямого олиго добавьте последовательность "gttttagagctagaaatagcaagttaaaat" к 5'-концу каждой направляющей последовательности; Для обратного олиго добавьте последовательность "tttcgtcctttccaagatatataaagc" к 3'-концу каждой направляющей последовательности.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, существует несколько вариантов для последовательностей sgRNA. Важно выбрать 2 или 3 последовательности sgРНК, нацеленные на один и тот же генотип, чтобы оценить их эффективность нокаута. В наших предварительных экспериментах для сравнения были выбраны две гРНК, нацеленные на Rorc (последовательность sgRNA1: GTCATCTGGGATCCACTACG; последовательность sgRNA2: CTTGAGTATAGTCCAGAACG). Экспериментальные результаты показали, что гРНК, представленная в текущем методе (последовательность sgRNA1), демонстрирует более высокую эффективность нокаута между ними.
    3. Амплифицируйте кодирующие последовательности sgRorc и sgNT с помощью ДНК-полимеразы в ПЦР с указанными праймерами и клонируйте их в вектор pMX-U6-MCS (между областями промотора U6 и скаффолда гРНК) в кадре с флуоресцентным белком mCherry соответственно9. Настройте реакционную систему (50 μл), как показано в таблице 1. Эти праймеры состоят из последовательности sgRNA (3'), которая может вставлять sgRNA в вектор, и сегмента векторной последовательности (5'), который может амплифицировать полноразмерный фрагмент вектора. Кроме того, сконструируйте прямые и обратные праймеры с перекрытием приблизительно 18.о. в пределах области sgРНК (но не полностью перекрывающимися), облегчающими сборку линеаризованного вектора клонирования в процессе лигирования.
      Примечание: Необходимо получить линеаризованный векторный фрагмент в месте последовательности sgРНК с праймерами методом ПЦР в объеме приблизительно 5551 kd.
    4. Очистите конструкцию с помощью набора для экстракции геля и циркулируйте ее с помощью набора для клонирования. Используйте продукты рекомбинации для анализа трансформации.
    5. Выберите одиночные клоны из планшетов и проверьте последовательности sgRorc или sgNT-кодирования с помощью секвенирования первого поколения, используя праймер промотора U6 (последовательность: ATGGACTATCATATGCTTACCGTA).
    6. Выберите нужный одиночный клон для амплификации в бульоне LB. Извлекайте высококачественную плазмидную ДНК из бактериальных клеток с помощью набора плазмид, не содержащего эндотоксинов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что плазмидный раствор имеет высокое качество. Мы рекомендуем, чтобы концентрация плазмидного раствора была не менее 1 мкг/мкл.
  2. Подготовка упаковочных ячеек
    1. Подготовьте клетки Platinum-E (Plat-E) с помощью следующей процедуры: культивируйте клетки Plat-E модифицированной средой Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 100 единиц/мл пенициллина и 0,1 мг/мл стрептомицина в чашке для культивирования диаметром 10 см. В дальнейшем она будет называться средой для культивирования клеток .
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения надлежащей эффективности трансфекции мы рекомендуем использовать клетки в логарифмической фазе роста с менее чем 15 числами пассажей.
    2. Разделите полную тарелку 10 см клеток Plat-E (~2,6 ×10 7 клеток) в правильном соотношении в новую чашку размером 10 см за 1 день до трансфекции, чтобы достичь слияния клеток примерно на 80% на следующий день, что является оптимальным условием для трансфекции. Проведите пассирование клеток для новой 10-сантиметровой чашки в соотношении 1:3 (семена ~8 ×10-6 клеток в новой 10-сантиметровой чашке за день до трансфекции).
      Примечание: Коэффициент расщепления зависит от условий роста клеток, при этом более высокая эффективность трансфекции достижима в клетках с устойчивым ростом. Мы выполняем пассирование клеток для чашки длиной 10 см в соотношении 1:3. Для различных тарелок для клеточных культур, таких как чашка 6 см, мы рекомендуем высевать 1,5 × 106 Plat-E клеток за день до трансфекции.
  3. Трансфекция
    1. За час до трансфекции замените среду для культивирования клеток 8 мл восстановленной сывороточной среды без фенолового красного на 5% FBS, но без пенициллин-стрептомицина, так как он может мешать реагенту для трансфекции. Перед применением нагрейте восстановленную сыворотку до 37 °C.
    2. Приготовьте трансфекционную смесь, содержащую смесь 1 и смесь 2: смесь 1 включает 18 мкг плазмидной ДНК (pMXs-U6-MCS-sgNT-mCherry/pMXs-U6-MCS-sgRorc-mCherry) и 6 мкг pCL-экотропного ретровирусного вектора (pCL-Eco) в 1 000 мкл восстановленной сывороточной среды. Смесь 2 содержит 48 мкл трансфекционного реагента в 1000 мкл восстановленной сывороточной среды. Добавляйте смесь 2 по каплям в смесь 1 и аккуратно и тщательно перемешивайте. Инкубировать комплекс в течение 15-20 мин при температуре 20-25 °С.
    3. Осторожно капните смесь в ячейки Plat-E, осторожно поворачивая пластину, чтобы обеспечить равномерное распределение. Инкубируйте клетки при 37 °C при 5%CO2 в течение 6-12 часов.
    4. Замените среду 10 мл свежей среды для культивирования клеток и продолжайте инкубацию клеток при 37 °C, 5%CO2 в течение 48 ч.
    5. Оценка эффективности трансфекции в клетках Plat-E путем обнаружения метки ретровирусного вектора, выступающей в качестве прокси, с помощью флуоресцентной микроскопии или проточной цитометрии.
      Примечание: Сильный флуоресцентный сигнал mCherry (положительный флуоресцентный показатель превышает 80%) был обнаружен в значительной части клеток Plat-E, трансфицированных вектором pMX-U6-MCS, что свидетельствует об успешной трансфекции.
    6. Соберите вируссодержащую надосадочную жидкость для культур и центрифугируйте при 1500 × г в течение 10 мин для удаления фрагментов клеток. Аликвотировать надосадочную жидкость вируса по 1 мл на флакон и хранить при температуре -80 °С.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Фильтрация является альтернативным методом удаления клеточного мусора. Мы рекомендуем использовать шприцевой фильтр с размером пор 0,45 мкм и мембраной из полиэфирсульфона (PES), чтобы свести к минимуму удержание вирусных частиц на фильтрующей мембране.

2. Ретровирусная инфекция активированных CD4 + Т-клеток и дифференцировка Th17

  1. Подготовка и активация первичных наивных CD4+ Т-клеток
    1. Покройте каждую лунку 24-луночного планшета для культивирования клеток 2 мкг/мл анти-CD3e и 4 мкг/мл анти-CD28 в стерильном 500 мкл PBS, оберните планшет парапленкой для предотвращения испарения и загрязнения, а затем инкубируйте планшет при 4 °C в течение ночи (или 37 °C в течение 1-2 часов перед осаждением CD4+ Т-клеток) за день до выделения наивных CD4+ Т-клеток.
      Примечание: Этот шаг необходим для выполнения стимуляции Т-клеток мыши перед проведением вирусной трансдукции.
    2. На следующий день усыпьте 6-8-недельных мышей, экспрессирующих Cas9 (мыши R26-CAG-Cas9) путем удушенияCO-2 и стерилизуйте их 70% этанолом.
    3. Соберите селезенку мыши и поместите ее в PBS с 2% FBS и 100 μM EDTA (FACS буфер).
    4. Измельчите селезенку с помощью стерилизованного матового стекла (матовая сторона) в буфере FACS, гомогенизируйте ткань в одноклеточную суспензию и отфильтруйте клеточную суспензию через клеточное сетчатое фильтр 70 мкм в пробирку объемом 50 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обязательно измельчайте салфетку аккуратно и последовательно, чтобы она оставалась влажной. Насильственное измельчение ткани может значительно повлиять на выживаемость клеток.
    5. Вращайте суспензию клеток селезенки при 800 × г в течение 5 минут. Удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 2 мл буфера для лизиса эритроцитов. Дайте ему постоять при комнатной температуре в течение 5 минут, затем добавьте буфер FACS, чтобы достичь общего объема 15 мл. Центрифугируйте спленоциты при 800 × г в течение 5 мин.
    6. Ресуспендируйте спленоциты и отфильтруйте их через клеточный фильтр размером 40 мкм. Отрегулируйте окончательный объем до 1 мл для выделения CD4+ Т-клеток.
    7. Выделите CD4+ Т-клетки с помощью коммерческих наборов реагентов, следуя инструкциям в руководстве.
    8. Пометьте CD4+ Т-клетки смесью флуоресцентных антител (CD4, CD25, CD44 и CD62L) при температуре 4 °C в течение 30 минут, промойте клетки буфером FACS и выделите наивные CD4+ Т-клетки с помощью проточного сортировщика. Это приведет к получению CD4+CD25-CD62Lс высоким уровнемCD44и низким уровнем наивных Т-клеток.
    9. Удалите надосадочную жидкость для стимуляции, связанную с планшетом, с 24-луночного планшета для культивирования клеток (приготовленного на шаге 2.1.1) и дважды промойте каждую лунку 500 мкл PBS. Планшет 1 x 106 наивных CD4+ Т-клеток в 1 мл питательной среды лимфоцитов в лунке 24-луночного планшета для культивирования клеток. Инкубируйте клетки в клеточном инкубаторе.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Питательная среда лимфоцитов содержит 10% FBS, 100 ЕД/мл пенициллина и 0,1 мг/мл стрептомицина, 1 мМ пирувата натрия, 10 мМ HEPES и 50 мкМ β-МЭ в среде RPMI 1640.
  2. Ретровирусная инфекция
    1. Через 18-24 ч соберите каждую лунку активированных клеток в пробирку объемом 1,5 мл. Центрифугируйте при 800 × г в течение 5 минут и выбросьте надосадочную жидкость.
    2. Ресуспендируйте клеточную гранулу в 1 мл инфекционной смеси (10 мкг/мл гексадиметрина бромида, 10 мМ HEPES в надосадочной жидкости вируса) и добавьте 1 мл смеси в новую лунку 48-луночного клеточного культурального планшета. В то же время, сохраняйте достаточное количество клеток в качестве отрицательного (нетрансдуцированного) контроля.
      Примечание: Возможно иметь менее 1 x 106 активированных наивных CD4+ Т-клеток в лунке, но не рекомендуется использовать менее 0,5 x 106 клеток в лунке. Кроме того, не следует засевывать клетки в периферические лунки 48-луночного культивального планшета.
    3. Оберните пластину парапленкой и центрифугируйте при 800 x g в течение 90 минут при 32 °C. Установите ускорение и замедление на 3. После центрифугирования снимите парапленку, инкубируйте клетки в инкубаторе в течение 4 ч и приступайте к этапам дифференцировки.
  3. Дифференцировка инфицированных клеток в клетки Th17
    1. Подготовьте антигенпрезентирующие клетки (АПК) во время ретровирусной инфекции. Во-первых, получите спленоциты от мышей дикого типа, следуя инструкциям из шагов с 2.1.2 по 2.1.4. Ресуспендировать спленоциты 1 мл питательной среды для лимфоцитов с 50 мкг/мл митомицина в пробирке объемом 15 мл. Инкубировать спленоциты при 37 °C при 5%CO2 в течение 1 ч.
    2. Через час добавьте PBS до отметки 15 мл для промывания спленоцитов, центрифугируйте при 800 x g в течение 5 минут, выбросьте надосадочную жидкость, повторно суспендируйте спленоциты 1 мл питательной среды для лимфоцитов и подсчитайте количество клеток. Элементы APC были успешно подготовлены.
    3. После 4 ч инкубации клеток (как на шаге 2.2.3) соберите трансдуцированные CD4+ Т-клетки в пробирки объемом 1,5 мл и центрифугируйте при 800 x g в течение 5 мин. Выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте инфицированные клетки в 600 мкл PBS для промывания. Центрифугируйте при 800 x g в течение 5 минут и выбросьте надосадочную жидкость.
    4. Поместите 0,5 × 106 трансдуцированных CD4+ Т-клеток в 1 мл питательной среды лимфоцитов с 1,5 x 106 APC-клетками в лунку 24-луночного клеточного культурального планшета. Добавка с 2 мкг/мл анти-CD3e, 2 мкг/мл анти-CD28 и коктейлем для дифференцировки клеток Th17, который содержит 10 мкг/мл анти-IFNγ, 10 мкг/мл анти-IL-12/IL23 p40, 10 мкг/мл анти-IL4, 2,5-3 нг/мл hTGF-β и 20-30 нг/мл IL-6. Культивируют клетки в течение 2 дней.
    5. Соберите каждую лунку клеток в пробирки объемом 1,5 мл, центрифугируйте при 800 x g в течение 5 минут и выбросьте надосадочную жидкость. Обновляйте новый 1 мл питательной среды лимфоцитов только 3 нг/мл TGF-β и 30 нг/мл IL-6. Поместите клетки в новую лунку с 24-луночным планшетом для культивирования клеток на длительный период культивирования. Анализируйте клетки через 2 дня после смены среды.

3. Оценка эффективности трансдукции и результаты дифференцировки

  1. После двух дней смены среды соберите клетки и центрифугируйте при 800 × г в течение 5 мин и выбросьте надосадочную жидкость. Обрабатывайте дифференцированные клетки 50 нг/мл форбола 12-миристат 13-ацетата (ПМА), 500 нг/мл иономицина и 5 мкг/мл брефелдина А в 500 мкл питательной среды лимфоцитов в новой лунке 24-луночного клеточного культиватора при 37 °C инкубаторе в течение 4 ч. Соберите половину клеток для анализа проточной цитометрии и лизируйте другую половину клеток с помощью буфера для экстракции РНК для анализа количественной ПЦР.
  2. Для анализа проточной цитометрии
    1. Соберите клетки в пробирки объемом 1,5 мл. Добавьте 1 мл буфера FACS в пробирки и центрифугируйте при 800 × г в течение 5 минут для промывания клеток.
    2. Ресуспендировать клеточную таблетку смесью флуоресцентных антител (CD4 и краситель для корректируемой жизнеспособности в 100 мкл PBS) и окрашивать клетки при температуре 4 °C в течение 30 минут.
    3. Промойте ячейки 300 μL PBS и зафиксируйте их 300 μL 2% фосфат-буферизованного формальдегида (FA) при 4 °C в течение не менее 60 минут.
    4. Через час промойте клетки PBS, повторно суспендируйте их 600 мкл 1x пермеабилизационного буфера и центрифугируйте при 800 × г в течение 5 минут.
    5. Выбросьте надосадочную жидкость и добавьте краситель анти-IL-17A в 100 мкл 1x пермеабилизационного буфера на 60 минут при комнатной температуре или 4 °C на ночь.
    6. На следующий день промойте клетки 1x пермеабилизационным буфером и повторно суспендируйте их в 200 мкл PBS. Анализ клеток с помощью проточной цитометрии10. Смотрите раздел «Репрезентативные результаты».
  3. Для анализа количественной ПЦР извлеките РНК, следуя инструкциям набора для экстракции РНК. Выполните обратную транскрибацию РНК в кДНК для хранения или последующего анализа количественной ПЦР. Дизайн этих праймеров должен соответствовать общим принципам дизайна праймеров для количественной ПЦР, а также быть специально нацелен на область, охватывающую ожидаемый индель-сайт, где произошло опосредованное гРНК расщепление. Любое снижение эффективности усиления или потеря сигнала на этом участке может служить показателем успешного нокаута. Праймеры для количественной ПЦР следующие:
    Rorc F: TCCACTACGGGGTTATCACCT; R: AGTAGGCCACATTACACTGCT.
    IL17a F: TCAGCGTGTCCAAACACTGAG; R: CGCCAAGGGAGTTAAAGACTT.

Результаты

В исследовании мы клонировали мишень sgRNA в Rorc и кодирующие последовательности без нацеливания sgRNA в вектор pMX-U6-MCS с флуоресцентным белком mCherry (рис. 1A, B). Производство ретровируса осуществлялось в соответствии с протоколом, приведенным на рисунке 2. Трансфекцию начинали на 0-й день, а ретровирусный забор – на 2-й день. Эффективность трансфекции можно проверить с помощью интенсивности флуоресценции mCherry (рис. 1C). Перед тем, как собрать вирус, наивные CD4+ Т-клетки были отсортированы и активированы. Эти активированные CD4+ Т-клетки затем инфицировали с помощью спиновой инфекции с последующим продолжением описанных стадий дифференцировки. Наконец, эффективность трансдукции и результаты дифференцировки оценивали с помощью анализа проточной цитометрии и анализа количественной ПЦР.

На рисунке 3 показана стратегия стробирования, применяемая для сортировки наивных CD4+ Т-клеток. После выбора основной клеточной популяции и синглетных клеток (как показано в первых двух вентильных элементах рисунка 3) клетки FVD-CD4+ были забиты для отличия CD4 Т-клеток в поляризованных клетках до Th17 от клеток в APC. Наконец, IL-17A, продуцируемый CD4 Т-клетками, демонстрирует эффективность дифференцировки Th17, что указывает на эффективность нокаута. Процент mCherry-положительных клеток отражает эффективность ретровирусной инфекции, в то время как эффективность нокаута указывается процентом IL-17A-положительных клеток. Для повышения жизнеспособности клеток и минимизации продолжительности сортировки спленоциты обогащали с помощью набора для выделения CD4+ Т-клеток мыши, в результате чего эффективность обогащения превысила 90%.

Эффективность ретровирусной инфекции, о чем свидетельствует наличие mCherry-положительных клеток, обычно составляет около 40% (рисунок 4A). Хотя эффективность инфекции может быть увеличена за счет концентрации вируса, такой подход достигается за счет увеличения продолжительности эксперимента и более высоких затрат. В наших экспериментах инфицированные клетки, культивируемые без коктейля дифференцировки клеток Th17, служили отрицательным контролем дифференцировки Th17, обозначенным как Th0. В качестве положительного контроля использовали нецелевую sgРНК, называемую sgNT. Для редактирования генов мы использовали гРНК, нацеленную на ген RORγt (sgRNA-Rorc), что значительно снижало эффективность дифференцировки Th17 (рис. 4A). Это вмешательство также привело к значительному снижению уровней экспрессии Rorc и IL-17a (рис. 4B).

figure-results-1
Рисунок 1: Пример субклонирования sgRNA в ретровирусный вектор и эффективность трансфекции. В качестве исходной конструкции был использован вектор pMX-U6-MCS. Скаффолд гРНК вместе с последовательностями sgРНК (оранжевая часть), нацеленными на (A) скремблированный сайт и (B) Rorc, вставляли ниже промотора U6 (зеленая часть в качестве участка для секвенирования с праймерами U6). Места расположения sgRNA-содержащих праймеров и сайтов секвенирования праймеров указаны ниже кругового вектора Полные названия аббревиатур на плазмиде следующие. Сокращения: AmpR = резистентность к ампициллину, карбенициллину и родственным антибиотикам; LTR = длинный терминальный повтор; MMLVψ сигнал упаковки вируса мышиного лейкоза Молони; gag = усеченный ген gag вируса мышиного лейкоза Молони (MMLV), лишенный стартового кодона. (C) Микроскопическая визуализация mCherry в плазмидных ДНК-трансфицированных клетках Plat-E. Масштабная линейка: 500 пикселей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2: Схематическое изображение протокола. За день до трансфекции плотность Plat-E клеток должна быть отрегулирована до соответствующего диапазона. На следующий день (день 0) проводят трансфекцию и через 12 ч заменяют среду. В 1-й день отсортируйте и активируйте наивные Т-клетки мышей, экспрессирующих Cas9. Затем (день 2) собирают вируссодержащую надосадочную жидкость культуры и объединяют с активированными Т-клетками для ретровирусной трансдукции. Затем инфицированные клетки дифференцируются в клетки Th17 в течение 3–4 дней и анализируются с помощью FACS. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-3
Рисунок 3: Стратегия гейтирования для сортировки CD4 наивных Т-клеток. Поверхностное окрашивание проводили на обогащенных CD4 Т-клетках для мечения CD4, CD25, CD44 и CD62L. Используемая стратегия стробирования заключалась в следующем: первоначально лимфоциты были скобированы на основе параметров прямого и бокового рассеяния. Впоследствии одиночные клетки были идентифицированы с помощью FSC-H и FSC-W. Затем CD4+CD25-клетки были закрыты для исключения регуляторных Т-клеток (Tregs). Наконец, были идентифицированыТ-клетки с низким уровнемCD62Lи высоким уровнем наивности. Выделенные CD4+ наивные Т-клетки были собраны для последующих экспериментов. Сокращения: FSC = прямой разброс; SSC = боковое рассеяние. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-4
Рисунок 4: Пример успешной трансдукции активированных Т-клеток и дифференцировки Th17. (A) Эффективность дифференцировки Th17 значительно снижается, что редактируется с помощью гРНК RORγt (гейтинг на популяцию mCherry+ IL-17a+). (B) относительная экспрессия мРНК Rorγt и IL-17a в Th0 (инфицированные клетки, культивируемые без коктейля для дифференцировки клеток Th17), sgNT (нецелевым sgRNA) и sgRNA-Rorc (sgRNA, нацеленных на ген RORγt ). p < 0,001 (непарный двухвостый t-критерий Стьюдента; данные представлены в виде среднего ± SEM). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Компоненты для реакции ПЦРПрограмма ПЦР
КомпонентОбъем (μл)ШагТемп.ВремяЦикл
2 × Phanta Mix (Краситель плюс)25195 ºC3 мин1
ддН2020295 ºC15 с
Праймер-Ф (10 мкМ)2356 ºC15 с
Праймер-Р (10 мкМ)2472 ºC5 мин 30 сПерейдите к шагу 2
35 ×
Шаблон (~30 нг)1572 ºC5 мин1
612 ºC∞

Таблица 1: Компоненты реакции ПЦР и программа ПЦР для построения векторов гРНК.

Обсуждение

Редактирование генома CRISPR/Cas9 с помощью ретровирусной доставки является надежным методом изучения роли хелперных Т-клеток. Этот протокол предлагает быстрый и эффективный подход к изучению конкретных генов, участвующих в дифференцировке и функционировании Th17. Для достижения оптимальных результатов необходимо тщательно следовать нескольким важным шагам. Во-первых, для повышения эффективности нокаута генов следует тщательно выбирать гРНК. Учитывая риск побочных эффектов при редактировании гена CRISPR/Cas9, для дальнейших экспериментов11,12 целесообразно выбирать 2-3 гРНК с высокими показателями, как указано в разделе протокола 1.1.1. Во-вторых, высокий титр вируса необходим для успешного инфицирования. Надлежащее техническое обслуживание упаковочной линии Plat-E имеет решающее значение. В день трансфекции клетки должны достичь примерно 80% конфлюенции, так как как как недостаточное и чрезмерное количество клеток может поставить под угрозу титры вируса. Если клетки Plat-E недоступны, совместная трансфекция клеток эмбриональной почки человека 293T вектором pCL-Eco также может продуцировать высокие титры вируса13,14. Поддержание высокой концентрации плазмид на уровне не менее 1 г/л важно для достижения высокого титра вируса. Важно собрать вирусную суспензию до того, как она станет лимонно-желтой, поскольку вирус проявляет чувствительность к изменению pH. Поэтому pH питательной среды должен тщательно регулироваться в соответствующем диапазоне. Вирус должен храниться при температуре -80 ºC для сохранения его целостности и защищен от повторных циклов замораживания-оттаивания15.

В-третьих, для достижения высокой эффективности инфекции первичные клетки должны быть адекватно активированы. Недостаточная клеточная активация значительно снижает эффективность вирусной инфекции16. Перед вирусной инфекцией статус активации Т-клеток должен быть подтвержден микроскопически, поскольку активированные клетки имеют заметно больший размер, чем инактивированные. Стоит отметить, что наш протокол дифференцировки Th17 был специально оптимизирован для мышей C57BL/6, поэтому для других линий мышей могут потребоваться корректировки. В-четвертых, для достижения желаемых результатов дифференцировки Th17 решающее значение имеет поддержание оптимальных клеточных условий. Во время спиновой инфекции важно поместить клетки в лунки рядом с центром, чтобы помочь сохранить жизнеспособность клеток. После спиновой инфекции инкубация клеток в течение 4 ч (шаг протокола 2.2.4) имеет решающее значение для их восстановления. Кроме того, при переносе клеток важно щадящее пипетирование для поддержания жизнеспособности клеток. Различные условия стимуляции могут влиять на дифференцировку Th17. В этом эксперименте включение антигенпрезентирующих клеток в систему дифференцировки значительно повысило эффективность дифференцировки по сравнению с анти-CD3e и анти-CD28 стимуляцией, связанной с пластинами. Наконец, крайне важно убедиться, что все используемые цитокины остаются функциональными во время транспортировки и хранения. Цитокины могут быстро терять стабильность при повторных циклах замораживания-оттаивания или неподходящих растворах для восстановления. Лечение холодом и равные аликвоты необходимы для того, чтобы цитокины сохраняли функции на протяжении всей процедуры.

Этот протокол для генерации специфических генных нокаутных клеток Th17 имеет несколько ограничений. Во-первых, трудно достичь полной эффективности трансдукции в первичных Т-клетках мыши. Некоторые клетки могут не подвергаться предполагаемому нокауту гена во время дифференцировки Th17. Во-вторых, первичные Т-клетки имеют ограниченную продолжительность жизни in vitro. Примерно через неделю эти клетки, как правило, умирают, что создает проблемы для последующих экспериментов. В-третьих, наш протокол основан на трансгенных мышах Cas9, и когда мы попытались включить последовательность Cas9 в плазмиду ядра, это привело к значительному снижению титров вируса. Наконец, мы отмечаем, что этот протокол не подходит для анализа функций генов, участвующих в ранних стадиях активации CD4+ Т-клеток, поскольку эти клетки должны быть активированы до ретровирусной трансдукции.

Несмотря на свои ограничения, этот протокол был успешно применен в различных исследованиях, способствуя изучению ключевых генетических регуляторов, участвующих в дифференцировке Th17. Это позволяет оценить изменения эффективности дифференцировки Th17 после нокаута генов-мишеней в активированных Т-клетках. Кроме того, этот протокол подходит для оценки других аспектов функции клеток Th17, включая пролиферацию клеток, выживаемость, стабильность транскрипционного фактора, секрецию цитокинов и иммунные реакции. Кроме того, наша лаборатория продемонстрировала его эффективность в ретровирусной трансдукции и дифференцировке индуцированных регуляторных Т-клеток (iTregs). Хотя не все типы Т-клеток были протестированы, этот протокол также может быть применим в других подгруппах, таких как Th1, Th2 и CD8+ Т-клетки. В целом, этот метод служит ценным инструментом для проведения нокаутов генов в иммунных клетках, предлагая значительный потенциал для раскрытия критических генетических сигналов, регулирующих иммунные функции.

Раскрытие информации

Авторы констатируют отсутствие конфликта интересов.

Благодарности

Выражаем признательность Доу Лю (Dou Liu), Дунлян Сюй (Dongliang Xu) и Пинпинпин Хоу (Pinpin Hou) из основного учреждения Шанхайского института иммунной терапии за их поддержку в использовании этих инструментов. Эта работа была поддержана грантами Национального фонда естественных наук Китая 31930038, U21A20199, 32100718 и 32350007 (Линьжун Лу); 32100718 (Сюэсяо Цзинь); Инновационная исследовательская группа местных университетов высокого уровня в Шанхае SHSMU-ZLCX 20211600 (до Линьжун Лу); Программа внутренней инкубации RJTJ24-QN-076 (Цзэзиню Цую). Рисунок 2 был подготовлен с помощью Figdraw.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,5 М ЭДТА (pH 8,0)SolarbioE1170
100 мм Чашка для клеточных и тканевых культурBIOFILTCD010100
1 М Hepes (свободная кислота, стерильная)SolarbioH1090
24-луночный планшет для клеточных и тканевых культурNEST702002
48-луночный планшет для клеточных и тканевых культурNEST748002
Брефельдин Раствор (1,000x)BioLegend420601
антимышиное антитело CD4 Brilliant Violet 650 (RM4-5)BioLegend
CD3e (145-2C11), функционального класса, моноклональное антитело eBioscienceInvitrogen16-0031-82
CD44 моноклональное антитело (IM7), ТЭЛА, моноклональное антитело eBioscienceInvitrogen12-0441-83
CD62L (L-селектин) (MEL-14), APC, eBioscienceInvitrogen17-0621-82 
Счетчик клетокNexcelom BioscienceCellometer Auto 2000
Cell Sither (40 μ m)Клеточныйbiosharp BS-40-CS
(70 μ m)biosharpBS-70-CS
Центрифуга Эппендорф5425  R
Центрифуга eppendorf5810 R
ChamQ SYBR Color qPCR Master MixVazymeQ411-02
ClonExpress II One Step Cloning KitVazymeC112
DH5α Компетентные клеткиSangon BiotechB528413
Direct-zol RNA MiniprepZYMO RESEARCHR2050
DMEM MediumBasalMediaL110KJ
EasySep Mouse CD4+ T Cell Isolation KitSTEMCELL19852
eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 660Invitrogen65-0864-18
EndoFree Mini Plasmid Kit IITIANGENDP118-02
ExFect Реагент для трансфекцииVazymeT101-01
Фетальная бычья сыворотка, Premium PlusGibcoA5669701
FITC антимышиное антитело IL-17A (TC11-18H10.1)BioLegend506907
раствор формальдегидаMacklinF864792
HiScript IV RT SuperMix для количественной ПЦР?+gDNA wiper?VazymeR423-01
ИономицинBeyotimeS1672
Митомицин CMaokang Biotechnology7/7/1950
Мышь GRCm38NCBIRefSeq v.108.20200622
OPTI-MEM Сниженная сыворотка MediumGibco31985070сниженная сыворотка Средняя Pacific
Blue антимышиное антитело CD4 (RM4-5)BioLegend
PE/Cyanine7 антимышиное антитело CD25 (PC61)BioLegend102015
PE/Cyanine7 антимышиное антитело CD4 (GK1.5)BioLegend100422
пенициллин-стрептомицин (10 000 ЕД/мл)Gibco15140122
PMA/TPA Мыши BeyotimeS1819
R26-CAG-Cas9 Шанхайский центр модельных организмовкат. No nm-ki-00120
Рекомбинантный человеческий белок TGF-beta-1 (экспрессируемый CHO), CFR& D Systems11409-BH
Рекомбинантный мышиный IL-6PeproTech216-16
Исследовательский клеточный анализаторBD BiosciencesBD LSRFortessa
Исследовательский клеточный сортировщикSONYMA900
RPMI 1640 MediumBasalMediaL210KJ
SimpliAmp Термоамплификатор ПЦР системаApplied BiosystemsA24811
Раствор пирувата натрия (100 мМ)Sigma-AldrichS8636
Ultra-LEAF Очищенное антимышиное антитело CD28 (37.51)BioLegend102121
Ultra-LEAF Очищенное антимышиное ИФН-&гамма; Антитело (XMG1.2)BioLegend505847
Ultra-LEAF Очищенное антитело против мышиного IL-4 (11B11)BioLegend504135
Ultra-LEAF Очищенное антитело против мышей IL-12/IL-23 p40 (C17.8)BioLegend505309
&бета;-меркаптоэтанол (50 мМ)SolarbioM8211
Моноклональное антитело 100546 фильтр 100531

Ссылки

  1. Wu, B., Wan, Y. Molecular control of pathogenic th17 cells in autoimmune diseases. Int Immunopharmacol. 80, 106187(2020).
  2. Dong, C. Th 17 cells in development:: An updated view of their molecular identity and genetic programming. Nat Rev Immunol. 8 (5), 337-348 (2008).
  3. Patel, D. D., Kuchroo, V. K. Th17 cell pathway in human immunity: Lessons from genetics and therapeutic interventions. Immunity. 43 (6), 1040-1051 (2015).
  4. Ghoreschi, K., et al. Generation of pathogenic Th17 cells in the absence of TGF-β signalling. Nature. 467 (7318), 967-U144 (2010).
  5. Lee, Y., et al. Induction and molecular signature of pathogenic th17 cells. Nat Immunol. 13 (10), 991-999 (2012).
  6. Yang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).
  7. Yang, H., Wang, H., Jaenisch, R. Generating genetically modified mice using CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Nat Protoc. 9 (8), 1956-1968 (2014).
  8. Doench, J. G., et al. Optimized sgrna design to maximize activity and minimize off-target effects of crispr-cas9. Nat Biotechnol. 34 (2), 184-191 (2016).
  9. Holst, J., et al. Generation of t-cell receptor retrogenic mice. Nat Protoc. 1 (1), 406-417 (2006).
  10. Ordonez, P., Bishop, K. N., Stoye, J. P., Groom, H. C. T. Analysis of SAMHD1 restriction by flow cytometry in human myeloid U937 cells. J Vis Exp. (172), (2021).
  11. Akcakaya, P., et al. In vivo CRISPR editing with no detectable genome-wide off-target mutations. Nature. 561 (7723), 416-419 (2018).
  12. Bae, S., Park, J., Kim, J. -S. Cas-OFFinder: A fast and versatile algorithm that searches for potential off-target sites of cas9 rna-guided endonucleases. Bioinformatics. 30 (10), 1473-1475 (2014).
  13. Singh, Y., Garden, O. A., Lang, F., Cobb, B. S. Retroviral transduction of helper T cells as a genetic approach to study mechanisms controlling their differentiation and function. J Vis Exp. (117), e54698(2016).
  14. Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. The pCL vector system: Rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses. J Virol. 70 (8), 5701-5705 (1996).
  15. Cante-Barrett, K., et al. Lentiviral gene transfer into human and murine hematopoietic stem cells: Size matters. BMC Res Notes. 9, 312-312 (2016).
  16. Zhong, S., Malecek, K., Perez-Garcia, A., Krogsgaard, M. Retroviral transduction of T-cell receptors in mouse T-cells. J Vis Exp. (44), 2307(2010).

Перепечатки и разрешения

Теги

CD4in vitroROR T
Ретровирусный CRISPR/Cas9-опосредованный генный таргетинг для изучения дифференцировки Th17 in vitro
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.